CN116179417A

CN116179417A - 一株混淆魏斯氏菌及其在产神经调节剂中的应用

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Publication number: CN116179417A
Application number: CN202211524248.9A
Authority: CN
Inventors: 娄文勇; 刘圣雅; 李梦帆; 吴晓玲
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2042-12-01
Also published as: CN116179417B

Abstract

本发明公开了一株混淆魏斯氏菌及其在产神经调节剂中的应用。该菌株名称为混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)W1h，保藏号为CGMCC NO.25725，该菌株于2022年9月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明中的混淆魏斯氏菌W1h可以分泌神经调节剂，如色氨酸、多巴胺、短链脂肪酸等，可用于抗抑郁益生菌产品的开发和利用，且该菌株对胃肠环境具有较好的耐受能力，拥有较高的肠道粘附性和抗菌活性，可将其用于改善肠道微生物菌群结构、抑制致病菌的生长和繁殖。

Description

一株混淆魏斯氏菌及其在产神经调节剂中的应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，特别涉及一株混淆魏斯氏菌及其在产神经调节剂中的应用。

背景技术

抑郁症是一种精神情感障碍，主要表现为情绪低落、快感和兴趣丧失、疲劳感和精力不济等，常伴有躯体和认知变化。抑郁症不仅严重危害人们生活质量，还因为其高自杀率及致残率给家庭和社会带来巨大负担。2008年世界卫生组织将重度抑郁症(majordepressive disorder，MDD)列为全球疾病负担的第三大原因，预计2030年MDD将居全球疾病负担的首位。

目前，关于抑郁症病理机制的研究较多，主要包括单胺假说、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴变化、炎症因子、神经可塑性和神经发生、大脑结构和功能变化、基因、环境因素、表观遗传学等，但目前尚无任何单一模型或机制能够解释抑郁症发病的所有方面。

治疗抑郁症的方法包括有西药治疗、心理学治疗、睡眠治疗、光疗、中草药治疗、电休克治疗等，近些年来逐渐明确了以药物治疗为主的方法。目前临床上抗抑郁症的药物是通过提高中枢神经系统内神经递质的水平发挥效果，常用的治疗抑郁的药物有单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)、三环类(TCAs)、选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRIs)、5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂(SNRIs)等，但是这些药物均具有起效慢、用药时间长、症状缓解不彻底、副作用明显、治疗流程长、适用范围窄和复发率高等缺点，因此，寻求一种非药物、安全、健康、有效的抗抑郁的方法势在必行。

近年国内外的研究表明，肠道菌群在抑郁症的发生和发展中扮演重要角色，肠-脑通信功能紊乱可能是抑郁症的重要病理机制，“微生物-肠-脑”(MGB)轴是肠道菌群参与的肠道和大脑双向信息交流的途径。

单胺类神经递质的缺乏或功能降低被认为是抑郁症的生物学基础，肠道菌群对大脑功能的调控，则可以通过肠道菌群代谢产物来实现，国内外已有大量关于抗抑郁精神益生菌的研究，表明益生菌及其功能性代谢产物可改善抑郁行为，例如多巴胺、色氨酸以及短链脂肪酸。但到目前为止，暂无涉及关于具有缓解抑郁功能的混淆魏斯氏菌的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株混淆魏斯氏菌。

本发明的另一目的在于提供所述混淆魏斯氏菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株混淆魏斯氏菌，名称为混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)W1h，保藏号为CGMCC NO.25725，该菌株于2022年9月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center，CMGCC)。

一种培养所述混淆魏斯氏菌的方法，具体步骤为：将所述混淆魏斯氏菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。

所述的培养基为MRS培养基；包括MRS液体培养基和MRS固体培养基。

所述的培养基的pH值为3～6.2；优选为6.2。

所述的培养的时间为24～48h；优选为48h。

所述的混淆魏斯氏菌在制备抗抑郁产品中的应用。

所述的产品包括微生物制剂、保健食品或药品。

所述的混淆魏斯氏菌能够分泌神经调节剂，以达到治疗或缓解抑郁的目的。

所述的神经调节剂包括色氨酸、多巴胺和短链脂肪酸中的至少一种。

所述的短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种。

所述的混淆魏斯氏菌在生产神经调节剂中的应用。

所述的神经调节剂包括多巴胺、色氨酸和短链脂肪酸中的至少一种。

所述的短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种。

所述的混淆魏斯氏菌在制备改善肠道微生物菌群结构的产品中的应用。

所述的混淆魏斯氏菌具有较好的耐受能力，具有较高的肠道黏附性和抗菌活性，能够抑制致病菌的生长和繁殖，有利于维持肠道正常微生物菌群平衡。

所述的致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌和沙门氏菌中的至少一种。

所述的混淆魏斯氏菌的生物学特性为混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)在MRS液体培养基中培养72h，菌落的生长符合S型曲线，菌株在3h后开始进入对数生长期并大量产酸，随后快速生长至12～15h左右进入稳定期，pH值也趋于平缓，最后稳定在3.5左右。在MRS琼脂培养基上37℃培养48h后，菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落有凸起，边缘整齐；该菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为短杆状，且倾向于成链，无鞭毛、不运动。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明中的混淆魏斯氏菌是先从发酵泡菜和成人粪便筛选出来的195株益生菌，通过高效液相色谱法初步筛选出4株产神经调节剂的益生菌，然后经耐酸能力、耐胆盐能力、耐胃肠道环境能力、黏附肠道能力等测试进一步筛选得到的益生菌，该菌株具有产神经调节剂、耐胃肠道环境、高黏附性等益生特性，在抗抑郁益生菌产品的开发和利用具有广阔的应用前景，且本发明中的筛选方法能够为益生菌产品中益生菌的筛选提供一种新的理论基础和方法。

(2)本发明中的混淆魏斯氏菌在肠道黏附性和抗菌活性上比其他菌株有优势，在酸性环境下仍具增殖能力，为开发益生菌制剂提供坚实的基础，可用于开发抗抑郁的功能性产品，如微生物制剂、保健食品或药品等，长期服用可以改善肠道微生物菌群结构，提高神经递质和短链脂肪酸水平，预防和缓解抑郁症状。

(3)本发明中的混淆魏斯氏菌可以分泌神经调节剂如色氨酸、多巴胺、短链脂肪酸，并且对其余产神经调节剂的益生菌分泌神经调节剂的能力有促进作用，具有缓解抑郁的效果，无致病性和溶血性，可以安全使用，并且对胃肠环境具有较好的耐受能力，拥有较高的肠道粘附性和抗菌活性，有利于维持肠道正常微生物菌群平衡，因此，可将其用于改善肠道微生物菌群结构以及抑制致病菌的生长和繁殖方面。

附图说明

图1是195株菌的产神经调节剂对比结果图。

图2是9株益生菌的毒力因子的16srDNA电泳鉴定图(图中：0为阳性对照，1为N1g，2为W1-5)。

图3是4株益生菌的生长曲线图。

图4是4株益生菌的产酸能力对比结果图。

图5是4株益生菌的耐酸能力对比结果图。

图6是4株益生菌的耐胆盐能力对比结果图。

图7是4株益生菌的表面疏水性情况图。

图8是4株益生菌的自凝集性情况图。

图9是4株益生菌的交互凝集性情况图。

图10是4株益生菌的细胞粘附形态图。

图11是4株益生菌的细胞粘附性对比结果图。

图12是复合益生菌的产神经调节剂对比结果图。

图13是本发明益生菌(Weissella confusa)W1h的菌落形态图。

图14是本发明益生菌(Weissella confusa)W1h的16s rDNA电泳鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1：产神经调节剂益生菌的初步筛选

1.1所需材料

①益生菌固体培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温801mL，无水乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄7H₂O 0.2g，MnSO₄H₂O 0 05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 6.2，121℃，灭菌20min。

②益生菌液体培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温801mL，无水乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄7H₂O 0.2g，MnSO₄H₂O 0.05g，碳酸钙20g，蒸馏水1000mL，pH 6.2，121℃，灭菌20min。

③PBS溶液：0.8％(w/v)NaCl，0.02％(w/v)KH₂PO₄，0.115％(w/v)Na₂HPO₄，调节pH为7.2。

④泡菜汁：购自广东省广州市某市场。

⑤粪便：健康成人粪便。

1.2菌株的分离与纯化

1.2.1菌株的分离

①吸取泡菜汁1mL到1.5mL离心管中，再从离心管中吸取100μL，注入另一盛有900μLPBS溶液中，震荡混匀。同法类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8CFU/mL的各种稀释度的菌悬液。选取合适梯度，吸取100μL稀释液在MRS固体培养基上进行涂布，做三个重复，37℃恒温培养24～48h。

②取新鲜粪便0.3g到1.5mL离心管中，再从离心管中吸取100μL，注入另一盛有900μLPBS溶液中，震荡混匀。同法类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8CFU/mL的各种稀释度的菌悬液。选取合适梯度，吸取100μL稀释液在MRS固体培养基上进行涂布，做三个重复，37℃恒温培养24～48h。

1.2.2菌株的纯化

从各个平板中分别挑选不同大小、形状和颜色的10～15个单菌落，经过2次划线纯化，将得到的单一菌株转接至MRS液体培养基中，于37℃培养24～48h后，共获得195株菌，并根据来源的不同相应进行标号，分别取菌液与50％(v/v)甘油按体积比1：1比例混合，-80℃保藏。

1.3产神经调节剂益生菌的初步筛选

1.3.1标准曲线的制作

(1)1mM多巴胺标准液：准确称取0.5mmol盐酸多巴胺(DA)溶于MRS液体培养基中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，得到DA标准液，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。

(2)1mM色氨酸标准液：准确称取0.5mmol L-色氨酸(L-Trp)溶于MRS液体培养基中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，得到Trp标准液，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。

(3)取浓度为1mM的DA标准液0，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL分别加入10mL干净试管中，依次加入MRS液体培养基1mL，0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL，0.1mL，0mL，选择水(含0.1％(v/v)甲酸)：甲醇＝93:7(体积比)为流动相，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量20μL，高效液相色谱法测定280nm的UV下样品吸收峰，以多巴胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线。

(4)取浓度为1mM的Trp标准液0，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL分别加入10mL干净试管中，依次加入MRS液体培养基1mL，0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL，0.1mL，0mL，选择水(含0.1％(v/v)甲酸)：甲醇＝93:7(体积比)为流动相，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量20μL，高效液相色谱法测定280nm的UV下样品吸收峰，以多巴胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线。

1.3.2产神经调节剂益生菌的初步筛选

(1)将步骤1.2.2中甘油保藏菌种分别以2％(v/v)的接种量接种于新鲜的MRS液体培养基中，放置于37℃，180r/min中培养，将过夜培养的种子液200μL接种到800μL的MRS培养基中，37℃培养24h。

(2)分别取0.2mL培养24h的菌液，8000r/min离心1min，取上清液过膜，选择水(含0.1％(v/v)甲酸)：甲醇＝93:7(体积比)为流动相，高效液相色谱法(测定方法同1.3.1)测定280nm的UV下样品吸收峰，按照标准曲线计算样品分泌神经调节剂(多巴胺、色氨酸)的能力，筛选出能力最好的9株益生菌(A6,C6,H9,W1h,W2a,N3b,N2-9,W1-5,N1g)，结果见图1。

实施例2：产神经调节剂益生菌的进一步筛选

2.1菌株安全性

2.1.1毒力因子

将实施例1中筛选得到的9株优选菌株活化扩大培养后，选择11种常见的毒力因子(ace、cylA、cylB、cylM、cylL1、efaA、esp、gelE、AS、asal、hyl)，以试验菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物设计如表1所示。取5μL PCR产物点样于琼脂糖凝胶(1.0％)点样孔，电压160V，电泳20min，电泳结束后紫外灯下观察并拍照记录，结果见图2。其中N1g和W1-5菌株均含有毒力因子efaA和Gel-E，属于条件致病菌，故选取其余不含毒力因子的菌株进行下一步试验。

表1毒力基因检测所用引物信息

2.1.2溶血性

2％大鼠红细胞(南京森贝伽生物科技有限公司)，加入等体积菌液混合，以蒸馏水作阳性对照，生理盐水为阴性对照，37℃培养箱中孵育2h后，以10000rpm离心5min，取上清，于545nm处测定吸光值，并计算溶血率。其中，溶血率＝(A_t-A_nc)/(A_pc-A_nc)*100％；式中：A_t为试验吸光度，A_nc为阴性对照吸光度，A_pc为阳性对照吸光度；判断方式：若溶血率>5％，则为溶血试验阳性。

结果见表2：选取其中溶血性最低的4株菌株(A6、C6、H9、W1h)进行下一步试验。

表2益生菌的溶血性

菌株	溶血性％
		N2-9	4.96±0.9
A6	0.42±0.34
		C6	0.24±0.12
H9	0.74±0.42
		W1h	1.05±1.82
N3b	4.51±0.45
		W2a	4.51±1.56

2.2生长曲线和产酸曲线

(1)将4株优选菌株活化扩大培养后，分别以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养，每隔2h定时取样，测定培养液在600nm处的吸光值以及pH值，3次重复，然后绘制生长曲线和产酸曲线。

(2)益生菌的生长曲线如图3所示：4株益生菌的生长均符合S型曲线，因测定菌株生长的OD值，故未观察到衰亡期。各菌株在3h后开始进入对数生长期，随后快速生长至12～15h左右进入稳定期。不同的菌株生物量不同。

(3)对于益生菌的产酸能力如图4所示：所有菌株均在5h后大量产酸，酸值快速下降至4.0左右，随后产酸曲线趋于平缓，最后稳定在3.7左右。

2.3耐酸能力测试

(1)调节MRS液体培养基的pH来分析益生菌的耐酸能力。用0.1M的HCl溶液调节MRS液体培养基的pH分别为3.0、4.0、5.0，以自然pH的MRS液体培养基(pH 6.2)作为对照组，每个试验3次重复。

(2)将这4株优选菌株的菌悬液按2％(v/v)接种量分别接种于不同pH的MRS培养液中，置于37℃环境下培养，分别于0、2、4、6、8h后取样，以未接种菌株的MRS液体培养基为参比，测定不同培养基中OD₆₀₀值，做3个平行样品并取其平均值，计算菌株的耐酸性。其中：菌株的耐酸性存活率＝(实验组的OD₆₀₀ _nm/自然pH对照组的OD₆₀₀ _nm值)×100％。

(3)在不同pH条件下益生菌的存活率如图5和表3所示，其中，表3为在不同pH条件下处理2h后益生菌的存活率。4株益生菌的耐酸性存活率随着pH值的降低而不断降低，各菌株的耐酸性存在一定的差异，在pH值为3.0时，4株菌株均能生长。

表3益生菌的耐酸性

2.4耐胆盐能力测试

(1)通过分析益生菌在含胆盐的培养基中的生长情况来判断其对胆盐的耐受能力。在MRS-THIO液体培养基(在MRS液体培养基中加入0.2％(w/v)巯基乙酸钠)中加入0.02％，0.04％，0.06％，0.08％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％(w/v)的猪胆盐，调节pH为7.2，以不含胆盐的MRS液体培养基作对照。

(2)将益生菌菌悬液按2％(v/v)的接种量分别加入到含不同胆盐浓度的MRS液体培养基中，每个试验3次重复，37℃培养24h后摇匀，测定不同菌株在不同浓度胆盐里生长的浑浊度(吸光度OD₆₀₀)来分析其耐受水平。其中：胆盐耐受力(％)＝(含胆盐培养基的OD值/不含胆盐培养基的OD值)×100％。

(3)在不同浓度胆盐条件下益生菌的存活率如图6所示：4株益生菌对胆盐的耐受能力相差不大，在胆盐浓度为0～0.1％范围内，随着胆盐浓度的增高，益生菌的耐胆盐能力迅速降低，当胆盐浓度升至0.1～0.2％时，益生菌耐胆盐能力几乎为0。其中，在胆盐浓度为0～0.1％范围内时，C6的耐胆盐能力相对较好。

2.5肠道粘附性

将甘油保藏益生菌以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中37℃，180r/min条件下培养24h，将细菌培养物以8000r/min，4℃，离心10min，收集菌体，用PBS溶液洗涤两次，再8000r/min离心10min，弃去上清液，再用PBS溶液重悬菌体沉淀以获得菌悬液。将菌体以PBS溶液为空白对照，用PBS溶液调整菌液浓度，使其在分光光度计600nm波长下OD值为0.5±0.02，用于后续测定益生菌的细胞表面疏水性、自凝集性和交互凝集性。

2.5.1表面疏水性

通过试验菌株对碳氢化合物的亲和力反映菌株表面疏水性，即采用微生物粘着碳氢化合物法(Bacteria Adhesion To Hydrocarbons，BATH)测定益生菌细胞表面疏水性，具体步骤如下：取2mL调整浓度后的菌液分别加入2mL二甲苯、2ml三氯甲烷，对照组不加溶剂，该两相体系通过涡旋彻底混合2min，室温条件下孵育1h来分离水和有机相。小心吸取水相，以PBS溶液为空白对照，测量OD₆₀₀，每组平行3管，记录。其中，菌株表面疏水率(％)＝(对照组OD₆₀₀-实验组OD₆₀₀)/对照组OD₆₀₀×100％。

结果如图7所示：4株益生菌的表面疏水性能不同，对三氯甲烷的吸附能力明显高于二甲苯，其中C6对三氯甲烷的表面疏水性能最好，为25.85±0.64％；A6次之，为18.2±0.6％；H9和W1h最低。

2.5.2自凝集性

取2mL调整浓度后的菌液涡旋震荡10s，于37℃下分别静置1、2、3h。小心吸取1mL静置后的上清液，以PBS溶液为空白对照，测量OD₆₀₀，每组平行3管，记录。其中，自凝集率(％)＝1-(ODt/OD0)×100％；式中，ODt表示t＝x h时的吸光度；OD0表示t＝0h时的吸光度。

结果如图8所示：4株益生菌的自凝集性差异较大，益生菌的OD₆₀₀值随着静置时间的增加均呈现出下降趋势，而菌液自凝聚率呈现出上升趋势，在3h时达到最高，C6的自凝集性最好，为25.78±0.04％；A6和W1h次之，为20.44±0.17％和23.75±0.2％，H9最差，为10.24±0.18％。

2.5.3交互凝集性

将2mL调整浓度后的益生菌和2mL病原菌菌悬液(OD₆₀₀＝0.5)混合，放置37℃(勿摇动)4h后，取上清液，以PBS溶液为空白对照，测量OD₆₀₀，每组平行3管，记录。其中，病原菌为大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922，简称E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 51650，简称SA)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenesCMCC 54002，简称LM)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica GIM 1.237，简称SE)，以上病原菌均购自广东省微生物培养中心(GDMCC)。

交互凝集率(％)＝[(OD_pat+OD_lab)-2×OD_mix]×100/(OD_pat+OD_lab)；

式中，OD_pat病原菌0h的OD值；OD_lab：益生菌0h的OD值；OD_mix：混匀液4h的OD值。

对4株益生菌与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌和沙门氏菌四种致病菌的共凝聚能力进行测定。结果如图9所示：4株益生菌与大肠杆菌的共凝聚能力最强，其中C6最强，为22.53±0.39％；其次是李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌。四株益生菌与四种致病菌的共凝聚率均高于致病菌的自凝聚率，这说明四种益生菌均具有促进这四种致病菌的聚集能力。

2.6益生菌对Caco-2细胞的粘附效果

2.6.1Caco-2细胞的培养

将2mL Caco-2细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)悬浮液均转移到25T细胞培养瓶中，并加入2～4mL 20％FBS-DMEM培养基(DMEM培养基中加入20％(v/v)胎牛血清)，采用十字交叉法摇晃细胞培养瓶使细胞均匀分布，放置于37℃、5％(v/v)CO₂条件下进行贴壁培养，隔天换液。

2.6.2革兰氏染色法观察益生菌的黏附效果

当培养瓶中细胞密度达到80％～90％，将细胞消化收集后，将12孔细胞培养板放入细胞爬片，按大约1×10⁵个细胞/孔加入细胞培养板中，放置于37℃、5％(v/v)CO₂培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，弃去原培养基，用DPBS缓冲液洗涤2～3次，每个培养孔加入1mL调整浓度后的菌悬液，放置于37℃、5％(v/v)CO₂培养箱中孵育2h，吸弃菌悬液，用DPBS缓冲液洗涤2～3次以除去未黏附的益生菌。用镊子小心取出细胞爬片后，用0.4％多聚甲醛溶液固定30min，放置于室温条件下自然晾干后进行革兰氏染色，并于显微镜下观察益生菌对Caco-2细胞黏附情况，拍照记录。结果如图10所示。

2.6.3平板计数法测试益生菌的黏附效果

当培养瓶中细胞密度达到80％～90％，将细胞消化收集后，将12孔细胞培养板放入细胞爬片，按大约1×10⁵个细胞/孔加入细胞培养板中，放置于37℃、5％(v/v)CO₂培养箱中培养过夜。向培养有Caco-2细胞的培养孔中加入1mL调整浓度后的菌悬液，以DPBS缓冲液为空白对照，待孵育2h后，弃掉菌悬液，用DPBS缓冲液轻轻洗涤2～3次，以除去未黏附的益生菌，用移液器枪头的尖端轻刮黏附的细胞，制成细胞悬浮液，采用涂布平板法计算黏附的菌落数，并采用血球计数板计数法计算空白组中Caco-2细胞数，根据公式计算益生菌对Caco-2细胞的黏附效果；其中，细胞黏附率(CFU/100cells)＝N₂×100/N₀；式中，N2表示黏附的益生菌数；N₀表示对照组中Caco-2细胞数。结果如图11所示。

2.7益生菌分泌神经调节剂的能力

2.7.1标准曲线的制作

①1mM乙酸标准液：准确吸取0.5mmol乙酸溶于MRS液体培养基中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。

②1mM丙酸标准液：准确吸取0.5mmol丙酸溶于MRS液体培养基中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。

③1mM丁酸标准液：准确吸取0.5mmol丁酸溶于MRS液体培养基中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。

④取浓度为1mM的短链脂肪酸(SCFA)(乙酸、丙酸、丁酸)标准液0，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL分别加入10mL干净试管中，依次加入MRS液体培养基1mL，0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL，0.1mL，0mL，以0.1％(v/v)磷酸溶液(A)和甲醇(B)为流动相。梯度洗脱程序如下：0-9min，5％ B；9-25min，50％-80％B；25-30min，5％ B，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)，柱温40℃，流速0.6ml/min，进样量20μL，高效液相色谱法在210nm处记录色谱数据，以SCFA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线。

2.7.2益生菌分泌神经调节因子的能力

将甘油保藏菌种分别以2％(v/v)的接种量接种于新鲜的MRS液体培养基中，放置于37℃，180r/min中培养，将过夜培养的种子液200μL接种到800μL的MRS液体培养基中，37℃培养24h。取0.2mL培养24h的菌液，8000r/min离心1min，取上清液过膜，高效液相色谱法(测定方法同2.7.1)测定样品吸收峰，按照标准曲线计算样品分泌神经调节剂的能力。

结果见图12：益生菌均可分泌SCFA。

实施例3：分泌神经调节剂能力最好益生菌的鉴定

3.1菌落特征

根据实施例2的结果，进一步对益生菌W1h进行鉴定：将W1h菌株接种在MRS固体培养基上37℃培养48h后，菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落有凸起，边缘整齐。

3.2显微镜下形态

W1h菌株的革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为杆状，不生芽孢，且倾向于成链，无鞭毛、不运动(图13)。

3.3 16s rDNA电泳鉴定

将W1h菌株进行16s rDNA测序，并于NBCI中进行BLAST比对。W1h菌株的16s rDNA电泳图如图14所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

将W1h菌株的序列对比结果和形态观察结果相结合，确定该菌株属于混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)。将该菌株命名为混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)W1h，于2022年9月15日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25725。

本发明所提供的混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)W1h，经试验证明具有产神经调节剂的能力。该菌株满足作为益生菌的基本条件，对胃肠环境具有较好的耐受能力，能够保持一定存活率，而且拥有较强的肠道黏附性，对维持肠道正常微生物菌群平衡具有一定的作用，并且能够较好黏附在肠道上皮细胞中并发挥作用，可用于开发成微生物制剂、保健食品或药品，长期服用可以改善肠道微生物菌群结构，预防和缓解抑郁症状。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株混淆魏斯氏菌，其特征在于：名称为混淆魏斯氏菌(Weissella confusa)W1h，保藏号为CGMCC NO.25725，该菌株于2022年9月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种培养权利要求1所述混淆魏斯氏菌的方法，其特征在于，具体步骤为：将混淆魏斯氏菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述的培养基为MRS培养基；

所述的培养基的pH值为3～6.2；

所述的培养的时间为24～48h。

4.权利要求1所述的混淆魏斯氏菌在制备抗抑郁产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的混淆魏斯氏菌能够分泌神经调节剂，以达到治疗或缓解抑郁的目的；

所述的神经调节剂为色氨酸、多巴胺和短链脂肪酸中的至少一种；

所述的短链脂肪酸为乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的产品包括微生物制剂、保健食品或药品。

7.权利要求1所述的混淆魏斯氏菌在生产神经调节剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的神经调节剂为多巴胺、色氨酸和短链脂肪酸中的至少一种；

所述的短链脂肪酸为乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种。

9.权利要求1所述的混淆魏斯氏菌在制备改善肠道微生物菌群结构的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的混淆魏斯氏菌能够抑制致病菌的生长和繁殖，维持肠道正常微生物菌群平衡；

所述的致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌和沙门氏菌中的至少一种。