CN116179473A - 一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法 - Google Patents

一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法，属于培养基制备技术领域。本发明完全培养基的原料包括：M199培养基粉末、EGF、IGF‑1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、维生素A、维生素E、胆固醇、青链霉素和新生牛血清。本发明的完全培养基能够使Vero细胞在培养基中生长良好，本发明通过所有原料相互配合、协同作用，通过合理确定各成分的浓度，能够高效地扩增Vero细胞，使得细胞汇合度更优、收获的活细胞总数更多，显著提高了细胞的扩增效率。

Description

一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于培养基制备技术领域，特别是涉及一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法。
背景技术
目前，大量生产人用狂犬病疫苗所利用的细胞基质包括原代细胞(如地鼠肾原代细胞PHKCV和鸡胚原代成纤维细胞PCECV等)，连续传代细胞(如非洲绿猴肾细胞Nero和人二倍体细胞等)。Vero细胞是世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系，与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比较，Vero细胞具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。
作为贴壁成纤维细胞，Vero细胞对血清有依赖性，因为血清能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分，利用牛血清作为Vero细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分，具有诸多不利因素：血清组分的复杂性和不确定性，导致血清生产批次间的质量差异，增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量；血清中存在病毒(如航病毒)等病原微生物，存在污染的潜在风险，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患；血清对病毒有一定的抑刷作用，特别是需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒(如轮状病毒等)，有血清培养基中的血清中利用了胰酶，使病毒不能充分激活，从而降低了所收获病毒的滴度。因此，无血清培养或者完全培养基的使用已成为生物技术药物领域的总趋势。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种培养Vero细胞的完全培养基及其制备方法，本发明的完全培养基能够使Vero细胞在培养基中生长良好，能够高效地扩增Vero细胞，使得细胞汇合度更优、收获的活细胞总数更多，显著提高了细胞的扩增效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明目的之一是提供一种培养Vero细胞的完全培养基，原料包括：M199培养基粉末、EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、维生素A、维生素E、胆固醇、青链霉素和新生牛血清。
进一步地，所述原料的用量为：M199培养基粉末为9.6g/L、EGF浓度为1-5ng/mL、IGF-1浓度为0.5-1.5μg/mL、氢化可的松浓度为0.5-1.5μg/mL、丙酮酸钠浓度为1-100mg/L、转铁蛋白浓度为1-10mg/L、纤维连接蛋白1-100μg/L、乙醇胺浓度为1-10mg/L、高密度脂蛋白浓度为10-20μg/L、牛血清白蛋白浓度为100-1000mg/L、巨球蛋白浓度为1-100μg/L、碱性磷酸酯酶浓度为10-100U/L、乳酸脱氢酶浓度为10-100U/L、葡萄糖浓度为100-1000mg/L、维生素A浓度为10-100μg/L、维生素E浓度为10-100μg/L、胆固醇10-100μg/L、青链霉素浓度为100-300IU/mL、新生牛血清浓度为2wt％。
本发明目的之二是提供一种所述的培养Vero细胞的完全培养基的制备方法，包括如下步骤：将维生素A、维生素E和胆固醇用无水乙醇单独溶解，将EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、青链霉素逐个用注射用水单独溶解，将M199培养基粉末用注射用水搅拌溶解；然后将所有原料混合，调节pH值并过滤除菌，得到所述培养Vero细胞的完全培养基。
进一步地，所述pH值通过加入碳酸氢钠进行调节。
进一步地，所述pH值为7.2-7.4。
进一步地，所述过滤除菌采用0.22μm的滤膜进行。
进一步地，所述培养Vero细胞的完全培养基在4℃下保存备用。
本发明的有益效果：
本发明的完全培养基能够使Vero细胞在培养基中生长良好，本发明通过所有原料相互配合、协同作用，通过合理确定各成分的浓度，能够高效地扩增Vero细胞，使得细胞汇合度更优、收获的活细胞总数更多，显著提高了细胞的扩增效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为在不同培养基中Vero细胞传代图，A为M199+10％FBS培养第6代，B为M199+10％FBS培养第12代，C为实施例1完全培养基培养第6代，D为实施例1完全培养基培养第12代；
图2为在M199+10％FBS培养基和实施例1的完全培养基中，Vero细胞的生长曲线。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1000mL完全培养基的配制：
原料的用量为：M199培养基粉末为9.6g/L、EGF浓度为3ng/mL、IGF-1浓度为1μg/mL、氢化可的松浓度为1μg/mL、丙酮酸钠浓度为50mg/L、转铁蛋白浓度为5mg/L、纤维连接蛋白50μg/L、乙醇胺浓度为5mg/L、高密度脂蛋白浓度为15μg/L、牛血清白蛋白浓度为500mg/L、巨球蛋白浓度为50μg/L、碱性磷酸酯酶浓度为50U/L、乳酸脱氢酶浓度为50U/L、葡萄糖浓度为500mg/L、维生素A浓度为50μg/L、维生素E浓度为50μg/L、胆固醇50μg/L、青链霉素浓度为200IU/mL、新生牛血清浓度为2wt％。
制备过程为：将维生素A、维生素E和胆固醇用无水乙醇(50μL)分别溶解，将EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、青链霉素逐个用水单独溶解，将M199培养基粉末用水搅拌溶解；然后将所有原料混合，加入碳酸氢钠调节pH值至7.3，采用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到培养Vero细胞的完全培养基，在4℃下保存备用。
实施例2
1000mL完全培养基的配制：
原料的用量为：M199培养基粉末为9.6g/L、EGF浓度为1ng/mL、IGF-1浓度为0.5μg/mL、氢化可的松浓度为0.5μg/mL、丙酮酸钠浓度为1mg/L、转铁蛋白浓度为1mg/L、纤维连接蛋白1μg/L、乙醇胺浓度为1mg/L、高密度脂蛋白浓度为10μg/L、牛血清白蛋白浓度为100mg/L、巨球蛋白浓度为1μg/L、碱性磷酸酯酶浓度为10U/L、乳酸脱氢酶浓度为10U/L、葡萄糖浓度为100mg/L、维生素A浓度为10μg/L、维生素E浓度为10μg/L、胆固醇10μg/L、青链霉素浓度为100IU/mL、新生牛血清浓度为2wt％。
制备过程为：将维生素A、维生素E和胆固醇用无水乙醇(10μL)分别溶解，将EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、青链霉素逐个用水单独溶解，将M199培养基粉末用水搅拌溶解；然后将所有原料混合，加入碳酸氢钠调节pH值至7.2，采用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到培养Vero细胞的完全培养基，在4℃下保存备用。
实施例3
1000mL完全培养基的配制：
原料的用量为：M199培养基粉末为9.6g/L、EGF浓度为5ng/mL、IGF-1浓度为1.5μg/mL、氢化可的松浓度为1.5μg/mL、丙酮酸钠浓度为100mg/L、转铁蛋白浓度为10mg/L、纤维连接蛋白100μg/L、乙醇胺浓度为10mg/L、高密度脂蛋白浓度为20μg/L、牛血清白蛋白浓度为1000mg/L、巨球蛋白浓度为100μg/L、碱性磷酸酯酶浓度为100U/L、乳酸脱氢酶浓度为100U/L、葡萄糖浓度为1000mg/L、维生素A浓度为100μg/L、维生素E浓度为100μg/L、胆固醇100μg/L、青链霉素浓度为300IU/mL、新生牛血清浓度为2wt％。
制备过程为：将维生素A、维生素E和胆固醇用无水乙醇(100μL)分别溶解，将EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、青链霉素逐个用水单独溶解，将M199培养基粉末用水搅拌溶解；然后将所有原料混合，加入碳酸氢钠调节pH值至7.4，采用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到培养Vero细胞的完全培养基，在4℃下保存备用。
验证例1
Vero细胞的传代：
用配制的Vero细胞培养基混悬细胞并计数，按2x104/ml接种于细胞培养瓶中，置37℃、5％CO2饱和湿度CO2孵箱中培养。3天后传代，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化5-6min。计数按2x104/ml连续传代培养。进行对比试验M199+10％FBS和使用实施例1完全培养基的Vero细胞连续传12代。Vero细胞传代图见图1，A为M199+10％FBS培养第6代，B为M199+10％FBS培养第12代，C为实施例1完全培养基培养第6代，D为实施例1完全培养基培养第12代。实验结果：M199+10％FBS和完全培养基培养的Vero细胞的细胞形态正常，细胞透亮，细胞密度高，汇合度均在90％左右；培养6代，增殖倍数可达9.5倍，表明细胞生长情况良好。
验证例2
Vero细胞生长曲线：
取M199+10％FBS和实施例1完全培养基连续传3代的细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2x104/ml，接种于24孔细胞培养板中，24h后用胰酶消化孔板中的3个孔并计数，连续8天每天取3个孔，计平均数。以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线，结果如图2所示。在接种后1-2天细胞数量变化不大，第3天起，细胞大量增殖，至第6天细胞量达到高峰，细胞倍增时间都是20h。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种培养Vero细胞的完全培养基，其特征在于，原料包括：M199培养基粉末、EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、维生素A、维生素E、胆固醇、青链霉素和新生牛血清。
2.根据权利要求1所述的培养Vero细胞的完全培养基，其特征在于，所述原料的用量为：M199培养基粉末为9.6g/L、EGF浓度为1-5ng/mL、IGF-1浓度为0.5-1.5μg/mL、氢化可的松浓度为0.5-1.5μg/mL、丙酮酸钠浓度为1-100mg/L、转铁蛋白浓度为1-10mg/L、纤维连接蛋白1-100μg/L、乙醇胺浓度为1-10mg/L、高密度脂蛋白浓度为10-20μg/L、牛血清白蛋白浓度为100-1000mg/L、巨球蛋白浓度为1-100μg/L、碱性磷酸酯酶浓度为10-100U/L、乳酸脱氢酶浓度为10-100U/L、葡萄糖浓度为100-1000mg/L、维生素A浓度为10-100μg/L、维生素E浓度为10-100μg/L、胆固醇10-100μg/L、青链霉素浓度为100-300IU/mL、新生牛血清浓度为2wt％。
3.一种如权利要求1或2所述的培养Vero细胞的完全培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将维生素A、维生素E和胆固醇用无水乙醇单独溶解，将EGF、IGF-1、氢化可的松、丙酮酸钠、转铁蛋白、纤维连接蛋白、乙醇胺、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、巨球蛋白、碱性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、青链霉素逐个用水单独溶解，将M199培养基粉末用水搅拌溶解；然后将所有原料混合，调节pH值并过滤除菌，得到所述培养Vero细胞的完全培养基。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述pH值通过加入碳酸氢钠进行调节。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为7.2-7.4。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述过滤除菌采用0.22μm的滤膜进行。
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