CN116179583A - 一种基于昆虫病毒fhv rna1复制子的质粒系统及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，该应用通过昆虫病毒FHV RNA1复制子的自主复制能力在mRNA水平上进行外源基因的扩增；本发明公开了上述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统和该质粒系统的构建方法；本发明还公开了该质粒系统在细胞中表达蛋白的方法和应用，该质粒系统在双酶切后获得克隆载体，与外源基因进行同源重组后，在细胞中表达动物或植物蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统及其构建和应用。
背景技术
外源基因的功能和其调控机理，需要通过在宿主细胞中表达才能够进行进一步的研究。表达外源基因的的宿主细胞称为表达系统，分为原核系统和真核系统，其中真核系统包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类动物细胞和植物细胞等。要使外源基因在宿主细胞中表达，需要将其插入带有基因表达所需的各种元件的表达载体中。对于不同的表达系统，则需要构建不同的表达载体。真核表达系统能够识别并且切除外源基因的内含子，同时真核表达系统对翻译水平的调节较好，且外源基因能够被糖基化，有利于保持免疫原性。
然而，真核表达系统中存在着外源基因导入真核细胞的效率较低的问题，真核表达载体无法持续复制以达到高拷贝数；且目前的真核表达载体存在界障，不同的真核细胞中并不能通用；另外，某些真核表达载体虽然能高效表达外源基因，但同时会对宿主细胞造成生理干扰或引起宿主死亡。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其能解决外源mRNA扩增能力弱的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，其能解决载体低转录活性的问题。
本发明的第三个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其能解决具有高复制能力的真核表达载体构建的问题。
本发明的第四个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，其能解决真核表达载体无法持续复制，存在物种界障和干扰宿主细胞的问题。
本发明的第五个目的在于提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的应用，其能解决真核表达载体在真核细胞中无法穿梭表达的问题。
本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：
一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，所述复制子的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
进一步地，将外源基因插入所述昆虫病毒FHV RNA1复制子的3’端与B2编码序列之间的开放阅读框内以进行外源基因的扩增，所述B2编码序列包括如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，所述质粒系统应用昆虫病毒FHVRNA1复制子；所述质粒系统以pUC载体为骨架载体；所述质粒系统的核苷酸序列依次包括载体启动子、昆虫病毒FHV RNA1复制子、Linker序列、P2A序列、B2编码序列、HDV核酶序列、载体终止子。
进一步地，所述P2A序列与B2编码序列间包括酶切位点；所述酶切位点依次为PstI、EcoRI、XhoI、XbaI和HindIII；所述载体启动子为CMV启动子或T7启动子中的一种。
本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用引物和模版扩增多个所述质粒系统的核苷酸序列片段；步骤2、连接所述多个质粒系统的核苷酸序列片段，获得连接产物；步骤3、将所述连接产物转至大肠杆菌感受态细胞培养；步骤4、培养步骤3所述大肠杆菌感受态细胞，筛选后提取重组质粒，完成一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建。
进一步地，步骤1中，所述质粒系统的核苷酸序列片段扩增时以绿色荧光蛋白表达盒为模版，扩增得到片段A；以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版，分别扩增得到片段B和片段C；以CMV启动子为模版，扩增得到片段D；所述pUC-T7-FHVRNA1质粒的核苷酸序列如SEQNO.3所示；所述绿色荧光蛋白表达盒核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述CMV启动子核苷酸序列如SEQ NO.5所示。
进一步地，所述步骤1中，采用上游引物[pUC/PstI]-hibit-fwd和下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev扩增绿色荧光蛋白表达盒，得到片段A，上游引物[pUC/PstI]-hibit-fwd核苷酸序列如SEQ NO.6所示，下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev核苷酸序列如SEQ NO.7所示；采用上游引物FHV RNA1/1st-fwd和下游引物[P2A/PstI]-rev以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段B，上游引物FHV RNA1/1st-fwd核苷酸序列如SEQNO.8所示，下游引物[P2A/PstI]-rev核苷酸序列如SEQ NO.9所示；采用上游引物[XhoI/B2]-fwd和下游引物pUC/last base-rev以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段C，上游引物[XhoI/B2]-fwd核苷酸序列如SEQ NO.10所示，下游引物pUC/last base-rev核苷酸序列如SEQ NO.11所示；采用上游引物pUC/CMV-fwd和下游引物CMV/FHV RNA1-ev扩增CMV启动子，得到片段D，上游引物pUC/CMV-fwd核苷酸序列如SEQ NO.12所示，下游引物CMV/FHV RNA1-rev核苷酸序列如SEQ NO.13所示。
本发明的第四个目的采用以下技术方案实现：
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，包括以下步骤：对所述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统进行双酶切，获得克隆载体；所述克隆载体与外源基因进行同源重组，获得同源重组产物；所述同源重组产物转染到宿主细胞中培养后，收取细胞样品并检测，完成蛋白的表达。
进一步地，所述双酶切的位点为PstI和XhoI。
本发明的第五个目的采用以下技术方案实现：
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在蛋白表达中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明的一种用于基因表达的质粒系统，具有良好的自主复制能力和高复制效率，且不会对宿主细胞造成任何生理干扰。另外，本发明构建的用于基因表达的质粒系统，能够跨越多个界障，其基因组可以在昆虫，哺乳动物，植物，甚至酵母细胞中复制，覆盖多种真核表达系统。
2.本发明的一种用于基因表达的质粒系统的构建，方法简便。本发明的一种用于基因表达的质粒系统的应用，将外源基因在宿主细胞表达时，具有很高的转录活性，并且没有显示出任何细胞病变效应，也不是人类病原体，生物安全度高。
附图说明
图1为本发明构建的基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒图谱
图2为本发明质粒系统在不同温度下表达外源蛋白msfGFP的结果图图3为本发明质粒系统表达外源蛋白msfGFP的时程结果图以及实时荧光定量PCR结果图
图4为本发明质粒系统表达外源蛋白msfGFP的免疫荧光结果图图5-9为本发明质粒系统与pXJ40载体表达相同外源基因的蛋白结果对比图
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
外源基因的功能和其调控机理，需要通过在宿主细胞中表达才能够进行进一步的研究。要使外源基因在宿主细胞中表达，需要将其插入带有基因表达所需的各种元件的表达载体中。真核表达系统能够识别并且切除外源基因的内含子，不需要想原核表达系统一样制备cDNA，同时真核表达系统对翻译水平的调节较好，且外源基因能够被糖基化，有利于保持免疫原性。
然而，真核表达系统中存在着外源基因导入真核细胞的效率较低的问题，真核表达载体无法持续复制以达到高拷贝数；且目前的真核表达载体存在界障，不同的真核细胞中并不能通用；另外，某些真核表达载体虽然能高效表达外源基因，但同时会对宿主细胞造成生理干扰或引起宿主死亡。因此提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的外源基因扩增方法，其能解决外源mRNA扩增能力弱的问题。
一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，所述复制子的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
进一步地，将外源基因插入所述昆虫病毒FHV RNA1复制子的3’端与B2编码序列之间的开放阅读框内以进行外源基因的扩增，所述B2编码序列包括如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
昆虫病毒FHV属于野田村病毒科和甲型结核病毒属，其结构为一个衣壳包装成一个无包膜的二十面体病毒粒子。FHV的基因组有两个单股正链RNA组成。基因组RNA1能够编码RNA聚合酶(RdRp)，使其具有自主复制能力。而基因组RNA2则主要负责编码病毒衣壳蛋白前体。在FHV的复制过程中，能合成编码B1和B2蛋白质的亚基因组RNA3。其中，B2蛋白是负责抑制RNA沉默，能够有效的控制基因组的复制。昆虫病毒FHV的基因组较小，因此作为载体，能够容纳基因组更大的外源基因。
另一方面，昆虫病毒FHV具有独一无二的穿梭能力，即能够在除昆虫外的脊椎动物、植物、甚至酵母细胞中进行基因组的复制。同时，FHV也具有非致病性，在哺乳动物细胞中没有显示出任何细胞病变效应，具有良好的生物安全性。因此本发明提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统。
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，所述质粒系统应用昆虫病毒FHVRNA1复制子；所述质粒系统以pUC载体为骨架载体；所述质粒系统的核苷酸序列依次包括载体启动子、昆虫病毒FHV RNA1复制子、Linker序列、P2A序列、B2编码序列、HDV核酶序列、载体终止子。
进一步地，所述P2A序列与B2编码序列间包括酶切位点；所述酶切位点依次为PstI、EcoRI、XhoI、XbaI和HindIII；所述载体启动子为CMV启动子或T7启动子中的一种。
所述多个单个酶切位点的存在，使得载体系统能够容纳基因组长度不同的外源基因，表达的外源蛋白种类更多样。
本发明提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建方法，其能解决具有高复制能力的真核表达载体构建的问题。
一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用引物和模版扩增多个所述质粒系统的核苷酸序列片段；
步骤2、连接所述多个质粒系统的核苷酸序列片段，获得连接产物；
步骤3、将所述连接产物转至大肠杆菌感受态细胞培养；
步骤4、培养步骤3所述大肠杆菌感受态细胞，筛选后提取重组质粒，完成一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建。
进一步地，步骤1中，所述质粒系统的核苷酸序列片段扩增时以绿色荧光蛋白表达盒为模版，扩增得到片段A；以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版，分别扩增得到片段B和片段C；以CMV启动子为模版，扩增得到片段D；所述pUC-T7-FHVRNA1质粒的核苷酸序列如SEQNO.3所示；所述绿色荧光蛋白表达盒核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述CMV启动子核苷酸序列如SEQ NO.5所示。
进一步地，所述步骤1中，采用上游引物[pUC/PstI]-hibit-fwd和下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev扩增报告基因表达盒，得到片段A，上游引物[pUC/PstI]-hibit-fwd序列如SEQ NO.6所示，下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev如SEQ NO.7所示；采用上游引物FHV RNA1/1st-fwd和下游引物[P2A/PstI]-rev扩增pUC-T7-FHVRNA1质粒，得到片段B，上游引物FHV RNA1/1st-fwd序列如SEQ NO.8所示，下游引物[P2A/PstI]-rev序列如SEQ NO.9所示；采用上游引物[XhoI/B2]-fwd和下游引物pUC/last base-rev扩增pUC-T7-FHVRNA1质粒，得到片段C，上游引物[XhoI/B2]-fwd序列如SEQ NO.10所示，下游引物pUC/last base-rev序列如SEQ NO.11所示；采用上游引物pUC/CMV-fwd和下游引物CMV/FHV RNA1-ev扩增CMV启动子，得到片段D，上游引物pUC/CMV-fwd序列如SEQ NO.12所示，下游引物CMV/FHVRNA1-rev如SEQ NO.13所示。
本发明同时提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，包括以下步骤：对所述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统进行双酶切，获得克隆载体；所述克隆载体与外源基因进行同源重组，获得同源重组产物；所述同源重组产物转染到宿主细胞中培养后，收取细胞样品并检测，完成蛋白的表达。
进一步地，所述双酶切的位点为PstI和XhoI。
本发明同时提供一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在蛋白表达中的应用，其能解决真核表达载体在真核细胞中无法穿梭表达的问题。
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：实施例1质粒系统的构建
1.FHV RNA1质粒系统构建
步骤1、根据模版扩增目的片段，目的片段包括片段A、片段B、片段C和片段D。目的片段和对应的引物如表1所示：
表1质粒系统同源重组引物和模版表
步骤2、对扩增出的目的片段A、B、C、D用DpnI酶切消化原质粒，避免后续构建重组质粒时造成的模板干扰。通过同源重组将目的片段A、B、C、D进行同源重组连接，得到连接产物。反应体系和反应条件见表2，其中目的片段的体积根据pUC-T7-FHVRNA1质粒的量确定，pUC-T7-FHVRNA1质粒：目的片段摩尔比为3：1。
表2同源重组的反应体系和条件
步骤3、通过热击的转化方法，将连接产物转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取适量的转化产物于含有100μg/ml氨苄西林LB固体培养基中进行涂布培养，培养12h至16h后随机挑选若干个形态大小均一的单菌落通过PCR的方法验证克隆是否成功。所述菌落PCR使用两对引物，引物的名称和序列如表3：
表3菌落PCR的引物信息
扩增后，从中挑选对应单克隆菌落进行质粒的提取，提取后的质粒通过BglII和XbaI双酶切得到2444bp和5042bp大小的的两个片段为目标质粒，进行测序验证得到的阳性质粒即为重组质粒pUC-CMV-FHVRNA1-HIBIT-msfGFP，其质粒图谱如图1所示，完成一种用于外源基因表达的质粒系统的构建。
2.质粒系统的最适作用温度的筛选
通过转染实验和蛋白免疫印迹实验筛选FHV RNA1质粒系统在BHK细胞的最适作用温度。所述转染实验的试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司的
TransfectionReagent。
将实施例1构建的组质粒pUC-CMV-FHVRNA1-HIBIT-msfGFP与转染试剂混合，静置15分钟。随后将质粒混合物逐滴加入到前一天在12孔板铺好的仓鼠肾细胞BHK-21细胞系中。将细胞系分别于28℃、30℃、32℃和37℃条件下培养48h。观察对应温度培养后的绿色荧光后，收取对应的蛋白样品进行Western Blot湿转检测。Western Blot湿转检测具体步骤如下：
1.弃去12孔板中的培养基，用PBS清洗一遍，每个孔加入200μL的2×LD和20μL的DTT；
2.将细胞刮下来放在1.5ml离心管中，将蛋白样品放在95℃的干浴锅变性15min,变性之前样品为粘稠液体，变性后样品为灵动的流动状态；在期间可以适当涡旋蛋白样品，检查裂解程度；
3.变性后的蛋白轻微离心后进行凝胶电泳，电泳条件为60V，30min。当条带跑到浓缩胶与分离胶的分界线，电泳条件改为换80V，1.5h；跑胶结束后进行蛋白转膜，转模条件为80V，2h；可以根据蛋白条带的大小适当延长时间。
4.转膜结束后将NC膜取出放置洁净容器，加入PBST清洗；清洗后在摇床上室温封闭2h；回收封闭液，再次加入PBST清洗；清洗后倒入一抗至覆盖NC膜即可，4℃过夜孵育。
5.回收一抗，用PBST清洗5次，每次5min。加入二抗，避光室温孵育1h；由于使用二抗为荧光二抗，需要在避光条件下进行回收；回收后的二抗用PBST清洗5遍。
使用扫描仪查看蛋白条带，结果如图2。可以看到30℃时，绿色荧光信号最强，蛋白质的表达量最多。
实施例2质粒系统的时程检测
通过转染实验和蛋白免疫印迹实验验证30℃下实施例1构建的组质粒pUC-CMV-FHVRNA1-HIBIT-msfGFP在五个时间点的蛋白表达程度。所述转染实验和蛋白免疫印迹实验同实施例1的实验方法。在培养时间分别达到24h、48h、72h、96h、120h五个时间点时观察绿色荧光数量，并将对应的细胞进行蛋白收样和Western Blot检测。
另外，分别对五个时间点的细胞进行进行RNA的抽提和特异反转录得到负股cDNA，使用的是天根生化科技(北京)有限公司的反转录试剂盒。将负股cDNA样品用DEPC水进行稀释，每1μg RNA反转录形成的cDNA稀释20倍，随后进行实时荧光定量PCR检测，验证本发明的质粒系统的复制情况。实时荧光定量PCR检测的每一孔的反应体系为cDNA稀释液4.6μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL和2×ChamQ Unversal SYBR Qpcr Master Mix 5μL。实时荧光定量PCR检测的反应条件见表4、实时荧光定量PCR检测引物序列见表5。
表4实时荧光定量PCR检测的反应条件
表5实时荧光定量PCR检测引物序列表
实施例2的结果如图3所示。从图中可以看出，在24h至96h时间段内，随时间的延长，GFP的表达量越多，在96h达到顶峰。120h后GFP数量随细胞的死亡而减少。从qPCR结果来看，在24h至96h时间段内，随时间的延长，负股RNA在不断增多，在96h达到顶峰。结合上述结果可知，随着质粒系统的不断复制，外源蛋白也不断的进行翻译表达。
实施例3质粒系统的自主复制能力验证
将实施例1构建的重组质粒转染进48孔板培养的BHK细胞中，所述转染方法同实施例1。在30℃分别培养48h、72h、96h三个时间，对三个时间点的细胞进行免疫荧光实验，具体步骤如下：
1.弃去孔板中的培养基，每个孔板加200μL PBS进行清洗。
2.每孔加入300μL的100％冰甲醇来进行细胞固定，-20℃，静置15min。固定后弃去孔板中的固定液，每孔加300μL PBS后，在室温下将孔板放置摇床清洗5min，重复3次。
3.每孔加入300μL 5％小牛血清(加入曲拉通增强细胞通透性)，室温封闭1h；封闭后弃掉封闭液，每孔加300μL PBS后，在室温下将孔板放置摇床清洗5min，重复3次。
4.用1％小牛血清按稀释一抗(鼠源的双链RNA抗体)，稀释倍数为500；每孔加入80μL稀释后的一抗，4℃下过夜孵育。孵育后回收一抗，每孔加300μL PBS后，在室温下将孔板放置摇床清洗5min，重复3次。
5.用PBS按稀释二抗(鼠抗)，稀释倍数为500；每孔加入80μL稀释后的二抗，室温避光孵育1h；孵育后弃掉二抗，每孔加300μL PBS后，在室温下将孔板放置摇床清洗5min，重复3次。
6.用PBS稀释DAPI(染核试剂)，稀释倍数为1000；每孔加入100μL稀释后的DAPI，37℃避光染色10min。染色后弃掉DAPI，每孔加300μL PBS后，在室温下将孔板放置摇床清洗5min，，重复3次。
7.用荧光显微镜观察细胞。
实施例3的结果如图4所示，可以看到，绿色荧光蛋白只出现在产生双链RNA的细胞中，因此，外源基因的复制表达和本申请的质粒系统存在必然关系。
实施例4质粒系统与动植物蛋白外源基因的整合
本发明的质粒系统在细胞中表达外源基因包括以下步骤：
1.将实施例1同源重组构建的重组质粒
pUC-CMV-FHVRNA1-HIBIT-msfGFP进行双酶切后获得克隆载体pUC-CMV-FHVRNA1，双酶切的位点为PstI和XhoI；
2.四种植物病毒G蛋白、九种甘蔗黑粉菌蛋白以及六种动物病毒蛋白的cDNA为模板，分别设计带有同源臂的引物进行PCR扩增，获得不同的动植物蛋白片段；所述外源基因PCR的引物序列见表6；外源基因PCR反应体系为上游引物1μL、下游引物1μL、质粒DNA模版10～20ng、2×EasyPfu PCR SuperMix 25μL，用去离子水补足体系至50μL；外源基因PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(退火温度根据上下游引物的Tm值确定)，72℃延伸(0.5kb/min)，72℃终延伸5min，总共进行35个循环。
3.将外源基因PCR产物用DpnI酶进行酶切，避免后续构建重组质粒时造成的模板干扰；将克隆载体pUC-CMV-FHVRNA1与外源基因PCR产物进行同源重组连接，同源重组方法与实施例1相同。
4.外源基因和克隆载体同源重组的产物同样转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取适量的转化产物于含有100μg/ml氨苄西林LB固体培养基中进行涂布培养，培养12h至16h后分别在每个培养基上挑选几个单克隆进行质粒的提取，同时进行NheI和XbaI双酶切验证外源基因是否成功构建到，最后挑选上述质粒中的阳性克隆送公司测序。
表6外源基因的引物序列
实施例5质粒系统表达外源基因的效率分析
将实施例4中成功整合的含动植物蛋白的质粒转染至BHK-21细胞系中，转染方法同实施例1。用pXJ40载体表达相同蛋白的质粒作为对比，在28℃、30℃和37℃三个温度进行培养，48h后收蛋白样，进行Western Blot检测，方法同实施例1，结果如图5-9所示。可以看到，本发明的质粒系统构建的克隆载体，与用pXJ40载体表达的蛋白相比，具有更显著的WB检测结果，说明本发明的质粒系统更强的表达效率。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其特征在于，所述复制子的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述一种昆虫病毒FHV RNA1复制子在外源基因扩增中的应用，其特征在于，将外源基因插入所述昆虫病毒FHV RNA1复制子的3’端与B2编码序列之间的开放阅读框内以进行外源基因的扩增，所述B2编码序列包括如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，应用权利要求1或2所述的昆虫病毒FHV RNA1复制子，其特征在于，所述质粒系统以pUC载体为骨架载体；所述质粒系统的核苷酸序列依次包括载体启动子、昆虫病毒FHV RNA1复制子、Linker序列、P2A序列、B2编码序列、HDV核酶序列、载体终止子。
4.根据权利要求3所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统，其特征在于，所述P2A序列与B2编码序列间包括酶切位点；所述酶切位点依次为PstI、EcoRI、XhoI、XbaI和HindIII；所述载体启动子为CMV启动子或T7启动子中的一种。
5.权利要求3-4任一项所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用引物和模版扩增多个所述质粒系统的核苷酸序列片段；
步骤2、连接所述多个质粒系统的核苷酸序列片段，获得连接产物；
步骤3、将所述连接产物转至大肠杆菌感受态细胞培养；
步骤4、培养步骤3所述大肠杆菌感受态细胞，筛选后提取重组质粒，完成一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统的构建。
6.根据权利要求5所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，步骤1中，所述质粒系统的核苷酸序列片段扩增时以绿色荧光蛋白表达盒为模版，扩增得到片段A；以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版，分别扩增得到片段B和片段C；以CMV启动子为模版，扩增得到片段D；所述pUC-T7-FHVRNA1质粒的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；所述绿色荧光蛋白表达盒核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述CMV启动子核苷酸序列如SEQNO.5所示。
7.根据权利要求6所述一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统构建方法，其特征在于，所述步骤1中，采用上游引物
[pUC/PstI]-hibit-fwd和下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev扩增绿色荧光蛋白表达盒，得到片段A，上游引物[pUC/PstI]-hibit-fwd核苷酸序列如SEQ NO.6所示，下游引物msfGFP-[pUC/XhoI]-rev核苷酸序列如SEQ NO.7所示；采用上游引物FHV RNA1/1st-fwd和下游引物[P2A/PstI]-rev以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段B，上游引物FHV RNA1/1st-fwd核苷酸序列如SEQ NO..8所示，下游引物[P2A/PstI]-rev核苷酸序列如SEQ NO.9所示；采用上游引物[XhoI/B2]-fwd和下游引物pUC/last base-rev以pUC-T7-FHVRNA1质粒为模版进行扩增，得到片段C，上游引物[XhoI/B2]-fwd核苷酸序列如SEQNO.10所示，下游引物pUC/last base-rev核苷酸序列如SEQNO.11所示；采用上游引物pUC/CMV-fwd和下游引物CMV/FHV RNA1-ev扩增CMV启动子，得到片段D，上游引物pUC/CMV-fwd核苷酸序列如SEQ NO.12所示，下游引物CMV/FHV RNA1-rev核苷酸序列如SEQ NO.13所示。
8.权利要求4所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：对所述基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统进行双酶切，获得克隆载体；所述克隆载体与外源基因进行同源重组，获得同源重组产物；所述同源重组产物转染到宿主细胞中培养后，收取细胞样品并检测，完成蛋白的表达。
9.根据权利要求8所述一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在细胞中表达蛋白的方法，其特征在于所述双酶切位点为PstI和XhoI。
10.权利要求3-4任一项所述的一种基于昆虫病毒FHV RNA1复制子的质粒系统在蛋白表达中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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