CN116200366A - 具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株。包括Bst DNA聚合酶突变株Sso7d‑Bst、Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)和Bst DNA聚合酶突变株Sso7d‑Bst(I659E,E660G)；所述Bst DNA聚合酶突变株既能识别及合成天然DNA，又能识别、合成及反转录RNA以及2’‑F、2’‑OMe修饰核酸的Bst DNA聚合酶突变株。本发明提供的三种Bst DNA聚合酶突变株，与野生型相比能够既能高效转录RNA和2’‑OMe–RNA，又能够高效反转录2’‑OMe–RNA。
Description
技术领域
本发明属于酶分子改造领域，具体涉及Bst DNA聚合酶的突变株及其应用与编码突变体的基因。
背景技术
天然的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是所有生命遗传信息的载体。DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶，则是生命体中最为关键的酶，在遗传信息的储存，使用和传递过程中发挥着关键作用。非天然核酸(XNAs)是指具有非天然结构单元的DNA/RNA的类似物，其制备方法包括对天然核酸的骨架、糖环和碱基进行修饰。XNA近年来逐渐成为了遗传信息的新型载体，其开发促进了异种生物学领域的快速发展。
XNA当中，含有糖基修饰的XNA是一种研究比较深入的XNA，包括苏糖核酸(TNA)、己糖醇核酸(HNA)、d-糖三醇核酸(AtNA)、环己烯基核酸(CeNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯核酸(ANA)、2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2’-F-DNA和2’-OMe-DNA等。这些XNA有的可被各种天然聚合酶和工程聚合酶识别。部分XNA双链比DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链更加稳定，同时一些XNA对核酸酶也具有较高的抗性。因此，XNA在开发具有优良生理稳定性的核酸适配体和生物材料等应用中体现出了巨大的优势。
然而，由于较高的底物特异性，天然的聚合酶难以高效识别非天然核酸，因而遗传信息在DNA和XNA之间的传递，如XNA的转录和逆转录都难以实现。为了解决这一问题，研究人员通过定向进化、理性设计或半理性设计对核酸聚合酶进行设计和改造，使其能够识别并合成非天然核酸分子。比如，Holliger组进化获得了一系列Tgo聚合酶的突变株，其能够合成和反转录各种XNA，如HNA、TNA、FANA和ANA等。Chaput组获得的KOD聚合酶突变株RSGA对TNA底物的特异性显著增强。Romesberg组基于噬菌体展示技术对Taq DNA聚合酶的Stoffel片段进行了定向进化，获得了聚合酶突变株SFM4-3、SFM4-6和SFM4-9，其中SFM4-3不仅可以转录全2’-OMe修饰的非天然核酸，而且可以通过PCR扩增得到部分2’-OMe或2’-F修饰的核酸链。
嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)是DNA聚合酶A家族的一员，由于具有较强的热稳定性、链置换活性以及聚合酶活性，被广泛应用于各种等温扩增技术。其中，环介导等温扩增(LAMP)针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在Bst DNA聚合酶的作用下短时间内即可实现DNA的指数扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点，是一种功能强大且应用广泛的诊断方法，比如对SARS-CoV-2的检测；滚环扩增(RCA)以一小段环状寡核苷酸为模板，在Bst DNA聚合酶的作用下扩增产生一条长重复单链的DNA，目前也已经广泛应用于基因组学、蛋白组学、分子诊断、生物传感、药物研发等领域。开发能够识别XNA的Bst聚合酶突变株，将有望实现对于XNA的等温扩增及滚环扩增，从而大大拓展XNA的应用范围。
Sso7d来自于嗜热古生菌Sulfolobus solfataricus，是一种分子量只有7kDa的带正电荷的DNA结合蛋白，与DNA结合后可以增加DNA的负超螺旋,并且能够提高DNA的熔解温度。Sso7d可以作为拼接蛋白连接DNA和其他有机分子,也可以作为支架蛋白把多个蛋白连接为一个功能性的复合体并促进其互相作用。Sso7d和很多DNA聚合酶(比如Pfu)的融合可以极大地提高这些聚合酶的合成速度和连续性。
DNA聚合酶与核苷酸相互作用的位点包含了被称为空间栅的氨基酸残基。这些氨基酸残基的侧链在空间上阻断了核糖核苷酸的2’-OH基团，从而防止了核糖核苷酸在DNA中的错误插入。研究表明，对DNA聚合酶的空间栅氨基酸残基进行突变可以使DNA聚合酶能够合成RNA以及各种带有糖环修饰的核酸。例如，Stoffel片段的I614和E615位点靠近所结合核苷酸的糖基且这两个氨基酸位于O形螺旋的N端，这对于聚合酶与底物核苷酸的相互作用非常重要。这些功能特征表明，Stoffel片段中位于614和615位的氨基酸可能作为空间栅来限制在糖基2’位修饰的核苷酸的整合。Stoffel片段突变体SFM19(I614E,E615G)对2’位修饰较好的活性证明了用较小的氨基酸替换这些氨基酸可以扩大活性位点的空间，从而可以识别核糖核苷酸和2’位修饰的核苷酸。
Bst DNA聚合酶与Taq聚合酶同为DNA聚合酶A族的成员，其氨基酸序列具有一定的同源性。因此我们将Taq聚合酶突变株SFM4-3上的I614E、E615G位点同源移植到Bst DNA聚合酶中，同时在Bst突变株的N端融合Sso7d蛋白，希望能够开发能够高效转录XNA的Bst DNA聚合酶突变株。
发明内容
为了改造野生型Bst DNA聚合酶的底物特异性，使其能够识别、合成及反转录RNA以及2’-F-RNA等核酸，本发明的首要目的在于提供三个既能识别及合成天然DNA，又能识别、合成及反转录RNA以及2’-F、2’-OMe修饰核酸的Bst DNA聚合酶突变株。
本发明的另一个目的在于提供上述Bst DNA聚合酶突变株的基因序列及氨基酸序列。
本发明的再一个目的在于提供上述Bst DNA聚合酶突变株的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供了编码上述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst的基因，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了编码上述Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)的基因，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了编码上述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)的基因，其基因序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步的，上述Sso7d-Bst突变株是通过重叠延伸PCR技术在野生型Bst DNA基因中引入Sso7d序列获得的。
进一步的，上述Bst(I659E,E660G)突变株是将SFM-4-3聚合酶的突变位点I614E、E615G通过由重叠延伸PCR介导的定点突变的方法移植到Bst DNA聚合酶中获得的。
进一步的，上述Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株是将SFM-4-3聚合酶的突变位点I614E、E615G通过由重叠延伸PCR介导的定点突变的方法移植到Sso7d-Bst突变株中获得的。
进一步的，测定各Bst DNA聚合酶突变株以DNA为模板对RNA、2’-F-NTPs、2’-OMe-NTPs底物的转录活性。
与野生型Bst DNA聚合酶相比，本发明具有如下优点和有益效果：本发明提供的三种Bst DNA聚合酶突变株，与野生型相比能够既能高效转录RNA和2’-OMe–RNA，又能够高效反转录2’-OMe–RNA。
附图说明
图1是DNA、RNA、2’-F-RNA和2’-OMe-RNA的结构示意图。
图2是SF聚合酶、SFM4-3聚合酶、Bst DNA聚合酶以及突变株Bst(I659E,E660G)聚合酶氨基酸序列比对示意图。虚线标记的氨基酸为SF聚合酶第614、615位残基的原始氨基酸和Bst DNA聚合酶第659、660位残基的原始氨基酸。实线标记的氨基酸为SFM4-3聚合酶第614、615位残基的氨基酸和突变株Bst(I659E,E660G)第659、660位点突变后的氨基酸。
图3是Sso7d蛋白分别和Bst DNA聚合酶以及突变株Bst(I659E,E660G)聚合酶融合的示意图，由上至下分别是突变株Sso7d-Bst和突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)。
图4是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录RNA的活性测试结果以及在不含Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录RNA的活性测试结果。从左到右，泳道1、6为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板的RNA转录产物；泳道7-10依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在不含Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板的RNA转录产物。P：18nt引物；F：40nt全长产物。
图5是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录2’-F-RNA的活性测试结果以及在不含Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录2’-F-RNA的活性测试结果。从左到右，泳道1、6为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板的2’-F-RNA转录产物；泳道7-10依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在不含Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板的2’-F-RNA转录产物。P：18nt引物；F：40nt全长产物。
图6是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录2’-OMe-RNA的活性测试结果以及在不含Mn2+的反应缓冲液中以DNA为模板转录2’-OMe-RNA的活性测试结果。从左到右，泳道1、6为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mMMn2+的反应缓冲液中以DNA为模板的2’-OMe-RNA转录产物；泳道7-10依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株以DNA为模板的2’-OMe-RNA转录产物。P：18nt引物；F：40nt全长产物。
图7是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株以RNA为模板反转录DNA的活性测试结果。从左到右，泳道1为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以RNA为模板的DNA反转录产物。P：15nt引物；F：30nt全长产物。
图8是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株以2’-F-RNA为模板反转录DNA的活性测试结果。从左到右，泳道1为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以2’-F-RNA为模板的DNA反转录产物。P：15nt引物；F：30nt全长产物。
图9是野生型Bst DNA聚合酶及其各突变株以2’-OMe-RNA为模板反转录DNA的活性测试结果。从左到右，泳道1为对照；泳道2-5依次是野生型Bst DNA聚合酶、Bst(I659E,E660G)突变株、Sso7d-Bst突变株、Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株在含1mM Mn2+的反应缓冲液中以2’-OMe-RNA为模板的DNA反转录产物。P：18nt引物；F：30nt全长产物。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是以下若有未特别详细说明之处，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。
实施例1
采用
超保真DNA聚合酶，通过PCR扩增后，进行重叠延伸PCR获得融合Sso7d序列以及含有突变I659E、E660G的Bst DNA聚合酶基因。定点突变所用引物如下表所示。
定点突变所采用的PCR扩增体系及反应条件如下：DNA片段1：
DNA片段2：
DNA片段3：
DNA片段4：
DNA片段5：
DNA片段6：
PCR反应条件：
PCR反应结束后，使用天根超薄回收试剂盒回收DNA片段，回收后片段用于下一步重叠延伸PCR反应获得含有突变的Bst基因全长。
重叠延伸PCR所采用的扩增体系及反应条件如下：Sso7d-Bst基因全长：
Bst(I659E,E660G)基因全长：
Sso7d-Bst(I659E,E660G)基因全长：
重叠延伸PCR反应条件：
PCR反应结束后，使用天根超薄回收试剂盒回收DNA片段，回收后片段以及质粒pET30a用限制性内切酶XbaI和EcoRI进行酶切，置于下述反应体系中在37℃孵育过夜。
酶切反应体系如下：
酶切反应结束后，使用天根超薄回收试剂盒回收DNA片段。琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的载体，并用美基凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体。使用T4 DNA连接酶连接酶切后的DNA片段和载体片段，置于下述反应体系中16℃孵育过夜。
酶连反应体系如下：
酶连产物直接转化大肠杆菌DH5α。采用菌落PCR验证阳性转化子，提取质粒，进行测序。
本发明从重组菌DH5α/Sso7d-Bst、DH5α/Bst(I659E,E660G)、DH5α/Sso7d-Bst(I659E,E660G)提取测序正确的重组质粒pET30a-Sso7d-Bst、pET30a-Bst(I659E,E660G)、pET30a-Sso7d-Bst(I659E,E660G)、并将其转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中，得到重组表达菌株BL21(DE3)pLysS/Sso7d-Bst、BL21(DE3)pLysS/Bst(I659E,E660G)、BL21(DE3)pLysS/Sso7d-Bst(I659E,E660G)。
实施例2
挑取BL21(DE3)pLysS/pET30a-Sso7d-Bst、BL21(DE3)pLysS/pET30a-Bst(I659E,E660G)和
BL21(DE3)pLysS/pET30a-Sso7d-Bst(I659E,E660G)的单克隆分别于20mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素的2×YT培养基中，于37℃、220rpm条件下过夜培养。将过夜培养物转接至1L含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素的2×YT培养基中，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，37℃培养4-5h。4℃、6000rpm离心10min收集菌体后用buffer A(50mM Tris·HCl、150mM NaCl、5mM imidazole、pH 7.5)重悬，随后通过高压匀浆破碎菌体。4℃、10000rpm离心1h。将上清用0.22μm的水系滤膜除去细胞碎片，过滤后的上清液通过镍柱亲和层析纯化。纯化的一般步骤为：蛋白上清液与镍柱孵育30min，用含不同浓度咪唑的1×Elution buffer(50mM Tris·HCl、150mM NaCl、10-500mMimidazole、pH 7.5)将目的蛋白洗脱。得到的产物通过SDS-PAGE验证。使用50kDa的Amicon-Ultra进一步浓缩目的蛋白，最后加入等体积的100％甘油并置于-20℃保存。
实施例3
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对NTPs底物的转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)的RNA转录活性。
转录体系为：
用到的DNA序列为：
预先将模板T40和互补引物T60-FAM-R的混合物在95℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。转录条件为50℃，2h。转录结束后，把转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图4野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以DNA为模板转录RNA的活性测试，由图4可知突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)能够合成全长产物，具有良好的RNA转录活性。
实施例4
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对2’-F-NTPs底物的转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)的2’-F-RNA转录活性。
转录体系为：
用到的DNA序列为：
预先将模板T40和互补引物T60-FAM-R的混合物在95℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。转录条件为50℃，2h。转录结束后，把转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图5野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以DNA为模板转录2’-F-NTPs的活性测试，由图5可知突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)能够合成全长产物，具有良好的2’-F-RNA转录活性。
实施例5
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对2’-OMe-NTPs底物的转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)的2’-OMe-RNA转录活性。
转录体系为：
用到的DNA序列为：
预先将模板T40和互补引物T60-FAM-R的混合物在95℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。转录条件为50℃，4h。转录结束后，把转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(上海生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图6野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以DNA为模板转录2’-OMe-NTPs的活性测试，由图6可知突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)具有一定的2’-OMe-RNA转录活性。
实施例6
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对以RNA为模板的反转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以RNA为模板的反转录活性。
反转录体系为：
用到的寡核苷酸序列为：
预先将RNA模板和互补引物FAM-R-P的混合物在65℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。反转录条件为50℃，3h。反转录结束后，把反转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(上海生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图7野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以RNA为模板反转录DNA的活性测试，由图7可知突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)能够反转录出全长产物，具有良好的RNA到DNA的反转录活性。
实施例7
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对以2’-F-RNA为模板的反转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以2’-F-RNA为模板的反转录活性。
反转录体系为：
用到的寡核苷酸序列为：
预先将2’-F-RNA模板和互补引物FAM-F-P的混合物在95℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。反转录条件为50℃，1h。反转录结束后，把反转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(上海生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图8野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以2’-F-RNA为模板反转录DNA的活性测试，由图8可知突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)能够反转录出全长产物，具有良好的2’-F-RNA到DNA的反转录活性。
实施例8
聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)对以2’-OMe-RNA为模板的反转录活性测试研究。通过以下测试确定根据本发明的突变株Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以2’-OMe-RNA为模板的反转录活性。
反转录体系为：
用到的寡核苷酸序列为：
预先将2’-OMe-RNA模板和互补引物FAM-OMe-P的混合物在95℃下变性5min，缓慢降至室温，冰上孵育5min。然后把其余试剂补足。反转录条件为50℃，1h。反转录结束后，把反转录产物加入一倍体积的2×TBE-Urea上样缓冲液(上海生工：C506046-0005)，95℃变性10min，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证活性。电泳结束后，在535nm滤光片的蓝光下观察FAM荧光确定转录产物条带大小。结果见图9野生型Bst DNA聚合酶及其突变株Sso7d-Bst、Bst(I659E,E660G)、Sso7d-Bst(I659E,E660G)以2’-OMe-RNA为模板反转录DNA的活性测试，由图9可知突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)能够反转录出全长产物，具有良好的2’-OMe-RNA到DNA的反转录活性。
Claims (10)
1.具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，包括Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst、Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)和Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)；所述Bst DNA聚合酶突变株既能识别及合成天然DNA，又能识别、合成及反转录RNA以及2’-F、2’-OMe修饰核酸的Bst DNA聚合酶突变株。
2.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，编码所述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst的基因，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，编码所述Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)的基因，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，编码所述Bst DNA聚合酶突变株Sso7d-Bst(I659E,E660G)的基因，其基因序列如SEQ IDNO.6所示。
8.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Sso7d-Bst突变株是通过重叠延伸PCR技术在野生型Bst DNA基因中引入Sso7d序列获得的。
9.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Bst(I659E,E660G)突变株是将SFM-4-3聚合酶的突变位点I614E、E615G通过由重叠延伸PCR介导的定点突变的方法移植到Bst DNA聚合酶中获得的。
10.根据权利要求1所述具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株，其特征在于，所述Sso7d-Bst(I659E,E660G)突变株是将SFM-4-3聚合酶的突变位点I614E、E615G通过由重叠延伸PCR介导的定点突变的方法移植到Sso7d-Bst突变株中获得的。
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