CN116194081A - 适用于治疗的脂质体rna制剂的制备和储存 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于制备用于在肠胃外施用之后(特别是在静脉内施用之后)将RNA递送至靶组织的RNA lipoplex颗粒的方法，以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。本公开内容还涉及允许以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法。此外，本公开内容涉及用于储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质并且特别是基本上不损失RNA活性的方法和组合物。

Description

适用于治疗的脂质体RNA制剂的制备和储存
技术领域
本公开内容涉及用于制备用于在肠胃外施用之后(特别是在静脉内施用之后)将RNA递送至靶组织的RNA lipoplex颗粒的方法，以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。本公开内容还涉及允许以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法。此外，本公开内容涉及用于储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质，并且特别是基本上不损失RNA活性的方法和组合物。本文中所述的RNA lipoplex颗粒制剂可通过冷冻干燥、喷雾干燥或相关方法冷冻或脱水，使得能够获得与液体储存相比延长的产品货架期(shelf-life)。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含单链RNA，例如编码目的肽或蛋白质(例如药物活性肽或蛋白质)的mRNA。RNA被靶组织的细胞吸收，并且RNA被翻译成可表现出其生理活性的编码的肽或蛋白质。目的肽或蛋白质可以是包含一个或更多个表位的肽或蛋白质，以用于诱导或增强针对所述一个或更多个表位的免疫应答。本文中所述的方法和组合物适合于以符合药物产品的要求，更具体地，符合GMP制造的要求和用于肠胃外施加的药物产品的品质的要求的方式使用。
背景技术
使用RNA将外来遗传信息递送到靶细胞中提供了DNA的有吸引力的替代方案。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特征。RNA不需要进入细胞核以进行表达，并且此外，RNA不会整合到宿主基因组中，从而消除肿瘤发生的风险。
RNA可通过所谓的lipoplex制剂递送，其中RNA与由阳离子脂质与辅助脂质(helper lipid)的混合物构成的脂质体结合以形成可注射的纳米颗粒制剂。然而，即使在制剂的储存之后，用于将生物活性RNA递送至靶组织的制剂的开发是未满足的需求。另外，用于符合GMP来制造可注射RNA lipoplex颗粒制剂的提供长货架期的方法的开发仍是未满足的需求。
因此，需要提供用于将生物活性RNA递送至靶组织的制剂，其中所递送的RNA被有效地翻译成其编码的肽或蛋白质。此外，需要提供这样的制剂，其是货架稳定的基本上不损失产品品质，并且特别是基本上不损失RNA的生物学活性。
本发明人出人意料地发现，本文中所述的RNA lipoplex颗粒制剂满足上述要求。
发明内容
I.用于制备RNA lipoplex颗粒的方法、RNA lipoplex颗粒和包含RNA lipoplex颗粒的组合物
在第一方面，本公开内容涉及用于制备具有改善的生物学活性的RNA lipoplex颗粒的方法、根据本公开内容制备的RNA lipoplex颗粒以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。RNA lipoplex颗粒和包含RNA lipoplex颗粒的组合物可用于在肠胃外施用之后，特别是在静脉内施用之后将RNA递送至靶组织。RNA lipoplex颗粒使用通过将在乙醇中的高度浓缩的脂质溶液注入到水或合适的水相中而获得的脂质体来制备。在一个实施方案中，RNA lipoplex产物的特征在于x射线散射中的特定模式，其中观察到在约1nm-1处的单个布拉格峰(Bragg peak)，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，脂质体和RNA lipoplex颗粒包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。脂质混合物中DOPE的浓度高于单独的乙醇中DOPE的平衡溶解度。在室温下，DOPE单独具有约50mM的溶解度，与DOTMA一起其则具有100mM或更高的溶解度。形成从中获得高活性lipoplex的脂质体的脂质溶液可具有270mM或更高的总脂质浓度(例如，90mM或更高的DOPE)。通过提高温度可获得乙醇中甚至更高浓度的溶液。从其中DOPE的浓度高于平衡溶解度的脂质溶液获得的脂质体显著大于来自其中DOPE的浓度处于平衡溶解度和以下的脂质溶液的脂质体。脂质体尺寸随在乙醇中的浓度而单调提高。
根据本公开内容制备的脂质体可通过将该脂质体与RNA混合而用于制备RNAlipoplex颗粒。在一个实施方案中，在混合之前将RNA与NaCl一起孵育以调整lipoplex的活性提高所需的特定离子强度。由这些较大的脂质体形成的lipoplex具有显著更高的生物学活性，如通过体外和体内实验所证明的。可通过某些物理化学参数将这些具有较高活性的lipoplex与具有较低活性的那些清楚地区分开，所述物理化学参数例如(i)较低的布拉格峰峰宽，以及(ii)在用于尺寸测量的分散分析方法，如场-流分级(field-flowfractionation)中的不同分离谱。具有较低活性的lipoplex平均更小。另外，它们还具有不同的洗脱曲线，这可能与参数如分子构象、形状以及与本体相(bulk phase)的相互作用相关。
因此，在这个方面，本公开内容涉及产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中的脂质溶液注入到水相中以产生脂质体胶体，其中所述脂质溶液中至少一种脂质的浓度对应于或高于所述至少一种脂质在乙醇中的平衡溶解度。
在一个实施方案中，所述方法包括将脂质溶液加热以提高脂质溶液中脂质的浓度。在一个实施方案中，将脂质溶液加热至至少约40℃或至少约60℃的温度。
在一个实施方案中，脂质溶液是两种或更多种不同脂质的混合物的溶液。
在一个实施方案中，脂质溶液中一种脂质的浓度对应于或高于脂质在乙醇中的平衡溶解度。
在一个实施方案中，脂质溶液中的总脂质浓度为约180mM至约600mM、约300mM至约600mM，或约330mM。
在一个实施方案中，脂质溶液包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，脂质溶液中的另外的脂质的浓度对应于或高于所述另外的脂质在乙醇中的平衡溶解度。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，脂质溶液包含摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
在一个实施方案中，脂质溶液中DOPE的浓度为至少约60mM或至少约90mM。
在一个实施方案中，将脂质溶液注入到约50rpm至约150rpm的水相搅拌速度的水相中。
在一个实施方案中，水相是水。
在一个实施方案中，水相具有酸性pH。在一个实施方案中，水相包含例如量为约5mM的乙酸。
在一个实施方案中，所述方法还包括搅拌脂质体胶体。
在一个实施方案中，将脂质体胶体搅拌约15分钟至约60分钟，或搅拌约30分钟。
本公开内容还涉及产生脂质体胶体的方法，所述方法包括将在乙醇中包含摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE的脂质溶液注入到以约150rpm的搅拌速度搅拌的水中以产生脂质体胶体，其中在所述脂质溶液中DOTMA和DOPE的浓度为约330mM。
在一个实施方案中，产生脂质体的方法不包括将脂质体挤出的步骤。
本公开内容还涉及可通过产生脂质体的方法获得的脂质体胶体。
在一个实施方案中，脂质体的平均直径为至少约250nm。
在一个实施方案中，脂质体的平均直径为约250nm至约800nm。
在一个实施方案中，脂质体具有小于约0.5、小于约0.4，或小于约0.3的多分散性指数。
在一个实施方案中，脂质体是阳离子脂质体。
在一个实施方案中，脂质体包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，脂质体包含摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
本公开内容还涉及制备RNA lipoplex颗粒的方法，所述方法包括将上述脂质体胶体添加至包含RNA的溶液。
在一个实施方案中，在X射线散射模式中，RNA lipoplex的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，所述RNA lipoplex颗粒可如上所述获得。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，并且
其中所述RNA lipoplex颗粒的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，所述组合物还包含浓度为约10mM至约300mM、约45mM至约300mM、约10mM至约50mM，或约80mM至约150mM的氯化钠。
在一个实施方案中，所述组合物还包含缓冲剂。
在一个实施方案中，所述组合物还包含螯合剂。
在一个实施方案中，在I.下的该方面中所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒具有小于约0.5、小于约0.4，或小于约0.3的多分散性指数。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1：1、或约2∶1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中正电荷与RNA中负电荷的电荷比为约1∶2至1.9∶2。
在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个实施方案中，EDTA的浓度为约0.25mM至约5mM，或约2.5mM。
在一个实施方案中，组合物还包含辅料。
在一个实施方案中，组合物配制成用于全身性施用。
在一个实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。
本公开内容还涉及用于治疗用途的如前所述的组合物。
II.用于以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法
在第二方面，本公开内容涉及允许以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法。
在本公开内容的一个实施方案中，将流体路径(fluid path)系统用于药物RNAlipoplex颗粒产品的GMP制造，这使得能够精确控制RNA与脂质体的混合比，这对于产品品质是重要的。在一个实施方案中，流体路径包括以1∶1(体积/体积)的方式将脂质体溶液与RNA溶液混合，其中选择组分的浓度以精确地维持期望的电荷比。在一个实施方案中，在混合之前将RNA与NaCl一起孵育以调整lipoplex的活性所需的特定离子强度。在一个实施方案中，实现了Y型混合设置，其完全基于单一使用材料。使流体动力学最优化以维持颗粒特征并避免堵塞。相反，当使用市售微流体装置时，在一段时间后会发生堵塞，这使得GMP的应用变得不可能。
在一个实施方案中，通过将RNA与阳离子脂质体一起孵育来制造lipoplex，其中通过使用注射器泵(灌注泵)精确地控制混合比和混合条件，其中将两个注射器(一个包含脂质体并且一个包含RNA)插入注射器泵中，优先地平行地插入到同一泵中。两个泵的活塞由同一驱动器向前移动，从而精确地控制了所混合的相对体积。在选定的工艺条件下，这两种溶液均使用相同的注射器，由此使实现精确的一对一(v/v)混合条件。通过在混合之前调整两种溶液的浓度，即可精确控制RNA与脂质体(阳离子脂质)之间的比。
因此，在这个方面，本公开内容涉及用于连续流制造RNA lipoplex颗粒的方法，其包括在RNA和阳离子脂质体的受控混合条件下将包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液混合。
在一个实施方案中，包含阳离子脂质体的溶液是如上所述的脂质体胶体。
在一个实施方案中，包含RNA的溶液和包含阳离子脂质体的溶液是水性溶液。
在一个实施方案中，使用允许包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液混合的流量(flow rate)。
在一个实施方案中，所述流的特征在于雷诺数大于300，或约500至约2100。
在一个实施方案中，所述受控混合条件包括控制包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液的混合比。
在一个实施方案中，所述受控混合条件包括控制待混合的包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液的相对体积。
在一个实施方案中，通过使用相同混合体积(v/v)的包含RNA的溶液和包含阳离子脂质体的溶液以及调整相应溶液中RNA和阳离子脂质体的浓度来控制RNA与阳离子脂质体的混合比。
在一个实施方案中，选择所述受控混合条件以在避免堵塞的同时维持RNAlipoplex颗粒的特征。
在一个实施方案中，所述方法包括使用Y型或T型混合元件。
在一个实施方案中，Y型或T型混合元件的直径为约1.2mm至约50mm。
在一个实施方案中，所述方法包括使用混合元件，例如Y型或T型混合元件，其中将来自两个管或软管的流体放在一起，并且其中不存在内部静态混合元件如例如裂缝，以及重组、交错的人字形、之字形或扭曲的通道，或者三维蛇纹石(serpentine)。混合元件的直径可为1.2至50.0mm。
在一个实施方案中，所述方法包括使用装置，其中将两个注射器(一个包含所述包含阳离子脂质体的溶液并且一个包含所述包含RNA的溶液)平行地插入到同一或两个保持物中，并且所述装置的活塞通过一个或两个精密致动器(actuator)伸出。在一个实施方案中，所述方法包括使用注射器泵，其中将两个注射器平行地插入到同一泵中，所述两个注射器一个包含所述包含阳离子脂质体的溶液并且一个包含所述包含RNA的溶液。
在一个实施方案中，所述方法包括将压力容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵、蠕动泵、HPLC/FPLC泵或任何其他活塞泵任选地与流量传感器组合使用，所述流量传感器任选地具有用于在线控制和实时调整流量的反馈回路。
在一个实施方案中，包含RNA的溶液与包含脂质体的溶液的混合物包含浓度为约45mM至约300mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约45mM至约300mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，RNA溶液包含浓度为约90mM至约600mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约90mM至约600mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，包含RNA的溶液与包含脂质体的溶液的混合物具有至少约50mM的离子强度。
在一个实施方案中，在X射线散射模式中，RNA lipoplex的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，所述RNA lipoplex颗粒可如上所述获得。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，并且
其中RNA lipoplex颗粒的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，组合物还包含浓度为约10至约300mM、约45mM至约300mM、约10mM至约50mM，或约80mM至约150mM的氯化钠。
在一个实施方案中，组合物还包含缓冲剂。
在一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。
在一个实施方案中，在II.下的该方面中所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒具有小于约0.5、小于约0.4，或小于约0.3的多分散性指数。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中正电荷与RNA中负电荷的电荷比为约1∶2至1.9∶2。
在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个实施方案中，EDTA的浓度为约0.25mM至约5mM，或约2.5mM。
在一个实施方案中，组合物还包含辅料。
在一个实施方案中，组合物配制成用于全身性施用。
在一个实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。
本公开内容还涉及用于治疗用途的如前所述的组合物。
III.用于储存RNA lipoplex颗粒的方法和组合物
在第三方面，本公开内容涉及用于储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质，并且特别是基本上不损失RNA活性的方法和组合物。特别地，本公开内容涉及允许RNAlipoplex颗粒的冷冻、冻干或喷雾干燥而基本上不损失RNA lipoplex颗粒的品质，并且特别是基本上不损失RNA活性的制剂。
本文中所述的RNA lipoplex颗粒制剂可通过冷冻干燥、喷雾干燥或相关方法冷冻或脱水，使得能够获得与液体储存相比延长的产品货架期。
为了使得能够冷冻，添加了稳定剂(冷冻保护剂)。在一个实施方案中，在制造之后，用稳定剂(冷冻保护剂)对lipoplex进行稀释，从而使得能够调整离子强度，优先降低离子强度并调整稳定剂的适当浓度。为了冷冻产品，稳定剂浓度可高于获得生理渗量浓度(osmolality)的值。在那种情况下，为了施用，将产品用合适的水相(例如注射用水、盐水)稀释以调整期望的渗量浓度和离子强度。可使用糖如葡萄糖、蔗糖或海藻糖作为稳定剂，还可使用其他化合物如葡聚糖作为稳定剂。
出乎意料的是，根据本公开内容发现，包含如本文中所述的稳定剂的RNAlipoplex制剂也可被冻干。对于冻干，所需的稳定剂(冷冻保护剂)浓度可低于冷冻所需的浓度，并且耐受的NaCl浓度(离子强度)可高于冷冻所需的浓度。如果需要大规模的经济脱水，也可将产品喷雾干燥。
将一些RNA lipoplex制剂的pH调整至低于通常的生理范围和在本体相(bulkphase)中通常对于RNA储存而言最佳的pH的值。最佳pH为约6.2，合适的范围为约5.7至约6.7。对于其他制剂，理想的pH可甚至更低。据推测，由于阳离子脂质的正电荷，RNAlipoplex内部的局部pH高于本体相pH。
在其中将RNA lipoplex组合物冷冻用于储存的本公开内容的那些实施方案中，可将组合物解冻，并且任选地，可通过添加水性液体来调整组合物的渗量浓度、离子强度和/或pH。所得组合物可施用于对象。
在其中将RNA lipoplex组合物冻干或冷冻干燥用于储存的本公开内容的那些实施方案中，可通过添加水性液体来使组合物重构，并且任选地，可通过添加水性液体来调整组合物的渗量浓度、离子强度和/或pH。所得组合物可施用于对象。
因此，在这个方面，本公开内容涉及制备包含RNA lipoplex颗粒的冷冻组合物的方法，其包括(i)提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物，以及(ii)冷冻所述组合物。
在一个实施方案中，冷冻在约-15℃至约-40℃，或在约-30℃的温度下进行。
在一个实施方案中，组合物例如在约-15℃至约-40℃，或约-20℃的储存温度下储存。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物包括提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物并向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂。因此，制备用于冷冻的组合物的方法包括提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物，并向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加稳定剂。
在一个实施方案中，向包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加稳定剂降低了所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的离子强度。
在一个实施方案中，在包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，在包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度足以维持RNA lipoplex颗粒的品质，并且特别地避免在将所述组合物在约-15℃至约-40℃的温度下储存至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月，或至少36个月之后RNA活性的实质性损失。
在一个实施方案中，在包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度为约5％至约35.0％(w/v)、约10％至约30.0％(w/v)、约12.5％至约25.0％(w/v)，或约22.0％(w/v)。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物包含浓度为约10mM至约50mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约10mM至约50mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物具有对应于浓度为约20mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒可通过如上在I.和II.下所述的方法获得。
在一个实施方案中，制备冷冻组合物的方法还包括储存包含RNA lipoplex颗粒的冷冻组合物。所述组合物可在对应于或基本对应于冷冻温度的温度或者高于或低于该冷冻温度的温度下储存。一般来说，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下，例如在约-20℃下储存。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，其可通过上述制备冷冻组合物的方法获得。本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，其可通过上述制备用于冷冻的组合物的方法获得。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
在一个实施方案中，组合物还包含浓度为约10mM至约50mM的氯化钠。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，
浓度为0mM至约40mM的氯化钠，以及
稳定剂。
在一个实施方案中，所述组合物还包含缓冲剂。
在一个实施方案中，所述组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL，或约0.05mg/mL。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约20mM至约30mM。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约20mM。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约30mM。
在一个实施方案中，所述组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，所述组合物中稳定剂的浓度为约5至约35重量/体积百分比(％w/v)，或约12.5至约25重量/体积百分比(％w/v)。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，稳定剂是蔗糖，其浓度为约5至约25重量/体积百分比(％w/v)。
在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约15％(w/v)至约25％(w/v)。
在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约20％(w/v)至约25％(w/v)。
在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约22％(w/v)。
在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约20％(w/v)。
在一个实施方案中，组合物的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
在一个实施方案中，组合物的pH为约5.7至约6.7，或约6.2。
在一个实施方案中，缓冲剂是2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
在一个实施方案中，HEPES的浓度为约2.5mM至约10mM，或约7.5mM。
在一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，浓度为约0.05mg/mL，以及
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，
浓度为约20mM的氯化钠，
浓度为约22％(w/v)的蔗糖，
浓度为约7.5mM、pH为约6.2的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
在一个实施方案中，组合物为液体或冷冻状态。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-15℃至约-40℃的温度下至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-15℃的温度下至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-15℃的温度下至少两个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-20℃的温度下至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-20℃的温度下至少两个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-30℃的温度下至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月保持稳定。
在一个实施方案中，冷冻组合物在约-30℃的温度下至少两个月保持稳定。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物，所述水性组合物可通过将上述冷冻组合物解冻，以及任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度来获得。
在一个实施方案中，组合物的渗量浓度为约200mOsmol/kg至约450mOsmol/kg。
在一个实施方案中，组合物包含浓度为约80mM至约150mM的氯化钠。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒可通过如上在I.和II.下所述的方法获得。
本公开内容还涉及制备包含RNA lipoplex颗粒的脱水的(例如冻干或喷雾干燥的)组合物的方法，其包括(i)提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物，以及(ii)对所述组合物进行脱水例如冻干或喷雾干燥。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物包括提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物并向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂。因此，制备用于脱水(例如冻干或喷雾干燥)的组合物的方法包括：提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物并向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加稳定剂。
在一个实施方案中，向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加稳定剂降低了所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的离子强度。
在一个实施方案中，在包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，在包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度足以维持RNA lipoplex颗粒的品质，并且特别地避免在将所述组合物储存至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月，或至少36个月之后RNA活性的实质性损失。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度为约5％至约35.0％(w/v)、约10％至约30.0％(w/v)、约12.5％至约25.0％(w/v)，或约22.0％(w/v)。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物包含浓度为约10mM至约80mM，或约10mM至约50mM的氯化钠，或者包含对应于浓度为约10mM至约80mM，或约10mM至约50mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物具有对应于浓度为约20mM、约40mM、约60mM，或约80mM的氯化钠的离子强度。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒可通过如上在I.和II.下所述的方法获得。
在一个实施方案中，制备脱水的(例如冻干或喷雾干燥的)组合物的方法还包括储存包含RNA lipoplex颗粒的冻干或喷雾干燥的组合物。一般来说，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下，例如在约-20℃下储存。在某些实施方案中，组合物在高于0℃的温度下，例如在约25℃或约4℃下，或例如在室温下储存。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，其可通过上述制备脱水的(例如冻干或喷雾干燥的)组合物的方法获得。本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的组合物，其可通过上述制备用于脱水(例如冻干或喷雾干燥)的组合物的方法获得。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
在一个实施方案中，RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
在一个实施方案中，组合物还包含浓度为约10mM至约80mM或约10mM至约50mM的氯化钠。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，
浓度为10mM至约80mM的氯化钠，以及
稳定剂。
在一个实施方案中，组合物还包含缓冲剂。
在一个实施方案中，组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL，或约0.05mg/mL。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约20mM至约30mM。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约20mM。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约30mM。
在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约5至约35重量/体积百分比(％w/v)，或约10至约25重量/体积百分比(％w/v)。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，稳定剂是海藻糖，其浓度为约5至约35重量/体积百分比(％w/v)。
在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约5％(w/v)至约25％(w/v)。
在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约10％(w/v)至约25％(w/v)。
在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约10％(w/v)。
在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约15％(w/v)。
在一个实施方案中，组合物的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
在一个实施方案中，组合物的pH为约5.7至约6.7，或约6.2。
在一个实施方案中，缓冲剂是2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
在一个实施方案中，HEPES的浓度为约2.5mM至约10mM，或约7.5mM。
在一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，浓度为约0.05mg/mL，以及
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，
浓度为约20mM的氯化钠，
浓度为约10％(w/v)的海藻糖，
浓度为约7.5mM、pH为约6.2的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
在一个实施方案中，组合物为液体或脱水的，例如冻干或冷冻干燥的状态。
在一个实施方案中，脱水的(例如冻干或冷冻干燥的)组合物至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物在高于0℃的温度下，例如在约25℃或约4℃下，或例如在室温下储存。
在一个实施方案中，脱水的(例如冻干或冷冻干燥的)组合物至少一个月保持稳定。
在一个实施方案中，脱水的(例如冻干或冷冻干燥的)组合物至少两个月保持稳定。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物，所述水性组合物可通过使上述脱水的(例如冻干或冷冻干燥的)组合物重构，以及任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度来获得。
在一个实施方案中，组合物的渗量浓度为约150mOsmol/kg至约450mOsmol/kg。
在一个实施方案中，组合物包含浓度为约80mM至约150mM的氯化钠。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒可通过如上在I.和II.下所述的方法获得。
在一个实施方案中，在III.下的该方面中所述的RNA lipoplex颗粒的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中峰宽小于0.2nm-1。
在一个实施方案中，在III.下的该方面中所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒具有小于约0.5、小于约0.4，或小于约0.3的多分散性指数。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中正电荷与RNA中负电荷的电荷比为约1∶2至1.9∶2。
在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个实施方案中，EDTA的浓度为约0.25mM至约5mM，或约2.5mM。
在一个实施方案中，组合物还包含辅料。
在一个实施方案中，组合物配制成用于全身性施用。
在一个实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。
本公开内容还涉及用于治疗用途的如前所述的组合物。
本公开内容还涉及制备包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的方法，其包括将上述冷冻组合物解冻或使上述冻干或喷雾干燥的组合物重构，以及任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度。
在一个实施方案中，添加水性液体以使所述组合物获得约200mOsmol/kg至约450mOsmol/kg的渗量浓度。
在一个实施方案中，添加水性液体以获得浓度为约80mM至约150mM的氯化钠。
本文中所述的适合储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质，并且特别是基本上不损失RNA活性的一些RNA lipoplex制剂不需要对产品进行修饰，特别是将产品用水相(例如注射用水、盐水)稀释以在施用之前调整期望的渗量浓度和离子强度。这样的RNAlipoplex制剂可在储存之后并且任选地在产品解冻或重构之后直接施用。在其中将RNAlipoplex组合物冷冻用于储存的本公开内容的那些实施方案中，可将组合物解冻，并且在无需调整组合物的渗量浓度、离子强度和/或pH的情况下施用。
因此，本公开内容涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
浓度为约10mM或更低的氯化钠，
浓度为约10％重量/体积百分比(％w/v)或更低的稳定剂，以及
缓冲剂。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约5mM至约10mM。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约7.5mM或更低，例如约5mM至约7.5mM。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约6.5mM或约7.5mM。
在一个实施方案中，组合物中盐和/或稳定剂的浓度约为生理渗量浓度所需的值。在一个实施方案中，由溶解的组分，包括离子和非离子组分产生的渗量浓度约为生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约5至约10％(w/v)。在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约5至约7.5％(w/v)。在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约7.5至约10％(w/v)。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，稳定剂是蔗糖或海藻糖。在一个实施方案中，稳定剂是蔗糖，其浓度为约5至约10％(w/v)。在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约10％(w/v)。在一个实施方案中，稳定剂是海藻糖，其浓度为约5至约10％(w/v)。在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约10％(w/v)。
在一个实施方案中，缓冲剂选自：2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、组氨酸、乙酸/乙酸钠和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES、组氨酸或MES。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES或MES。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。
在一个实施方案中，组合物的pH为6.0至7.2、6.0至7.0、6.2至7.0、6.5至7.0或6.5至6.7。在一个实施方案中，组合物的pH为约6.5或6.7。
在一个实施方案中，缓冲剂以2.5mM至10mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以2.5mM至5mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以5mM至10mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以5mM至7.5mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以7.5mM至10mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以约7.5mM的浓度存在。
在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES，其浓度为约7.5mM或更低，例如2.5mM至7.5mM或5mM至7.5mM、pH为约6.5或约6.7。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)v-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1到约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，所述RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
在一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约3.5mM或更低，或约0.25mM至约3.5mM，或约0.25mM至约2.5mM。
在本文中所述的组合物的一个实施方案中，所述RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，
浓度为约7.5mM的氯化钠，
浓度为约10％(w/v)的蔗糖，
浓度为约7.5mM、pH为约6.5或约6.7的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
在本文中所述的组合物的一个实施方案中，所述RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
在本文中所述的组合物的一个实施方案中，所述组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、约0.05mg/mL，或约0.02mg/mL。
在本文中所述的组合物的一个实施方案中，组合物还包含辅料。
在本文中所述的组合物的一个实施方案中，组合物为液体、冷冻或脱水状态。
在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物并且在约-15℃的温度下至少一个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物并且在约-15℃的温度下至少两个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物并且在约-15℃的温度下至少四个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物并且在约-15℃的温度下至少六个月保持稳定。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物，所述液体组合物可通过将本文中所述的冷冻组合物解冻来获得。在一个实施方案中，所述液体组合物具有如上所述的组成。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物，所述液体组合物可通过将本文中所述的脱水组合物溶解来获得。在一个实施方案中，所述液体组合物具有如上所述的组成。
在一个实施方案中，本文中所述的液体组合物是水性组合物。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物，特别是液体组合物可直接施用于对象。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物是药物组合物。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物配制成用于全身性施用。
在一个实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。
本公开内容还涉及用于治疗用途的本文中所述的组合物。
本公开内容还涉及制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，其包括将本文中所述的冷冻组合物解冻。本公开内容还涉及制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，其包括将本文中所述的脱水组合物溶解。在本文中所述的方法的一个实施方案中，所述液体组合物是水性组合物。在一个实施方案中，所述液体组合物具有如上所述的组成。对于如本文中所述的治疗应用，将本文中所述的液体组合物施用于对象。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含
RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
浓度为约10mM或更低的氯化钠，
浓度为超过约10％重量/体积百分比(％w/v)且低于约15％重量/体积百分比(％w/v)的稳定剂，以及
缓冲剂。
在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约5mM至约10mM。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约8.5mM或更低，例如约5mM至约8.5mM。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约8.2mM
在一个实施方案中，组合物中盐和/或稳定剂的浓度约为生理渗量浓度所需的值。在一个实施方案中，由溶解的组分(包括离子和非离子组分)产生的渗量浓度约为生理渗量浓度所需的值。
在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约11％至约14％(w/v)。在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约12至约14％(w/v)。在一个实施方案中，组合物中稳定剂的浓度为约13％(w/v)。
在一个实施方案中，稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
在一个实施方案中，稳定剂是蔗糖或海藻糖。在一个实施方案中，稳定剂是浓度为约12至约14％(w/v)的蔗糖。在一个实施方案中，蔗糖的浓度为约13％(w/v)。在一个实施方案中，稳定剂是浓度为约12至约14％(w/v)的海藻糖。在一个实施方案中，海藻糖的浓度为约13％(w/v)。
在一个实施方案中，缓冲剂选自：2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、组氨酸、乙酸/乙酸钠和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES、组氨酸或MES。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES或MES。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。
在一个实施方案中，组合物的pH为6.0至7.5、6.5至7.5、6.5至7.3、6.5至7.2、6.7至7.2或6.5至7.0。在一个实施方案中，组合物的pH为约6.7。
在一个实施方案中，缓冲剂以2.5mM至10mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以2.5mM至7.5mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以4mM至6mM的浓度存在。在一个实施方案中，缓冲剂以约5mM的浓度存在。
在一个实施方案中，缓冲剂是浓度为约7.5mM或更低(例如2.5mM至7.5mM或4mM至6mM，例如约5mM)且pH为约6.7的HEPES。
在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
在一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)，特别是EDTA二钠盐。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约3.5mM或更低，或约0.25mM至约3.5mM，或约0.25mM至约2.5mM。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
本公开内容还涉及组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，
浓度为约8.2mM的氯化钠，
浓度为约13％(w/v)的蔗糖，
浓度为约5mM、pH为约6.7的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、或约0.025mg/mL。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，组合物还包含酸。在一个实施方案中，酸以使脂质体稳定的量存在。在一个实施方案中，酸以降低DOPE水解的量存在。在一个实施方案中，酸是乙酸或HCl。在一个实施方案中，酸是乙酸。在一个实施方案中，酸是浓度为约0.09mM的乙酸。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，组合物还包含辅料。
在本文中所述组合物的一个实施方案中，组合物为液体、冷冻或脱水状态。
在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物，并且在约-15℃的温度下至少一个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物，并且在约-15℃的温度下至少两个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物，并且在约-15℃的温度下至少四个月保持稳定。在一个实施方案中，组合物是冷冻组合物，并且在约-15℃的温度下至少六个月保持稳定。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物，其可通过将本文中所述的冷冻组合物解冻来获得。在一个实施方案中，所述液体组合物具有如上所述的组成。
本公开内容还涉及包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物，其可通过将本文中所述的脱水组合物溶解来获得。在一个实施方案中，所述液体组合物具有如上所述的组成。
在一个实施方案中，本文中所述的液体组合物是水性组合物。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物，特别是液体组合物，可直接施用于对象。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物是药物组合物。
在一个实施方案中，本文中所述的组合物配制成用于全身性施用。
在一个实施方案中，全身性施用是通过通过静脉内施用。
本公开内容还涉及用于治疗用途的本文中所述的组合物。
本公开内容还涉及制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，所述方法包括将本文中所述的冷冻组合物解冻。本公开内容还涉及制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，所述方法包括将本文中所述的脱水组合物溶解。在本文中所述方法的一个实施方案中，液体组合物是水性组合物。在一个实施方案中，液体组合物具有如上所述的组成。对于本文中所述的治疗应用，将本文中所述的液体组合物施用于对象。
另一些实施方案如下：
1.产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中的脂质溶液注入到水相中以产生所述脂质体胶体，其中所述脂质溶液中至少一种脂质的浓度对应于或高于所述至少一种脂质在乙醇中的平衡溶解度。
2.实施方案1所述的方法，其中所述脂质溶液是两种或更多种不同脂质的混合物的溶液。
3.实施方案1或2所述的方法，其中所述脂质溶液中一种脂质的浓度对应于或高于室温下所述脂质在乙醇中的平衡溶解度。
4.实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液中的总脂质浓度为约180mM至约600mM、约300mM至约600mM，或约330mM。
5.实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
6.实施方案5所述的方法，其中所述脂质溶液中的另外的脂质的浓度对应于或高于所述另外的脂质在乙醇中的平衡溶解度。
7.实施方案5或6所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
8.实施方案5至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
9.实施方案5至8中任一项所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
10.实施方案5至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
11.实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
12.实施方案8至11中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液中DOPE的浓度为至少约60mM或至少约90mM。
13.实施方案1至12中任一项所述的方法，其中将所述脂质溶液注入到约50rpm至约150rpm的水相搅拌速度的水相中。
14.实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述水相是水。
15.实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括搅拌所述脂质体胶体。
16.实施方案1至15中任一项所述的方法，其中将所述脂质体胶体搅拌约15分钟至约60分钟，或搅拌约30分钟。
17.产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中包含摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE的脂质溶液注入到以约150rpm的搅拌速度搅拌的水中以产生所述脂质体胶体，其中在所述脂质溶液中DOTMA和DOPE的浓度为约330mM。
18.脂质体胶体，其可通过实施方案1至17中任一项所述的方法获得。
19.实施方案18所述的脂质体胶体，其中所述脂质体的平均直径为至少约250nm。
20.实施方案18或19所述的脂质体胶体，其中所述脂质体的平均直径为约250nm至约800nm。
21.实施方案18至20中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体是阳离子脂质体。
22.实施方案18至21中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
23.实施方案22所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
24.实施方案22或23所述的脂质体胶体，其中所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
25.实施方案22至24中任一项所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
26.实施方案22至25中任一项所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
27.实施方案18至26中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体包含摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
28.制备RNA lipoplex颗粒的方法，其包括将实施方案18至27中任一项所述的脂质体胶体添加至包含RNA的溶液。
29.用于连续流制备RNA lipoplex颗粒的方法，其包括在RNA和阳离子脂质体的受控混合条件下将包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液混合。
30.实施方案29所述的方法，其中所述包含阳离子脂质体的溶液是实施方案18至27中任一项所述的脂质体胶体。
31.实施方案29或30所述的方法，其中所述包含RNA的溶液和所述包含阳离子脂质体的溶液是水性溶液。
32.实施方案29至31中任一项所述的方法，其中使用允许所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液混合的流量。
33.实施方案29至32中任一项所述的方法，其中所述流的特征在于雷诺数大于300，或为约500至约2100。
34.实施方案29至33中任一项所述的方法，其中所述受控混合条件包括控制所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液的混合比。
35.实施方案29至34中任一项所述的方法，其中所述受控混合条件包括控制待混合的所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液的相对体积。
36.实施方案29至35中任一项所述的方法，其中通过使用相同混合体积(v/v)的所述包含RNA的溶液和所述包含阳离子脂质体的溶液以及调整相应溶液中RNA和阳离子脂质体的浓度来控制所述RNA与所述阳离子脂质体的混合比。
37.实施方案29至36中任一项所述的方法，其中选择所述受控混合条件以在避免堵塞的同时维持所述RNA lipoplex颗粒的特征。
38.实施方案29至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用Y型或T型混合元件。
39.实施方案29至38中任一项所述的方法，其中所述Y型或T型混合元件的直径为约1.2mm至约50mm。
40.实施方案29至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用注射器泵，其中将两个注射器平行地插入到同一泵中，所述两个注射器的一个包含所述包含阳离子脂质体的溶液并且一个包含所述包含RNA的溶液。
41.实施方案29至40中任一项所述的方法，其中所述方法包括将压力容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵或蠕动泵与流量传感器组合使用，所述流量传感器任选地具有用于在线控制和实时调整流量的反馈回路。
42.实施方案29至41中任一项所述的方法，其中所述包含RNA的溶液与所述包含脂质体的溶液的混合物包含浓度为约45mM至约300mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约45mM至约300mM的氯化钠的离子强度。
43.实施方案29至42中任一项所述的方法，其中所述包含RNA的溶液与所述包含脂质体的溶液的混合物具有至少约50mM的离子强度。
44.实施方案28至43中任一项所述的方法，其中在X射线散射模式中，所述RNAlipoplex的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中所述峰宽小于0.2nm-1。
45.实施方案28至44中任一项所述的方法，其中所述RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
46.制备包含RNA lipoplex颗粒的冷冻组合物的方法，其包括(i)提供包含RNAlipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物，以及(ii)冷冻所述组合物。
47.实施方案46所述的方法，其中冷冻在约-15℃至约-40℃，或在约-30℃的温度下进行。
48.实施方案47所述的方法，其中所述稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
49.实施方案46至48中任一项所述的方法，其中提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物包括提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物并向所述包含RNAlipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂。
50.实施方案46至49中任一项所述的方法，其中向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂降低所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的离子强度。
51.实施方案46至50中任一项所述的方法，其中在所述包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
52.实施方案46至51中任一项所述的方法，其中在所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度足以维持所述RNA lipoplex颗粒的品质，并且特别地足以避免在将所述组合物在约-15℃至约-40℃的温度下储存至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月，或至少36个月之后RNA活性的实质性损失。
53.实施方案46至52中任一项所述的方法，其中所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
54.实施方案46至53中任一项所述的方法，其中所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物包含浓度为约10mM至约50mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约10mM到约50mM的氯化钠的离子强度。
55.实施方案46至54中任一项所述的方法，其中所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物具有对应于浓度为约20mM的氯化钠的离子强度。
56.实施方案46至55中任一项所述的方法，其中所述RNA lipoplex颗粒可通过实施方案28至44中任一项所述的方法获得。
57.包含RNA lipoplex颗粒的组合物，所述RNA lipoplex颗粒可通过实施方案28至45中任一项所述的方法获得。
58.实施方案57所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
59.实施方案57或58所述的组合物，其中所述RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
60.组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，并且
其中所述RNA lipoplex颗粒的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中所述峰宽小于0.2nm-1。
61.实施方案57至60中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含浓度为约10至约300mM、约45mM至约300mM、约10mM至约50mM，或约80mM至约150mM的氯化钠。
62.实施方案57至61中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。
63.实施方案57至62中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含螯合剂。
64.包含RNA lipoplex颗粒的组合物，其可通过实施方案46至56中任一项所述的方法获得。
65.实施方案64所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
66.实施方案64或65所述的组合物，其中所述RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
67.实施方案64至66中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含浓度为约10mM至约50mM的氯化钠。
68.组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0，
浓度为0mM至约40mM的氯化钠，以及
稳定剂。
69.实施方案64至68中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。
70.实施方案64至69中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL，或约0.05mg/mL。
71.实施方案67至70中任一项所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约20mM至约30mM。
72.实施方案67至71中任一项所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约20mM。
73.实施方案67至71中任一项所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约30mM。
74.实施方案64至73中任一项所述的组合物，其中所述组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。
75.实施方案64至74中任一项所述的组合物，其中所述组合物中稳定剂的浓度为约5至约35重量/体积百分比(％w/v)，或约12.5至约25重量/体积百分比(％w/v)。
76.实施方案64至75中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
77.实施方案64至76中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是蔗糖，其浓度为约5至约25重量/体积百分比(％w/v)。
78.实施方案77所述的组合物，其中所述蔗糖的浓度为约15％(w/v)至约25％(w/v)。
79.实施方案77所述的组合物，其中所述蔗糖的浓度为约20％(w/v)至约25％(w/v)。
80.实施方案77所述的组合物，其中所述蔗糖的浓度为约22％(w/v)。
81.实施方案77所述的组合物，其中所述蔗糖的浓度为约20％(w/v)。
82.实施方案64至81中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。
83.实施方案64至82中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为约5.7至约6.7，或约6.2。
84.实施方案68至83中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
85.实施方案84所述的组合物，其中所述HEPES的浓度为约2.5mM至约10mM，或约7.5mM。
86.实施方案64至85中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含螯合剂。
87.组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，所述RNA浓度为约0.05mg/mL，以及
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，浓度为约20mM的氯化钠，
浓度为约22％(w/v)的蔗糖，
浓度为约7.5mM、pH为约6.2的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
88.实施方案64至87中任一项所述的组合物，其中所述组合物为液体或冷冻状态。
89.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃至约-40℃的温度下至少一个月保持稳定。
90.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少一个月保持稳定。
91.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少两个月保持稳定。
92.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-20℃的温度下至少一个月保持稳定。
93.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-20℃的温度下至少两个月保持稳定。
94.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-30℃的温度下至少一个月保持稳定。
95.实施方案88所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-30℃的温度下至少两个月保持稳定。
96.包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物，所述水性组合物可通过将实施方案88至95中任一项所述的冷冻组合物解冻，以及任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度来获得。
97.实施方案96所述的组合物，其中所述组合物的渗量浓度为约200mOsmol/kg至约450mOsmol/kg。
98.实施方案96或97所述的组合物，其中所述组合物包含浓度为约80mM至约150mM的氯化钠。
99.实施方案64至98中任一项所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒可通过实施方案28至45中任一项所述的方法获得。
100.实施方案64至99中任一项所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒的特征在于在约1nm-1处的单个布拉格峰，其中所述峰宽小于0.2nm-1。
101.实施方案57至100中任一项所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
102.实施方案58至63、65至86和88至101中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
103.实施方案58至63、65至86和88至102中任一项所述的组合物，其中所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
104.实施方案58至63、65至86和88至103中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
105.实施方案58至63、65至86和88至104中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
106.实施方案58至63、65至86和88至105中任一项所述的组合物，其中所述RNAlipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中正电荷与所述RNA中负电荷的电荷比为约1∶2至1.9∶2。
107.实施方案63、86和88至106中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
108.实施方案107所述的组合物，其中所述EDTA的浓度为约0.25mM至约5mM，或约2.5mM。
109.实施方案57至108中任一项所述的组合物，其还包含辅料。
110.实施方案57至109中任一项所述的组合物，其配制成用于全身性施用。
111.实施方案110所述的组合物，其中所述全身性施用是通过静脉内施用。
112.实施方案57至111中任一项所述的组合物，其用于治疗用途。
113.制备包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的方法，其包括将实施方案88至112中任一项所述的冷冻组合物解冻，以及任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度。
114.实施方案113所述的方法，其中添加水性液体以使所述组合物获得约200mOsmol/kg至约450mOsmol/kg的渗量浓度。
115.实施方案113或114所述的方法，其中添加水性液体以获得氯化钠浓度为约80mM至约150mM。
附图说明
图1示出了脂质储备溶液中脂质浓度与脂质体尺寸之间的相关性。通过在水中注射乙醇来制备脂质体(乙醇注射之后不进行过滤过程)。脂质体的尺寸随乙醇中的脂质浓度而提高。该实例：％摩尔比为66∶33的脂质混合物DOTMA/DOPE。
图2示出了在用不同浓度的不同脂质溶液制备的DOTMA/DOPE脂质体制剂中存在的颗粒量。
图3示出了脂质体前体尺寸(所使用的未经过滤脂质体胶体)对RNA-lipoplex尺寸的影响。当将小脂质体用于其形成时获得小RNA-lipoplex。在用较大脂质体制备的所有RNA-lipoplex中，未发现脂质体尺寸与RNA-lipoplex尺寸之间有明显的相关性。
图4示出了在用不同脂质体前体(未经过滤脂质体)制备的RNA-lipoplex制剂中存在的颗粒量。在用较大脂质体制备的RNA-lipoplex制剂中0.5μm颗粒的量提高。使用不同浓度的不同脂质储备溶液通过乙醇注射来制备脂质体。
图5示出了从来自RNA-lipoplex的SAXS测量获得的衍射曲线，所述RNA-lipoplex是用以4/1(顶部)的电荷比和1.3/2的电荷比制备的脂质体形成的，其中用于lipoplex形成的脂质体是用400mM、300mM和100mM的乙醇中的mM脂质储备溶液获得的。
图6示出了用不同脂质体前体制备的不同RNA-lipoplex的相关长度和体外转染效率(人树突细胞)。生物活性(体外RNA转染)随RNA-lipoplex的相关长度单调提高。脂质体是通过乙醇注射和在不同脂质浓度下制备的不同脂质储备溶液来制备的。
图7示出了来自由乙醇中的150mM储备溶液或乙醇中的400mM储备溶液制造的两种不同类型脂质体的lipoplex的AF4测量。
图8示出了树突细胞中不同RNA-lipoplex的体外转染效率。萤光素酶信号随用于RNA-lipoplex形成的脂质体尺寸单调提高。
图9示出了树突细胞中不同RNA-lipoplex的体外转染效率。萤光素酶信号随脂质体尺寸单调提高。
图10示出了在施加之后6小时RNA-lipoplex制剂的体内转染效率。RNA-lipoplex是用小的和大的脂质体(未经过滤脂质体)制备的。用较大脂质体制备的RNA-lipoplex得到较高的萤光素酶表达。
图11示出了在施加之后6小时RNA-lipoplex的体内成像。RNA-lipoplex是用小的和大的脂质体制备的。A)用来自原始胶体的小脂质体制备的RNA-lipoplex。B)用来自原始胶体的较大脂质体制备的RNA-lipoplex。C)用小的经过滤脂质体制备的RNA-lipoplex。D)用大的经过滤脂质体制备的RNA-lipoplex。用较大脂质体制备的RNA-lipoplex获得较高的生物发光信号。
图12示出了RNA lipoplex的自动化批量制造的一般性操作。
图13示出了使用内径为3.2mm的Y型混合元件在不同流量下制备的RNA lipoplex的Z-平均值和多分散性。
图14示出了使用内径为2.4mm的Y型混合元件在不同流量下制备的RNA lipoplex的Z-平均值和多分散性。
图15示出了lipoplex形成时颗粒尺寸与RNA浓度的相关性。PCS测量在冷冻之前进行。
图16示出了在三个冷冻解冻循环(freeze thaw cycle)之后lipoplex形成时颗粒特征与RNA浓度的相关性。
图17示出了颗粒特征与1.0∶2.0至2.1∶2.0的电荷比(正∶负)的相关性。
图18示出了颗粒特征与2.0∶1.0至5.0∶1.0的电荷比(正∶负)的相关性。
图19示出了在lipoplex形成时颗粒特征与NaCl浓度的相关性。
图20示出了在lipoplex形成时生物活性与NaCl浓度的相关性。
图21示出了在+40℃下加速储存之后，在数个pH值下使用不同缓冲物质(HEPES；乙酸钠；磷酸钠；碳酸钠)、没有冷冻保护剂的RNA(LIP)组合物中RNA完整性的测量。不同的条指示从左(3天)到右(21天)储存期提高。
图22示出了在+40℃下加速储存之后，在数个pH值下使用HEPES作为缓冲物质、用蔗糖作为冷冻保护剂的RNA lipoplex制剂中RNA完整性的测量。不同的条指示从左(1天)到右(21天)储存期提高。
图23示出了使用不同含量的EDTA在40℃下储存的lipoplex中RNA的完整性。
图24是显示在每个步骤中优化了NaCl和冷冻保护剂的浓度的总图。
图25示出了在存在递增量的替代冷冻保护剂的情况下，冷冻的RNA lipoplex的Z-平均值和多分散性。
图26示出了在存在递增量的替代冷冻保护剂的情况下，冷冻的RNA lipoplex制剂中≥10μm的亚可见(subvisible)颗粒的数目。
图27示出了在-30℃下冷冻之前和之后，包含5％w/v至20％w/v蔗糖(X轴)和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图28示出了在-30℃下冷冻之前和之后，包含5％w/v至20％w/v海藻糖二水合物(x轴)和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图29示出了在多次冷冻解冻循环之后，包含50mM NaCl和多种量(％w：V)海藻糖二水合物的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图30示出了在多次冷冻解冻循环之后，包含70mM NaCl和多种量(％w/v)海藻糖二水合物的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图31示出了在多次冷冻解冻循环之后，包含90mM NaCl和多种量(％w/v)海藻糖二水合物的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图32示出了在-15℃下储存8个月之后，包含5％w/v至20％w/v蔗糖和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。不同的条指示从左(0个月)到右(8个月)储存期提高。在少于8个条的蔗糖/NaCl组合中，在两个随后时间点颗粒尺寸超出规格，并且停止对其进行分析。
图33示出了在-30℃下储存8个月之后，包含5％w/v至20％w/v蔗糖和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。不同的条指示从左(0个月)到右(8个月)储存期提高。在少于8个条的蔗糖/NaCl组合中，在两个随后时间点颗粒尺寸超出规格，并且停止对其进行分析。
图34示出了在-15℃下储存8个月之后，包含5％w/v至20％w/v海藻糖二水合物和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。不同的条指示从左(0个月)到右(8个月)储存期提高。在少于8个条的海藻糖/NaCl组合中，在两个随后时间点颗粒尺寸超出规格，并且停止对其进行分析。
图35示出了在-30℃下储存8个月之后，包含5％w/v至20％w/v海藻糖二水合物和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。不同的条指示从左(0个月)到右(8个月)储存期提高。在少于8个条的海藻糖/NaCl组合中，在两个随后时间点颗粒尺寸超出规格，并且停止对其进行分析。
图36示出了在-20℃下储存之后，包含22％w/v蔗糖和多种低NaCl浓度的RNAlipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图37示出了在-20℃下储存之后，包含22％w/v海藻糖二水合物和多种低NaCl浓度的RNA lipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图38示出了在-20℃下储存之后，包含22％w/v葡萄糖和多种低NaCl浓度的RNAlipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图39示出了在-15℃至-40℃下冷冻并储存的包含22％w/v蔗糖和20mM NaCl的RNAlipoplex制剂中颗粒尺寸的测量。
图40示出了在-20℃下储存之后，在包含表10中列出的冷冻保护剂组合的组合物中冷冻的RNA lipoplex的颗粒尺寸的测量。
图41示出了冷冻-解冻之后或者冷冻-干燥和重构之后，RNA lipoplex制剂[RNA(lip)]制剂中海藻糖浓度的作用。
图42示出了在用0.9％NaCl溶液或WFI(注射用水)重构之后，以22％海藻糖制备的经冷冻干燥的RNA(lip)制剂的颗粒尺寸变化。
图43示出了在不同NaCl浓度下以22％海藻糖制备的经冷冻干燥的RNA lipoplex制剂[RNA(lip)]的Luc-RNA体外转染。经冷冻干燥的样品用0.9％NaCl溶液重构。(纹理化柱：液体对照)。
图44示出了用0.9％NaCl溶液重构之后，在2℃至8℃或25℃下储存的以不同的海藻糖/NaCl比例配制的经冷冻干燥的RNA lipoplex制剂[RNA(lip)]的Z平均直径。冷冻干燥之后，将制剂以原始体积重构。
图45示出了用0.9％NaCl溶液重构并在2℃至8℃或25℃下储存之后，以不同海藻糖/NaCl比例配制的经冷冻干燥的RNA(lip)的RNA完整性(％全长RNA)。冷冻干燥之后，将制剂以原始体积重构，并用0.9％NaCl溶液以1∶1稀释用于细胞培养实验(0.01mg/mL RNA)。
图46示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图47示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的多分散性的测量。虚线示出了多分散性指数的预期规格限制为0.5。
图48示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的pH的测量。
图49示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的预期规格限制。
图50示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图51示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的多分散性的测量。虚线示出了多分散性指数的预期规格限制为0.5。还可看出，在存在较低浓度NaCl的情况下，较低的蔗糖浓度足以有效稳定冷冻状态下RNA lipoplex的胶体特性。
图52示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的pH的测量。
图53示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的预期规格限制。
图54示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图55示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的多分散性指数的测量。虚线示出了多分散性指数的预期规格限制为0.5。
图56示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的pH的测量。
图57示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的规格限制。
图58示出了在冷冻之前和之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的颗粒尺寸转变。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图59示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图60示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的多分散性的测量。虚线示出了多分散性指数的预期规格限制为0.5。
图61示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的pH的测量。
图62示出了在-15℃下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNA lipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的预期规格限制。
图63示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同HEPES缓冲剂浓度和pH的RNAlipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。在50天之后测量的颗粒尺寸被认为是异常值(outliner)。
图64示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同HEPES缓冲剂浓度和pH的RNAlipoplex组合物的多分散性指数的测量。虚线示出了多分散性指数的规格限制为0.5。
图65示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同HEPES缓冲剂浓度和pH的RNA1ipoplex组合物的pH的测量。
图66示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同HEPES缓冲剂浓度和pH的RNAlipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的规格限制。
图67示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的颗粒尺寸的测量。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图68示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的多分散性指数的测量。虚线示出了多分散性指数的预期规格限制为0.5。
图69示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的pH的测量。
图70示出了在加速条件(+25℃)下储存之后包含不同缓冲物质和pH的RNAlipoplex组合物的RNA完整性的测量。虚线示出了≥80％完整全长RNA的预期规格限制。
图71示出了在冷冻之前和之后包含降低浓度的蔗糖和NaCl的RNA lipoplex组合物的颗粒尺寸转变。虚线示出了颗粒尺寸的预期规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图72：药物产品制剂改变的概述
A：表A示出了当前制剂和推荐制剂之间的差异。
为了简化制造过程和降低生产成本，对以下方面进行了研究，并应实施以下修改。
用1.1mM乙酸酸化提高了脂质体的稳定性。改变RNA药物物质缓冲剂以简化过程(添加100mM NaCl，并将pH值改变为pH 7.0，以补偿乙酸引起的pH改变，并提高RNA稳定性。将药物产品中的RNA浓度从0.05mg/mL降至0.025mg/mL，使得产品随时可用，其无需稀释即可直接施用。无需床边稀释，并简化了低剂量的处理。从7.5mM HEPES降低至5.0mM HEPES，以降低离子强度，且不影响pH稳定性。EDTA二钠盐的含量没有改变，并被发现可作为缓冲剂。EDTA二钠盐在药物产品生产过程中稳定pH。用于RNA控制的NaCl含量保持不变。药物产品中NaCl的减少使得由于溶液离子强度降低而蔗糖含量降低。蔗糖降至13％(w/v)可节约成本，且不影响稳定性，并且是接近生理渗量浓度所必需的。无需床边稀释。将pH值提高至pH6.7，以提高RNA的稳定性。
B：表B示出了为开发推荐制剂而研究的范围。该表包括RNA、DOTMA、DOPE、HEPES、EDTA二钠盐、蔗糖、NaCl、乙酸的研究的浓度范围以及研究的pH范围。
图73：在3种不同温度下测量的，在不同乙酸浓度下作为时间函数的脂质体中DOPE的稳定性的研究。
A：在4℃的温度下脂质体与0mM至3.0mM乙酸一起储存。
B：在25℃的温度下脂质体与0mM至1.6mM乙酸一起储存。
C：在40℃的温度下脂质体与0mM至3.0mM乙酸一起储存。
发现酸化导致脂质体中的DOPE水解速率降低。在所有测量温度下，稳定性均随着乙酸浓度的提高而提高。1.1mM的乙酸浓度是优选的，因为它可以在对已经存在的脂质体制造过程进行略微修改之后实现。在较低的乙酸浓度下已经可以观察到稳定作用。添加乙酸之后，稳定效力呈线性相关，当乙酸浓度高于约为1mM时，会转变为平稳期。
图74：RNA药物物质缓冲剂和RNA浓度：为过程简化而进行的调整
该表中示出了开发的RNA药物物质制剂。它允许将RNA药物物质处理成RNAlipoplex，而不需要调节浓度和张力。固定和轻微提高的缓冲剂和EDTA二钠盐浓度以及pH调节提高了过程的再现性，并允许补偿脂质体中的乙酸引起的pH改变(RNA lipoplex形成时可预测的pH改变)。在RNA lipoplex形成过程中，处理参数例如RNA浓度和离子条件保持相似，使得改变风险较低。在pH 7.0时，RNA药物物质稳定性提高。
图75：RNA浓度调整至0.025mg/mL。
对于所考虑的所有情况，药物产品中25μg/mL的RNA浓度使得剂量体积与1mL注射器上的主要刻度一致。这些剂量体积便于HCP正确测量和给药。
图76：HEPES含量：降低至5.0mM。
A：图A包括对于不同缓冲剂体系(HEPES、组氨酸和乙酸钠)在25℃下随时间的药物产品中RNA稳定性。在相关pH范围(pH 6.4至7.0)内，HEPES对药物产品中的RNA提供一些独特的稳定作用(优于组氨酸、MES(未示出)和乙酸钠(pH 5.5至5.8))，使得药物产品中RNA稳定性显著增强。HEPES有助于在RNA与含有乙酸的脂质体混合期间控制pH。发现HEPES在pH 6至7时的缓冲能力足以长期稳定pH。
B：图B示出了在25℃下孵育之后，在选定的pH 6.7下在不同HEPES浓度下随时间的药物产品中的RNA完整性。发现2.5mM至10.0mM的浓度范围产生相当的pH和RNA稳定性。为了降低离子负荷，将药物产品中的HEPES浓度从7.5mM降低至5.0mM。
图77：EDTA二钠盐含量：2.5mM时不变
A：图A中示出了在-15℃下储存时，在不同量的EDTA二钠盐和不同pH下的RNAlipoplex的颗粒尺寸。与用含EDTA二钠盐的药物物质缓冲剂制备的RNA lipoplex相比，不使用EDTA二钠盐制备的RNA lipoplex产生更大的颗粒尺寸。对于0.4mM至2.5mM EDTA二钠盐以及pH 6.5和7.0，含EDTA二钠盐药物产品的RNA lipoplex颗粒尺寸相当。在RNAlipoplex形成过程中，含EDTA二钠盐的两组的EDTA二钠盐浓度相同。最终EDTA二钠盐浓度通过随后的RNA lipoplex稀释进行调整。EDTA二钠盐在RNA lipoplex形成过程中有助于pH稳定(0mM EDTA二钠盐导致RNA lipoplex形成过程中的pH改变、RNA lipoplex颗粒尺寸增大以及药物产品中RNA稳定性降低(图77B))。
B：图B示出了在25℃下孵育之后，在不同EDTA二钠盐浓度下随时间的药物产品中的RNA完整性。发现药物产品中在0.4mM至2.5mM EDTA二钠盐之间的RNA稳定性相当，而与pH6.5相比，pH 7.0时RNA稳定性略高。药物物质缓冲剂中EDTA二钠盐的缺乏(在药物产品中0mM EDTA二钠盐)导致RNA lipoplex形成过程中的pH改变，这导致药物产品中RNA稳定性降低和RNA lipoplex颗粒尺寸增大(图77A))。
图78：NaCl浓度降至8.2mM。
图中示出了在-15℃下与不同量的NaCl和不同量的蔗糖一起储存的RNA lipoplex的颗粒尺寸。NaCl含量对冷冻状态下RNA lipoplex的长期胶体稳定性至关重要(越低越好)。在RNA lipoplex形成过程中NaCl浓度应保持不变，但DP中的NaCl浓度应尽可能降至最低值。
图79：蔗糖作为冷冻保护剂确保药物产品的胶体稳定性
A：与当前标称制剂(BM1)相比，具有最坏情况组成(药物产品中离子负荷更高且RNA浓度提高)的RNA lipoplex的颗粒尺寸。不同组的蔗糖浓度不同(8％(w/v)至14％(w/v)；BM1＝22％(w/v))，并在-15℃下储存12个月。由于离子组分的浓度提高，冷冻药物产品(8％(w/v)至14％(w/v)蔗糖)之后RNA lipoplex的尺寸增加。与较低蔗糖浓度(8％(w/v)至12％(w/v))相比，较高蔗糖浓度(12％(w/v)至14％(w/v))使得RNA lipoplex尺寸稳定性更好。RNA lipoplex的颗粒尺寸随时间仅略有提高。
B：将具有最坏情况组成(药物产品中离子负荷更高且RNA浓度提高)和具有10％(w/v)蔗糖的标称组成的RNA lipoplex的AF4尺寸分布谱与当前标称制剂的进行比较。不同组的蔗糖浓度不同(8％(w/v)至14％(w/v)；BM1＝22％(w/v))，并在-15℃下储存12个月。使用AF4系统分析样品，其中洗脱的组分作为其流体动力学半径(Rh)的函数。
一般而言，所有颗粒在25分钟至70分钟的洗脱时间下均出现光散射峰，在较长洗脱时间下峰形略有差异。此外，具有最坏情况组成和降低的蔗糖浓度的样品显示出峰最大值向更长洗脱时间移动，表明颗粒随时间发生变化。当与含12％(w/v)和14％(w/v)蔗糖的最坏情况样品相比时，含10％(w/v)蔗糖的标称组成的洗脱曲线表现出轻微改变。含有12％(w/v)和14％(w/v)蔗糖的最坏情况样品的相当的洗脱曲线表明，蔗糖浓度提高至超过12％(w/v)不会导致稳定性进一步提高。根据AF4数据，应考虑至少为12％(w/v)的蔗糖浓度，以确保药物产品的长期稳定性，即使在最坏情况条件下也是如此。
图80：pH值：提高至pH 6.7。
A：在25℃下孵育之后，在不同pH(pH 6.2、6.7和7.2)下，含HEPES缓冲剂的lipoplex药物产品中的RNA完整性。发现HEPES的最佳pH值范围为pH 6.7至pH 7.2，这使得RNA的稳定性明显优于pH 6.2时。在冷冻状态下，未发现pH 5.5至7.2与不同缓冲剂体系组合的差异(数据未示出)。为了优化液体状态下的RNA稳定性，RNA lipoplex药物产品的pH应改为pH 6.7。
B：在25℃下孵育之后，在不同pH(pH 6.0、6.5和7.0)下，含有HEPES缓冲剂和2.5mMEDTA二钠盐的lipoplex药物产品中的RNA完整性。与图80A所示结果一致，发现最佳pH值范围为pH 6.5至pH 7.0，而pH 6.0确实导致RNA稳定性显著更低。此外，EDTA二钠盐的螯合效力取决于pH，在pH 6.5与pH 7.0之间未发现药物产品中RNA稳定性的差异。为了优化液体状态下的RNA稳定性，RNA lipoplex药物产品的pH应改为pH 6.7。
图81：具有不同蔗糖浓度且在脂质体中含有乙酸和不含有乙酸的制剂的可比性。
A：表A示出了测试制剂的详细说明。将含有10％(w/v)蔗糖且在脂质体中含和不含有乙酸的所述制剂与含有22％(w/v)蔗糖的基准制剂进行比较。
B：通过PCS测量各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的颗粒尺寸。未发现不同产品的尺寸和多分散性的差异。给出了所有单独制剂的批间再现性。
C：各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNAlipoplex药物产品的体外萤光素酶信号强度。所有制剂的体外翻译是相当的。
D：各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNAlipoplex药物产品的体内萤光素酶信号强度。所有制剂的体内萤光素酶信号强度是相当的。
图82：具有不同蔗糖浓度且在脂质体中含和不含乙酸的不同制剂的稳定性。
A：在表A中，示出了测试制剂的详细说明。将含有10％(w/v)蔗糖且在脂质体中含和不含乙酸的所述制剂与含有22％(w/v)蔗糖的基准制剂进行比较。
B：在-20℃下储存13个月之后通过PCS测量各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.Xw/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的颗粒尺寸。未发现不同产品的尺寸存在差异。
所有测量的制剂的稳定性是相当的。
C：在-20℃下储存13个月之后，各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的体外萤光素酶信号强度。所有制剂的体外翻译是相当的。
具体实施方式
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述一些特定实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本公开内容的范围。除非另外限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，将本文中所用的术语定义为如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC RecommendationS)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.
Figure BDA0004156329990000481
编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)中所述。
除非另外指出，否则本公开内容的实践将采用本领域的文献中阐明的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术方法(参见例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应当理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。多种不同描述的实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述的要素的任何排列和组合应认为被本说明书公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％，或±3％。
除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为表示一个/种和/或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在所述范围内的各个单独值的速记法。除非本文中另外指出，否则各个单独值被并入本说明书中，就像其在本文中被单独记载。除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则本文中所述所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求的范围提出限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实施本公开内容必需的任何未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以表示除了由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由...组成”的含义。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、用法指导等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这些公开内容。
定义
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
如本文中所使用的，术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更多、约10％或更多、约20％或更多、约50％或更多，或约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。
在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％，或至少约100％。
如本文中所使用的，“生理pH”是指约7.5的pH。
如本公开内容中所使用的，“％w/v”是指按体积计的重量百分比，其是测量溶质的量(以克(g)计)的浓度单位，表示为溶液总体积(以毫升(mL)计)的百分比。
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类的离子物质的数量与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上由下式表示
Figure BDA0004156329990000501
/>
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和∑取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
根据本公开内容，在一个实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止RNA的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解RNA核苷酸之间磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。
“渗量浓度”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质的渗透压摩尔数(osmole)。
雷诺数是一个无量纲数，其可使用下式来计算：
Figure BDA0004156329990000511
其中p是流体的密度，v是流体的速度，l是特征长度(在此是混合元件的内径)，并且η是黏度。
术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。
术语“冻干”是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力以使物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，产生干燥粉末。
术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。
术语“冻干保护剂”涉及添加至制剂以在干燥阶段期间保护活性成分的物质。
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。
在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传工程制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物质”不是天然存在的。
如本文中所使用的，术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”是指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。
术语“平衡溶解度”是指这样的溶质浓度，在该浓度下溶质溶解的速率与溶质从溶液中沉积出来的速率相同。在一个实施方案中，该术语涉及室温下的相应浓度。
如本文中所使用的，术语“室温”是指大于4℃的温度，优选约15℃至约40℃、约15℃至约30℃、约15℃至约24℃，或约16℃至约21℃。这样的温度将包括14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA lipoplex颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNAlipoplex颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒是纳米颗粒。
如本公开内容中所使用的，“纳米颗粒”是指包含RNA和至少一种阳离子脂质并且具有适合于静脉内施用的平均直径的颗粒。
术语“平均直径”是指如通过动态光散射(DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，所述累积量算法的结果是提供具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel，D.，J.Chem.Phys.57，1972，pp4814-4820，ISO 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该Z平均值的值同义使用。
术语“多分散性指数”在本文中用作颗粒(例如，纳米颗粒)系综(ensemble)的尺寸分布的量度。基于动态光散射测量通过所谓的累积量分析来计算多分散性指数。
如本文中所使用的，“亚可见颗粒”是指平均直径小于100微米(μm)的颗粒。亚可见颗粒的数目可使用光遮蔽(light obscuration)来测量，以指示本公开内容中RNAlipoplex颗粒的聚集程度。在一些实施方案中，测量了平均直径大于或等于10μm的亚可见颗粒的数目。在另一些实施方案中，测量了平均直径大于或等于25μm的亚可见颗粒的数目。
术语“乙醇注射技术”是指其中通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该作用将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成例如脂质体形成。一般来说，本文中所述的RNA lipoplex颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体来获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，如下形成这样的胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子脂质(如DOTMA)和另外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的RNA lipoplex颗粒无需挤出步骤即可获得。
术语“挤出”是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的小型化，由此迫使颗粒通过具有限定孔的滤器。
术语海藻糖通常是指无水海藻糖和海藻糖二水合物二者。海藻糖的所有浓度均相对于海藻糖二水合物给出。
术语EDTA是指乙二胺四乙酸二钠盐。所有浓度均相对于EDTA二钠盐给出。
RNA lipoplex颗粒直径
本文中所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径在一个实施方案中为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约400nm。
本文中所述的RNA lipoplex颗粒(例如通过本文中所述的方法产生的)表现出小于约0.5、小于约0.4或小于约0.3的多分散性指数。举例来说，RNA lipoplex颗粒可表现出约0.1至约0.3的多分散性指数。
脂质
在一个实施方案中，本文中所述的脂质溶液、脂质体和RNA lipoplex颗粒包含阳离子脂质。如本文中所使用的，“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用与脂质基质与带负电荷的RNA结合。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双二十八烷基铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基铵(2，3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，所述至少一种阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质是DOTMA，特别是(R)-DOTMA。
可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和RNA lipoplex颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。如本文中所使用的，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC))、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，第二脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。不希望受到理论的束缚，与所述至少一种另外的脂质的量相比，所述至少一种阳离子脂质的量可影响重要的RNAlipoplex颗粒特征，例如电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和RNA的生物活性。因此，在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2，或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1，或约1∶1。在一个示例性实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。
RNA
在本公开内容中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文中所使用的，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2′-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白质的RNA转录物相关的信使RNA(mRNA)。如本领域中认可的，mRNA通常包含5′非翻译区(5′-UTR)、肽编码区和3′非翻译区(3′-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的RNA lipoplex组合物中的RNA的浓度为约0.01mg/mL至约1mg/mL，或约0.05mg/mL至约0.5mg/mL。在一些具体实施方案中，RNA的浓度为约0.01mg/mL、约0.02mg/mL、约0.03mg/mL、约0.04mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.10mg/mL、约0.11mg/mL、约0.12mg/mL、约0.13mg/mL、约0.14mg/mL、约0.15mg/mL、约0.16mg/mL、约0.17mg/mL、约0.18mg/mL、约0.19mg/mL、约0.20mg/mL、约0.21mg/mL、约0.22mg/mL、约0.23mg/mL、约0.24mg/mL、约0.25mg/mL、约0.26mg/mL、约0.27mg/mL、约0.28mg/mL、约0.29mg/mL、约0.30mg/mL、约0.31mg/mL、约0.32mg/mL、约0.33mg/mL、约0.34mg/mL、约0.35mg/mL、约0.36mg/mL、约0.37mg/mL、约0.38mg/mL、约0.39mg/mL、约0.40mg/mL、约0.41mg/mL、约0.42mg/mL、约0.43mg/mL、约0.44mg/mL、约0.45mg/mL、约0.46mg/mL、约0.47mg/mL、约0.48mg/mL、约0.49mg/mL或约0.50mg/mL。在一个示例性实施方案中，RNA的浓度为约0.02mg/mL或约0.05mg/mL。
在一个实施方案中，RNA可具有经修饰核糖核苷酸。经修饰核糖核苷酸的一些实例包括但不限于5-甲基胞苷和假尿苷。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5′-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5′-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5′-帽类似物修饰。术语“5′-帽”是指见于mRNA分子的5′-端的结构，并且通常由通过5′至5′三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5′-帽或5′-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5′-帽共同转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶转录后与RNA连接。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5′-UTR和/或3′-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5′′(上游)(5′-UTR)和/或开放阅读框的3′′(下游)(3′-UTR)。5′-UTR(如果存在的话)位于5′端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5′-UTR位于5′-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5′帽相邻。3′-UTR(如果存在的话)位于3′端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3′-UTR”优选不包含poly(A)尾。因此，3′-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3′-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及通常位于RNA分子的3′端的腺苷酸(A)残基的序列。根据本公开内容，在一个实施方案中，poly(A)序列包含至少约20、至少约40、至少约80或至少约100，并且多至约500、多至约400、多至约300、多至约200或多至约150A核苷酸，并且特别是约120A核苷酸。
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可翻译成肽或蛋白质。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mRNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质的在细胞的核糖体中的过程。
在一个实施方案中，在施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA是编码肽或蛋白质的RNA，并且RNA被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。因此，本文中所述的RNAlipoplex颗粒可用于将RNA递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将RNA递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒。在一个实施方案中，RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA是编码肽或蛋白质的RNA，并且RNA被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。
在一个实施方案中，RNA编码药物活性肽或蛋白质。
根据本公开内容，术语“RNA编码”意指，如果存在于合适环境中，例如靶组织的细胞内，则RNA可在翻译过程中指导氨基酸的组装以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，RNA能够与细胞翻译机器相互作用，从而允许肽或蛋白质的翻译。细胞可在细胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)产生编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可使其在表面上产生。
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。
“药物活性肽或蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的状况或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可以施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。药物活性肽或蛋白质可以具有预防特性，并且可以用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，并且也可以是指其药物活性片段。其还可以包括肽或蛋白质的药物活性类似物。
药物活性蛋白的一些实例包括但不限于细胞因子和免疫系统蛋白，例如免疫活性化合物(例如白介素、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干扰素、整联蛋白、地址素(addressin)、选择蛋白(seletin)、归巢受体(homing receptor)、T细胞受体、免疫球蛋白、可溶性主要组织相容性复合体抗原、免疫活性抗原例如细菌、寄生物或病毒抗原、变应原、自身抗原、抗体)、激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素(trophic hormone)、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素等)、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)、生长因子受体、酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成性或降解性、类固醇生成酶(steriodogenic enzyme)、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脱甲基酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶(neuramidase)等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白(例如抑制血管生成的蛋白质)、结构蛋白(例如胶原蛋白、丝心蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、冯·维勒布兰德因子(von Wilebrand factor)、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或经修饰因子VIII、抗凝剂等。
术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答，例如通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟、诱导和/或抑制细胞因子生物合成和/或通过刺激B细胞产生抗体改变体液免疫来改变免疫应答的任何化合物。免疫活性化合物具有强效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从TH2免疫应答转移，这可用于治疗广泛多种TH2介导的疾病。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含一种或更多种抗原或者一种或更多种表位，即，向对象施用所述肽或蛋白质在对象中引发针对所述一种或更多种抗原或者一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。
术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包含蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞如树突细胞或巨噬细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位，通过T或B细胞受体或通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗性目的。疾病相关抗原可与微生物(通常是微生物抗原)感染相关或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可源自细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌成分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包含T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的背景下存在时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex)”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入微生物的片段)二者。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位。在某些实施方案中，表位来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，它对个体的肿瘤具有特异性，并且以前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，pl90小BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，存活蛋自，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。
癌症突变因个体而异。因此，编码新表位的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。存在于脾中的树突细胞(dendritic cell，DC)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已示出多种表位的使用促进肿瘤疫苗组合物中的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可由本文中所述的RNA编码，例如作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的RNA和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的RNA。
电荷比
本公开内容的RNA lipoplex颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下等式来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。RNA的浓度和至少一种阳离子脂质的量可由本领域技术人员使用常规方法来确定。
在第一实施方案中，在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2至约1∶2。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2.0、约1.8∶2.0、约1.7∶2.0、约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。在一个实施方案中，在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.3∶2.0。在另一个实施方案中，在生理pH下，本文中所述的RNA lipoplex颗粒可具有相等数目的正电荷和负电荷，从而产生具有净中性电荷比的RNAlipoplex颗粒。
在第二实施方案中，在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约6∶1至约1.5∶1。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约6.0∶1.0、约5.9∶1.0、约5.8∶1.0、约5.7∶1.0、约5.6∶1.0、约5.5∶1.0、约5.4∶1.0、约5.3∶1.0、约5.2∶1.0、约5.1∶1.0、约5.0∶1.0、约4.9∶1.0、约4.8∶1.0、约4.7∶1.0、约4.6∶1.0、约4.5∶1.0、约4.4∶1.0、约4.3∶1.0、约4.2∶1.0、约4.1∶1.0、约4.0∶1.0、约3.9∶1.0、约3.8∶1.0、约3.7∶1.0、约3.6∶1.0、约3.5∶1.0、约3.4∶1.0、约3.3∶1.0、约3.2∶1.0、约3.1∶1.0、约3.0∶1.0、约2.9∶1.0、约2.8∶1.0、约2.7∶1.0、约2.6∶1.0、约2.5∶1.0、约2.4∶1.0、约2.3∶1.0、约2.2∶1.0、约2.1∶1.0、约2.0∶1.0、约1.9∶1.0、约1.8∶1.0、约1.7∶1.0、约1.6∶1.0或约1.5∶1.0。
对于基于RNA的免疫治疗，需要靶向精确的器官(例如脾)以避免其他器官中的自身免疫应答和潜在的毒性。根据本公开内容，RNA可靶向不同的细胞、组织或器官。
已经发现，具有根据第一实施方案的电荷比的RNA lipoplex颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在一个实施方案中，在RNAlipoplex颗粒的施用之后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNAlipoplex颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在RNA lipoplex颗粒的施用之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积累和/或RNA表达发生。在一个实施方案中，在RNA lipoplex颗粒的施用之后，在脾中在抗原呈递细胞例如专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA lipoplex颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
已经发现，具有根据第二实施方案的电荷比的RNA lipoplex颗粒可以用于优先靶向肺组织或肺细胞。因此，在一个实施方案中，在RNA lipoplex颗粒的施用之后，在肺中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA lipoplex颗粒可用于在肺中表达RNA。因此，如果期望在除脾之外的组织中表达RNA，则在关于根据第一实施方案的电荷比(例如，约1∶2至约1.9∶2的电荷比)的本文中所述的一些实施方案中，根据第二实施方案的电荷比(例如，约6∶1至约1.5∶1的电荷比)可用于替代根据第一实施方案的电荷比。在本文中所述的这些和另一些实施方案中，可使用除编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA之外的RNA，例如编码本文中所述的药物活性肽或蛋白质的RNA。在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质是细胞因子和/或旨在治疗肺癌。
包含RNA lipoplex颗粒的组合物
A.盐和离子强度
根据本公开内容，本文中所述的组合物可包含盐，例如氯化钠。不希望受到理论的束缚，氯化钠在与至少一种阳离子脂质混合之前，用作用于预处理RNA的离子渗量浓度剂。在本公开内容中，某些实施方案考虑了氯化钠的替代有机盐或无机盐。替代盐包括但不限于：氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)钠盐。
通常，包含本文中所述RNA lipoplex颗粒的组合物包含浓度优选为0mM至约500mM、约5mM至约400mM或约10mM至约300mM的氯化钠。在一个实施方案中，包含RNAlipoplex颗粒的组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
通常，用于由RNA和脂质体形成RNA lipoplex颗粒的组合物或由RNA和脂质体形成RNA lipoplex颗粒所产生的组合物，例如本文中所述的那些，包含高氯化钠浓度或包含高离子强度。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为至少45mM。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约45mM至约300mM，或约50mM至约15OmM。在一个实施方案中，组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
通常，用于储存RNA lipoplex颗粒(例如用于冷冻RNA lipoplex颗粒，例如本文中所述的那些)的组合物包含低氯化钠浓度，或包含低离子强度。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为0mM至约50mM、0mM至约40mM或约10mM至约50mM。在一些具体实施方案中，氯化钠的浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM或约50mM。在一些优选实施方案中，氯化钠的浓度为约20mM、约30mM或约40mM。在一个示例性实施方案中，氯化钠的浓度为20mM。在另一个示例性实施方案中，氯化钠的浓度为30mM。在一个实施方案中，组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
通常，由使冷冻的RNA lipoplex颗粒组合物解冻和任选地通过添加水性液体来调整渗量浓度和离子强度而产生的组合物包含高氯化钠浓度，或包含高离子强度。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为约50mM至约300mM，或约80mM至约150mM。在一个实施方案中，组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
B.稳定剂
本文中所述的组合物可包含稳定剂以在冷冻、冻干或喷雾干燥以及经冷冻、经冻干或经喷雾干燥的组合物的储存期间避免产品品质的实质性损失，特别是避免RNA活性的实质性损失。这样的组合物在本文中也称为稳定的。通常，稳定剂在冷冻、冻干或喷雾干燥过程之前存在，并持续存在于所得的经冷冻、经冻干或经冷冻干燥的制剂中。其可用于在冷冻、冻干或喷雾干燥以及经冷冻、经冻干或经冷冻干燥的制剂的储存期间保护RNAlipoplex颗粒，例如降低或防止聚集、颗粒塌缩(collapse)、RNA降解和/或其他类型的损坏。
在一个实施方案中，稳定剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在一个实施方案中，稳定剂是单糖。本文中使用的术语“单糖”是指不能被水解成更简单的碳水化合物单元的单一碳水化合物单元(例如，简单的糖)。一些示例性的单糖稳定剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。
在一个实施方案中，稳定剂是二糖。本文中使用的术语“二糖”是指由两个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起。二糖可被水解成两个单糖。一些示例性的二糖稳定剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。
术语“三糖”意指连接在一起以形成一个分子的三个糖。三糖的一些实例包括棉子糖和松三糖。
在一个实施方案中，稳定剂是寡糖。本文中使用的术语“寡糖”是指由3至约15个、优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起以形成线性、分支或环状的结构。一些示例性的寡糖稳定剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。
在一个实施方案中，稳定剂是环状寡糖。本文中使用的术语“环状寡糖”是指由3至约15个、优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起以形成环状结构。一些示例性的环状寡糖稳定剂包括为离散化合物的环状寡糖，例如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
另一些示例性的环状寡糖稳定剂包括在较大的分子结构中包含环糊精部分的化合物，例如含有环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。本文中使用的术语“环糊精部分”是指并入到较大分子结构(例如聚合物)或其一部分中的环糊精(例如，α、β或γ环糊精)基团。环糊精部分可直接或通过任选的接头与一个或更多个另外的部分键合。环糊精部分可被氧化或还原，例如被氧化成二羰基形式。
碳水化合物稳定剂，例如环状寡糖稳定剂，可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，稳定剂是衍生的环状寡糖，例如衍生的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精，例如部分醚化的环糊精(例如部分醚化的β-环糊精)。
一个示例性的稳定剂是多糖。本文中使用的术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，并且包括包含多糖作为其骨架结构的一部分的聚合物，所述单糖单元通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起以形成线性、分支或环状的结构。在骨架中，多糖可以是线性或环状的。一些示例性的多糖稳定剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。
在一个实施方案中，稳定剂是糖醇。本文中使用的术语“糖醇”是指“糖”的还原产物，并且表示简单糖醇分子中的所有氧原子均以羟基形式存在。糖醇是“多元醇(polyol)”。该术语是指包含三个或更多个羟基的化合物，并且与另一个常用术语多元醇(polyhydricalcohol)同义。糖醇的一些实例包括但不限于：山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、甘油、木糖醇或肌醇。
根据本公开内容，提供了包含蔗糖作为稳定剂的药物组合物。不希望受到理论的束缚，蔗糖的功能是促进组合物的冷冻保护，从而防止RNA lipoplex颗粒聚集并维持组合物的化学和物理稳定性。在本公开内容中某些实施方案考虑了蔗糖的替代稳定剂。替代稳定剂包括但不限于：海藻糖、葡萄糖、果糖、精氨酸、甘油、甘露糖醇、脯氨酸、山梨糖醇、甘氨酸甜菜碱和葡聚糖。在一个具体实施方案中，蔗糖的替代稳定剂是海藻糖。
在一个实施方案中，稳定剂的浓度为约5％(w/v)至约35％(w/v)，或约10％(w/v)至约25％(w/v)。在一些具体实施方案中，稳定剂的浓度为约10％(w/v)、约11％(w/v)、约12％(w/v)、约13％(w/v)、约14％(w/v)、约15％(w/v)、约16％(w/v)、约17％(w/v)、约18％(w/v)、约19％(w/v)、约20％(w/v)、约21％(w/v)、约22％(w/v)、约23％(w/v)、约24％(w/v)或约25％(w/v)。在一个优选实施方案中，稳定剂的浓度为约15％(w/v)至约25％(w/v)。在另一个优选实施方案中，稳定剂的浓度为约20％(w/v)至约25％(w/v)。在一个示例性实施方案中，稳定剂的浓度为约25％(w/v)。在另一个示例性实施方案中，稳定剂的浓度为约22％(w/v)。在本公开内容的一些实施方案中，稳定剂是蔗糖或海藻糖。在本公开内容的一个实施方案中，稳定剂是蔗糖。在本公开内容的一个实施方案中，稳定剂是海藻糖。
根据本公开内容，本文中所述的RNA lipoplex颗粒组合物具有适合于组合物的稳定性，特别是RNA lipoplex颗粒的稳定性和RNA的稳定性的稳定剂浓度。
C.pH和缓冲剂
根据本公开内容，本文中所述的RNA lipoplex颗粒组合物具有适合于RNAlipoplex颗粒的稳定性，特别是适于RNA的稳定性的pH。在一个实施方案中，本文中所述的RNA lipoplex颗粒组合物的pH为约5.7至约6.7。在一些具体实施方案中，组合物的pH为约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6或约6.7。
根据本公开内容，提供了包含缓冲剂的组合物。不希望受到理论的束缚，缓冲剂的使用在组合物的制造、储存和使用期间维持组合物的pH。在本公开内容的某些实施方案中，缓冲剂可以是碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酸(Bicine)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(Tris)、N-(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(Tricine)、3-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(TAPSO)、2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(HEPES)、2-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、1，4-哌嗪二乙烷磺酸(PIPES)、二甲基次胂酸、2-吗啉-4-基乙烷磺酸(MES)、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。另外的合适的缓冲剂可以是乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
在一些实施方案中，缓冲剂的pH为约5.7至约6.7。在一些具体实施方案中，缓冲剂的pH为约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6或约6.7。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。在一个优选实施方案中，HEPES的pH为约5.7至约6.7。在一些具体实施方案中，HEPES的pH为约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6或约6.7。在一个示例性实施方案中，HEPES的pH为约6.2。
在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度为约2.5mM至约10mM。在其中HEPES为缓冲剂的一些具体实施方案中，HEPES的浓度为约2.5mM、约2.75mM、3.0mM、约3.25mM、约3.5mM、约3.75mM、约4.0mM、约4.25mM、约4.5mM、约4.75mM、约5.0mM、约5.25mM、约5.5mM、约5.75mM、约6.0mM、约6.25mM、约6.5mM、约6.75mM、约7.0mM、约7.25mM、约7.5mM、约7.75mM、约8.0mM、约8.25mM、约8.5mM、约8.75mM、约9.0mM、约9.25mM、约9.5mM、约9.75mM或约10.0mM。在一个优选实施方案中，HEPES的浓度为约7.5mM。
D.螯合剂
本公开内容的某些实施方案考虑使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外地诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA盐、去铁敏B(desferrioxamineB)、去铁胺(deferoxamine)、二硫代氨基甲酸钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、戊酸钙、戊酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、双(氨基乙基)乙二醇醚-N，N，N’，N’-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸，或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二水合二钠。
在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.25mM至约5mM。在一些具体实施方案中，EDTA的浓度为约0.25mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM或约5.0mM。在一个优选实施方案中，EDTA的浓度为约2.5mM。
E.本公开内容的一些示例性组合物
在一个示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的组合物包含摩尔比为约2∶1至约1∶1的DOTMA和DOPE以及浓度为约0.05mg/mL的编码至少一个表位的RNA，其中在生理pH下RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.3∶2.0；氯化钠的浓度为约20mM；蔗糖的浓度为约22％(w/v)；HEPES的浓度为约7.5mM，pH为约6.2；并且EDTA的浓度为约2.5mM。在另一些具体实施方案中，RNA编码五个表位或十个表位。
在另一个示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的组合物包含摩尔比为约2∶1至约1∶1的DOTMA和DOPE以及浓度为约0.05mg/mL的编码至少一个表位的RNA，其中在生理pH下RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.3∶2.0；氯化钠的浓度为约30mM；蔗糖的浓度为约20％(w/v)；HEPES的浓度为约7.5mM，pH为约6.2；并且EDTA的浓度为约2.5mM。在另一些具体实施方案中，RNA编码五个表位或十个表位。
F.本公开内容的组合物的稳定性
本文中使用的“稳定”是指其中多种理化参数的测量值在限定范围内的组合物。在一个实施方案中，分析组合物以根据多种参数评估稳定性。根据本公开内容，稳定性参数包括但不限于：RNA lipoplex颗粒的平均直径、多分散性指数、RNA的完整性、RNA含量、pH、渗量浓度和亚可见颗粒的数目。本领域技术人员将能够使用常规实验室技术和仪器来测量这样的参数。例如，可以使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)、光阻(lightobscuration)、光谱法、琼脂糖凝胶电泳、生物分析仪或其他任何合适的技术来评估稳定性参数。在一个实施方案中，生物分析仪是能够测量RNA完整性和RNA含量二者的Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies)。在一个实施方案中，生物分析仪是AdvancedAnalytical的片段分析仪。
不希望受到理论的束缚，DLS测量可用于分析与本公开内容的RNA lipoplex颗粒有关的参数。在一个实施方案中，DLS可用于确定RNA lipoplex颗粒的平均直径，其以Z-平均值(平均颗粒尺寸的量度)的术语表示。在另一个实施方案中，DLS可用于确定RNAlipoplex颗粒的多分散性指数，其指示RNA lipoplex颗粒的尺寸和重量分布。
在某些实施方案中，当稳定性参数的测量值在限定范围内时，组合物是稳定的。在稳定的组合物的一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，RNA lipoplex颗粒的平均直径与原始平均直径(即，冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥和解冻或重构之前的平均直径)相差不超过±20％、±10％、±5％或±3％。在稳定的组合物的一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，RNA lipoplex颗粒的平均直径与原始平均直径(即，冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥和解冻或重构之前的平均直径)相比不大于20％、10％、5％或3％。在稳定的组合物的另一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，RNA lipoplex颗粒的多分散性指数与原始多分散性指数(即，冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥和解冻或重构之前的多分散性指数)相差不超过±20％、±10％、±5％或±3％。在一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，稳定的组合物具有不超过6,000个直径大于或等于10μm的亚可见颗粒。在一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，稳定的组合物具有不超过600个直径大于或等于25μm的亚可见颗粒。
在稳定的组合物的一个实施方案中，在储存之后，例如在约-15℃至约-40℃的温度下储存之后，RNA的完整性为至少80％。
在一个实施方案中，组合物在约-15℃至约-40℃的储存温度下是稳定的。在一些具体实施方案中，组合物在约-15℃、约-16℃、约-17℃、约-18℃、约-19℃、约-20℃、约-21℃、约-22℃、约-23℃、约-24℃、约-25℃、约-26℃、约-27℃、约-28℃、约-29℃、约-30℃、约-31℃、约-32℃、约-33℃、约-34℃、约-35℃、约-36℃、约-37℃、约-38℃、约-39℃或约-40℃的温度下是稳定的。在一个优选实施方案中，组合物在约-15℃、约-20℃、约-30℃或约-40℃的温度下是稳定的。
在一个实施方案中，当药物组合物避光时，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下是稳定的。在一个优选实施方案中，当组合物避光时，组合物在约-15℃至约-25℃的温度下是稳定的。
在一个实施方案中，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下至少1个月直至约24个月保持稳定。在一些具体实施方案中，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月、至少24个月、至少25个月、至少26个月、至少27个月、至少28个月、至少29个月、至少30个月、至少31个月、至少32个月、至少33个月、至少34个月、至少35个月或至少36个月保持稳定。
在一个优选实施方案中，组合物在约-15℃的温度下至少1个月保持稳定、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或至少6个月。
在另一个优选实施方案中，组合物在约-20℃的温度下至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或至少6个月保持稳定。
在另一个优选实施方案中，组合物在约-30℃的温度下至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或至少6个月保持稳定。
在一个实施方案中，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下冷冻并解冻至约4℃至约25℃的温度(环境温度)之后是稳定的。在另一个实施方案中，组合物在约-15℃至约-40℃的温度下冷冻并解冻至约4℃至约25℃的温度(环境温度)的多个冻融循环之后是稳定的。
G.本公开内容的组合物的物理状态
在一些实施方案中，本公开内容的组合物是液体或固体。固体的一些非限制性实例包括冷冻形式或经冻干的形式。在一个优选实施方案中，组合物是液体。
本公开内容的药物组合物
本文中所述的包含RNA lipoplex颗粒的组合物可用作用于治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物或用于制备这样的药物组合物或药物。
本公开内容的颗粒可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含本文中所述的RNA lipoplex颗粒。
本公开内容的药物组合物优选包含一种或更多种佐剂或可以与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如
Figure BDA0004156329990000711
ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学上有效的量”和“可药用制剂”应用。
术语“可药用的”是指不与药物组合物活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
术语“药学上有效的量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是所述疾病或所述病症的发作延迟或发作预防。本文中所述的颗粒或组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、身材大小和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的颗粒或组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在患者对初始剂量的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径有效地获得更高的剂量)。
本公开内容的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可以存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中。
可以根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
本公开内容的药物组合物的施用途径
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可以以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道以外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。
制品制造
在一个方面中，本文中所述的RNA lipoplex颗粒存在于药物组合物中。在另一个方面中，本文中所述的组合物是药物组合物。
在一个方面中，本公开内容涉及包含本文中所述的药物组合物的小瓶。在另一个方面中，本公开内容涉及包含本文中所述的药物组合物的注射器。
本公开内容的药物组合物的用途
本文中所述的RNA lipoplex颗粒可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是其中向对象提供肽或蛋白质导致治疗性或预防性作用的疾病。例如，提供源自病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗癌症疾病，在所述癌症疾病中癌细胞表达所述肿瘤抗原。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题，或所折磨个体死亡，或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。
在本发明背景中，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，降低个体中症状的频率或严重程度，和/或降低当前或以前患有疾病的个体中的复现性。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的患病细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，并且治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。
可以将包含本文中所述的RNA lipoplex颗粒的药物组合物施用于对象，以在对象中引发针对一种或更多种抗原或一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或部分或完全保护性的，所述RNA lipoplex颗粒包含编码包含一种或更多种抗原或一种或更多种表位的肽或蛋白质的RNA。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原并且以用I类或II类MHC分子呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与T淋巴细胞有关，T淋巴细胞可归类为辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)，它们通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞，CD8+T细胞或CTL)发挥主要作用，在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CD8+T细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原与I类MHC分子一起呈递。
本公开内容考虑了可以是保护性、防止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫或抗原疫苗接种。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
在一个实施方案中，本公开内容考虑了这样的实施方案：其中施用靶向脾组织的本文中所述的RNA lipoplex颗粒。RNA编码包含例如本文中所述的抗原或表位的肽或蛋白质。RNA被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取，以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对抗原或表位的免疫应答，从而导致对涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述的RNA lipoplex颗粒诱导的免疫应答包括抗原呈递细胞例如树突细胞和/或巨噬细胞对抗原或其片段例如表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性T细胞的活化。例如，由RNA或其加工产物编码的肽或蛋白质可由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白来呈递。然后，MHC肽复合物可被免疫细胞(例如T细胞或B细胞)识别，从而导致它们的活化。
因此，在一个实施方案中，在施用之后，本文中所述的RNA lipoplex颗粒中的RNA被递送至脾和/或在脾中表达。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒被递送至脾以活化脾抗原呈递细胞。因此，在一个实施方案中，在RNA lipoplex颗粒的施用之后，在抗原呈递细胞中发生RNA递送和/或RNA表达。抗原呈递细胞可以是专职抗原呈递细胞或非专职抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞可以是树突细胞和/或巨噬细胞，甚至更优选地是脾树突细胞和/或脾巨噬细胞。
因此，本公开内容涉及本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNA lipoplex颗粒的药物组合物以诱导或增强免疫应答，优选针对癌症的免疫应答。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNA lipoplex颗粒的药物组合物，用于涉及抗原的疾病，优选癌症疾病的预防性和/或治疗性治疗。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及用于将抗原或抗原表位递送至脾中的抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)，或在脾中的抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)中表达抗原或抗原表位的方法，其包括向对象施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNA lipoplex颗粒的药物组合物。在一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在这方面中，抗原或抗原表位优选由RNA lipoplex颗粒中的RNA编码。
在一个实施方案中，全身性施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNAlipoplex颗粒的药物组合物导致在脾中而不在肺和/或肝中的RNA lipoplex颗粒或RNA的靶向和/或积累。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒在脾中释放RNA和/或进入脾中的细胞中。在一个实施方案中，全身性施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNAlipoplex颗粒的药物组合物将RNA递送至脾中的抗原呈递细胞。在一个具体实施方案中，脾中的抗原呈递细胞是树突细胞或巨噬细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及用于在对象中诱导或增强免疫应答的方法，其包括向对象施用本文中所述的RNA lipoplex颗粒或包含RNA lipoplex颗粒的药物组合物。在一个示例性的实施方案中，免疫应答是针对癌症的。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，从而导致T细胞和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们就会被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，这些片段使用MHC分子呈现在它们的细胞表面处。同时，它们上调了在T细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，极大地增强了它们活化T细胞的能力。它们还上调了CCR7，其是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此它们充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递它们抗原来活化辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell，APC)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以以专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞区分。
术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成性表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHCII类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导T细胞活化的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职抗原呈递细胞”是指不组成性表达II类MHC分子，但在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后组成性表达II类MHC分子的抗原呈递细胞。一些示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其为所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与MHC分子的缔合(例如，通过结合)，用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的T细胞。
术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指牵涉抗原或表位的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是感染性疾病或癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位可源自这样的抗原。
术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面中，感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感和流感。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)赘生物、神经外胚癌、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是理想的，它可比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应功能的任何试剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体可通过多种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complement dependentcytotoxicity，CDC)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、布妥昔单抗(CD30 TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(Claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素αvβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(IL-Iβ)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDCl)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD 152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL-5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-Ra)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilommumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL-6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、西木单抗(CTLA-4)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL-13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、替西木单抗(CTLA-4)、西莫白介素图考珠单抗(tucomzumab celmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1轴结合拮抗剂。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于：PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合伴侣是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体实施方案中，PD-L1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体实施方案中，PD-L2结合伴侣是PD-1。PD-1结合拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。抗PD-1抗体的一些实例包括但不限于MDX-1106(纳武单抗，OPDIVO)、Merck 3475(MK-3475，派姆单抗，KEYTRUDA)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108和BGB-A317。
在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素，其包含与恒定区融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg，是PD-L2-Fc)，其是WO2010/027827和WO2011/066342中所述的融合可溶性受体。
在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体，包括但不限于YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MEDI4736(度伐单抗)、MDX-1105和MSB0010718C(阿维单抗)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1结合拮抗剂。在另一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个示例性实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
实施例1：材料
用于下文所述实验的值得注意的材料是：
Figure BDA0004156329990000811
实施例2：脂质混合物的制备
以2∶1的脂质摩尔比在乙醇中在不同的脂质浓度下分别制备DOTMA/DOPE脂质混合物。溶液如下制备：
-称量DOPE脂质。
-计算DOTMA的量，以保持2∶1DOTMA/DOPE的％摩尔比。
-称量DOTMA脂质。
-计算溶解所述脂质所需的无水乙醇的量。
-称量无水乙醇。
-在37℃下借助水负载(water bad)将脂质溶解在乙醇中。
通过在乙醇中制备300mM DOPE或330mM DOPE/DOTMA(66：33)溶液，研究了DOPE和DOPE/DOTMA在乙醇中的溶解度。通过将脂质溶液在37℃下孵育20分钟来溶解脂质。将DOPE溶液在17000G下离心1小时，并通过HPLC测量上清液中的DOPE浓度。通过0.22μm PES注射器过滤器过滤DOTMA/DOPE溶液，并通过HPLC测量滤液中的脂质浓度。
另外的脂质混合物可通过遵循该实施例中所描述的基本步骤同样地制备，前提是使用另外的脂质作为起始物质和/或计算另外的摩尔比。
实施例3：脂质体的制备
如下通过乙醇注射来制备脂质体：在120rpm搅拌下，在装备有0.9×40mm针的1mL注射器的辅助下，将乙醇中的0.2mL DOTM/DOPE或(另外的脂质溶液)注射到9.8mL水中。将脂质体胶体搅拌30分钟。通过0.45或1.2或5μm CA注射器过滤器过滤脂质体或不过滤脂质体。脂质体胶体储存在4℃至8℃下。以66∶33％摩尔比在100mM至400mM的不同总脂质浓度(其中中间步骤为50mM)下制备DOTMA/DOPE脂质溶液。
实施例4：RNA lipoplex的制备
首先如下通过将RNA溶液(例如luc-RNA溶液)与NaCl溶液混合以预浓缩luc-RNA来制备RNA lipoplex制剂。之后，将脂质体胶体和luc-RNA-NaCl溶液混合以形成RNAlipoplex。将RNA lipoplex制剂在室温下孵育10分钟，并在4℃至8℃下储存。不同的RNAlipoplex制剂是例如以0.65的N/P比制备的。这些不同的RNA lipoplex制剂中的RNA浓度为0.1mg/mL，并且NaCl浓度为50mM。不同的脂质体前体(不同的尺寸)用于制备RNA lipoplex。
实施例5：动态光散射
使用Nicomp仪器(PSS.Santa Barbara.USA)通过动态光散射(DLS)的已知方法测量脂质体尺寸和RNA lipoplex尺寸。用水将脂质体样品稀释至1mM总脂质浓度。用0.9％NaCl溶液将RNA lipoplex样品以1∶5稀释。在5×50mm培养管(Kimble.USA)中测量样品。
实施例6：光阻-动态光散射
使用Accusizer A7000仪器(PSS.Santa Barbara.USA)对尺寸为0.5至5μm的不同脂质体和RNA lipoplex制剂进行颗粒计数/测量。进行5mL(2.5μL样品/20mL游离颗粒水)体积的三次测量。所获得的结果表示三次测量的颗粒量的平均值。
实施例7：小角X射线散射
通过小角X射线散射(Small Angel X-ray Scattering，SAXS)测量用不同脂质体前体制备的不同RNA lipoplex制剂的内部结构参数。SAXS是这样的技术：通过所述技术样品中的纳米级密度差异可通过分析X射线穿过材料时的弹性散射行为并以小角记录其散射来量化。对于每个测试的RNA制剂，计算相关长度和d间隔参数。RNA lipoplex制剂用0.65的N/P比、0.1mg/mL RNA和112mM NaCl来制备。
实施例8：琼脂糖凝胶电泳
通过凝胶电泳测量不同RNA lipoplex样品中游离RNA的量。使用含次氯酸钠的1％琼脂糖凝胶进行测量。RNA lipoplex样品用DNA负载染料以1：6稀释。小心地将12μL稀释的RNA lipoplex样品上样到琼脂糖凝胶中。电泳在80V下进行，运行时间为40分钟。
实施例9：HPLC
使用Sunfire C18 2.5μm 4.6×75mm柱(Waters.Massachusetts.USA)和205nm的波长通过HPLC(Agilent technologies.Santa Clara.USA)测量不同脂质体制剂中的脂质浓度。流动相A为70％甲醇/30％异丙醇/0.1％TFA的混合物，流动相B为55％甲醇/15％异丙醇/30％水/0.1％TFA的混合物。将脂质体样品用水稀释至3mM总脂质浓度或不稀释。
实施例10：细胞培养：体外在树突细胞中的RNA转染
用不同的脂质体前体和luc-RNA制备RNA lipoplex制剂。用0.9％NaCl溶液将RNAlipoplex稀释至0.01mg/mL RNA，用于细胞培养实验。在接种于培养基或全血中的人树突细胞中研究不同RNA lipoplex制剂的RNA转染效率。
实施例11：动物模型：树突细胞中的脾靶向和RNA转染
在BALB/c小鼠中研究了不同RNA lipoplex制剂的转染效率。眼眶后(retro-orbital)注射20μg配制的RNA lipoplex，并在6小时之后测量树突细胞(脾靶标)中的萤光素酶表达。在这样的情况下制备RNA lipoplex：luc-RNA和不同的脂质体前体，获自原始胶体的小或大脂质体以及经0.45μm过滤的小和大的脂质体，0.65的N/P比和112mM NaCl。
实施例12：溶解度测试
已经测试了是否可以制备更高浓度的含DOPE溶液(过饱和状态)并将其用于乙醇注射以进行脂质体制造(下一部分)。此溶解度测试系列中获得的结果示于表1和2中。
表1：获自不同供应商的DOPE脂质在乙醇中的溶解度。
DOPE在乙醇中的溶解度
Figure BDA0004156329990000851
表2：DOPE脂质在于无水乙醇中制备的具有66∶33％摩尔比的DOTMA/DOPE脂质混合物中的提高的溶解度。
DOPE在包含220mM DOTMA的乙醇中的溶解度
Figure BDA0004156329990000852
根据这些结果，购自不同供应商的DOPE在乙醇中的平衡溶解度为约50至60mM(室温)。但是，如果制备了与阳离子脂质DOTMA的共溶液，则平衡溶解度显著提高，例如如果使用摩尔比为66∶33的DOTMA/DOPE共溶液，则提高至约90至100mM。
实施例13：不同尺寸的脂质体的制造
使用实施例3中所述的方案通过乙醇注射制备脂质体。在乙醇注射之后不进行过滤过程。改变乙醇中的脂质浓度，保持所有其他参数不变。如通过实施例5和6中动态光散射(DLS)所描述的，测量脂质体尺寸。
例如，有关从具有66∶33％摩尔比的DOTMA/DOPE混合物中获得的脂质体的结果示于表3(以下)以及图1和2中。
表3：脂质体尺寸对储备溶液中不同脂质浓度的依赖性。
Figure BDA0004156329990000861
可看出，所获得的脂质体尺寸(Z-平均值)随着用于乙醇注射的乙醇溶液中脂质浓度而提高。因此，乙醇中的脂质浓度可有效地用于控制脂质体的尺寸。有趣的是，如果DOPE浓度低于和高于DOPE在单独的乙醇中的平衡溶解度，则尺寸变化最为明显。如果DOPE浓度高于50mM(总脂质浓度为150mM)，则获得的脂质体尺寸急剧提高，从<50nm提高至大于500nm(图1)。然而，同样高于溶解度极限，脂质体尺寸随着脂质浓度提高而进一步单调提高。
所有脂质体制剂中均存在0.5μm脂质体级分，该脂质体级分在用300mM脂质溶液制备的脂质体中较高，而在在较低和较高脂质浓度下制备的脂质体中降低。此外，在以较高脂质浓度制备的脂质体制剂中，测得0.6μm和0.7μm的脂质体级分(图2)。在乙醇注射高浓度脂质溶液之后，形成较大的脂质体。与在脂质溶液中低脂质浓度下制备的脂质体制剂相比，形成的脂质体的总量较低。所获得的结果表示三次测量的颗粒量的平均值。
实施例14：由不同尺寸的脂质体制造RNA lipoplex
如实施例4中所述的，使用不同的脂质体前体来制造RNA lipoplex，其中改变用于其形成的脂质体尺寸，保持所有其他参数不变。如在实施例5和6中所述的，在动态光散射(DLS)实验过程中确定脂质体尺寸(z-平均值)和多分散性指数(PDI)。
有关用于脂质体制备的脂质浓度(进而对脂质体前体尺寸)对RNA lipoplex尺寸(Z-平均值)的影响的结果示于表4(以下)以及相应的图3和图4中。
表4：用不同脂质体前体(未过滤的脂质体)制备的RNA lipoplex制剂中存在的颗粒量。在用较大脂质体制备的RNA lipoplex制剂中0.5μm颗粒的量提高。在不同浓度下使用不同脂质储备溶液通过乙醇注射来制备脂质体。脂质体的尺寸随着储备溶液中的脂质浓度而提高。
Figure BDA0004156329990000871
根据该测试系列，获自小脂质体的RNA lipoplex比获自大脂质体的那些更小。获自用300mM溶液及以上制造的脂质体的RNA lipoplex是获自150mM储备溶液的脂质体的RNAlipoplex的约两倍大。在用较大脂质体制备的所有RNA lipoplex中，没有发现脂质体尺寸与RNA lipoplex尺寸之间的相关性(图3)。
所获得的RNA-lipoplex的量随着用于其形成的脂质体的尺寸而提高。在用较大脂质体制备的制剂中测得较大RNA-lipoplex颗粒的较高量，从而确认了获自动态光散射测量的数据(图4)。所获得的结果表示三次测量的颗粒量的平均值。
实施例15：来自不同lipoplex的小角X射线散射(SAXS)
如在从来自不同浓度储备溶液的脂质体获得的RNA lipoplex的情况下所描述的，进行小角X射线散射实验。例如，由DOTMA/DOPE 2/1(mol/mol)脂质体和RNA以1.3∶2的电荷比形成RNA lipoplex。通过所述的乙醇注射，由在乙醇中100mM、300mM和400mM的脂质浓度制造脂质体。
图5中示出了从小角X射线散射测量获得的衍射曲线，所述测量来自用脂质体形成的RNA lipoplex，所述脂质体以4/1(顶部)的电荷比和1.3/2的电荷比制备，其中用于lipoplex形成的脂质体通过在乙醇中400mM、300mM和100mM的mM脂质储备溶液获得。
散射图在1nm-1附近包含单布拉格峰(Bragg peak)。这是脾靶向lipoplex的典型衍射图，其中过量(带负电荷)的RNA用于lipoplex形成。如果lipoplex不带负电荷，则散射谱完全不同。例如，测量了在+/-4/1电荷比下的RNA lipoplex，其中发现了不那么明显的峰。同样地可观察到一个二阶峰(second order peak)(尽管强度很低)。实际上，lipoplex的X射线散射谱的一般特征在于存在数个峰，其可以是等距的或可具有其他间隔，这取决于相态。在此，相反，仅确定了一个单峰。此外，峰宽根据最初用于脂质体制造的储备溶液的浓度而变化。如果乙醇中的浓度较高，则峰宽较低。布拉格峰指示lipoplex是常规有序的，其中从峰位置给出的重复距离(d间距)为：
Figure BDA0004156329990000881
在此，q是动量传递，其中
Figure BDA0004156329990000882
n为阶数，并且q最大为各个布拉格峰的最大位置，λ为波长并且θ为角度。可以从布拉格峰得出的d间隔为约6.5nm。
峰宽Δq随着堆栈(stack)中重复单元数目的提高而降低。对于液晶阵列，相关长度可以表示为：
Figure BDA0004156329990000891
对于在此的lipoplex产物，可以推导出散射图与乙醇中用于脂质体制造的前述脂质浓度和生物活性之间的明确相关性。当峰位置不变时，峰宽随着乙醇中所施加的脂质浓度而单调变化。乙醇中提高的脂质浓度(其导致提高的脂质体尺寸)对应于降低的峰宽，以及因此更高的相关长度。同时，生物活性随着相关长度的提高而提高。因此，可以通过清楚的结构特征来辨别所描述的具有改善活性的lipoplex，所述lipoplex是由脂质体制造的，其中使用了乙醇中较高浓度的脂质储备溶液来制造。另外，也可以通过其他方法，例如不对称场流分级法(AF4)，将所述具有改善活性的lipoplex与较低活性的那些区分开。
实施例16：人树突细胞中RNA lipoplex的转染效率
如所描述的，使用不同的脂质体前体来制造Luc-RNA lipoplex，其中用于其形成的脂质体的尺寸是变化的(通过改变用于其形成的起始脂质浓度)，保持所有其他参数不变。此后，在接种于培养基或全血中的人树突细胞中研究不同RNA lipoplex制剂的RNA转染效率。
图6中示出了显示如通过测量用不同脂质体前体制备的不同RNA lipoplex的萤光素酶表达和相应生物活性所确定的体外转染效率(人树突细胞)的结果。
生物活性(体外RNA转染)随着RNA lipoplex的相关长度而单调提高。相关长度越高，表明RNA lipoplex中脂质双层的群越均匀。
实施例17：不同lipoplex的不对称流场流分级法
不对称流场流分级法(AF4)是如今用于混悬液中颗粒的分级和分离的普通且最先进的方法，其用于进一步确定RNA lipoplex的差异。根据AF4理论，具有相似特性和相等尺寸的颗粒应同时洗脱。
图7中示出了有关来自两种不同类型脂质体的lipoplex的AF4测量的一些结果，这些脂质体是由乙醇中150mM储备溶液或由乙醇中400mM储备溶液制造的。
总之，场流分级法的测量表明，来自乙醇中150mM脂质浓度的脂质体的lipoplex在质和量上与来自400mM脂质浓度的那些不同。150mM来源的lipoplex较小，但直觉上相反，稍后洗脱，因此两个部分之间必须存在质的差异(形状、介质相互作用、电荷)。来自150mM乙醇溶液的RNA lipoplex稍后洗脱，尽管它们的尺寸较小。这表明由脂质体(其中使用乙醇中150mM脂质溶液)制造的脂质体的RNA lipoplex平均小于由乙醇中400mM脂质制造的那些。即使在相同的尺寸下，150mm来源的lipoplex的理化特性也不同于400mM来源的那些。这些尺寸和理化特性的差异与400mM来源的RNA lipoplex的较高生物活性相关。
实施例18：RNA lipoplex的体外生物活性
如通过细胞培养转染实验(树突细胞)在所述由脂质体、不同脂质储备溶液和/或不同脂质浓度制备不同尺寸的编码萤光素酶的RNA lipoplex的情况下所确定的，萤光素酶信号和因此生物活性随脂质起始浓度以及因此用于RNA lipoplex形成的脂质体尺寸而单调提高。相应的结果示于图6、8和9中。
总之，从用于脂质体制造的较高脂质浓度产生的RNA lipoplex在体外显示出显著较高的活性。
实施例19：RNA lipoplex的体内生物活性
如通过细胞培养转染实验(树突细胞)在由不同尺寸的脂质体制备的编码萤光素酶的RNA lipoplex的情况下所确定的，用较大脂质体制备的RNA lipoplex导致显著较高的萤光素酶表达和相应的生物活性。
该测试系列的一些非限制性实例示于图10和11中。与来自200mM原始胶体的小RNAlipoplex相比，用来自360mM原始胶体的较大脂质体制备的RNA lipoplex导致显著的体内表达信号。
实施例20：RNA lipoplex的自动化制造
为了自动化批量制造RNA lipoplex，已开发了普遍适用的操作，其示于图12中。所有步骤均使用预先灭菌的一次性流体路径进行，以允许对材料进行安全无菌的处理。首先，将RNA的浓度调整至脂质体浓度，并添加NaCl以使RNA浓缩。由此，将RNA溶液调整至允许混合相同体积的RNA和脂质体的RNA浓度。RNA和脂质体溶液二者均被转移到大体积注射器中，并且两个注射器都安装在同时驱动注射器的两个活塞的单个注射器泵上。在RNA lipoplex形成之后，添加冷冻保护剂溶液并调整药物产品的最终浓度。在将药物产品装入到玻璃瓶中之后，将药物产品冷冻为浓缩物以进行长期储存。
RNA lipoplex的关键品质特性是通过RNA与脂质体之间的混合比调整的电荷比。开发了允许有效控制混合比的RNA lipoplex的可自动化和可规模化的工业制造方法。在用于小规模(≤10升)的制造过程中，通过使用同时驱动填充有RNA或脂质体的两个大体积注射器的单个灌注泵，实现了对相同体积的两种含脂质体和RNA的水性溶液的混合的控制。对于更大体积(≥10升)的等同泵送，泵送系统如加压容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵或蠕动泵与具有反馈回路的流量传感器组合使用以进行流量的在线控制和实时调整。
对于自动化的RNA lipoplex的制造，需要确保含有RNA和脂质体的水性溶液有效混合的静态混合元件。发现市售的含有蛇纹石和嵌入结构以增强混合的微流体混合元件以及具有相当结构的原型混合元件在制造期间阻塞。因此，这些混合元件不适合用于RNAlipoplex的自动化制造。发现直径为1.2至50.0mm的Y型和T型混合元件适合于RNAlipoplex的自动化制造。
方法：通过使用不同的混合元件制备RNA lipoplex(表1)。在lipoplex的制造期间，混合元件由操作员观察，并且记录材料沉积或堵塞。
结果：用市售的微流控芯片(NanoAssemblrTM，Precision Nanosystems，Vancouver，Canada)，在制备3mL RNA lipoplex之后观察到堵塞。在测试其他原型微流体混合元件期间，也得到了类似的观察结果(表5)。尽管对于所有包含与可商购混合元件相当的构造的(微)流体混合元件，可观察到沉积以及特别地元件阻塞，但是当使用Y型或T型混合元件时没有观察到。除了所描述的直径为2.4mm的y型混合元件之外，还测试了具有较大直径的混合元件。由于没有发现对Y型混合元件的直径的限制，因此认为所述方法适合于在y型混合元件的多至50mm的直径下制备RNA lipoplex。
表5：微流控芯片的堵塞。
Figure BDA0004156329990000921
当使用Y型或T型混合元件时，需要最小流量以实现充分的混合。RNA lipoplex的制备可通过使用内径为1.6至50mm的Y型或T型混合元件混合两种包含RNA和脂质体的水性溶液来进行。由混合流量引起的雷诺数不应低于约300，以确保有效混合。流量与混合元件的直径之比不应低于约150，以确保有效混合。高至约2100的雷诺数经实验测试，并且发现其适合于自动化制造。更高流量的数据支持也是可行的。这是由于这样的事实：在雷诺数为2100时，条件已经处于湍流模式，因此，在甚至更高的流量下，预期了类似的混合条件。
方法：通过使用单个灌注泵泵送RNA溶液和脂质体溶液来制备RNA lipoplex。用包含2.4和3.2mm内径的代表性Y型混合元件进行RNA lipoplex的形成。RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性通过光子相关光谱(photon correlation spectroscopy，PCS)测量来分析。使用等式理论上计算了由流量和混合元件直径的所研究组合得出的雷诺数(图13)。通过将流量(cm3/分钟)除以混合元件的直径(cm)来计算流量与混合元件的直径之比。该因子以无量纲数给出。
结果：在导致理论计算的雷诺数低于约300的流量和混合元件组合的情况下制造RNA lipoplex时，形成具有提高的颗粒尺寸和多分散性的RNA lipoplex(图13和表6)。为了确保可重复形成具有期望颗粒特性的RNA lipoplex，理论上雷诺数应为最小约300(图13和14以及表6)并且流量与混合元件的直径之比应为最小约150。发现2.4mm的混合元件能够在宽范围的流量(60至240mL/分钟)中使得RNA和脂质体的混合有效且可重现。由于在这些研究期间未发现上限，因此预计雷诺数或流量与混合元件的直径之比没有上限。
表6：计算的雷诺数和流量与混合元件的直径之比。
Figure BDA0004156329990000931
a水的黏度(0.001Pa s)和密度(1000kg/m3)用于雷诺数的计算。
b通过将流量(cm3/分钟)除以混合元件的直径(cm)来计算该因子。该因子以无量纲数给出。
实施例21：RNA浓度的影响
用具有代表性尺寸(2.4mm)的y型混合元件制备RNA lipoplex。为了确定在当前设置中可以制备RNA lipoplex的浓度范围，RNA浓度系统地从0.05mg/mL变化至0.5mg/mL。为了研究所形成的lipoplex的稳定性，将最终制剂调整至0.05mg/mL RNA，22％蔗糖和20mMNaCl，并将制剂冷冻3次。
在RNA lipoplex形成过程中，在0.1至0.5mg/mL RNA浓度下的RNA lipoplex形成产生相当的颗粒特性(图15)。这样的颗粒的颗粒特性在三次冷冻之后也得以保留，表明在RNA浓度变化方面制造方法非常稳健(图16)。由于没有暗示在RNA lipoplex制备期间限制RNA浓度，因此，所描述的设置被认为适用于在多至5mg/mL的RNA浓度下的RNA lipoplex制备。
用于RNA lipoplex自动化制造的所述方法允许具有不同电荷比的稳定RNAlipoplex的可重现制备。
方法：为了证明RNA lipoplex半自动化制备关于电荷比的稳健性，该参数系统地从1.0∶2.0变化至2.1∶2.0，并且从2.0∶1.0变化至5.0∶1.0。RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性通过光子相关光谱(PCS)测量来分析。
结果：在1.0∶2.0至2.1∶2.0的电荷比之间，未发现电荷比变化对RNA lipoplex尺寸和多分散性的影响(图17)。因此，认为1.0∶2.0至2.1∶2.0的范围产生具有等同品质的RNAlipoplex制剂。另外，具有限定的尺寸和多分散性的稳定颗粒在3.0∶1.0至5.0∶1.0的电荷比之间形成(图18)。
实施例22：在RNA lipoplex形成过程中的盐浓度
对于包含高生物活性的RNA lipoplex的自动化制造，需要在RNA lipoplex形成过程中控制离子条件。为了确保生物活性，必须在45至300mM NaCl的存在下进行RNAlipoplex形成。另外的离子化合物，例如EDTA、HEPES等，促进离子强度并且可降低所需的最低NaCl浓度。
方法：在RNA lipoplex形成过程中，以不同的NaCl浓度自动化制备RNA lipoplex。RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性通过光子相关光谱(PCS)测量来分析。另外，通过在体外测量萤光素酶信号来研究lipoplex的生物活性。
结果：可以通过调整离子强度来控制颗粒特性。在制造期间提高盐浓度导致颗粒尺寸略有提高(图19)。发现盐浓度对生物活性有影响。在制造期间提高盐浓度导致提高的生物活性(图20)。因此，RNA lipoplex形成过程中的NaCl浓度不应低于45mM NaCl。
实施例23：RNA lipoplex的稳定化
用于在pH 5.5至6.7的pH范围内稳定lipoplex中RNA的缓冲剂体系(例如HEPES、乙酸/乙酸钠和磷酸钠)可在存在和不存在冷冻保护剂的情况下用于稳定RNA lipoplex中的RNA。发现碳酸钠体系不产生相当的稳定效力。
方法：对于研究最佳pH范围并测试涵盖不同pH范围的不同缓冲剂(HEPES pH 6.8至8.2，乙酸/乙酸钠pH 3.7至5.6，磷酸钠pH 5.8至8.0并且碳酸钠pH 6.2至8.6)的适用性。RNA lipoplex最初是在不存在冷冻保护剂的情况下在应激状态(40℃)下孵育的。通过21天的毛细管电泳分析RNA完整性。为了研究在示例性冷冻保护剂的存在下的最佳pH范围，将RNA lipoplex在HEPES和蔗糖的存在下于40℃下孵育，并分析RNA完整性21天。
结果：尽管对于缓冲剂体系HEPES、乙酸/乙酸钠和磷酸钠，获得了相当的结果，但碳酸盐体系未导致相当的RNA稳定化(图21)。RNA完整性取决于制剂的pH值。确定最佳pH范围为pH 5.5至7.4。在示例性冷冻保护剂蔗糖的存在下，确定了pH 5.5至8.0的pH范围，导致RNA的最佳稳定化(图22)。
二价金属离子可由RNA合成过程、制剂赋形剂或玻璃容器引起，并且可影响RNA稳定性。EDTA二钠盐与碱土金属和重金属离子形成稳定的水溶性络合物。EDTA二钠盐有助于RNA lipoplex形成过程中存在的离子浓度，从而降低制备生物活性RNA lipoplex所需的NaCl浓度。用所描述的方法可在EDTA(0至20mM)存在下形成RNA lipoplex。
方法：RNA lipoplex在存在提高浓度的EDTA(多至18mM)的情况下形成，并在稀释之后在降低的EDTA含量(0.1mM至5.4mM)下于40℃下孵育。在21天内，将RNA完整性作为关键的理化参数进行分析。
结果：发现在高浓度EDTA(多至18mM)的存在下RNA lipoplex的形成产生与在更低浓度存在下的制剂等同的颗粒特性。在储存期间，在含有0.01％(w/v)(0.26mM)至0.2％(w/v)(5.2mM)EDTA的不同组之间，没有发现显著差异(图23)。由于EDTA二钠盐有助于RNAlipoplex形成过程中存在的离子浓度，并且可用作可能降低RNA完整性的二价金属离子的清除剂，因此在RNA lipoplex形成过程中存在多至20mM的EDTA浓度被认为是有利的。
实施例24：NaCl和冷冻保护剂含量的优化
在RNA lipoplex的制造、长期储存以及应用于患者期间，需要调整调整的离子条件(图24)。NaCl的浓度在RNA lipoplex形成过程中可为45至300mM；在RNA lipoplex在冷冻状态下长期储存期间为10至50mM；并且在解冻和用盐水稀释之后为80至150mM。
对于每个≤70mM的NaCl浓度，发现不应添加冷冻保护剂的各个含量以确保多次冷冻之后颗粒特性的稳定。作为冷冻保护剂，可使用浓度为12.5％至35.0％(w/v)的单分子和双分子糖，例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇、三醇例如甘油，以及其混合物。与后面的化合物相比，山梨糖醇的稳定效力较低，并且精氨酸在冷冻期间不能有效地稳定RNA lipoplex。
表7：在单个冷冻步骤之后研究的NaCl浓度和冷冻保护剂含量的组合。
Figure BDA0004156329990000961
表8：在1、2、3、5和10个冷冻步骤之后研究的NaCl浓度和冷冻保护剂含量的组合。
Figure BDA0004156329990000962
方法：研究了代表单糖(葡萄糖和山梨糖醇)、二糖(蔗糖和海藻糖)、氨基酸(精氨酸、脯氨酸)、三醇(甘油)以及包含不同糖(甘露糖醇和蔗糖)的混合物的冷冻保护剂体系的不同化合物以鉴定合适的冷冻保护剂(图25和26)。因此，在提高浓度的这些化合物的存在下，冷冻RNA lipoplex。为了鉴定在一定NaCl浓度下冷冻保护剂的最低含量，在提高量的作为代表性冷冻保护剂的蔗糖或海藻糖的存在下，冷冻RNA lipoplex(表7)。首先将样品冷冻一次，以确定要详细研究的冷冻保护剂的浓度范围。在第三个实验中，通过在冷冻保护剂海藻糖的存在下将RNA lipoplex冷冻多至10次，挑战了颗粒尺寸的稳定的效力(表8)。
结果：尽管精氨酸明显使RNA lipoplex不稳定，但其他冷冻保护剂通常可用于冷冻期间RNA lipoplex的稳定(图25和26)。甘油、甘露糖醇和蔗糖(1∶1，w∶w)、脯氨酸和山梨糖醇可用作RNA lipoplex的冷冻保护剂。除精氨酸之外，所有经过额外测试的稳定剂似乎都适用，表明广泛的氨基酸、糖和这样的化合物的混合物适用于冷冻期间RNA lipoplex的稳定。与后面的化合物相比，山梨糖醇的稳定效力较低。
当详细研究每种NaCl浓度下所需的冷冻保护剂的量(表8)时，发现在单个冷冻步骤之后，NaCl浓度与所需的冷冻保护剂浓度之间存在直接相关性(图27和28)。在20％(w/v)蔗糖或海藻糖二水合物下对于0至60mM NaCl的单个冷冻步骤之后，发现可接受地保留了颗粒尺寸，而对于较低百分比的冷冻保护剂(例如，对于60％mM NaCl，≤15％；对于40mMNaCl，≤10％；对于20mM NaCl，≤5％)，发现稳定不足。在研究范围内，在蔗糖和海藻糖之间没有发现差异。
当在表8中示出的NaCl和海藻糖组合的存在下在1、2、3、5和10次冷冻之后分析RNAlipoplex的颗粒尺寸时，获得以下结果。在50mM NaCl浓度下，≥12.5％的海藻糖对于RNAlipoplex颗粒特性的稳定是足够的，即使在10次冷冻之后仍如此(图29)，而在70mM NaCl下，对于最低稳定需要≥12.5％，并且对于颗粒尺寸的准确保留，需要≥22.5％(图30)。在90mM NaCl下，对于最低稳定需要≥15.0％海藻糖，并且无法实现颗粒尺寸的准确保留，即使在27.5％的最高研究浓度的情况下仍如此(图31)。
实施例25：用于长期储存的盐和冷冻保护剂的组合
为了在给定温度下长期储存，应使用表9中列出的NaCl和冷冻保护剂的组合。
方法：
为了研究在一定NaCl浓度下在-15℃至-30℃下长期储存的冷冻保护剂的最低含量，在NaCl和蔗糖或海藻糖的组合的存在下冷冻RNA lipoplex。样品在-30℃下冷冻，并随后转移到相应温度下进行长期储存(-15℃或-30℃)。在限定的储存时间之后，分析样品，并通过使用PCS测量颗粒尺寸来分析胶体稳定性的保留。这些实验是在0.05mg/mL的总RNA浓度下进行的。
结果：尽管在多至70mM NaCl的存在下在冷冻期间可保留RNA lipoplex的颗粒特性，但在这些实验中可观察到有助于破坏胶体稳定性的其他作用。在冷冻(例如60mM NaCl和20％的蔗糖的组合)之后，确认了颗粒特性的可接受的稳定化，在-15℃的储存温度下这些制剂的颗粒尺寸随时间显著提高(图32和33)。在-30℃下储存之后，这种作用延迟(图34和35)。
在给定的NaCl含量下，RNA lipoplex的稳定性取决于冷冻保护剂的量。稳定所需的冷冻保护剂的量随着储备溶液中盐含量的提高而提高。这种作用与用作冷冻保护剂的糖类型无关。在-15℃或-30℃的冷冻状态下长期储存的RNA lipoplex的组合物应包含表9中所列的冷冻保护剂的含量。表9：用于在-15℃和-30℃下储存的与冷冻保护剂(蔗糖或海藻糖)含量组合的最大可接受NaCl浓度。
Figure BDA0004156329990000981
实施例26：用不同冷冻保护剂进行的长期储存
在10至40mM NaCl的情况下在22％(w/v)单分子或双分子糖的存在下，稳定超过9个月是可能的。这些制剂可以在-15℃至-40℃下冷冻，并且可保持在相应温度下以长期储存。在12.6％至16.8％(w/v)葡聚糖的存在下，10至30mM NaCl是可行的。这些实验是在0.05mg/mL的总RNA浓度下进行的。
方法：为了研究在-20℃下长期储存所需的代表性冷冻保护剂(例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖和包含葡聚糖的混合物)的最低含量，以固定的冷冻保护剂含量组合变化的NaCl浓度冷冻RNA lipoplex。对于单体或二聚体分子冷冻保护剂，例如葡萄糖、蔗糖和海藻糖，调整22％(w/v)的浓度。将这些制剂冷冻并储存在-15℃至-40℃下，并通过在规定的储存时间之后使用PCS测量颗粒尺寸来研究长期稳定性。
对于包含聚合物葡聚糖混合物的制剂，调整表10中列出的组合物。将样品冷冻并储存在-20℃下。在限定的储存时间之后，分析样品并通过测量颗粒尺寸分析胶体稳定性的保留。
结果：对于所有所研究的单体或二聚体分子冷冻保护剂，发现不应超过最大NaCl浓度，以确保在冷冻状态下RNA lipoplex的长期稳定。尽管60和80mM的NaCl导致lipoplex的快速失稳，但当NaCl的浓度≤40mM，在-20℃下储存时，胶体特性可以保留最少9个月(表10和图36至38)。发现蔗糖、海藻糖和葡萄糖的稳定效力没有差异。对于包含20mM NaCl的制剂，当将样品冷冻并储存在-15℃至-40℃下时，未发现长期稳定性的差异(图39)。
由于在较低冷冻保护剂含量(12.6％至16.8％(w/v)的情况下研究了包含葡聚糖的制剂，因此当与单分子或双分子糖相比时，稳定效力是相当的或更好的(图40)。
表10：包含葡聚糖的制剂1至7的组成(参见图40)。
Figure BDA0004156329990000991
实施例27：冷冻干燥
a)冻融
为了确定最有效的冷冻/冻干保护剂浓度，进行了冻融研究。将RNA lipoplex制剂在添加10％、15％、20％、25％和30％海藻糖的情况下在5mM HEPES、80mM NaCl、2.6mM EDTA中冻融。在于-20℃下储存之前和之后确定颗粒尺寸。在没有海藻糖的情况下冷冻的制剂中观察到颗粒聚集，并且未确定其颗粒尺寸。根据图41，用冷冻/冻干保护剂冷冻的制剂显示出浓度依赖性的冷冻保护，在较低的冷冻/冻干保护剂浓度下颗粒尺寸提高。在22％w/v海藻糖的情况下，仅观察到颗粒尺寸的最小提高，其中Sf/Si(Sf＝最终尺寸，Si＝初始尺寸)为1.04，其小于1.3仍被认为是可接受的。在较低的海藻糖浓度下，Sf/Si比值较高。从冻融研究获得的Sf/Si比值与在冷冻干燥和重构之后获自同一制剂的Sf/Si比值相关。
b)重构和颗粒稳定性
将在5mM HEPES、2.6mM EDTA、浓度为0mM至80mM的NaCl和浓度为10％或22％海藻糖中制备的RNA lipoplex制剂冷冻干燥。所有冷冻干燥的样品均表现出良好的饼状(cake)外观。将样品用0.9％NaCl溶液以原始体积重构。用0.9％NaCl溶液或WFI重构之后，所有冷冻干燥的RNA lipoplex制剂均立即溶解。确定了在用0.9％NaCl溶液或水重构之后在22％海藻糖中制备的冷冻干燥的RNA lipoplex制剂的颗粒尺寸变化。
根据图42，在冷冻干燥和重构之后，在含有海藻糖的所有冷冻干燥的RNAlipoplex制剂中，颗粒尺寸保持大体上稳定。与用水重构的冷冻干燥的样品相比，当用0.9％NaCl重构冷冻干燥的样品时，观察到RNA lipoplex的尺寸仅略有降低。观察到NaCl与海藻糖之比与颗粒稳定性之间的相关性。在较低的海藻糖浓度和较高的NaCl浓度下制备的制剂中，RNA lipoplex颗粒的尺寸提高。
c)用冷冻干燥的RNA lipoplex制剂进行的细胞培养实验
进行了在22％海藻糖中在不同NaCl浓度下制备的冷冻干燥的编码萤光素酶的RNAlipoplex制剂的体外转染实验。将冷冻干燥的样品用0.9％NaCl溶液重构。
根据图43，在22％海藻糖和不同NaCl浓度下制备的冷冻干燥的RNA lipoplex制剂在树突细胞中显示出相似的luc-RNA转染水平。在RNA lipoplex制剂中存在的NaCl浓度与体外RNA转染之间没有发现相关性。与新鲜的RNA lipoplex对照相比，冷冻干燥的样品显示出相似或甚至更好的luc-RNA转染。
d)稳定性研究
研究了包含10％海藻糖、22％海藻糖和0mM、20mM、40mM、60mM和80mM NaCl的冷冻干燥的RNA lipoplex制剂在4℃、25℃和40℃下(1个月和6个月)的稳定性研究。在用0.9％NaCl溶液以原始体积重构之后，表征样品的颗粒尺寸和RNA完整性(全长RNA％)。
根据图44和45，不同的RNA lipoplex的尺寸不依赖于制剂或储存温度，不随时间显著变化。有趣的是，较低量的冷冻保护剂(例如10％)足以维持冷冻干燥的制剂中的颗粒稳定性，而在冷冻制剂的情况下则需要较高量(例如22％)。在4℃下储存6个月之后，冷冻干燥的样品中的RNA完整性(全长RNA％)在94％至100％之间变化，而在25℃下储存的RNA(1ip)制剂的RNA完整性在85％至94％之间变化。但是，未确定与海藻糖与NaCl浓度之比或储存时间相关。
实施例28：RNA lipoplex颗粒的制备和测试
RNA lipoplex的制备
为了自动化批量制造RNA 1ipoplex，所有步骤均使用预先灭菌的一次性流体路径进行，以允许对材料进行安全无菌的处理。首先，将RNA的浓度调整至脂质体浓度，并添加NaCl以使RNA浓缩。由此，将RNA溶液调整至允许混合相同体积的RNA和脂质体的RNA浓度。RNA和脂质体溶液二者均被转移到大体积注射器中，并且两个注射器都安装在同时驱动注射器的两个活塞的单个注射器泵上。在RNA lipoplex形成之后，通过添加冷冻保护剂溶液来调整药物产品的最终浓度。在将药物产品装入到玻璃瓶中之后，将药物产品冷冻为浓缩物以进行长期储存。
RNA lipoplex的关键品质特性是通过RNA与脂质体之间的混合比调整的电荷比。开发了允许有效控制混合比的RNA lipoplex的可自动化和可规模化的工业制造方法。在用于小规模(≤10升)的制造过程中，通过使用同时驱动填充有RNA或脂质体的两个大体积注射器的单个灌注泵，实现了对相同体积的两种含脂质体和RNA的水性溶液的混合的控制。对于更大体积(≥10升)的等同泵送，泵送系统如加压容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵或蠕动泵与具有反馈回路的流量传感器组合使用以进行流量的在线控制和实时调整。
对于自动化的RNA lipoplex的制造，需要确保含有RNA和脂质体的水性溶液有效混合的静态混合元件。发现市售的含有蛇纹石和嵌入结构以增强混合的微流体混合元件以及具有相当结构的原型混合元件在制造期间阻塞。因此，这些混合元件不适合用于RNAlipoplex的自动化制造。发现直径为1.2至50.0mm的Y型和T型混合元件适合于RNAlipoplex的自动化制造。
1.组成的一些实例
1.1药物产品的组成
制剂1包含：
·约(不超过)10％海藻糖/蔗糖
·≤10mM NaCl
·≤7.5mM HEPES(或组氨酸作为第二选择)
·pH 6.5或pH 6.7
·≤3.5mM EDTA。
制剂1能够在缓冲条件下冷冻RNA lipoplex，其能够直接肠胃外施加于患者，不用任何进一步稀释或其他步骤。较低的盐含量不会导致较低的活性。制剂的渗量浓度适合于直接静脉注射。
药物产品是通过在流体路径设置中混合相同体积的RNA溶液和脂质体溶液来获得的，其中浓度和缓冲条件已被优化。脂质体中阳离子脂质和RNA的浓度的摩尔比(电荷比)精确限定为1.3至2。脂质体和RNA的溶液在如下条件下提供。
1.2RNA的组成
·约0.3mg/mL RNA浓度(但在相对于脂质体中阳离子脂质精确的摩尔比下)
·约18mM的HEPES
·约18mM的EDTA*2Na*2H2O
·pH 6.2至7.0
为了补偿由存在于脂质体中的乙酸引起的pH改变，将RNA药物物质缓冲剂pH调整至pH 7.0。
通过用(正常)盐水稀释，将RNA的浓度调整至脂质体中DOTMA的浓度。
1.3脂质体的组成
·约0.5至0.7mM DOTMA
·约0.2至0.4mM DOPE
·≤5mM乙酸(优先地2mM)
乙酸的添加提高了脂质体的贮存期。
2.另外的合适的缓冲剂和最佳pH范围的一些实例
用于在pH 5.5至7.0的pH范围内稳定lipoplex中RNA的缓冲剂体系(如HEPES、组氨酸和乙酸/乙酸钠)可在存在和不存在冷冻保护剂二者的情况下用于稳定RNA lipoplex中的RNA。
方法：对于研究最佳pH范围并测试不同缓冲剂的适用性，对涵盖不同pH范围的缓冲剂(HEPES pH 6.0至7.2、组氨酸pH 5.8至7.0、乙酸盐pH 5.5至5.8、MES pH 6.0至7.0)进行测试。RNA lipoplex在存在示例性冷冻保护剂的情况下在加速条件(25℃)下孵育。在60天内通过毛细管电泳分析RNA完整性。另外，RNA lipoplex在预期储存条件(-15℃)下在存在示例性冷冻保护剂的情况下孵育长达两年。RNA完整性通过毛细管电泳进行分析。
结果：对于缓冲剂体系HEPES、组氨酸、乙酸盐和MES，在液体(图46、47和图54、55)和冷冻状态(图50、51和图58至60)二者中针对保持RNA lipoplex颗粒尺寸和多分散性与降低蔗糖和NaCl的量的组合，获得了相当的结果。RNA完整性取决于制剂的pH值。最佳pH范围被确定为pH 6.5至7.0(图48、49，图53，图57和图62)。发现所有测试的缓冲剂类型均有效地保持调节的pH(图52、图56和图61)。
实施例2.1：HEPES、组氨酸和乙酸盐适合于稳定RNA lipoplex
在以下研究中，研究了三种缓冲剂体系(HEPES、组氨酸和乙酸盐)稳定由包含5mM乙酸的脂质体形成的RNA lipoplex的能力。在加速条件(25℃)和冷冻状态(-15℃)下研究了相应的RNA lipoplex。测试了pH 5.5至7.0的pH范围，其中不同的pH范围由相应的缓冲剂体系(HEPES pH 6.2至7.0、组氨酸pH 5.8至7.0和乙酸盐pH 5.5至5.8)涵盖。
Figure BDA0004156329990001031
Figure BDA0004156329990001041
*仅加速研究
在25℃(加速)下的液体储存
图46和47表明在存在所有缓冲剂体系的情况下，所有体系在加速条件下储存之后的颗粒尺寸和多分散性均维持良好。
图48表明在存在所有缓冲剂体系的情况下，所有体系在加速条件下储存之后，调节的pH均维持良好。
图49示出了在加速条件(25℃)下发现包含HEPES缓冲剂的样品稳定性最佳，而组氨酸和乙酸盐缓冲剂显示出RNA lipoplex中RNA的稳定性较低。
对于HEPES缓冲剂体系，高于6.2的pH值显示出相对于较低值的显著改善的稳定性。对于最佳稳定性，确定pH为pH 6.5至7.0左右。
对于组氨酸，观察到类似的pH依赖性。然而，整体稳定性与用HEPES缓冲的制剂相比更低。总体而言，乙酸盐显示出比其他两种体系更低的完整性，其中5.8显示出比pH 5.5更好的稳定性。
冷冻储存(-15℃)
图50和51示出了在与之前研究的在25℃下液体状态下的相同体系中缓冲的样品的胶体稳定性。图50和图51表明HEPES、组氨酸和乙酸盐同样适合于在冷冻状态(-15℃)下保持RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性。还可看出，在存在较低浓度NaCl的情况下，较低的蔗糖浓度足以有效保持冷冻状态下RNA lipoplex的多分散性。
图52示出了在与之前研究的在25℃下液体状态下的相同体系中缓冲的样品的pH值。其表明所有缓冲剂体系(HEPES、组氨酸和乙酸盐)均能够在冷冻状态(-15℃)下将pH保持在调节的范围内。
图53示出了在与之前研究的在25℃下液体状态下的相同体系中缓冲的样品的稳定性。总体而言，对于在冷冻状态(-15℃)下保持RNA完整性没有明显趋势。某些变化可能是由实验条件给出的错误引起的。在pH7.0时HEPES缓冲剂体系的完整性稍低可能是由于这样的实验性人工产物，因为对于该体系也未观察到随时间的降解。
实施例2.2：MES也适合于稳定RNA lipoplex
在以下研究中，将在先前研究中确定的两种最合适的缓冲剂体系(HEPES和组氨酸)与另一种缓冲剂体系(MES)进行比较。RNA lipoplex是用包含2mM乙酸的脂质体形成的。在加速条件(25℃)和冷冻状态(-15℃)下研究了相应的RNA lipoplex。在此重点是6.0至7.0的pH范围，其在先前的研究中被认为是最佳范围。
Figure BDA0004156329990001051
在-15℃下实时研究：新鲜、0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、18、24、36个月
在+25℃下加速研究：9周，每周1至2次采样
在25℃(加速)下的液体储存
如在图55中可看出的，仍在该新研究中，在加速条件下储存之后，未观察到多分散性和颗粒尺寸在缓冲剂体系之间的差异。MES显示出与组氨酸和HEPES相当的行为。
如在图56中可看出的，在加速条件下储存之后，所有缓冲剂体系均能够将pH保持在调节的范围内。因此，MES以及HEPES和组氨酸均适合于固定相应的RNA lipoplex制剂pH。
图57示出了在加速条件(25℃)下储存之后来自不同缓冲剂体系的稳定性数据。HEPES和MES显示出相当地稳定RNA完整性，而组氨酸显示出略微降低的稳定性。发现在HEPES、MES或组氨酸缓冲剂的情况下，最佳pH为约6.5至7.0的pH。
冷冻储存(-15℃)
图58表明，在存在所有缓冲剂体系的情况下，制剂冷冻之后颗粒尺寸和多分散性维持良好，并且在存在较低浓度NaCl的情况下，较低的蔗糖浓度足以有效稳定冷冻之后RNAlipoplex的颗粒尺寸。
图59和60表明，在存在所有缓冲剂体系的情况下，在冷冻状态下储存之后，颗粒尺寸和多分散性维持良好。还可看出，在存在较低浓度NaCl的情况下，较低的蔗糖浓度足以有效稳定冷冻状态下RNA lipoplex的胶体特性。
图61表明，所有研究的缓冲剂体系(HEPES、组氨酸、MES)均能够在冷冻状态下将pH保持在调节的范围内。
图62示出了在冷冻状态下来自不同缓冲剂体系的稳定性数据。所有研究的缓冲剂体系(HEPES、MES或组氨酸)均显示出相当地稳定RNA完整性，并且在研究的先前优化的pH范围内无指向最佳pH的明显趋势。
3.另外的适合的缓冲剂浓度的一些实例
对于在液体和冷冻状态二者下的RNA lipoplex的长期稳定，优化了稳定调节的pH和保持RNA完整性二者所需的缓冲剂浓度。为了确保pH稳定性和RNA完整性，将RNAlipoplex与10％(w/v)蔗糖和6.5mM NaCl一起配制。在存在具有以下浓度的示例性缓冲剂体系HEPES的情况下，将样品在加速条件下储存：
·2.5mM HEPES
·5.0mM HEPES
·7.5mM HEPES
·10.0mM HEPES
用以下示例性pH值研究稳定的效力：
·pH 6.2
·pH 6.7
·pH 7.2
方法：所有RNA lipoplex均在单批次中自动制备，并通过添加包含不同量的HEPES的冷冻保护剂溶液来调整HEPES的不同浓度。RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性通过光子相关光谱(PCS)测量来分析。另外，通过毛细管电泳分析RNA完整性并测量pH。
结果：发现所有测试的缓冲剂浓度均有效地保持液体状态下的RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性(图63、64)。此外，有效地维持了pH值(图65)并且作为pH函数的RNA完整性的维持与相应缓冲剂的浓度无关(图66)。总之，发现2.5mM至10.0mM的缓冲剂浓度同样有效地稳定了lipoplex制剂中的RNA完整性。发现最佳pH在pH 6.7至7.2的范围内。
在以下研究中，研究了稳定RNA lipoplex的pH所需的HEPES浓度。RNA lipoplex是用包含5mM乙酸的脂质体形成的，并且HEPES的不同浓度是通过使用不同的冷冻保护剂溶液来调整的，并且在加速条件(25℃)下研究了相应的RNA lipoplex。测试了pH 6.2至7.2的pH范围。
Figure BDA0004156329990001071
/>
Figure BDA0004156329990001081
在+25℃下加速研究：8周，每周1至2次采样
在25℃(加速)下的液体储存
在图63和图64中可看出，在加速条件(25℃)下储存之后，所有研究的缓冲剂浓度均在相应pH值下保持了RNA lipoplex的颗粒尺寸和多分散性。
在图65中示出了测量的RNA lipoplex的pH值。样品已在存在2.5mM至10.0mM的HEPES的情况下储存。发现低至2.5mM的HEPES浓度足以稳定调节的pH容量。
图66示出了来自不同缓冲剂浓度的稳定性数据。在加速条件下，发现所有研究的缓冲剂浓度同等地稳定RNA的完整性。发现在约6.7至7.2的pH下最好地稳定了RNA完整性。在pH 6.2下储存的RNA lipoplex显示出RNA完整性略有降低。
4.另外的适合的NaCI和冷冻保护剂浓度的一些实例
在下文中给出了一些实例，其中在RNA lipoplex长期储存和施加于患者期间调整的离子条件可以是相同的。无需在解冻之后对产品进行稀释或其他修饰即可获得可注射产品。除了已经研究过的储存期间NaCl的浓度范围外，较低的NaCl浓度(5至10mM)也适合于长期储存。这样的RNA lipoplex可在解冻之后直接施用，并且不需要进一步的稀释步骤。
对于NaCl浓度≤10mM，发现冷冻保护剂的相应含量为6.0至16.0％(w/v)，为了确保多次冷冻之后颗粒特性的稳定，该含量不应降低。
方法：研究了浓度为10％(w/v)的作为代表性冷冻保护剂的蔗糖。实验的详细描述在第2节中给出。
结果：当对在冷冻状态下储存之后RNA lipoplex的颗粒尺寸进行分析时，发现示例性浓度10％(w/v)的蔗糖与浓度≤10.0mM的NaCl组合足以有效长期稳定RNA lipoplex。冷冻状态下的胶体稳定性(图50、51、图58至60和图71)以及用报道的制剂稳定的RNAlipoplex中的RNA降解率通过加速(图49、图57、图66和图70)和冷冻(图53和图62)稳定性测试进行证实。降低的糖含量和使用组氨酸作为缓冲剂与降低的NaCl含量组合显示出与当前制剂(22％蔗糖和20mM NaCl)相当的结果。
实施例4.1：用降低的蔗糖和NaCl浓度稳定RNA lipoplex
在以下研究中，在存在HEPES或组氨酸作为缓冲剂的情况下，在pH 6.5下，用降低浓度的NaCl和蔗糖的组合研究了RNA lipoplex在冷冻状态下的长期稳定性。
Figure BDA0004156329990001091
在-15℃下实时研究：新鲜、0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、18、24、36个月
在+25℃下加速研究：9周，每周1至2次采样
在25℃(加速)下的液体储存
图67和68表明，在包含降低的NaCl和蔗糖含量的体系中，在加速条件下储存之后颗粒尺寸和多分散性维持良好。颗粒尺寸和多分散性与包含22％蔗糖和20mM NaCl的当前制剂相当。
图69表明，在加速条件下储存之后，总结的体系能够将pH保持在调节的范围内。作为对测量到的pH略有提高的解释，确定了所使用pH计的故障。
图70示出了来自包含降低浓度的蔗糖和NaCl的制剂的稳定性数据。当与包含20mMNaCl和22％蔗糖的当前制剂相比时，新制剂显示出改进的RNA完整性。与先前研究一致，这种改进的稳定性可归因于pH值提高为6.5。与早期研究一致，当与组氨酸相比时，用HEPES更好地保持RNA完整性。
冷冻储存(-15℃)
图71表明，所述体系可稳定胶体性质如制剂的颗粒尺寸。所有制剂均可冷冻且在颗粒尺寸上变化最小。
实施例29：RNA lipoplex颗粒的制备和测试
1.材料与方法
用于下文所述实验的值得注意的材料是：
Figure BDA0004156329990001101
Figure BDA0004156329990001111
脂质混合物的制备
以2∶1的脂质摩尔比在乙醇中在不同的脂质浓度下分别制备DOTMA/DOPE脂质混合物。溶液如下制备：
-称量DOPE脂质(1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)。
-计算DOTMA的量，使％摩尔比保持为2∶1DOTMA/DOPE。
-称量DOTMA脂质(1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐))。
-计算溶解脂质所需的无水乙醇量。
-称量无水乙醇。
-借助37℃下的水浴将脂质溶于乙醇中。
通过制备在乙醇中的330mM DOTMA/DOPE(66：33)溶液，研究了DOTMA/DOPE在乙醇中的溶解度。通过在37℃下孵育脂质溶液360分钟来溶解脂质。通过HPLC测量DOPE浓度。将DOTMA/DOPE溶液通过0.22μm PES过滤器过滤，并通过HPLC测量滤液中的脂质浓度。
脂质体的制备
脂质体通过乙醇注射如下制备：在150rpm搅拌下，在配备有0.9mm×152mm针的60mL注射器的辅助下，将60mL在乙醇中的DOTMA/DOPE注射到3000mL水中。将脂质体胶体搅拌60分钟。将脂质体通过0.45μm过滤器过滤。将脂质体胶体储存在4至8℃下。以66∶33％摩尔比制备DOTMA/DOPE脂质溶液。将脂质体用水稀释至总浓度为0.9mM。通过HPLC测量DOTMA/DOPE浓度。
动态光散射
使用Nicomp仪器(PSS.Santa Barbara.USA)通过已知的动态光散射(DynamicLight Scattering，DLS)方法来测量RNA lipoplex尺寸。
RNA lipoplex样品在测量之前进行稀释
1.与水1∶20(BM1；INEST 2.1)
2.与水1∶8(所有其他样品；INEST 2.X)
使用Nicomp 380ZLS动态光散射颗粒尺寸测定系统(particle sizing system)测量颗粒尺寸和多分散性。CDZW388版本2.14软件将接近的双峰和原生颗粒群与聚集尾分离，并将数据绘制为高斯(Gaussian)或多模态分布。测量在在一次性硼硅酸盐玻璃培养管5×50mm(Kimble.USA)在室温下在波长为660nm处进行。液体折射率预设为1.333，并且液体黏度预设为0.933cp。该分析作为外部纤维角度为90°的固体颗粒的强度加权高斯分布分析进行。在测量样品之前，对1∶500的水中稀释纳米球150nm标准品进行了测量，以检查Nicomp颗粒尺寸测定系统的功能性。当测得的标准品平均颗粒尺寸为150nm±7.5nm时，功能性得到了保证。
HPLC
使用Sunfire C18 2.5μm 4.6×75mm柱(Waters.Massachusetts.USA)和205nm的波长通过HPLC(Agilent technologies.Santa Clara.USA)测量不同脂质体制剂中的脂质浓度。流动相A为70％甲醇/30％异丙醇/0.1％TFA的混合物，流动相B为55％甲醇/15％异丙醇/30％水/0.1％TFA的混合物。将脂质体样品用水稀释至3mM总脂质浓度。
细胞培养：体外在树突细胞中的RNA转染
用0.9％NaCl溶液将RNA lipoplex稀释至0.01mg/mL RNA，用于细胞培养实验。在接种于培养基中的人树突细胞中研究不同RNA lipoplex制剂的RNA转染效率。
动物模型：树突细胞中的脾靶向和RNA转染
在BALB/c小鼠中研究了不同RNA lipoplex制剂的转染效率。眼眶后注射2μg配制的RNA lipoplex，并在6小时之后测量树突细胞(脾靶标)中的萤光素酶表达。
将制剂INEST 2.1(图81B)用0.9％NaCl稀释至0.01mg/mL的RNA浓度。向小鼠施加200μL的注射体积。注射100μL的制剂INEST 2.X(图81B)。
不对称流场流分级法
AF4法是基于纳米颗粒、聚合物和蛋白质的扩散系数来对其进行表征和分离的分级技术。使用施加在平分离通道中的流体动力实现分离。在通道内，由于流动相(对其施加了垂直力场)的层流产生了抛物线型流动剖面。通过洗脱注射程序进行分离，注射流量为0.2mL/分钟，检测器流量为0.5mL/分钟，并且横流量为1.5mL/分钟。洗脱的颗粒通过多角度光散射(multi-angle light scattering，MALS)检测器(HELLEOS II，Wyatt TechnologyCorp.Santa Barbara，CA，USA)检测。通过ASTRA软件版本7.1.3.25(Wyatt TechnologyEurope，Dernbach Germany)记录LS痕迹(trace)。
RNA lipoplex的自动化制造
为了自动化批量制造RNA lipoplex，已开发了普遍适用的操作。所有步骤均使用预先灭菌的一次性流体路径进行，以允许对材料进行安全无菌的处理。首先，将RNA的浓度调整至脂质体浓度，并添加NaCl以使RNA浓缩。由此，将RNA溶液调整至允许混合相同体积的RNA和脂质体的RNA浓度。RNA和脂质体溶液二者均被转移到大体积注射器中，并且两个注射器都安装在同时驱动注射器的两个活塞的单个注射器泵上。然后，用y型混合器(对于内径为2.4mm的管)混合脂质体和RNA-NaCl溶液，以形成RNA lipoplex。将RNA lipoplex制剂在室温下孵育10分钟，然后直接处理。用N/P比为0.65的RNA主链中带正电荷的DOTMA和带负电荷的磷酸基团来制备不同的RNA lipoplex制剂。这些不同RNA lipoplex制剂中的RNA浓度为0.15mg/mL，并且NaCl浓度为约50mM。
当前制剂(INEST 2.1/BM)：在RNA lipoplex形成之后，以1∶1.5的比例添加冷冻保护剂溶液，测量RNA浓度，然后用药物产品缓冲剂调节药物产品的最终浓度。
推荐制剂(INEST 2.X/所有其他)：RNA lipoplex形成之后，添加冷冻保护剂溶液至目标RNA浓度。
最后，用5μm过滤器过滤RNA lipoplex。
RNA lipoplex的关键品质特性是通过RNA与脂质体之间的混合比调整的电荷比。开发了允许有效控制混合比的RNA lipoplex的可自动化和可规模化的工业制造方法。在用于小规模(≤10升)的制造过程中，通过使用同时驱动填充有RNA或脂质体的两个大体积注射器的单个灌注泵，实现了对相同体积的两种含脂质体和RNA的水性溶液的混合的控制。对于更大体积(≥10升)的等同泵送，泵送系统如加压容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵或蠕动泵与具有或不具有反馈回路的流量传感器组合使用以进行流量的在线控制和可选的实时调整。
对于自动化的RNA lipoplex的制造，需要确保含有RNA和脂质体的水性溶液有效混合的混合元件。发现市售的含有蛇纹石和嵌入结构以增强混合的微流体混合元件以及具有相当结构的原型混合元件在制造期间导致材料沉积并可阻塞。因此，这些混合元件不适合用于RNA lipoplex的自动化制造。发现直径为1.2至50.0mm的Y型和T型混合元件适合于RNA lipoplex的自动化制造。
RNA完整性测量
为了分析RNA的完整性，必须从RNA lipoplex中分离RNA。将经冷冻保护的RNAlipoplex与RNeasy试剂盒(Qiagen)RLT缓冲剂以1∶3.5的比率混合。然后以1份乙醇比1.8份LPX-RLT的比率添加乙醇。
使用Qiagen的RNeasy Mini试剂盒方案和RNeasy Mini试剂盒进行进一步RNA分离。
使用Advanced Analytical(AATI)的48毛细管碎片分析仪自动系统根据制造商的说明分析RNA的完整性。结果通过PROSize 2.0版本2.0.051数据分析软件进行分析。
实施例29.1：药物产品制剂改变的概述
图72A总结了当前制剂和推荐制剂之间的差异。
图72B示出了为开发推荐制剂而研究的范围。该表包括RNA、DOTMA、DOPE、HEPES、EDTA二钠盐、蔗糖、NaCl、乙酸的研究的浓度范围以及研究的pH范围。
结果：为了简化制造过程和降低生产成本，对以下方面进行了研究，并应实施以下修改：
-用1.1mM乙酸酸化提高了脂质体的稳定性。
-改变RNA药物物质缓冲剂以简化过程(添加100mM NaCl并将pH改变为pH 7.0，以补偿乙酸引起的pH改变并提高RNA稳定性)。
-将药物产品中的RNA浓度从0.05mg/mL降至0.025mg/mL，使得产品随时可用，其无需稀释即可直接施用。无需床边稀释，并简化了低剂量的处理。
-从7.5mM HEPES降低至5.0mM HEPES以降低离子强度，且不影响pH稳定性。
-EDTA二钠盐二水合物的含量没有改变，并发现除了其RNA稳定功能(螯合可能存在的二价金属离子)外，其还可用作缓冲剂。EDTA二钠盐在药物产品制造过程中稳定pH。
-用于RNA调节的NaCl含量保持不变。药物产品中NaCl的减少使得由于溶液离子强度降低而蔗糖含量降低。
-蔗糖降至13％(w/v)可节约成本而不影响稳定性，并且是接近生理渗量浓度所必需的。无需床边稀释。
-将pH值提高至pH 6.7，以提高RNA的稳定性。
实施例29.2：在3种不同温度下测量的，在不同乙酸浓度下作为时间函数的脂质体中DOPE的稳定性的研究。
图73A：在4℃的温度下脂质体与0mM至3.0mM乙酸一起储存。
图73B：在25℃的温度下脂质体与0mM至1.6mM乙酸一起储存。
图73C：在40℃的温度下脂质体与0mM至3.0mM乙酸一起储存。
将从恰好制造之后(0个月)的样品的第一DOPE完整性值计算出的平均值设定为1，作为各研究组的初始完整性值。以下值是相对于该初始值归一化的。
方法：如上所述制备脂质体。为了酸化脂质体，向脂质体添加不同体积的1M乙酸贮备溶液，总脂质浓度为0.9mM。之后，将脂质体在不同温度(4℃、25℃和40℃)下在0mM至3mM范围内的不同乙酸浓度下储存最长6个月。
结果：发现酸化导致脂质体中的DOPE酯水解速率降低。在所有测量温度下，稳定性均随着乙酸浓度的提高而提高。1.1mM的乙酸浓度是优选的，因为它可以在对已经存在的脂质体制造过程进行略微修改之后实现。在较低的乙酸浓度下已经可以观察到稳定作用。添加乙酸之后，稳定效力呈线性相关，当乙酸浓度高于约1mM时，会转变为平稳期。稳定作用可与乙酸引起的pH改变相关。因此，其他酸(如盐酸)也适用于稳定脂质体中的DOPE。
实施例29.3：RNA药物物质缓冲剂和RNA浓度：为过程简化而进行的调整
图74总结了当前RNA药物物质制剂与推荐制剂之间的差异。
结果：推荐的RNA药物物质制剂允许将RNA药物物质处理成RNA lipoplex，而不需要调节浓度和张力。固定和轻微提高的缓冲剂浓度、EDTA二钠盐浓度以及pH调节提高了过程的再现性，并允许补偿脂质体中的乙酸引起的pH改变(RNA lipoplex形成时可预测的pH改变)。在RNA lipoplex形成过程中，处理参数例如RNA浓度和离子条件保持相似，使得改变风险较低。在pH 7.0时，RNA药物物质的稳定性提高。
实施例29.4：RNA浓度调整至0.025mg/mL。
图75示出了RNA浓度为0.025mg/mL时常用药物物质量的剂量体积。
结果：对于所考虑的所有情况，药物产品中25μg/mL的RNA浓度使得剂量体积与1mL注射器上的主要刻度一致。这些剂量体积便于HCP正确测量和给药。
实施例29.5：HEPES含量：降低至5.0mM。
图76A示出了在25℃下孵育61天之后，在不同pH下对于不同缓冲剂体系(HEPES、组氨酸和乙酸钠)随时间的药物产品的RNA完整性。每个点表示两个小瓶药物产品的平均RNA完整性值及相关的标准偏差。将从恰好制造之后(时间点T0)的样品的第一RNA完整性值计算出的平均值设定为100％，作为各研究组的初始完整性值。以下值是相对于该初始值归一化的。虚线描绘了冷冻的当前制剂(BM1)的≥80％完整全长RNA的规格限制。
方法：如上所述制备BM1 RNA lipoplex。用含有5mM乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。为了产生不同的研究组，RNA在以下中提供：
a)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 6.2，用于BM1
b)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于HEPES组
c)20mM组氨酸，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于组氨酸组
d)20mM乙酸钠，18mM EDTA二钠盐，pH 6.6，用于乙酸钠组
如上所述冷冻保护BM1 RNA lipoplex并调节RNA浓度。通过以1∶6.7的比率添加含有相应缓冲物质的冷冻保护缓冲剂来冷冻保护所有其他RNA 1ipoplex。通过向经冷冻保护的RNA 1ipoplex添加HCl或NaOH滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001171
Figure BDA0004156329990001172
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在环境温度(25℃)下储存至少61天。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定RNA完整性。
结果：在相关pH范围(pH 6.4至7.0)内，HEPES对药物产品中的RNA提供一些独特的稳定作用(优于组氨酸、MES(未示出)和乙酸钠(pH 5.5至5.8))，使得药物产品中RNA稳定性显著增强。HEPES有助于在RNA与含有乙酸的脂质体混合期间控制pH。发现HEPES在pH 6至7时的缓冲能力足以长期稳定pH。
图76B示出了在25℃下孵育56天之后，在选定的pH 6.7下在不同HEPES浓度下随时间的药物产品的RNA完整性。每个点表示两个小瓶药物产品的平均RNA完整性值及相关的标准偏差。将从恰好制造之后(时间点T0)的样品的第一RNA完整性值计算出的平均值设定为100％，作为各研究组的初始完整性值。以下值是相对于该初始值归一化的。虚线描绘了冷冻的当前制剂(BM1)的≥80％完整全长RNA的规格限制。
方法：如上所述制备BM1 RNA lipoplex。用含有5mM乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。为了产生不同的研究组，RNA在以下中提供：
a)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 6.2，用于BM1
b)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于HEPES组
如上所述冷冻保护BM1 RNA lipoplex并调节RNA浓度。通过以1∶6.7的比率添加具有提高的HEPES含量以在最终PD组合物中产生不同的HEPES浓度的冷冻保护缓冲剂来冷冻保扩所有其他RNA lipoplex。通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加HCl滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001181
Figure BDA0004156329990001182
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在环境温度(25℃)下储存56天。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定RNA完整性。
结果：发现2.5mM至10.0mM的浓度范围产生相当的pH(数据未示出)和RNA稳定性。为了降低离子负荷，将药物产品中的HEPES浓度从7.5mM降低至5.0mM。
实施例29.6：EDTA二钠盐含量：2.5mM时不变
图77A示出了在-15℃下储存18个月之后，在不同EDTA二钠盐浓度和不同pH值下随时间的药物产品的颗粒尺寸。每个点表示两个小瓶药物产品的平均颗粒尺寸值及其相关的标准偏差。虚线描绘了冷冻的当前制剂BM1的颗粒尺寸的规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图77B示出了在25℃下孵育66天之后，在不同EDTA二钠盐浓度和不同pH值下随时间的药物产品的RNA完整性。每个点表示两个小瓶药物产品的平均RNA完整性值及相关的标准偏差。将从恰好制造之后(时间点T0)的样品的第一RNA完整性值计算出的平均值设定为100％，作为各研究组的初始完整性值。以下值是相对于该初始值归一化的。虚线表示冷冻的当前制剂(BM1)的≥80％完整全长RNA的规格限制。
方法：如上所述制备BM1 RNA lipoplex。用含有5mM乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。为了产生不同的研究组，RNA在以下中提供：
a)18rnM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 6.2，用于BM1
b)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于含EDTA的HEPES组
c)18mM HEPES，pH 7.0，用于不含EDTA的HEPES组
在RNA lipoplex形成过程中，含EDTA的两组的EDTA二钠盐浓度相同。通过随后用冷冻保护缓冲剂稀释RNA lipoplex来调节最终的EDTA二钠盐浓度。
如上所述冷冻保护BM1 RNA lipoplex并调节RNA浓度。通过以1∶6.7的比率添加不含EDTA二钠盐(0mM和0.4mM EDTA二钠盐组)或含有EDTA二钠盐以在最终PD组合物中产生不同的EDTA二钠盐浓度的冷冻保护缓冲剂来冷冻保护所有其他RNA lipoplex。通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加NaOH滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001201
Figure BDA0004156329990001202
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在环境温度(25℃)下储存66天，或在-15℃下储存18个月。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定颗粒尺寸和RNA完整性。
结果：与用含EDTA二钠盐的药物物质缓冲剂制备的RNA lipoplex相比，不使用EDTA二钠盐制备的RNA lipoplex产生更大的颗粒尺寸。对于0.4mM至2.5mM EDTA二钠盐以及pH 6.5和7.0，含EDTA二钠盐的药物产品的RNA lipoplex颗粒尺寸相当。此外，还发现药物产品中在0.4mM至2.5rnM EDTA二钠盐之间的RNA稳定性相当，而与pH 6.5相比，pH 7.0时的RNA稳定性略高。EDTA二钠盐在RNA lipoplex形成过程中有助于pH稳定，而其在药物物质缓冲剂中的缺乏(在药物产品中0mM EDTA二钠盐)导致RNA lipoplex形成过程中的pH改变，这导致药物产品中RNA稳定性降低和RNA lipoplex颗粒尺寸增大。
实施例29.7：NaCl浓度降至8.2mM。
图78中的图表示出了在-15℃下储存6个月之后，含不同量NaCl和蔗糖的冷冻保护药物产品随时间的颗粒尺寸。每个点表示两个小瓶药物产品的平均颗粒尺寸值及其相关的标准偏差。虚线描绘了冷冻的当前制剂BM1的颗粒尺寸的规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
方法：用使RNA浓缩的提高量的NaCl和不含乙酸的脂质体制备RNA lipoplex。这些不同RNA lipoplex制剂中的RNA浓度为0.15mg/mL，但NaCl浓度在60mM NaCl(DP中20mM)、120mM NaCl(DP中40mM)和150mM NaCl(DP中60mM)之间变化。通过以1.0∶1.5的比率添加不含NaCl(20mM NaCl和40mM NaCl组)或含NaCl(60mM NaCl组)和具有不同蔗糖含量以在最终DP组合物中产生不同NaCl和蔗糖浓度的冷冻保护缓冲剂来冷冻保护RNA lipoplex。通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加NaOH或HCl滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001211
Figure BDA0004156329990001212
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入2mL塑料小瓶中，并在-15℃下储存至少6个月。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定颗粒尺寸。在2个月之后停止了60mMNaCl和15％(w/v)蔗糖组的理化分析，因为颗粒尺寸的增加超过了分析方法的分辨率(resolution)。
结果：药物产品中的NaCl含量对冷冻状态下RNA lipoplex的长期胶体稳定性至关重要(越低越好)。冷冻保护剂的含量只能在一定程度上补偿NaCl的负面影响。为了获得具有接近生理渗量浓度的随时可用产品，将蔗糖含量降至13％(w/v)蔗糖，这限制了总体NaCl含量。在RNA lipoplex形成过程中NaCl浓度应保持不变，但DP中的NaCl浓度应尽可能降至最低值。
实施例29.8：蔗糖作为冷冻保护剂确保药物产品的胶体稳定性。
图79A示出了在-15℃下储存12个月之后，与当前标称制剂(BM1)相比，新制剂的具有最坏情况组成(药物产品中离子负荷更高且RNA浓度提高)的经冷冻保护RNA lipoplex随时间的颗粒尺寸。不同组的蔗糖浓度不同(8％至14％(w/v)；BM1＝22％(w/v))。每个点表示两个小瓶药物产品的平均颗粒尺寸值及其相关的标准偏差。虚线描绘了冷冻的当前制剂BMl颗粒尺寸的规格限制(上限：700nm，下限：250nm)。
图79B示出了与包含具有标称组成(具有降低的蔗糖含量10％(w/v))的新制剂和当前制剂(BM1)的药物相比，新制剂的具有最坏情况组成(药物产品中离子负荷更高且RNA浓度提高)的经冷冻保护RNA lipoplex的90°处AF4 LS痕迹。分析之前，样品在-15℃下储存12个月。
方法：如上所述制备BMl RNA lipoplex。用不含乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。因此，将药物物质缓冲剂的pH设定为pH 6.7。为了产生具有最坏情况组成的不同研究组，将具有升高的HEPES和EDTA二钠盐浓度和提高的蔗糖含量的冷冻保护剂缓冲剂与RNA lipoplex以1∶3.9的比率混合。必要时，通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加NaOH或HCl滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001221
Figure BDA0004156329990001222
/>
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在-15℃下储存12个月。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定颗粒尺寸。
结果：短时间之后，发现与较高蔗糖浓度(12％(w/v)至14％(w/v))相比，较低蔗糖浓度(8％(w/v)至10％(w/v))稳定RNA lipoplex尺寸的有效性较低。在进一步的时间过程中，可以观察到所有RNA lipoplex颗粒尺寸略有增加，但是当使用较低蔗糖浓度冷冻保护时，RNA lipoplex尺寸较高的趋势保持稳定。
将具有最坏情况组成(药物产品中离子负荷更高且RNA浓度提高)的RNA lipoplex和使用具有降低的蔗糖含量10％(w/v)的标称组成制造的RNA lipoplex的AF4尺寸分布谱与当前标称制剂的进行比较。不同组的蔗糖浓度不同(8％(w/v)至14％(w/v)；BM1＝22％(w/v))，并在-15℃下储存12个月。使用AF4系统分析样品，其中洗脱的组分作为其流体动力学半径(Rh)的函数。
一般而言，所有颗粒在25分钟至70分钟的洗脱时间下均出现光散射峰，在较长洗脱时间下峰形略有差异。此外，具有最坏情况组成和降低的蔗糖浓度的样品显示出峰最大值向更长洗脱时间移动，表明颗粒随时间发生变化。与含12％(w/v)和14％(w/v)蔗糖的最坏情况样品相比，用具有降低的蔗糖含量10％(w/v)的标称组成产生的样品的洗脱曲线显示出轻微改变。含有12％(w/v)和14％(w/v)蔗糖的最坏情况样品的相当的洗脱曲线表明，蔗糖浓度提高至超过12％(w/v)不会导致稳定性进一步提高。根据AF4数据，应考虑至少为12％(w/v)的蔗糖浓度，以确保药物产品的长期稳定性，即使在最坏情况条件下也是如此。
实施例29.9：pH值：提高至pH 6.7。
图80A示出了在25℃下孵育56天之后，在不同pH(pH 6.2、6.7和7.2)下含有5mMHEPES缓冲剂的lipoplex药物产品随时间的RNA完整性。每个点表示两个小瓶药物产品的平均RNA完整性值及相关的标准偏差。将从恰好制造之后(时间点T0)的样品的第一RNA完整性值计算出的平均值设定为100％，作为各研究组的初始完整性值。以下值是相对于该初始值归一化的。虚线描绘了冷冻的当前制剂(BM1)的≥80％完整全长RNA的规格限制。
方法：如上所述制备BM1 RNA lipoplex。用含有5mM乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。RNA在以下中提供：
a)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 6.2，用于BM1
b)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于其他组
如上所述冷冻保护BM1 RNA lipoplex并调节RNA浓度。通过以1∶6.7的比率添加冷冻保护缓冲剂来冷冻保护所有其他RNA lipoplex。通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加NaOH或HCl滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001231
Figure BDA0004156329990001232
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在环境温度(25℃)下储存56天。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定RNA完整性。
结果：发现HEPES的最佳pH范围为pH 6.7至pH 7.2，这使得RNA的稳定性明显优于pH 6.2时。在冷冻状态下，未发现pH 5.5至7.2与不同缓冲剂体系组合的差异(数据未示出)。为了优化液体状态下的RNA稳定性，RNA lipoplex药物产品的pH应改为pH 6.7。
图80B示出了在25℃下孵育66天之后，在不同pH(pH 6.0、6.5和7.0)下含有HEPES缓冲剂和2.5mM EDTA二钠盐的lipoplex药物产品中的RNA完整性。虚线描绘了冷冻的当前制剂(BM1)的≥80％完整全长RNA的规格限制。
方法：如上所述制备BM1 RNA lipoplex。用含有5mM乙酸的脂质体如上所述制备所有其他RNA lipoplex。RNA在以下中提供：
a)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 6.2，用于BM1
b)18mM HEPES，18mM EDTA二钠盐，pH 7.0，用于其他组
如上所述冷冻保护BM1 RNA lipoplex并调节RNA浓度。通过以1∶6.7的比率添加冷冻保护缓冲剂来冷冻保护所有其他RNA lipoplex。通过向经冷冻保护的RNA lipoplex添加NaOH或HCl滴定最终pH值，最终得到以下组成：
Figure BDA0004156329990001241
Figure BDA0004156329990001242
将滴定的、经冷冻保护的RNA lipoplex装入10R玻璃小瓶中，并在环境温度(25℃)下储存66天。在限定的时间点，每组收集两个小瓶，并确定RNA完整性。
结果：与图80A中示出的结果一致，发现最佳pH范围为pH 6.5至pH 7.0，而pH 6.0确实导致RNA稳定性显著更低。此外，EDTA二钠盐的螯合效力取决于pH，在pH 6.5与7.0之间未发现药物产品中RNA稳定性的差异。为了优化液体状态下的RNA稳定性，RNA lipoplex药物产品的pH应改为pH 6.7。
实施例29.10：具有不同蔗糖浓度且在脂质体中含有乙酸和不含乙酸的制剂的可比性。
在图81A中，示出了测试制剂的详细说明。将含有10％(w/v)蔗糖且在脂质体中含和不含乙酸的所述制剂与含有22％(w/v)蔗糖的基准制剂进行比较。
图81B包括不同测试制剂的颗粒尺寸和PDI。通过PCS测量各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的颗粒尺寸。每个条表示制剂的颗粒尺寸。每个点表示所研究制剂的PDI。
图81C包括各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的体外萤光素酶信号强度。
图81D包括各自一式三份(#1至#3)制备的含22％蔗糖(INEST 2.1)、含10％蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNAlipoplex药物产品的体内萤光素酶信号强度。
方法：如上所述制备RNA lipoplex。为了将脂质体酸化至2mM乙酸的浓度，向脂质体添加1M的乙酸储备溶液。
结果：当前的制剂(INEST 2.1)显示出与推荐制剂(INEST 2.X)相当的结果。未发现不同产品的尺寸和多分散性的差异(图81B)。给出了所有单独制剂的批间再现性(图81B，C，D)。所有制剂的体外翻译是相当的(图81C)。所有制剂的体内萤光素酶信号强度是相当的(图81D)。
实施例29.11：具有不同蔗糖浓度且在脂质体中含和不含乙酸的不同制剂的稳定性。
在表图82A中示出了测试制剂的详细说明。将含有10％(w/v)蔗糖且在脂质体中含和不含乙酸的所述制剂与含有22％(w/v)蔗糖的基准制剂进行比较。
图82B包括不同测试制剂的颗粒尺寸。在-20℃下储存13个月之后通过PCS测量各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.Xw/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的颗粒尺寸。
图82C包括在-20℃下储存13个月之后，各自一式三份(#1至#3)制备的含22％(w/v)蔗糖(INEST 2.1)、含10％(w/v)蔗糖(INEST 2.X w/o)和含10％(w/v)蔗糖以及脂质体中的2mM乙酸(INEST 2.X与AcOH)的RNA lipoplex药物产品的体外萤光素酶信号强度。
方法：如上所述制备RNA lipoplex。将RNA lipoplex储存在-20℃下。为了将脂质体酸化至2mM乙酸的浓度，向脂质体添加1M的乙酸贮备溶液。
结果：
13个月之后，当前制剂(INEST 2.1)显示出与推荐制剂(INEST 2.X)相当的结果。未发现不同产品在尺寸方面的差异(图82B)。所有制剂的体外翻译是相当的(图82C)。发现所有测量制剂的稳定性相当(图82B，C)。

Claims (50)

1.组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
RNA，以及
至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质，
浓度为约10mM或更低的氯化钠，
浓度为超过约10％重量/体积百分比(％w/v)且低于约15％重量/体积百分比(％w/v)的稳定剂，以及
缓冲剂。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约5mM至约10mM。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约8.5mM或更低。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为约8.2mM。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物中盐和/或稳定剂的浓度约为生理渗量浓度所需的值。
6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物中稳定剂的浓度为约12至约14％(w/v)，优选约13％(w/v)。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇以及直链多元醇的碳水化合物。
8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是蔗糖或海藻糖。
9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是浓度为约12至约14％(w/v)的蔗糖。
10.权利要求8或9所述的组合物，其中所述蔗糖的浓度为约13％(w/v)。
11.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是浓度为约12至约14％(w/v)的海藻糖。
12.权利要求8或11所述的组合物，其中所述海藻糖的浓度为约13％(w/v)。
13.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂选自：2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、组氨酸、乙酸/乙酸钠和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是HEPES、组氨酸或MES。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是HEPES或MES。
16.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是HEPES。
17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为6.0至7.5、6.5至7.5、6.5至7.3、6.5至7.2、6.7至7.2或6.5至7.0。
18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为约6.7。
19.权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂以2.5mM至10mM的浓度存在。
20.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂以约5mM的浓度存在。
21.权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是浓度为约5mM或更低且pH为约6.7的HEPES。
22.权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
23.权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。
24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
25.权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1。
26.权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒包含摩尔比为约10∶0至1∶9、约4∶1至1∶2、约3∶1至约1∶1、或约2∶1的DOTMA和DOPE。
27.权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含螯合剂。
28.权利要求27所述的组合物，其中所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
29.权利要求28所述的组合物，其中EDTA的浓度为约3.5mM或更低，或约0.25mM至约3.5mM，或约0.25mM至约2.5mM。
30.权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码包含至少一个表位的肽或蛋白质，其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1∶2至约1.9∶2，或约1.3∶2.0。
31.组合物，其包含：
RNA lipoplex颗粒，其包含：
编码包含至少一个表位的肽或蛋白质的RNA，
摩尔比为约2∶1的DOTMA和DOPE，
其中所述组合物中正电荷与负电荷之比为约1.3∶2.0，
浓度为约8.2mM的氯化钠，
浓度为约13％(w/v)的蔗糖，
浓度为约5mM、pH为约6.7的HEPES，以及
浓度为约2.5mM的EDTA。
32.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm，或约350nm至约400nm。
33.权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的量为约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、或约0.025mg/mL。
34.权利要求1至33中任一项所述的组合物，其还包含使脂质体稳定的量的酸。
35.权利要求1至34中任一项所述的组合物，其中所述组合物为液体、冷冻或脱水状态。
36.权利要求35所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少一个月保持稳定。
37.权利要求35所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少两个月保持稳定。
38.权利要求35所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少四个月保持稳定。
39.权利要求35所述的冷冻组合物，其中所述组合物在约-15℃的温度下至少六个月保持稳定。
40.包含RNAlipoplex颗粒的液体组合物，其可通过将冷冻的权利要求35至39中任一项所述组合物解冻来获得。
41.包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物，其可通过将脱水的权利要求35所述组合物溶解来获得。
42.权利要求35、40或41所述的液体组合物，其为水性组合物。
43.权利要求42所述的组合物，其可直接施用于对象。
44.权利要求1至43中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
45.权利要求1至44中任一项所述的组合物，其配制成用于全身性施用。
46.权利要求45所述的组合物，其中所述全身性施用是通过静脉内施用。
47.权利要求1至46中任一项所述的组合物，其用于治疗用途。
48.制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，其包括将冷冻的权利要求35至39中任一项所述组合物解冻。
49.制备用于直接施用于对象的包含RNA lipoplex颗粒的液体组合物的方法，其包括将脱水的权利要求35所述组合物溶解。
50.权利要求48或49所述的方法，其中所述液体组合物是水性组合物。
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