CN116194579A - 单代靶向基因整合 - Google Patents

Abstract

本公开提供了使用例如两步、两阶段过程用于高频、靶向哺乳动物转基因的方法和组合物，其能够在单代中将大片段核酸整合到哺乳动物基因组的任何位置。

Description

单代靶向基因整合

政府许可权利

本发明是在美国国立卫生研究院授予的R21 OD027052项目的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。

相关申请

本申请根据美国35U.S.C.§119(e)要求于2020年8月7日提交的美国临时申请63/063,147号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

对通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表的引用

本申请包含通过EFS-WEB以ASCII格式提交的序列表，在此其通过全文引用并入本文。在2021年8月5日创建的所述ASCII拷贝被命名为J022770088WO00-SEQ-NTJ，并且大小为13,140字节。

背景技术

基因组工程变革持续推动通过向动物基因组中添加DNA的快速修饰，例如比以前更快地产生更精致复杂的突变小鼠品系。虽然小基因组修饰通过基于可编程核酸酶的系统正变得更简单和更有效地介导，但是使用同源重组来精确插入大的供体DNA仍然具有挑战性。例如，产生人源化小鼠需要整合基因的控制区以重演预期的表达模式和功能。目前使用随机和固有混乱的转基因的方法存在效率低、部分/不完全整合和多拷贝多联化的问题。此外，这种插入通常沉积在活性基因座中，导致对转基因表达的有害位置效应和无意中破坏的内源基因。因此，大的构建体转基因项目通常需要大量的表征时间和额外的繁殖轮数，从而增加了产生疾病动物模型所花费的成本和时间。

发明内容

在一些方面，本公开提供了有效的、靶向转基因技术，其能够在哺乳动物基因组中的任何地方整合大的核酸片段(例如，大于3kb)。有利地，例如，该技术可用于在任何遗传背景下快速地开发用于转基因表达的基因特异性时间(例如发育)和空间(例如细胞特异性)控制的模型系统。

本公开的一些方面提供了方法，其包括：(a)向受精卵递送包含第一整合酶附着位点的核酸；(b)培养所述受精卵以产生在胚胎的基因组中包含所述第一整合酶附着位点的多细胞胚胎；以及(c)向所述胚胎递送包含第二整合酶附着位点和编码目标产物的序列的核酸以产生包含第二整合酶附着位点的工程化胚胎。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向胚胎递送同源整合酶或编码同源整合酶的核酸。在其他实施方案中，编码同源整合酶的核酸被整合到受精卵的基因组中(例如，受精卵从一种或多种经工程化以在其基因组中编码同源整合酶的小鼠种系产生)。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将工程化胚胎(例如，两细胞阶段胚胎)植入能够生育后代哺乳动物的假孕雌性哺乳动物中

在一些实施方案中，向受精卵的递送是通过电穿孔。在其他实施方案中，向受精卵的递送是通过显微注射。在一些实施方案中，向胚胎的递送是通过显微注射。在其他实施方案中，向胚胎的递送是通过电穿孔。

在一些实施方案中，多细胞胚胎是两细胞胚胎。在一些实施方案中，两细胞胚胎的每个细胞被显微注射。

在一些实施方案中，所述整合酶是Bxb1。可以使用其他整合酶。

在一些实施方案中，(a)的第一整合酶附着位点是Bxb1 attP附着位点(或修饰形式)，并且(c)的第二整合酶附着位点是Bxb1 attB附着位点(或修饰形式)。在其他实施方案中，(a)的第一整合酶附着位点是Bxb1 attB附着位点，且(c)的第二整合酶附着位点是Bxb1attP附着位点。应当理解，术语“attP附着位点”包括SEQ ID NO:1的序列和该序列的修饰形式，如SEQ ID NO:2的序列。同样，术语“attB附着位点”包括SEQ ID NO:3的序列和该序列的修饰形式，如SEQ ID NO:4的序列。

在一些实施方案中，(b)的第一整合酶附着位点与目标基因的内源启动子可操作地连接。在一些实施方案中，(b)的第一整合酶附着位点在转录起始密码子的上游(5′)并与转录起始密码子同框。在其他实施方案中，(b)的第一整合酶附着位点在转录起始密码子的下游(3′)并与转录起始密码子同框。

在一些实施方案中，(a)的第一整合酶附着位点侧翼为与受精卵基因组中的核苷酸序列同源的核苷酸序列。

在一些实施方案中，(i)的核酸是无载体骨架的DNA微环。在一些实施方案中，(ii)的核酸是信使RNA(mRNA)。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受精卵递送可编程核酸酶。

在一些实施方案中，可编程核酸酶是RNA引导的核酸酶，和所述方法进一步包括向受精卵递送(i)RNA引导的核酸酶或编码RNA引导的核酸酶的核酸和(ii)靶向目标基因的指导RNA(gRNA)。

在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶和gRNA形成核糖核蛋白。

在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶是Cas9。在其他实施方案中，可编程核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。又在其它实施方案中，可编程核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。可以使用其他基因编辑系统。

在一些实施方案中，受精卵是哺乳动物受精卵。在一些实施方案中，受精卵是哺乳动物受精卵，其为非人受精卵(例如，商业食用动物，如牛、猪、绵羊、山羊或鸡)。在一些实施方案中，哺乳动物受精卵是啮齿动物受精卵。例如，啮齿动物受精卵可以是大鼠受精卵或小鼠受精卵。在一些实施方案中，小鼠受精卵是NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ

小鼠受精卵。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括繁殖由假孕雌性哺乳动物所生育的后代哺乳动物。

在一些实施方案中，啮齿动物受精卵是小鼠受精卵，和内源启动子是小鼠白蛋白启动子。在一些实施方案中，目标产物是人白蛋白。

在一些实施方案中，啮齿动物受精卵是小鼠受精卵，和内源启动子是小鼠宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(mAce2)启动子。在一些实施方案中，目标产物是人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(huACE2)。

SARS-CoV-2通过ACE2受体进入人体。S糖蛋白附接于宿主细胞上的ACE2受体，导致SARS-CoV-2与宿主细胞融合。融合后，存在于宿主细胞表面上的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)清除ACE2受体并激活受体连接的S糖蛋白，从而导致允许病毒进入宿主细胞的构象变化(Rabi等人Pathogens 2020；9:231)。因此，ACE2和TMPRSS2是病毒进入的主要决定因素。

在啮齿动物中，SARS-CoV-2不能有效地结合内源ACE2蛋白。因此，为了提供重演人类中的SARS-CoV-2感染的模型系统，在一些方面本公开提供了以工程化以表达人ACE2蛋白(huACE2)的转基因啮齿动物模型(例如小鼠模型)。

本公开的其他方面提供了通过前述方法中的任一种产生的后代哺乳动物，其中所述后代哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。

本公开的再其他方面提供了包含通过前述段落中任一的方法产生的工程化胚胎的啮齿动物。

本公开的再其他方面提供了一种方法，其包括向上述后代哺乳动物施用候选预防或治疗药剂。

在一些实施方案中，候选药剂是恢复期人血清、人疫苗或抗微生物剂，任选地抗菌剂和/或抗病毒剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用SARS-CoV-2感染小鼠。在一些实施方案中，所述方法进一步包括评估所述药剂预防SARS-CoV-2感染和/或COVID-19发生的功效。

在一些实施方案中，目标产物是可编程核酸酶。在一些实施方案中，目标产物是RNA引导的核酸酶。在一些实施方案中，目标产物是Cas9。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向胚胎递送靶向目标核苷酸序列的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，目标核苷酸序列是干扰素调节因子5(Irf5)基因。在一些实施方案中，目标产物是锌指核酸酶(ZFN)。在一些实施方案中，目标产物是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

在一些实施方案中，第一整合酶附着位点位于基因组的安全港基因座中。在一些实施方案中，安全港基因座是ROSA26基因座、AAVS1基因座、Hip11基因座、Hprt基因座或Tigre基因座。

附图说明

图1描述了用于哺乳动物中的遗传修饰的两步、两阶段过程。在受精卵阶段，使用Cas9介导的同源定向修复(HDR)，将Bxb1 attP位点插入CD68基因座中，邻近起始密码子(ATG)(A)。在两细胞阶段中，在同一胚胎中，使用Bxb1丝氨酸重组酶(整合酶)，整合含有Bxb1 attB位点的Cas9-EGFP(B)。含有正确整合的等位基因(B')用于人源化和人红细胞(RBC)存活研究。EP，电穿孔；RNP，核糖核蛋白；ssODN，单链供体寡核苷酸；MIJ，显微注射。

图2A-2C显示在CD68控制下小鼠中表达Cas9对于小鼠中基因组编辑的有效性。从ROSA26基因座中含有表达盒的小鼠获得腹腔巨噬细胞。该表达盒包含编码人CD68和Cas9的核酸序列，这两个核酸序列均可操作地连接于在巨噬细胞中有活性的CD68启动子。图2A显示用混杂的sgRNA(泳道1和2)或靶向Irf5中序列的两个sgRNA(泳道3和4)转染的巨噬细胞的Irf5基因座的PCR扩增子。泳道5和6是非模板对照。图2B显示了在sgRNA 1和sgRNA 2所示的两个位点处靶向切割后从基因组中删除的Irf5基因的丢失(DO)区。图2C显示了在图2A的泳道3中检测的扩增子的Sanger测序。sgRNA；单链指导RNA；bp，碱基对；kb，千碱基；DO，丢失。

具体实施方式

历史上，在小鼠中引入大的转基因已经通过胚胎干细胞操作或更常见地通过受精卵中的随机转基因，以及最近直接在受精卵中通过可编程核酸酶介导的(例如，CRISPR介导的，例如，Cas9介导的)HDR完成。靶向转基因通常依赖于使用供体转基因侧翼的广泛同源臂，从而导致甚至更大的载体尺寸。这种方法的使用在生产和处理中存在技术挑战，并且需要大量的下游工作以减轻任何非预期的后果。

此外，随着供体构建体变得大于～4kb，可编程核酸酶介导的HDR是非常低效的。替代的方法，“随机转基因”涉及将DNA构建体直接注射到受精卵中，希望它整合到基因组中并且是功能性的。然而，使用这种方法产生的动物(例如，哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠)模型常常受到位置效应的影响，例如，整合位点处的天然基因的破坏和异常的转基因表达水平。多拷贝多联体可导致大量过表达或具有散布在基因组上的多个插入，导致在繁殖期间转基因的分离，以及随后的表达变化和所需表型的不稳定性。此外，来自原核质粒骨架的元件的通常并存的包含可导致转基因沉默，从而使潜在哺乳动物模型的效用失效。

在一些方面，本公开提供了靶向转基因技术，其导致在单代后所需基因整合到选择的基因座中的转基因首建者，从而消除了对准备用于整合目标基因的中间代的需要。

单代靶向基因整合

本公开的一些方面提供了方法，其包括：(a)向受精卵递送包含第一附着位点(例如，Bxb1 attP或attB)的核酸构建体；(b)培养所述受精卵以产生在胚胎的基因组中包含所述第一整合酶附着位点的多细胞胚胎；以及(c)向所述胚胎递送(i)包含第二整合酶附着位点和编码目标产物(例如，蛋白质)的序列的核酸(例如，DNA)和(ii)同源整合酶(例如，Bxb1)或编码同源整合酶的核酸(例如，mRNA)以产生包含编码目标产物的序列的工程化胚胎。

单细胞阶段递送

本文所述方法的一个步骤包括向受精卵(例如，通过电穿孔)递送包含整合酶附着位点的核酸，其通过可编程核酸酶介导整合到从受精卵发育的胚胎的基因组中。本文别处描述了促进核酸的基因组整合的方法。

受精卵，也称为受精的卵母细胞，是单细胞胚胎，其包含由两个单倍体配子融合形成的二倍体细胞。在一些实施方案中，受精卵是哺乳动物受精卵。在一些实施方案中，受精卵是非人受精卵(例如，商业食用动物，如奶牛、绵羊、猪、山羊、鸡等)。在一些实施方案中，哺乳动物受精卵是啮齿动物受精卵。例如，啮齿动物受精卵可以是大鼠受精卵或小鼠受精卵。尽管本文主要描述了小鼠受精卵，但应理解本公开的方法可用于产生任何转基因动物。

在一些实施方案中，小鼠受精卵是NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ

小鼠受精卵。可以使用的小鼠品系的其他非限制性示例包括NOD-Rag1^null、IL2rg^null(NRG)和NOD-Shi^scidIl2rgγ^null(NOG)、C57BL/6J,C57BL/6NJ(5304)、FVB/NJ(1800)、BALB/cJ、BALB/cByJ、B6D2(C57BL/6x DBA/2J)、A/J(The Jackson Lab原种号000646)、129S1/SvImJ(TheJackson Lab原种号002448)、NOD/ShiLtJ(The Jackson Lab原种号001976)、NZO/HiLtJ(The Jackson Lab原种号002105)、CAST/EiJ(The Jackson Lab原种号000928)、PWK/PhJ(The Jackson Lab原种号003715)、WSB/EiJ(The Jackson Lab原种号001145)、DBA2(TheJackson Lab原种号000671)和Collaborative Cross(CC)品系。本文考虑了其他品系。

在整合酶附着位点递送后，可以培养受精卵以产生多细胞胚胎。在合适的条件下培养受精卵使受精卵能够进行细胞分裂以产生多细胞胚胎。如果核酸(例如，DNA)整合发生在第一次核分裂之前，胚胎的细胞将(在基因组中)携带整合酶附着位点。如果整合随后发生，例如，在两细胞阶段，动物将是镶嵌体，在其一些细胞中携带该附着位点。植入前培养胚胎的条件是已知的。参见，例如，Gardner DK&Lane M Mouse Molecular Embryology(2013)pp 167-182；和Tung E.W.Y.,Winn L.M.(2019)Mouse Whole Embryo Culture.在HansenJ.,Winn L.(编辑)Developmental Toxicology.Methods in Molecular Biology,vol1965.Humana,New York,NY中。

在一些实施方案中，多细胞胚胎是卵裂球。在一些实施方案中，多细胞胚胎包含通过原始受精卵的重复细胞分裂形成的2、4、8或16个细胞。

多细胞阶段递送

本文所述方法的另一个步骤包括向多细胞胚胎(在其基因组中现在包含第一整合酶附着位点)递送(例如，通过显微注射)(i)包含第二整合酶附着位点和编码目标产物的序列的核酸，和(ii)同源核酸酶或编码同源整合酶的核酸。这些核酸的递送和随后编码的整合酶的表达和活性导致编码目标产物的序列在单细胞阶段递送的整合酶附着位点处整合。例如，在同一胚胎上进行的该两步/两阶段递送过程否定了在递送目标蛋白质编码序列之前建立首建系的需要。

在该方法的该步骤之后，可以将胚胎植入能够生成为后代哺乳动物的假孕雌性哺乳动物中。假孕描述了假怀孕，由此表现出妊娠的所有体征和症状，除了受精卵的存在。小鼠在其中雌性与不育雄性交配繁殖，导致不育交配的发情期后变成假孕的。

基于整合酶的基因重排

在本文提供的方法的单细胞阶段递送整合酶附着位点。整合酶是催化核酸(例如，DNA)链在特定点(本文称为附着位点)处断裂和重接合，从而精确重排核酸的酶。整合酶属于位点特异性重组酶的两个大家族之一，其根据攻击特异性DNA磷酸二酯以切割链的亲核活性位点氨基酸残基，称为丝氨酸重组酶和酪氨酸重组酶。

在一些实施方案中，整合酶是Bxb1，它是由Bxb1分枝杆菌噬菌体编码的丝氨酸重组酶。该丝氨酸重组酶可用于将任何人、小鼠(或任何其他物种)或合成构建体引入哺乳动物基因组。实际上，Bxb1整合酶发挥功能以在溶菌阶段中在噬菌体(“attP”)和其细菌宿主(“attB”)的独特附着位点之间进行DNA链交换。每个附着位点的长度短于50个核苷酸碱基对(bp)，这对于用于分子克隆以及使用例如基因编辑技术插入宿主基因组是理想的。Bxb1整合酶在真核细胞中起作用并且不需要任何另外的宿主因子来起作用。此外，已经显示其在细胞中以高效率发挥功能，是单向的并且在小鼠基因组中没有可检测的假位点(pseudosite)。Bxb1系统也使其适宜于增强，因为附着位点中的两个中心二核苷酸单独地负责重组事件的特异性。这些组合属性使得该系统可用于直接修饰哺乳动物(例如，小鼠)受精卵。

虽然本公开主要集中于Bxb1整合酶，但是应当理解，可以使用其他特异位点重组酶和附着位点。在一些实施方案中，使用不同的丝氨酸重组酶，例如γ-δ解离酶、Tn3解离酶、

整合酶或R4整合酶。在一些实施方案中，使用酪氨酸重组酶，例如Cre重组酶或FLP重组酶。进一步的实施方案利用设计用于靶向新位点的定制的或合成的整合酶。

尽管Bxb1整合酶附着DNA位点相对较小(<50bp)，但该反应对这些位点具有高度选择性并且也具有强方向性(参见，例如，Singh A等人PLoS Genetics 2013；9(5):e1003490)。Bxb1 attB位点显示至少7个独特的和特异性的最佳变异，加上内部二核苷酸识别序列中的另外9个亚最佳变异，从而允许相同的Bxb1重组酶同时使用一系列的不同构建体，每个构建体具有其特异性的二核苷酸地址(参见，例如，Ghosh P等人J.Mol Biol.2006；349:331-348)。因此，本文预期使用Bxb1 attP位点和修饰的attP*位点(例如，相对于SEQID NO:1的序列修饰的)，以及使用Bxb1 attB位点和修饰的attB*位点(例如，相对于SEQ IDNO:3的序列修饰的)。

应当理解，除非另有说明，引入到宿主动物基因组的Bxb1附着位点(“基因组附着位点”)可以是Bxb1 attP位点、修饰的Bxb1 attP位点、Bxb1 attB位点、修饰的Bxb1 attB位点或其任意组合。待插入Bxb1附着位点中的相应供体多核苷酸应包括另外的一个或多个Bxb1附着位点。因此，如果基因组中的Bxb1附着位点是Bxb1 attP位点，则待插入基因组Bxb1附着位点中的相应多核苷酸(例如，环状供体DNA)应包括Bxb1 attB位点；且如果基因组中的Bxb1附着位点是Bxb1 attB位点，待插入基因组Bxb1附着位点中的相应多核苷酸应包括Bxb1 attP位点。

在一些实施方案中，单一Bxb1附着位点引入胚胎的基因组基因座中。例如，Bxb1附着位点可选自attP附着位点、修饰的attP*附着位点、attB附着位点和修饰的attB*附着位点。

在其他实施方案中，将两个(至少两个)Bxb1附着位点引入胚胎的基因组基因座中，其在本文中可称为第一Bxb1附着位点和第二Bxb1附着位点。在一些实施方案中，第一和第二Bxb1附着位点选自attP附着位点、修饰的attP*附着位点、attB附着位点和修饰的attB*附着位点。第一和第二Bxb1附着位点可以彼此相邻(没有插入核苷酸序列)，或者它们可以通过一定数量核苷酸彼此分隔。分隔两个Bxb1附着位点的核苷酸的数量可以变化，条件是在一些实施方案中，每个Bxb1附着位点在相同的靶基因座内(例如，在CD68基因座内)。因此，在一些实施方案中，任何两个(例如，第一和第二)Bxb1附着位点彼此分开至少1、至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000个核苷酸碱基对(bp)。在一些实施方案中，任何两个(例如，第一和第二)Bxb1附着位点彼此分开1至500bp、1至1000bp、1至1500bp、1至2000bp、1至2500bp或1至3000个核苷酸碱基对(bp)。例如，任何两个Bxb1附着位点可以彼此分开1至450bp、1至400bp、1至350bp、1至300bp、1至250bp、1至200bp、1至150bp、1至100bp、1至50bp、5至450bp、5至400bp、5至350bp、5至300bp、5至250bp、5至200bp、5至150bp、5至100bp、5至50bp、10至450bp、10至400bp、10至350bp、10至300bp、10至250bp、10至200bp、10至150bp、10至100bp、10至50bp、50至450bp、50至400bp、50至350bp、50至300bp、50至250bp、50至200bp、50至150bp、50至100bp、100至450bp、100至400bp、100至350bp、100至300bp、100至250bp、100至200bp或100至150bp。

在一些实施方案中，Bxb1附着位点位于内源基因的起始密码子(ATG)内或附近。例如，内源基因的正常转录调控元件可以通过在基因的起始密码子附近包括Bxb1附着位点，然后整合目标基因(通过Bxb1整合酶)以使得目标基因的转录在内源基因的转录调控元件的控制下来“阻截”。以这种方式，在一些实施方案中，整合酶附着位点可操作地与目标基因的内源启动子连接。在一些实施方案中，整合酶附着位点在转录起始密码子的上游(5′)并与转录起始密码子同框。

在一些实施方案中，整合酶附着位点位于转录起始密码子的下游并与转录起始密码子同框，目标是产生杂合蛋白，例如以提高稳定性。

这种基因阻截允许根据内源启动子活性的位置和时间对基因表达进行空间和时间控制。有利地，可以靶向任何细胞类型。细胞类型的非限制性示例包括干细胞、红细胞、白细胞、血小板、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、皮肤细胞、内皮细胞、上皮细胞和脂肪细胞。

外源启动子也可用于驱动产物(例如，目标蛋白质)的表达。

在一些实施方案中，Bxb1附着位点位于安全港基因座中，其是基因组的开放染色质区域。基因组安全港(GSH)是基因组中能够容纳新遗传物质的整合的位点，其方式确保新插入的遗传元件：(i)可预测地发挥功能和(ii)不引起宿主基因组的改变而对宿主细胞或生物体造成风险(参见，例如，Papapetrou EP和Schambach A Mol Ther2016；24(4):678-684).

可如本文提供使用的安全港基因座的非限制性示例包括AAVS1基因座、ROSA26基因座、Hip11基因座、Hprt基因座和Tigre基因座。可以如本文提供的使用其他安全港基因座。

在一些实施方案中，整合酶附着位点侧翼是与受精卵基因组中的核苷酸序列同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与受精卵基因组中的目标基因同源。在一些实施方案中，目标基因是作为在特定细胞类型中表达的基因的基因。在一些实施方案中，目标基因是CD68。

一个同源臂位于整合酶位点的左侧(5′)(左侧同源臂)，和另一个同源臂位于整合酶位点的右侧(3′)(右侧同源臂)。同源臂是与位于基因组(例如，CD68)基因座中的基因组DNA的区域同源的ssDNA的区域。这些同源臂使得ssDNA供体和基因组基因座之间能够同源重组，从而导致Bxb1附着位点插入到基因组基因座中，如下所述(例如，通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(HDR))。

同源臂的长度可以变化。例如，每个同源臂(左臂和右同源臂)可以具有20个核苷酸碱基至1000个核苷酸碱基的长度。在一些实施方案中，每个同源臂具有20至200、20至300、20至400、20至500、20至600、20至700、20至800或20至900个核苷酸碱基的长度。在一些实施方案中，每个同源臂具有20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个核苷酸碱基的长度。在一些实施方案中，一个同源臂的长度不同于另一个同源臂的长度。例如，一个同源臂可以具有20个核苷酸碱基的长度，且另一个同源臂可以具有50个核苷酸碱基的长度。在一些实施方案中，供体DNA是单链的。在一些实施方案中，供体DNA是双链的。在一些实施方案中，例如通过硫代磷酸化修饰供体DNA。也可以进行其他修饰。

包含Bxb1附着位点(例如，着陆垫)的核酸的浓度可以变化。在一些实施方案中，浓度为500ng/μl至5000ng/μl或500ng/μl至3000ng/μl。例如，浓度可以是500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或3500、500ng/μl至5000ng/μl。

编码Bxb1整合酶(或另一整合酶)的核酸(例如，mRNA)的浓度可以变化。在一些实施方案中，浓度为50ng/μl至500ng/μl或50ng/μl至200ng/μl。例如，浓度可以是50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/μl。

在一些实施方案中，2至100ng/ul浓度的Bxb1蛋白与或不与编码Bxb1的mRNA一起递送(例如，同时地或连续地)。

工程化核酸、递送方法和整合方法

在一些实施方案中，本文提供的核酸是工程化的。工程化核酸是不天然存在的核酸(例如，共价连接在一起的至少两个核苷酸，并且在一些情况下，包含磷酸二酯键，称为磷酸二酯主链)。工程化核酸包括重组核酸和合成核酸。重组核酸是通过接合来自两种不同生物体(例如，人和小鼠)的核酸(例如，分离的核酸、合成的核酸或其组合)而构建的分子。合成的核酸是经过扩增的或化学地或通过其他方式合成的分子。合成的核酸包括化学修饰的或以其他方式修饰的，但可以与天然存在的核酸分子碱基配对(结合)的那些核酸。重组和合成的核酸还包括由上述任一种的复制得到的那些分子。

工程化核酸可以包含DNA(例如，基因组DNA、cDNA或基因组DNA与cDNA的组合)、RNA或杂合分子，例如，其中核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合(例如，人工的或天然的)，以及两种或更多种碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的任何组合。

在一些实施方案中，核酸是互补DNA(cDNA)。cDNA在由逆转录酶催化的反应中由单链RNA(例如，信使RNA(mRNA)或microRNA(miRNA))模板合成。

本公开的工程化核酸可以使用标准分子生物学方法(参见，例如，Green andSambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring Harbor Press)来产生。在一些实施方案中，使用GIBSON

克隆产生核酸(参见，例如，Gibson,D.G等人Nature Methods,343-345,2009；和Gibson,D.G.等人Nature Methods,901-903,2010，其各自通过引用并入本文)。GIBSON/>

通常在单管反应中使用三种酶活性：5'核酸外切酶，DNA聚合酶的3'延伸活性和DNA连接酶活性。5'核酸外切酶活性咬掉5'末端序列并暴露互补序列用于退火。然后聚合酶活性填充退火结构域上的空隙。然后DNA连接酶封闭缺口并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比在GoldenGate Assembly中使用的重叠序列长得多，因此导致更高的正确组装百分比。根据本公开可以使用产生工程化核酸的其他方法。

基因是独特的核苷酸序列，其顺序决定多核苷酸或多肽中单体的顺序。基因通常编码蛋白质。基因可以是内源的(天然存在于宿主生物体中)或外源的(天然地或通过基因工程转移至宿主生物体)。等位基因是通过突变产生的基因的两种或更多种可选形式之一，并且发现于染色体上的相同基因座处。在一些实施方案中，基因包括启动子序列、编码区(例如，外显子)、非编码区(例如，内含子)和调控区(也称为调控序列)。

启动子是RNA聚合酶与其结合以起始转录的核苷酸序列(例如，ATG)。启动子通常直接位于转录起始位点的上游(其5'端)。在一些实施方案中，启动子是内源启动子。内源启动子是在该宿主动物中天然存在的启动子。

开放阅读框是以起始密码子(例如，ATG)开始，以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并且编码多肽(例如，蛋白质)的连续密码子延伸段。如果启动子调节开放阅读框的转录，则开放阅读框与该启动子可操作地连接。

外显子是编码氨基酸的基因区域。内含子(和其他非编码DNA)是不编码氨基酸的基因区域。

在一些实施方案中，编码目标产物的核苷酸序列具有200个碱基对(bp)至100千碱基(kb)的长度。在一些实施方案中，核苷酸序列具有至少10kb的长度。例如，核苷酸序列可以具有至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb或至少35kb的长度。在一些实施方案中，核苷酸序列具有10至100kb、10至75kb、10至50kb、10至30kb、20至100kb、20至75kb、20至50kb、20至30kb、30至100kb、30至75kb或30至50kb的长度。

本文提供的任一种核酸可以具有200bp至500kb、200bp至250kb或200bp至100kb的长度。在一些实施方案中，核酸具有至少10kb的长度。例如，核酸可以具有至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少50kb、至少100kb、至少200kb、至少300kb、至少400kb或至少500kb的长度。在一些实施方案中，供体多核苷酸具有10至500kb、20至400kb、10至300kb、10至200kb或10至100kb的长度。在一些实施方案中，核酸具有10至100kb、10至75kb、10至50kb、10至30kb、20至100kb、20至75kb、20至50kb、20至30kb、30至100kb、30至75kb或30至50kb的长度。核酸多核苷酸可以是环状或线性的。

编码目标产物的核酸(例如，DNA微环)的浓度可以变化。在一些实施方案中，浓度为10ng/μl至1000ng/μl或10ng/μl至100ng/μl。例如，浓度可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng/μl。

用于核酸递送的载体包括微环、质粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体。然而，应当理解可能不需要载体。例如，可以没有其载体骨架的情况下将环化的或线性化的核酸递送至胚胎。例如，载体骨架较小(～4kb)，而待环化的供体DNA可在>100bp至50kb的范围内。

在一些实施方案中，DNA微环是已经从所有原核载体部分释放的质粒衍生物(例如，不再含有包含抗生素抗性标记和/或细菌复制起点的细菌质粒骨架)。产生DNA微环的方法是本领域公知的。例如，包含细菌骨架和真核插入片段(包括待表达的转基因)的亲本质粒可以在表达位点特异性重组酶蛋白的特化大肠杆菌菌株中产生。重组位点侧接亲本质粒中的真核插入片段，使得当重组酶蛋白(非Bxb1)的活性通过如但不限于阿拉伯糖诱导、葡萄糖诱导等方法诱导时，从真核插入片段切除细菌骨架，从而产生真核DNA微环和细菌质粒。

用于将核酸递送至啮齿动物胚胎以产生转基因啮齿动物的方法包括但不限于电穿孔(参见，例如，Wang W等人J Genet Genomics2016；43(5):319-27；WO 2016/054032；和WO 2017/124086，其各自通过引用并入本文)、DNA显微注射(参见，例如，Gordon和Ruddle,Science 1981:214:1244-124，通过引用并入本文)、胚胎干细胞介导的基因转移(参见，例如，Gossler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1986；83:9065-9069，通过引用并入本文)和逆转录病毒介导的基因转移(参见，例如，Jaenisch,Proc.Natl.Acad.Sci.1976；73:1260-1264，通过引用并入本文)，可以如本文提供的使用其中的任何一种。

例如，可以使用任何合适的方法将工程化的核酸(如指导RNA、供体多核苷酸和其他核酸编码序列)引入到胚胎的基因组。本申请考虑使用多种基因编辑技术，例如，以将核酸引入胚胎的基因组中而产生转基因啮齿动物。非限制性示例包括基于可编程核酸酶的系统，如成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)系统、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。参见，例如，Carroll DGenetics.2011；188(4):773-782；Joung JK等人Nat Rev Mol Cell Biol.2013；14(1):49-55；和Gaj T等人Trends Biotechnol.2013Jul；31(7):397-405，其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，CRISPR系统用于编辑本文提供的啮齿动物(例如，小鼠)胚胎的基因组。参见，例如，Harms DW等人,Curr Protoc Hum Genet.2014；83:15.7.1-15.7.27；和Inui M等人,Sci Rep.2014；4:5396，其各自通过引用并入本文)。例如，可以将Cas9 mRNA或蛋白质和一种或多种指导RNA(gRNA)直接递送(例如，注射或电穿孔)到处于单细胞(受精卵)阶段的啮齿动物胚胎中以促进同源定向修复(HDR)而将工程化核酸引入基因组中。

CRISPR/Cas系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被改造为用于基因编辑的RNA指导的DNA靶向平台。工程化CRISPR系统含有两个主要成分：指导RNA(gRNA)和CRISPR相关核酸内切酶(例如，Cas蛋白)。gRNA是由用于核酸酶结合的支架序列和限定待修饰的基因组靶标(例如，基因)的用户定义的核苷酸间隔区(例如，～15-25个核苷酸，或～20个核苷酸)组成的短合成RNA。因此，可以通过简单地改变gRNA中存在的靶序列来改变Cas蛋白的基因组靶标。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶来自酿脓链球菌(NGG PAM)或金黄色葡萄球菌(NNGRRT或NNGRR(N)PAM)，尽管可以如在本文提供的使用其他Cas9同源物、直系同源物和/或变体(例如，Cas9的进化形式)。可以如本文提供使用的RNA引导核酸酶的另外的非限制性示例包括Cpf1(TTN PAM)；SpCas9 D1135E变体(NGG(降低的NAG结合)PAM)；SpCas9VRER变体(NGCG PAM)；SpCas9 EQR变体(NGAG PAM)；SpCas9 VQR变体(NGAN或NGNG PAM)；脑膜炎奈瑟氏菌(NM)Cas9(NNNNGATT PAM)；嗜热链球菌(ST)Cas9(NNAGAAW PAM)；和齿垢密螺旋体(TD)Cas9(NAAAAC)。在一些实施方案中，CRISPR相关核酸内切酶选自Cas9、Cpf1、C2c1和C2c3。在一些实施方案中，Cas核酸酶是Cas9。

指导RNA至少包含与靶标核酸序列杂交(结合)的间隔区序列和结合核酸内切酶并将核酸内切酶引导至靶标核酸序列的CRISPR重复序列。如本领域普通技术人员所理解的，每种gRNA被设计成包括与其基因组靶序列互补的间隔区序列。参见，例如，Jinek等人,Science,2012；337:816-821和Deltcheva等人,Nature,2100；471:602-607，其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在递送至胚胎之前，RNA引导的核酸酶和gRNA复合以形成核糖核蛋白(RNP)。

RNA引导的核酸酶或编码RNA引导的核酸酶的核酸的浓度可以变化。在一些实施方案中，浓度为100ng/μl至1000ng/μl。例如，浓度可以是100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/μl。在一些实施方案中，浓度为100ng/μl至500ng/μl或200ng/μl至500ng/μl。

gRNA的浓度也可以变化。在一些实施方案中，浓度为200ng/μl至2000ng/μl。例如，浓度可以是200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1700、1900或2000ng/μl。在一些实施方案中，浓度为500ng/μl至1000ng/μl。在一些实施方案中，浓度为100ng/μl至1000ng/μl。例如，浓度可以是100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/μl。

在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶或编码RNA引导的核酸酶的核酸的浓度与gRNA的浓度的比率为2：1。在其他实施方案中，RNA引导的核酸酶或编码RNA引导的核酸酶的核酸的浓度与gRNA的浓度的比率为1：1。

在一些实施方案中，目标产物是可编程核酸酶。可编程核酸酶(如本文所述的CRISPR/Cas核酸酶、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)中的任一种)，当从细胞的基因组表达时，可用于编辑基因组中的另一个位点。在一些实施方案中，目标产物是RNA引导的核酸酶。示例性的RNA引导的核酸酶包括Cas9、Cpf1、C2c1和C2c3。在一些实施方案中，目标产物是Cas9。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向胚胎递送靶向目标核苷酸序列的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，目标核苷酸序列是干扰素调节因子5(Irf5)基因。在一些实施方案中，目标产物是锌指核酸酶(ZFN)。在一些实施方案中，目标产物是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

实施例

实施例1.

该实施例描述了两步、两阶段基因组修饰策略，以在单代中产生从内源启动子表达重组蛋白的小鼠品系。

(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)小鼠中的CD68基因座用作实例。该基因座用编码Cas9-EGFP的序列“阻截”以提供组织特异性方式的表达，其在活的转基因小鼠中由小鼠CD68启动子指导。这通过以下的顺序添加完成：首先，通过电穿孔将包含Bxb1 attP附着位点的核酸(也称为着陆垫)递送至小鼠受精卵(单细胞阶段)；其次，在两细胞阶段通过显微注射将编码Bxb1整合酶的核酸和包含Bxb1 attB位点和编码Cas9-EGFP的序列的核酸递送至相同胚胎。

在第一(1)天，将来自

小鼠品系的受精卵母细胞电穿孔(EP)以使用Cas9-引导复合物将着陆垫(Bxb1-attP_GA)(SEQ ID NO:5)插入11号染色体上的CD68基因座中，以促进寡核苷酸介导的同源定向修复(HDR)。为了形成Cas9-引导复合物，将酿脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白(417ng/μl)与靶向CD68的指导RNA(gRNA)(SEQ ID NO:6)(864ng/μl)和具有～50bp同源臂侧翼的～50bp attP位点的～150碱基对(bp)供体寡核苷酸(2097ng/μl)在37℃下孵育15分钟，然后置于冰上(4℃)。然后使用本领域已知的标准方法将胚胎培养过夜(例如，在油(Parrafin)下的COOK RCVL微滴中培养过夜；在培养箱中在37℃，5/5/90(5％CO₂/5％O₂/90％N₂；任何合适的培养基(例如，KSOM+AA)可以替代COOK RCVL)。

在第二(2)天，将Bxb1 mRNA(100ng/μl)、制备为微环的供体DNA(30ng/μl)和RNAsin(0.2U/μl)在TE(10mM Tris/0.1mM EDTA/pH7.5)中组合，并显微注射到两种细胞的细胞核中。供体DNA制备为含有相应的Bxb1-attB_GA位点、

标记的Cas9-EGFP编码序列(由2A肽分开)，随后是土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素聚腺苷酸化信号的6,061bp的微环。

然后将显微注射的胚胎转移到假孕雌性并进行足月分娩。断奶时，从后代获取尾部组织活检并通过PCR和Sanger测序进行基因分型。测序结果显示15只小鼠中7只(47％)具有正确插入CD68基因座中的attP位点，和15只小鼠中2只(13％)具有正确整合在CD68基因座处的所需Cas9-EGFP构建体。然后阳性首建候选者繁殖以建立新的遗传工程小鼠品系。

接下来，包含可操作地连接至(i)编码人CD68的核酸序列；和(ii)编码Cas9的核酸序列的小鼠CD68启动子的表达盒插入小鼠染色体6的ROSA26基因座中。分离腹腔巨噬细胞，然后用靶向小鼠Irf5基因座的两种sgRNA中的一种，或含有Irf5基因座靶向sgRNA的核苷酸序列的随机重排的两种混杂的sgRNA转染。第一Irf5基因座靶向的sgRNA含有序列CGAGGCAUGGUCCCAGCC(SEQ ID NO:7)，和第二Irf5基因座靶向的sgRNA含有序列UUGCAGCCCGGUUGCUGC(SEQ ID NO:8)。用这些sgRNA中的任一种转染，而不是用混杂的sgRNA中的任一种转染，导致产生在Irf5基因座中的基因丢失事件(图2A)。在由这些sgRNA中的任一个靶向的序列处切割Irf5基因座后，由于在DNA修复期间插入或缺失一个或多个碱基，非同源末端连接(NHEJ)导致基因丢失事件。该基因丢失事件的位置如图2B所示。Irf5基因座的Sanger测序证实了这一丢失事件，如含有靶向的区域的扩增子的异质性所证明的，从而表明在靶向的序列中存在多种不同的插入和缺失(图2C)。这些结果表明，从插入安全港基因座(如小鼠染色体6上的ROSA26基因座)中的核酸序列的Cas9表达允许小鼠中的靶向切割，并且因此通过同源定向修复(HDR)的基因组编辑。

实施例2.

在该实施例中，小鼠宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(mAce2)基因(例如，SEQ IDNO:9)用编码人ACE2(huACE2)的开放阅读框(例如，SEQ ID NO:10或11)“阻截”。这是通过以下顺序添加完成的：首先，通过电穿孔将包含Bxb1 attP附着位点的核酸递送至小鼠受精卵(单细胞阶段)；其次，在两细胞阶段通过显微注射将编码Bxb1整合酶的核酸和包含Bxb1attB位点和编码huACE2的序列的核酸递送至相同胚胎，如实施例1中所述。

然后将显微注射的胚胎转移到假孕雌性并进行足月分娩。断奶时，从后代获取尾部组织活检并通过PCR和Sanger测序进行基因分型。然后阳性首建候选者繁殖以建立新的遗传工程小鼠品系。

实施例3.

在该实施例中，小鼠白蛋白基因用编码人白蛋白的开放阅读框“阻截”。如实施例1所述，这是通过以下顺序添加完成的：首先，通过电穿孔将包含Bxb1 attP附着位点的核酸递送至小鼠受精卵(单细胞阶段)；其次，在两细胞阶段通过显微注射将编码Bxb1整合酶的核酸和包含Bxb1 attB位点和编码人白蛋白的序列的核酸递送到相同胚胎。

然后将显微注射的胚胎转移到假孕雌性并进行足月分娩。断奶时，从后代获取尾部组织活检并通过PCR和Sanger测序进行基因分型。然后阳性首建候选者繁殖以建立新的遗传工程小鼠品系。

序列

Bxb1 attP位点

GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACC(SEQ ID NO:1)

Bxb1 attP*位点

GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGACTCAGTGGTGTACGGTACAAACC(SEQ ID NO:2)

Bxb1 attB位点

GGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCAT(SEQ ID NO:3)

Bxb1 attB*位点

GGCTTGTCGACGACGGCGGACTCCGTCGTCAGGATCAT(SEQ ID NO:4)。

Bxb1供体寡聚核苷酸(实施例1)

G*A*TTGAGGAAGGAACTGGTGTAGCCTAGCTGGTCTGAGCATCTCTGCCATGCGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGACTCAGTGGTGTACGGTACAAACCGGCTCCCTGTGTGTCTGATCTTGCTAGGACCGCTTATAGGTAAGGAGA*A*A(SEQ ID NO:5)

*硫代磷酸酯修饰

CD68 gRNA靶标

GACACACAGGGAGCCGCATGG(SEQ ID NO:6)

Irf5 gRNA 1

CGAGGCAUGGUCCCAGCC(SEQ ID NO:7)

Irf5 gRNA 2

UUGCAGCCCGGUUGCUGC(SEQ ID NO:8)

小鼠Ace2外显子2-人ACE插入的位点加下划线

TGCCCAACCCAAGTTCAAAGGCTGATGAGAGAGAAAAACTCATGAAGAGATTTTACTCTAGGGAAAGTTGCTCAGTGGATGGGATCTTGGCGCACGGGGAAAGATGTCCAGCTCCTCCTGGCTCCTTCTCAGCCTTGTTGCTGT TACTACTGCTCAGTCCCTCACCGAGGAAAATGCCAAGACATTTTTAAACAACTTTAATCAGGAAGCTGAAGACCTG TCTTATCAAAGTTCACTTGCTTCTTGGAATTATAATACTAACATTACTGAAGAAAATGCCCAAAAGATG(SEQ IDNO:9)

HuACE2 CDS+

TAG CDS(2442bp)

ATGGCAAGCTCTTCCTGGCTCCTTCTCAGCCTTGTTGCTGTAACTGCTGCTCAGTCCACCATTGAGGAACAGGCCAAGACATTTTTGGACAAGTTTAACCACGAAGCCGAAGACCTGTTCTATCAAAGTTCACTTGCTTCTTGGAATTATAACACCAATATTACTGAAGAGAATGTCCAAAACATGAATAATGCTGGGGACAAATGGTCTGCCTTTTTAAAGGAACAGTCCACACTTGCCCAAATGTATCCACTACAAGAAATTCAGAATCTCACAGTCAAGCTTCAGCTGCAGGCTCTTCAGCAAAATGGGTCTTCAGTGCTCTCAGAAGACAAGAGCAAACGGTTGAACACAATTCTAAATACAATGAGCACCATCTACAGTACTGGAAAAGTTTGTAACCCAGATAATCCACAAGAATGCTTATTACTTGAACCAGGTTTGAATGAAATAATGGCAAACAGTTTAGACTACAATGAGAGGCTCTGGGCTTGGGAAAGCTGGAGATCTGAGGTCGGCAAGCAGCTGAGGCCATTATATGAAGAGTATGTGGTCTTGAAAAATGAGATGGCAAGAGCAAATCATTATGAGGACTATGGGGATTATTGGAGAGGAGACTATGAAGTAAATGGGGTAGATGGCTATGACTACAGCCGCGGCCAGTTGATTGAAGATGTGGAACATACCTTTGAAGAGATTAAACCATTATATGAACATCTTCATGCCTATGTGAGGGCAAAGTTGATGAATGCCTATCCTTCCTATATCAGTCCAATTGGATGCCTCCCTGCTCATTTGCTTGGTGATATGTGGGGTAGATTTTGGACAAATCTGTACTCTTTGACAGTTCCCTTTGGACAGAAACCAAACATAGATGTTACTGATGCAATGGTGGACCAGGCCTGGGATGCACAGAGAATATTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTTGTATCTGTTGGTCTTCCTAATATGACTCAAGGATTCTGGGAAAATTCCATGCTAACGGACCCAGGAAATGTTCAGAAAGCAGTCTGCCATCCCACAGCTTGGGACCTGGGGAAGGGCGACTTCAGGATCCTTATGTGCACAAAGGTGACAATGGACGACTTCCTGACAGCTCATCATGAGATGGGGCATATCCAGTATGATATGGCATATGCTGCACAACCTTTTCTGCTAAGAAATGGAGCTAATGAAGGATTCCATGAAGCTGTTGGGGAAATCATGTCACTTTCTGCAGCCACACCTAAGCATTTAAAATCCATTGGTCTTCTGTCACCCGATTTTCAAGAAGACAATGAAACAGAAATAAACTTCCTGCTCAAACAAGCACTCACGATTGTTGGGACTCTGCCATTTACTTACATGTTAGAGAAGTGGAGGTGGATGGTCTTTAAAGGGGAAATTCCCAAAGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGCGAGAGATAGTTGGGGTGGTGGAACCTGTGCCCCATGATGAAACATACTGTGACCCCGCATCTCTGTTCCATGTTTCTAATGATTACTCATTCATTCGATATTACACAAGGACCCTTTACCAATTCCAGTTTCAAGAAGCACTTTGTCAAGCAGCTAAACATGAAGGCCCTCTGCACAAATGTGACATCTCAAACTCTACAGAAGCTGGACAGAAACTGTTCAATATGCTGAGGCTTGGAAAATCAGAACCCTGGACCCTAGCATTGGAAAATGTTGTAGGAGCAAAGAACATGAATGTAAGGCCACTGCTCAACTACTTTGAGCCCTTATTTACCTGGCTGAAAGACCAGAACAAGAATTCTTTTGTGGGATGGAGTACCGACTGGAGTCCATATGCAGACCAAAGCATCAAAGTGAGGATAAGCCTAAAATCAGCTCTTGGAGATAAAGCATATGAATGGAACGACAATGAAATGTACCTGTTCCGATCATCTGTTGCATATGCTATGAGGCAGTACTTTTTAAAAGTAAAAAATCAGATGATTCTTTTTGGGGAGGAGGATGTGCGAGTGGCTAATTTGAAACCAAGAATCTCCTTTAATTTCTTTGTCACTGCACCTAAAAATGTGTCTGATATCATTCCTAGAACTGAAGTTGAAAAGGCCATCAGGATGTCCCGGAGCCGTATCAATGATGCTTTCCGTCTGAATGACAACAGCCTAGAGTTTCTGGGGATACAGCCAACACTTGGACCTCCTAACCAGCCCCCTGTTTCCATATGGCTGATTGTTTTTGGAGTTGTGATGGGAGTGATAGTGGTTGGCATTGTCATCCTGATCTTCACTGGGATCAGAGATCGGAAGAAGAAAAATAAAGCAAGAAGTGGAGAAAATCCTTATGCCTCCATCGATATTAGCAAAGGAGAAAATAATCCAGGATTCCAAAACACTGATGATGTTCAGACCTCCTTTGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGA(SEQ ID NO:10)

HuACE2+FLAG TAG(813AA，93.4kDa预测的)

MASSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSFDYKDDDDK(SEQ ID NO:11)

就其各自所引用的主题而言，本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入，其在一些情况下可涵盖文献的全部内容。

在本文说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/一种”，除非明确地相反指示，否则应理解为“至少一个”。

还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于方法的步骤或动作所陈述的顺序。

在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等应理解为开放式的，即，表示包括但不限于。仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是如美国专利局《专利审查程序手册》第2111.03节所规定的封闭式或半封闭式过渡短语。

数值前的术语“约”和“基本上”是指所述数值的±10％。

在提供数值范围的情况下，该范围的上端和下端之间的每个数值在本文中被具体考虑和描述。

Claims (46)

1.一种方法，包括：

(a)向受精卵递送包含第一整合酶附着位点的核酸；

(b)培养所述受精卵以产生在胚胎的基因组中包含所述第一整合酶附着位点的多细胞胚胎；以及

(c)向所述胚胎递送包含第二整合酶附着位点和编码目标产物的序列的核酸以产生工程化胚胎。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括向所述胚胎递送同源整合酶或编码同源整合酶的核酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受精卵包含编码同源整合酶的序列，其中所述同源整合酶整合到所述受精卵的基因组中。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将所述工程化胚胎植入能够生育后代哺乳动物的假孕雌性哺乳动物中。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述受精卵的递送是通过电穿孔。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述胚胎的递送是通过显微注射递送到所述胚胎的每个细胞中。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多细胞胚胎是两细胞胚胎。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述同源整合酶是Bxb1。

9.根据权利要求8所述的方法，其中(a)的所述第一整合酶附着位点是Bxb1 attP附着位点，和(c)的所述第二整合酶附着位点是Bxb1 attB附着位点。

10.根据权利要求8所述的方法，其中(a)的所述第一整合酶附着位点是Bxb1 attB附着位点，和(c)的所述第二整合酶附着位点是Bxb1 attP附着位点。

11.根据权利要求10所述的方法，其中(b)的所述第一整合酶附着位点与目标基因的内源启动子可操作地连接。

12.根据权利要求11所述的方法，其中(b)的所述第一整合酶附着位点位于转录起始密码子的上游(5′)并与转录起始密码子同框。

13.根据权利要求11所述的方法，其中(b)的所述第一整合酶附着位点在转录起始密码子的下游(5′)并与转录起始密码子同框。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)的所述第一整合酶附着位点侧翼为与所述受精卵的基因组中的核苷酸序列同源的核苷酸序列。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(c)的所述核酸是DNA微环。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所述同源整合酶的核酸是信使RNA(mRNA)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)进一步包括向所述受精卵递送可编程核酸酶，其中(a)中的所述核酸用作在所述可编程核酸酶切割所述基因组后用于修饰所述受精卵的基因组的模板，从而将所述第一整合酶附着位点引入所述受精卵的基因组中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可编程核酸酶是RNA引导的核酸酶，和所述方法进一步包括向所述受精卵递送(i)RNA引导的核酸酶或编码所述RNA引导的核酸酶的核酸和(ii)靶向目标核苷酸序列的指导RNA(gRNA)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶和所述gRNA形成核糖核蛋白。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述可编程核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述可编程核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受精卵是哺乳动物受精卵。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物受精卵是啮齿动物受精卵。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物受精卵是大鼠受精卵。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物受精卵是小鼠受精卵。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述小鼠受精卵是NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ

小鼠受精卵。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标基因是CD68。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括繁殖通过所述假孕雌性哺乳动物所生育的后代哺乳动物。

30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物受精卵是小鼠受精卵并且所述内源启动子是小鼠宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(mAce2)启动子。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标产物是人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(huACE2)。

32.通过根据权利要求29所述的方法产生的后代哺乳动物，其中所述后代哺乳动物是啮齿动物，任选地是小鼠。

33.一种包含通过根据前述权利要求中任一项所述的方法产生的工程化胚胎的啮齿动物。

34.一种包括向权利要求32的后代哺乳动物施用候选预防或治疗药剂的方法。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述候选药剂是恢复期人血清、人疫苗或抗微生物剂，任选地抗菌剂和/或抗病毒剂。

36.根据权利要求34或35所述的方法，进一步包括用SARS-CoV-2感染小鼠。

37.根据权利要求36所述的方法，进一步包括评估所述药剂预防SARS-CoV-2感染和/或COVID-19发生的功效。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目标产物为可编程核酸酶。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述目标产物是RNA引导的核酸酶。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述目标产物是Cas9。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述方法进一步包括向胚胎递送靶向目标核苷酸序列的指导RNA(gRNA)。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述目标核苷酸序列是干扰素调节因子5(Irf5)基因。

43.根据权利要求38所述的方法，其中所述目标产物是锌指核酸酶(ZFN)。

44.根据权利要求38所述的方法，其中所述目标产物是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一整合酶附着位点位于所述基因组的安全港基因座中。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述安全港基因座是ROSA26基因座、AAVS1基因座、Hip11基因座、Hprt基因座或Tigre基因座。

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