CN116217552B - 用于醇类化合物标记的n-苯基咔唑类荧光化合物及其合成方法与应用 - Google Patents

用于醇类化合物标记的n-苯基咔唑类荧光化合物及其合成方法与应用

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Abstract

本发明提供一种用于醇类化合物标记的N‑苯基咔唑类荧光化合物的合成方法与应用，属于有机小分子醇类化合物荧光标记技术领域。本发明以N‑苯基咔唑为荧光母体环，咪唑为反应活性基团，其化学名称为：4‑(9‑咔唑)‑苯甲酰基咪唑，具体制备方法为：(1)将咔唑与对碘苯甲酸酯进行反应，得到4‑(9‑咔唑基)‑苯甲酸甲酯a；(2)a与氢氧化钾水溶液反应，得到4‑(9‑咔唑基)‑苯甲酸b；(3)b与N,N′‑羰基二咪唑反应得到目标产物。本发明荧光标记试剂可以准确、灵敏地标记十二种脂肪醇，从而实现复杂体系中痕量脂肪醇的分离与检测，可用于生命、食品等研究领域中多种脂肪醇的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。

Description

用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物及其合成方 法与应用
技术领域
本发明涉及有机小分子醇类化合物荧光标记技术领域，具体提供一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物及其合成方法与应用。
背景技术
脂肪醇是生命有机体的重要组成部分。快速、准确地测定脂肪醇对生物学、食品学和临床医学都具有重要意义。众所周知，大多数脂肪醇既无紫外吸收也不显示荧光，因此在痕量水平上检测它们相当困难的。目前借助自动分析仪及新型荧光试剂进行柱前或柱后的衍生化以寻求高灵敏的测定方法仍是一个前沿的研究领域。几种光度法测定脂肪醇的衍生化试剂不仅灵敏度低，且衍生时间长，限制了其应用。因此开发一种新型的高灵敏的荧光标记试剂用于脂肪醇的荧光检测具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种用于醇类化合物荧光标记的N-苯基咔唑类化合物及其合成方法与应用，具有反应速率快、标记产物信号强、准确性和灵敏度高等优点。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，本发明提供一种4-(9-咔唑)-苯甲酸类化合物标记试剂，以4-(9-咔唑)-苯甲酸为荧光母体环，咪唑为反应活性基团，其化学名称为：4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑，其化学结构式为：
本发明还包括一种N-苯基咔唑类荧光化合物标记试剂的合成方法，包括：
步骤1：将咔唑与对碘苯甲酸甲酯进行取代反应，得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯；
步骤2：将中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯与氢氧化钾水溶液反应，随后进行酸化得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸；
步骤3：将中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸与N,N'-羰基二咪唑反应，得到目标产物4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑。
进一步的，所述合成方法具体包括以下步骤：
步骤1：取代反应：将咔唑、碳酸钾、碘化亚铜、铜粉、二叔戊酰甲烷溶置于二甲基亚砜中，恒压下滴加溶有对碘苯甲酸甲酯的二甲基亚砜溶液，油浴130℃反应45min，反应结束，待反应液冷却后，滤去不溶物，倒入400mL水，并不断搅拌，析出白色固体，抽滤，并水洗两次，粗产物晾干得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯；
步骤2：水解反应：将4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯粗产物溶解于乙醇中，加入氢氧化钾水溶液，油浴80℃反应1h，反应结束后冷却至室温，加水加盐酸出沉淀，抽滤，取沉淀加氢氧化钠水溶液调节至中性，上清液继续加盐酸至强酸性(pH为2-4)，反复该分离步骤，后用乙醇重结晶2遍得到白色针状结晶产物。
步骤3：取代反应：将中间产物4-(9-咔唑基)-苯甲酸溶解于四氢呋喃中，电磁搅拌下加入溶有N,N'-羰基二咪唑的四氢呋喃溶液，油浴50℃反应30min，静置析出白色结晶产物。
进一步的，所述步骤1中，咔唑与对碘苯甲酸甲酯的摩尔比优选为1:1.2。
进一步的，所述步骤3中，目标产物4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑四氢呋喃重结晶2次，得到白色针状结晶产物；4-(9-咔唑基)-苯甲酸与CDI的摩尔比优选为1:1。
本发明还包括一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物试剂的合成与应用，标记试剂具有上述的结构，或通过上述的合成方法合成，应用于检测样品中脂肪醇含量。
进一步的，检测样品中脂肪醇含量的具体步骤如下：
(1)溶液配制：配制40g/L DMAP(4-二甲氨基吡啶)水溶液；配制5份混合脂肪醇混合标准品溶液，浓度分别为10nM、100nM、1μM、10μM和100μM；配制浓度为10mM的4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液；
(2)工作曲线绘制：依次将40μL DMAP溶液、20μL脂肪醇、20μLDMSO混合标准溶液和100μL 4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，80℃下反应30min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10min进样分析；
(b)取10μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪醇混合标准品色谱分离图，将五份脂肪醇混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以脂肪醇浓度为横坐标，以峰高为纵坐标绘制脂肪醇浓度工作曲线；
(3)脂肪醇浓度检测：将样品用4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑衍生标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪醇浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪醇的浓度。
进一步的，检测洗手液中脂肪醇含量的步骤如下：
量取5mL洗手液，用盐酸调至酸性，加10mL三氯甲烷超声振荡3min，离心10min，分离出有机相，有机相用6mol/L HCl反复洗几次，直到大量白色沉淀不再析出，白色沉淀用N2吹干后加乙腈重新溶解后备用，按所述步骤(2)方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰高代入工作曲线中，即可求得洗手液中各脂肪醇的浓度，近而得出洗手液中各脂肪醇的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明试剂荧光最大激发波长与发射波长分别在290nm与443nm，可以实现对脂肪醇化合物的快速荧光标记与检测。该试剂以N-苯基咔唑环为荧光母体环，咪唑为反应活性基团，其合成步骤简单方便，易于实现，三步反应即可完成：(1)将咔唑与对碘苯甲酸甲酯进行反应，得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯；(2)4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯与氢氧化钾水溶液反应，得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸，经乙醇重结晶2次，得到白色针状结晶产品4-(9-咔唑基)-苯甲酸；(3)4-(9-咔唑基)-苯甲酸与CDI反应得到目标产物4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑,经四氢呋喃重结晶2遍得到白色结晶产物。
本发明荧光标记试剂化学性质稳定，化学纯度达99.5％。本发明N-苯基咔唑类荧光标记试剂是以N-苯基咔唑为母体环，以咪唑为活性基团。咪唑基团在标记醇类化合物时(如脂肪醇)，对醇类化合物选择性强，而且标记时间短、标记产率高。在衍生条件上，脂肪醇荧光标记试剂只需在80℃下反应30min即可衍生完全，且不需要复杂的萃取条件，在检测方法上，采用高效液相色谱荧光检测。
本发明的N-苯基咔唑类荧光标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记脂肪醇，从而实现复杂体系中微量、痕量脂肪醇的分离与检测，可用于生命分析、食品分析等研究领域中多种脂肪醇的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1制备4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑合成路线图；
图2是本发明实施例1制备的4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的质谱图；
图3是本发明实施例1标记试剂与乙醇标记产物的紫外可见吸收光谱图；
图4是本发明实施例1标记试剂与乙醇标记产物的荧光发射光谱图；
图5是本发明实施例2标记试剂与脂肪醇的反应路线图；
图6是本发明实施例2标记试剂衍生12种脂肪醇混合标准品的色谱分离图；
图7是本发明实施例3标记试剂检测实际样品洗手液中脂肪醇色谱图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例及对比例中所用试剂及材料，如无特殊说明，均可经过商业途径得到。
本发明提供一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的合成方法，具体实施例如下。
实施例1
一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物，以N-苯基咔唑为荧光母体环，咪唑为反应活性基团，其化学名称为：4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑，其化学结构式为：
具体的合成路线见图1，包括：
(1)取代反应：将咔唑(6.4g)、碳酸钾(5.3g)、碘化亚铜(0.5g)、铜粉(0.5g)、二叔戊酰甲烷(3mL)置于二甲基亚砜(50mL)中，恒压下滴加溶有对碘苯甲酸甲酯(12.04g)的二甲基亚砜溶液(20mL)，油浴130℃反应45min，反应结束，待反应液冷却后，滤去不溶物，倒入400mL水，并不断搅拌，析出白色固体，抽滤，并水洗两次，粗产物晾干得到中间体4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯；
(2)水解反应：将4-(9-咔唑基)-苯甲酸甲酯粗产物(5.0g)溶解于乙醇(100mL)中，加入氢氧化钾(5.0g)水溶液(30mL)，油浴80℃反应1h,反应结束后冷却至室温，加水沉淀后加盐酸调节至酸性，抽滤，取沉淀加氢氧化钠水溶液调节至中性，上清液继续加盐酸至强酸性，反复该分离步骤，后沉淀用乙醇重结晶2遍得到白色针状结晶产物。
(3)取代反应：将中间产物4-(9-咔唑基)-苯甲酸(2.0g)溶解于四氢呋喃(5mL)中，电磁搅拌下加入溶有N,N'-羰基二咪唑(1.14g)的四氢呋喃溶液(2mL)，油浴50℃反应30min，静置析出白色结晶产物。
图2是制备的白色结晶产物的质谱图,其表征数据如下：MS:m/z[M+H]+338.1，证明成功制备4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑。
为提高荧光标记脂肪醇的检测灵敏度，准确的获得荧光标记试剂的最大激发波长与最大发射波长是提高检测灵敏度的关键。为获得标记试剂或者标记产物的最大激发波长与最大发射波长，本发明用浓度1μM的4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑溶液对乙醇标准品溶液进行标记，然后进行荧光分析。图3是标记试剂与乙醇标记产物的荧光激发光谱图；图4是标记试剂与乙醇标记产物的荧光发射光谱图。由图3-4可知，获得标记产物的最大激发波长与最大发射波长分别为290nm与443nm。
实施例2
本发明还提供一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的应用，用于检测样品中脂肪醇含量，具体的：
(1)配制40g/L DMAP溶液；配制5份混合(C1-C12)脂肪醇标准品溶液，其中每种脂肪醇的浓度均分别为10nM配制10nM混合脂肪醇标准品溶液，依次配制100nM、1μM、10μM和100μM；配制浓度为10mM的4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液；
(2)依次将40μL DMAP溶液、20μL脂肪醇混合标准溶液、20μLDMSO和100μL 4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，80℃下反应30min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪醇混合标准品色谱分离图，将五份脂肪醇混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以脂肪醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制脂肪醇浓度工作曲线，见表1；
(3)将样品用4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑衍生标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪醇浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪醇的浓度。
表1
注：Y为峰面积，X为浓度。
由表1可知，检出限和定量限分别为0.99-1.51μg/kg，3.32-5.23μg/kg，相关系数(R2)>0.9992，表明该分析物具有良好的线性关系，日内日间精密度分别为1.5-3.94％、2.1-6.14％。即该分析方法具有良好的线性关系、较高精密度、较低的检测线和定量限。
本发明4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑与脂肪醇的反应路线图见图5；经过标记衍生12种脂肪醇混合标准品的色谱分离图见图6。由图6可知，本发明的N-苯基咔唑类荧光标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记脂肪醇，尤其适用于复杂体系中微量、痕量小分子醇类化合物的分离检测。
实施例3
一种检测洗手液中脂肪醇含量的方法，步骤如下：
(1)量取5mL洗手液，用盐酸调至酸性，加10mL三氯甲烷超声振荡3min，离心10min，分离出有机相，有机相用6mol/L HCl反复洗几次，直到大量白色沉淀不再析出，白色沉淀用N2吹干后加乙腈重新溶解后得到待测样品。
(2)依次将40μL DMAP溶液、20μL上述待测样品、20μL DMSO和100μL 4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，80℃下反应30min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到混合脂肪醇的色谱分离图，见图7，将所得到的峰面积代入相应工作曲线中，即可求得洗衣液中各脂肪醇的浓度，近而得出洗手液中各脂肪醇的含量，见表2。
表2
由表2可知，本实施例选取的洗手液中仅含有丙醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇和十二醇，并精确测量出其浓度。
实施例4
在相同的洗脱条件下，对十二种小分子脂肪醇进行三次平行实验分析，计算保留时间和峰面积的重现性，将三个水平的脂肪醇标准溶液添加到洗手液样品中来评估回收率。具体的：
(1)依据实施例3得到洗手液待测样品，并检测洗手液中各脂肪醇浓度c1；
(2)依次将40μL DMAP溶液、20μL上述待测样品、20μL DMSO和100μL 4-(9-咔唑)-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液加到2mL的安瓿瓶中，再分别加入浓度为5mg/L(C1-C12各脂肪醇的浓度均为5mg/L)、10mg/L(C1-C12各脂肪醇的浓度均为10mg/L)、15mg/L(C1-C12各脂肪醇的浓度均为15mg/L)的混合脂肪醇标准样品，80℃下反应30min后，将衍生化溶液做如下处理：
(a)加入50μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
(b)取10μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到混合脂肪醇的色谱分离图，将所得到的峰面积代入相应工作曲线中，即可求各脂肪醇的浓度c2，依据下述公式计算回收率，结果见表3。
回收率＝(c2-c1)×100％/混合脂肪醇标准样品浓度。
表3
由表3可知，在相同的洗脱条件下，十二种小分子脂肪醇回收率在88-99％，回收率良好，说明本方法的准确度较好。
综上可知，本发明制备的N-苯基咔唑类化合物可以快速、准确、灵敏地标记脂肪醇，从而实现复杂体系中微量、痕量脂肪醇的分离与检测，可用于生命分析、食品分析等研究领域中多种脂肪醇的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的应用，其特征在于，所述N-苯基咔唑类荧光化合物具有如下所示的化学结构式：
；
所述醇类化合物为脂肪醇，所述N-苯基咔唑类荧光化合物的应用为：用于检测样品中脂肪醇含量。
2.根据权利要求1所述的用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的应用，其特征在于，所述检测样品中脂肪醇含量的具体步骤如下：
（1）溶液配制：配制40 g/L 4-二甲氨基吡啶水溶液；配制5份混合脂肪醇混合标准品溶液，浓度分别为10 nM、100 nM、1 μM、10 μM和100 μM；配制浓度为10 mM的4-（9-咔唑）-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液；
（2）工作曲线绘制：依次将40 μL DMAP溶液、20 μL脂肪醇混合标准溶液、20 μL 二甲基亚砜和100 μL 4-（9-咔唑）-苯甲酰基咪唑的乙腈溶液加到2 mL的安瓿瓶中，80 ℃下反应30 min后，将衍生化溶液做如下处理：
（a）加入50 μL淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；
（b）取10 μL反应液进行高效液相色谱-荧光分析，得到脂肪醇混合标准品色谱分离图，将五份脂肪醇混合标准品依次衍生、高效液相色谱- 荧光分析后，以脂肪醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制脂肪醇浓度工作曲线；
（3）脂肪醇浓度检测：将待测样品用4-（9-咔唑）-苯甲酰基咪唑按照步骤（2）进行衍生标记后，然后进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入脂肪醇浓度工作曲线中，即可得到样品中脂肪醇的浓度。
3.根据权利要求2所述的用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，混合脂肪醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇和十二醇。
4.根据权利要求2所述的用于醇类化合物标记的N-苯基咔唑类荧光化合物的应用，其特征在于，所述应用为用于检测洗手液中脂肪醇含量，具体步骤为：
量取5 mL洗手液，用盐酸调至酸性，加10 mL三氯甲烷超声振荡3 min，离心10 min，分离出有机相，有机相用6 mol/L HCl反复洗几次，直到大量白色沉淀不再析出，白色沉淀用N2吹干后加乙腈重新溶解后备用，按权利要求2步骤（2）方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得洗手液中各脂肪醇的浓度，进而得出洗手液中各脂肪醇的含量。
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