CN116179759A - 乙型肝炎病毒rna定量检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乙型肝炎病毒RNA定量检测试剂盒及方法，具体地，本发明开发的多重引物探针体系针对乙型肝炎病毒RNA表现出了极高的灵敏度，该多重引物探针体系配合试剂盒中的定量参考品检测时具有极佳的线性，因而可以提供高准确性和灵敏度而且性能稳定的HBV RNA定量检测手段，以满足临床需求。

Description

乙型肝炎病毒RNA定量检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种乙型肝炎病毒RNA定量检测试剂盒及方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，是导致慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的主要致病因素。乙型肝炎病毒感染是全球性的公共卫生问题。全球肝硬化和肝细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为30％和45％。我国肝硬化和肝细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为60％和80％。HBV造成的疾病负担非常沉重，其防治工作面临严峻的挑战。
研究显示，外周血中HBV RNA水平可以反映肝内HBV病毒的转录活性。在抗病毒治疗过程中，核苷(酸)类药物可有效抑制HBV DNA的合成，但不抑制HBV RNA的合成，即使血液中HBV DNA浓度低于检测下限，但仍然能检测到HBV RNA。此外，在接受聚乙二醇干扰素α(Peg-IFN-α)治疗中，HBV RNA的载量可辅助作为HBeAg的血清转换预测的指标之一。因此，血液中的HBV RNA的载量，在监测抗病毒疗效方面具有临床意义。
目前荧光PCR法检测有两类靶标，一个是检测HBV DNA，另一个是检测HBV RNA。HBVDNA主要用于评估HBV感染者病毒复制水平，是抗病毒治疗适应证选择及疗效判断的重要指标，应用广泛。但目前应用于治疗HBV的口服药物如恩替卡韦、拉米夫定以及核苷类、核苷酸类药物虽然可有效降低外周HBV DNA载量，但对肝细胞内的共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA，cccDNA)无明确作用。
HBV RNA载量可以反映cccDNA的在肝内的活动水平，由于核苷(酸)类药物的影响，即使血液中检测不到HBV DNA，由于cccDNA的持续存在，血液中仍存在HBV RNA。此外，在接受Peg-IFN-α治疗中，HBV RNA可辅助作为HBeAg的血清转换预测的指标之一。因此，血液中的HBV RNA的载量可以作为反应HBV病毒的转录活性及判断药物疗效的一种更可靠、更高效的指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的乙型肝炎病毒(HBV)RNA核酸定量检测试剂盒。
本发明的第一方面，提供了一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对组还包括SEQ ID NO.4所示的逆转录引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.3所示的针对乙型肝炎病毒的特异性的探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.7所示的内标探针。
本发明的第三方面，提供了一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对组和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的引物对组和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含Taq酶、C-MMLV酶、UDG酶和dNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内包含内标溶液，所述内标溶液包括含内标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内包含DNA酶I。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内包含DNA酶I缓冲液；优选地，所述DNA酶I缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化镁、和氯化钙。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内包含阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内包含强阳性质控品；优选地，所述强阳性质控品包括浓度为105copies/mL至106copies/mL的含HBV RNA目标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器，所述第八容器内包含临界阳性质控品；优选地，所述临界阳性质控品包括浓度为102copies/mL至103copies/mL的含HBV RNA目标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第九容器，所述第九容器内包含第一阳性定量参考品；优选地，所述第一阳性定量参考品包括浓度为1.0×106copies/mL的含HBV RNA目标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十容器，所述第十容器内包含第二阳性定量参考品；优选地，所述第二阳性定量参考品包括浓度为1.0×105copies/mL的含HBV RNA目标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十一容器，所述第十一容器内包含第三阳性定量参考品；优选地，所述第三阳性定量参考品包括浓度为1.0×104copies/mL的含HBVRNA目标片段的假病毒。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第十二容器，所述第十二容器内包含第四阳性定量参考品；优选地，所述第四阳性定量参考品包括浓度为1.0×103copies/mL的含HBVRNA目标片段的假病毒。
本发明的第四方面，提供了一种定量检测乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，提取待检样本中的核酸；
(2)使用DNA酶I进行样本核酸DNA消化；
(3)制备扩增反应体系，进行扩增反应，定量检测样本中的HBV RNA；
其中，所述扩增反应体系包括经步骤(2)处理的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于定量检测乙型肝炎病毒RNA。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的最低检测限参考品(50copies/mL)检测结果图；
图2所示为本发明具体实施方式的交叉反应样本检测结果图；
图3所示为本发明具体实施方式的检测精密度参考品(1.0×105copies/mL)的检测结果图；
图4所示为本发明具体实施方式的检测精密度参考品(1.0×103copies/mL)的检测结果图；
图5所示为本发明具体实施方式的检测线性参考品的检测结果图；
图6所示为本发明具体实施方式的检测临床样本的检测结果图。
具体实施方式
本发明基于多重实时荧光定量PCR开发了定量检测乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)的试剂盒及方法，本发明开发的多重引物探针体系针对乙型肝炎病毒RNA表现出了极高的灵敏度，该多重引物探针体系配合试剂盒中的定量参考品检测时具有极佳的线性，因而可以提供高准确性和灵敏度而且性能稳定的HBV RNA定量检测手段，以满足临床需求。
本发明属于病原体分子检测领域，涉及一种高灵敏度的人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA的检测试剂盒，具体涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对HBV DNA核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒，可广泛应用于HBV病毒引起的乙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪，以及检验检疫和疫情防控等多个领域。
多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用不同荧光基团对特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在同一个PCR反应管中对多种类型的病毒同时进行扩增，荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光PCR技术应用于乙型肝炎病毒的快速检测，能提高检测鉴别效率，在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染乙型肝炎病毒，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，防止这些病毒继续传播，并提高诊疗效率，为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
基于多重PCR的原理，在本发明的一个优选地实施方式中，提供了一种乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测用引物包括2对正、反向引物，1条逆转录引物以及2条特异性探针，分别针对HBV RNA及内标的检测，其核酸序列为：
检测HBV RNA的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，逆转录引物其核酸序列如SEQ ID NO.4所示，检测HBV RNA的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
检测内标的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.5～6所示，检测内标的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述SEQ ID NO.3核苷酸序列的5’端标记有荧光基团(如FAM)、3’端标记有荧光淬灭基团(如MGB)，所述SEQ ID NO.7核苷酸序列的5’端标记有荧光基团(如VIC)、3’端标记有荧光淬灭基团(如BHQ1)。
荧光基团标记可采用FAM、VIC、HEX、YELLOW中任一荧光基团；荧光淬灭基团可采用TAMRA、BHQ1、BHQ2、Eclipse、Dabcy 1中任一荧光淬灭基团。优选的，SEQ ID NO.3核苷酸序列的荧光基团不同于SEQ ID NO.7序列的荧光基团。
优选地，所述上游引物在反应体系中的终浓度为0.15μmol/L，所述下游引物在反应体系中的终浓度为0.15μmol/L，所述逆转录引物在反应体系中终浓度为0.20μmol/L，所述检测HBV RNA探针在反应体系中的终浓度为0.03μmol/L，所述检测内标的探针在反应体系中的终浓度为为0.05μmol/L；
所述检测HBV RNA和内标的引物探针序列如下表：
引物、探针序列号 核苷酸序列(5’-3’)
HBV RNA上游引物SEQ ID NO.1 TGCCTTCTGACTTCTTTCCTTC
HBV RNA下游引物SEQ ID NO.2 CCCCAACACAGGATAGCTTG
HBV RNA探针SEQ ID NO.3 FAM-CTCGACACCGCCTCTGCTCT-MGB
逆转录引物SEQ ID NO.4 ACTACTAATTCCCTGGATGCTGG
内标上游引物SEQ ID NO.5 ACTTGAGATCAAAGTACCCAT
内标下游引物SEQ ID NO.6 AACCCCAGAAGTTTTCACA
内标探针SEQ ID NO.7 VIC-TTGGCTCGACAAGTCCCT-BHQ1
本发明还提供了上述PCR扩增引物对和探针的用途，用于制备实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述实时荧光定量PCR检测试剂盒用于定量检测乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)。
在本发明的另一个优选地实施方式中，提供了一种用于定量检测乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)的试剂盒，所述试剂盒包括HBV RNA反应液A，所述HBV RNA反应液A包括上述的PCR引物对组和探针组；优选地，所述HBV RNA反应液A还包括10×HBV RNA buffer，所述PCR反应液的10×HBV RNA buffer包括如下成分，如表：
Figure BDA0003725666710000061
Figure BDA0003725666710000071
在另一优选例中，所述试剂盒还包括所述HBV RNA反应液B，所述HBV RNA反应液B包括选自下表的一种或多种组分：
Figure BDA0003725666710000072
在另一优选例中，所述试剂盒还包括DNA消化试剂，所述DNA消化试剂包括DNA酶I和/或DNA酶I buffer(保存缓冲液)。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品，所述阴性质控品为DEPC水。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括强阳性质控品，所述强阳性质控品为包含乙型肝炎病毒RNA的假病毒颗粒。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括临界阳性质控品，所述临界阳性质控品为包含乙型肝炎病毒RNA的假病毒颗粒。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性定量参考品1至4，所述阳性定量参考品1至4为包含乙型肝炎病毒RNA的假病毒颗粒。
在另一优选例中，所述包含乙型肝炎病毒RNA的假病毒颗粒中，包含的乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA目标片段)的序列如下：
ATTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGACTCGGTTAATGATCTTTGTACTGGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGTGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTATATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTAAGGCAAGCTATCCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTAAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTACCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTT(SEQ ID NO.8)。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括内标溶液，所述内标溶液为包含内标片段的假病毒颗粒。所述内标片段包含内标上游引物和内标下游引物所扩增序列；优选地，所述内标片段的序列(RNA)如下：
GTAGTTGTTGGGCATTCTCGGCCGTTGCAACTGTAGAGGGAATAAATAAGATTAGAACTGGAAAATTAGTAGAATTATCAGAGCAAGAACTTGTTGACTGTGAAAGACGTAGCCATGGGTGCAAAGGAGGTTATCCGCCGTATGCACTTGAATATGTGGCTAAGAATGGTATTCACTTGAGATCAAAGTACCCATATAAAGCAAAGCAAGGGACTTGTCGAGCCAAACAAGTGGGAGGTCCGATTGTGAAAACTTCTGGGGTTGGACGTGTGCAACCAAATAATGAAGGGAATCTCTTAAATGCAATTGCAAAGCAACCTGTGAGCGTTGTGGTTGAATCCAAGGGAAGACCTTTCCAATTGTATAAAGGGGGAATATTTGAGGGGCCATGCGGAACCAAAGTAGATCATGCAGTAACAGCAGTTGGTTATGGAAAAAGTGGAGGCAAAGGTTACATACTCATCAAGAATTCAT(SEQ ID NO.9)
可以使用本领域常规方法制备假病毒颗粒，例如，制备假病毒颗粒的方法包括：将合成的目的片段(HBV RNA目标片段或内标片段)连接到构建好的pET28a-MS2载体中，并转化表达至宿主菌BL21感受态细胞中，挑取单克隆并测序验证后进行诱导表达、超声破碎，将破碎完全的表达产物于12000rpm，4℃，离心30min，收集上清。将收集到的上清经消化处理后即为含有目的片段的假病毒颗粒。
在本发明的另一个优选地实施方式中，提供了一种定量检测乙型肝炎病毒RNA的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，提取待检样本中的核酸；
(2)使用DNA酶I进行样本核酸DNA消化；
(3)制备扩增反应体系，进行扩增反应，定量检测样本中的HBV RNA。
其中，所述扩增反应体系包括经步骤(2)处理的待检测样本、本发明所述的引物对组和探针组。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。
在本发明的另一个优选地实施方式中，提供了本发明所述的引物对组和探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)检测试剂盒
本实施例提供了一种乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)检测的试剂盒，其组成成分、包装及数量(24反应/盒)，如表：
Figure BDA0003725666710000091
实施例2：最低检测限检测
最低检测限样本为含HBV RNA目标片段的假病毒，稀释到5.0×101copies/mL作为最低检出限参考品，标示为M1；强阳性质控品、临界阳性质控品及阳性定量参考品(1-4)为HBV RNA目标片段的假病毒的提取液，阴性质控品为DEPC水提取液；
使用DNA酶I对提取后的强阳性质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品(1-4)、阴性质控品和最低检测限参考品核酸进行DNA消化处理，取消化后的核酸加样至实施方法1配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
50℃10分钟，1个循环；95℃10分钟，1个循环；95℃10秒→57℃35秒，5个循环；95℃10秒→55℃35秒，35个循环；
将PCR反应完的反应管置于ABI 7500仪器上，对本发明的最低检测限进行检测，得到结果如下：
Figure BDA0003725666710000101
试剂盒的最低检测限参考品M1，重复检测20次，检测结果均为阳性；因此，本发明的最低检测限为5.0×101copies/mL。
实施例3：交叉反应检测
交叉反应检测样本为人巨细胞病毒，EB病毒，人类免疫缺陷病毒1型，甲型流感病毒，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒临床样本；阳性质控品为HBV RNA目标片段的假病毒的提取液，阴性质控品为DEPC水提取液；
使用DNA酶I对提取后的阳性质控品、阴性质控品和交叉反应样本核酸进行DNA消化处理，取消化后的核酸加样至实施方法1配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
50℃10分钟，1个循环；95℃10分钟，1个循环；95℃10秒→57℃35秒，5个循环；95℃10秒→55℃35秒，35个循环；将PCR反应完的反应管置于ABI 7500仪器上，对本发明的最低检测限进行检测，得到结果如下：
Figure BDA0003725666710000111
实施例4：精密度检测
精密度检测样本为含有HBV RNA目标片段的假病毒，稀释到1.0×105copies/mL和1.0×103copies/mL作为精密度参考品，分别标示为R1和R2；强阳性质控品、临界阳性质控品及阳性定量参考品(1-4)为HBV RNA目标片段的假病毒的提取液，阴性质控品为DEPC水提取液；
使用DNA酶I对提取后的强阳性质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品(1-4)、阴性质控品和精密度参考品核酸进行DNA消化处理，取消化后的核酸加样至实施方法1配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
50℃10分钟，1个循环；95℃10分钟，1个循环；95℃10秒→57℃35秒，5个循环；95℃10秒→55℃35秒，35个循环；
将PCR反应完的反应管置于ABI 7500仪器上，对本发明的精密度进行检测，得到结果如下：
Figure BDA0003725666710000121
实施例5：线性检测
线性检测样本为含有HBV RNA目标片段的假病毒，梯度稀释到1.0×108copies/mL、1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL和1.0×102copies/mL作为线性参考品，分别标示为L0-L6；强阳性质控品、临界阳性质控品及阳性定量参考品(1-4)为HBV RNA目标片段的假病毒的提取液，阴性质控品为DEPC水提取液；
使用DNA酶I对提取后的强阳性质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品(1-4)、阴性质控品和线性参考品核酸进行DNA消化处理，取消化后的核酸加样至实施方法1配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
50℃10分钟，1个循环；95℃10分钟，1个循环；95℃10秒→57℃35秒，5个循环；95℃10秒→55℃35秒，35个循环；
将PCR反应完的反应管置于ABI 7500仪器上，对本发明的精密度进行检测，得到结果如下：
Figure BDA0003725666710000131
Figure BDA0003725666710000141
实施例6临床样本检测
用不含抗凝剂的采血管采集50例临床阳性受检者静脉血，放置室温自发完全凝集析出血清或直接使用水平离心机离心，上层即为血清。
用含乙二胺四乙酸盐(EDTA-盐)或枸橼酸钠抗凝剂的采血管采集受检者静脉血，立即轻轻颠倒采血管混合，使抗凝剂与静脉血充分混匀，将采集的抗凝全血离心分离血浆。将制备好的血清、血浆用于样本核酸的提取。采用广州达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。模板核酸可直接用于后续实验。
使用DNA酶I对提取后的强阳性质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品(1-4)、阴性质控品和样本核酸加样至实施方法1配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；
PCR的扩增条件：
50℃10分钟，1个循环；95℃10分钟，1个循环；95℃10秒→57℃35秒，5个循环；95℃10秒→55℃35秒，35个循环；
将PCR反应完的反应管置于ABI 7500仪器上，检测、分析样本中的HBV RNA。
检测结果为：50例样本均为阳性，所检结果与临床样本DNA阳性结果一致。
对比例1
HBV RNA可辅助作为HBeAg的血清转换预测指标。因此，血液中的HBV RNA的载量可以作为反应HBV病毒的转录活性及判断药物疗效的一种可靠和高效的指标。临床血液样本中的HBV RNA载量差异巨大，因而在定量检测过程中，需要检测试剂盒具有极佳的灵敏度和优异的线性，以保证检测结果的可靠性。
本发明人针对HBV RNA靶序列设计了十数对多重PCR扩增引物，其中绝大部分引物的灵敏度较低，有些特异性也较差，无法满足检测需要，例如对照引物对：
上游引物:ACTTCTTTCCTTCTATTCGTGATC(SEQ ID NO.10)；
下游引物:TGGCCAGATTCATCAACTCACC(SEQ ID NO.11)
在5.0×101copies/mL的检测限下，重复20次，检测结果准确率仅为40％；在5.0×102copies/mL的检测限下，重复20次，检测结果准确率能够达到100％。
在检测线性方面，不仅不同的引物探针体系其定量线性差异较大，用于阳性定量参考品的假病毒也会导致线性波动。例如，同样采用SEQ ID NO：1-7的检测体系，当假病毒颗粒中包含的HBV RNA目标片段的序列为：
TAATGATCTTTGTACTGGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAACACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGTGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTATATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTAAGGCAAGCTATCCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTAAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTACCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAG(SEQ ID NO.12)
采用实施例5的方法测得的线性特征如下：
Figure BDA0003725666710000151
Figure BDA0003725666710000161
总体而言，本发明试剂盒不仅具有极佳的灵敏度，而且定量检测线性良好，能够保证检测结果的可靠性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的引物对组，其特征在于，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.2所示的反向引物；
优选地，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述引物对组还包括SEQ ID NO.4所示的逆转录引物。
2.一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的探针组，其特征在于，所述探针组包括：如SEQ ID NO.3所示的针对乙型肝炎病毒的特异性的探针和如SEQ ID NO.7所示的内标探针。
3.一种用于乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对组和权利要求2所述的探针组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液包括权利要求1所述的引物对组和权利要求2所述的探针组。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含Taq酶、C-MMLV酶、UDG酶和dNTPs。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含内标溶液，所述内标溶液包括含内标片段的假病毒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含DNA酶I；
并且，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含DNA酶I缓冲液；所述DNA酶I缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化镁、和氯化钙。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内包含阴性质控品。
9.一种定量检测乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，提取待检样本中的核酸；
(2)使用DNA酶I进行样本核酸DNA消化；
(3)制备扩增反应体系，进行扩增反应，定量检测样本中的HBV RNA；
其中，所述扩增反应体系包括经步骤(2)处理的待检测样本、权利要求1所述的引物对组、和权利要求2所述的探针组。
10.权利要求1所述的引物对组、和权利要求2所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于定量检测乙型肝炎病毒RNA。
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