CN116173205A - 一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于抗菌光动力治疗(antimicrobialphotodynamictherapy，aPDT)牙周炎的复合纳米材料及其制备方法和应用，包括蓝藻、两种上转换纳米材料以及光敏剂；该复合纳米材料以蓝藻作为载体，加载了两种上转换纳米粒子材料及光敏剂，在近红外光激发下，上转换材料分别发射红光和蓝光；红光激发光敏剂产生活性氧，蓝光使蓝藻进行光合作用产生氧气，进而解决aPDT疗法中的缺氧问题，极大的提升了抗菌光动力治疗的效率；可以实现通过体外近红外光的操控，在生物组织的深层位置改善抗菌光动力治疗中的缺氧问题，从而进行更有效地aPDT治疗。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌治疗技术领域，尤其涉及一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
牙周病是一种慢性炎症性疾病，菌斑生态失衡在牙周炎的发生和发展过程中起着决定性作用，这种失衡主要表现为厌氧致病菌比例上升。
目前，牙周炎的治疗主要使用机械清创和辅助抗生素治疗相结合的治疗方法，而龈下机械清创是利用器械尽可能多的去除生物膜和龈下的结石，尽管细菌数量可通过机械清创大幅减少，但是由于部分细菌可能存在于软组织、不规则根面以及牙本质小管等器械难以到达的部位，因此很难完全清除龈下的菌斑和牙石，这就使得细菌生物膜难以被彻底清除，进而导致深部感染细菌生物膜以及深部炎症治疗等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料及其制备方法和应用。
本发明的创新点在于：该复合纳米材料以蓝藻作为载体，加载了两种上转换纳米粒子材料及光敏剂，在近红外光激发下，上转换材料分别发射红光和蓝光；红光激发光敏剂产生活性氧，蓝光使蓝藻进行光合作用产生氧气，进而解决aPDT疗法中的缺氧问题，极大的提升了抗菌光动力治疗的效率；可以实现通过体外近红外光的操控，在生物组织的深层位置改善抗菌光动力治疗中的缺氧问题，从而进行更有效地aPDT治疗。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：
一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料，包括以下成分：蓝藻、两种上转换纳米材料以及光敏剂；在近红外光激发下，两种所述上转换材料分别发射红光和蓝光。
进一步地，所述红光激发光敏剂产生活性氧，所述蓝光使蓝藻进行光合作用产生氧气，进而解决aPDT治疗中的缺氧问题。
进一步地，所述蓝藻可以将过度光照下产生的氧气转化为热量，起到进一步消散细菌生物膜的作用。
进一步地，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)、酞菁、姜黄素或聚乙烯亚胺。
一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法：包括以下步骤：
步骤1：制备稀土离子掺杂上转换纳米材料NaYF4:Yb,Tm@Silane；
具体步骤为：称取醋酸钇、醋酸镱、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合；通过高温共沉淀法制备NaYF4:Yb,Tm；将制备得到的NaYF4:Yb,Tm与三甲氧基十八烷基硅烷溶于四氢呋喃(THF)中，超声处理后注入氨水中，然后避光静置，水解透析，得到NaYF4:Yb,Tm@Silane；
步骤2：制备核壳结构的稀土离子掺杂上转换纳米材料NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane；具体步骤为：称取醋酸铒、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法制备得到NaErF4:Tm；称取醋酸钇、醋酸镱与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法将NaErF4:Tm包覆形成β相核壳结构，得到NaErF4:Tm@NaYF4:Yb；将制备得到的NaErF4:Tm@NaYF4:Yb与三甲氧基十八烷基硅烷溶于四氢呋喃(THF)中，再加入一定量的二氢卟吩e6分子溶液，超声处理后注入氨水中，然后避光静置，水解透析，得到NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane。
步骤3：将蓝藻菌株放在培养基中培养，待蓝藻菌株浓度达到设定浓度时，向其中加入等量的步骤1及步骤2中制得的NaYF4:Yb,Tm@Silane与NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane，共同孵育数小时后，对溶液进行离心处理，得到的沉淀物即为复合纳米材料。
进一步地，所述步骤1中NaYF4:Yb,Tm与三甲氧基十八烷基硅烷的质量比为2:3；所述氨水的pH值约为9。
进一步地，所述步骤2中NaErF4:Tm@NaYF4:Yb与三甲氧基十八烷基硅烷的质量比为2:3；所述氨水的pH值约为9；所述透析所用透析袋的截留分子量为8000-14000。
进一步地，所述步骤3中蓝藻的设定浓度为CFU＝108。
一种纳米药物，部分或全部包含上述的复合纳米材料。
上述纳米药物在牙周炎抗菌光动力治疗中的应用。
上述纳米药物在消散菌斑生物膜及炎症免疫调节药物中的中应用。本发明的有益效果是：
该复合纳米材料以蓝藻作为载体，加载了两种上转换纳米材料及光敏剂，在近红外光激发下，上转换材料分别发射红光和蓝光；红光激发光敏剂产生活性氧，蓝光使蓝藻进行光合作用产生氧气，进而解决aPDT疗法中的缺氧问题，极大的提升抗菌光动力效率；可以实现在体外对红外光的操控，且在生物组织的深层位置改善光动力学疗法的缺氧问题，进行aPDT与PTT协同治疗。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法的流程示意图。
图2为本发明实施例提供的稀土离子掺杂上转换纳米材料各级产物包括NaYF4:Yb,Tm(a)、NaYF4:Yb,Tm@Silane(b)的TEM图、包覆前后粒子的傅里叶红外图谱(c)、xrd表征图(d)以及粒子在980nm近红外光激发下的发射光谱图(e)。
图3为本发明实施例提供的核壳结构的稀土离子掺杂上转换纳米材料的各级产物NaErF4:Tm(a)、NaErF4:Tm@NaYF4:Yb(b)、NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Silane@Ce6(c)的TEM图、粒子不同阶段的傅里叶红外图谱(d)、xrd表征图(e)、粒子在980nm近红外光激发下的发射光谱图(f)以及用ABDA探针测试的材料产生单线态氧的能力(g)。
图4为本发明实施例提供的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的蓝藻复合纳米材料的TEM图。
图5为不同材料对f.nucleatum形成的生物膜的抗菌能力对比图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
如图1所示，本实施例提供了一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的蓝藻复合纳米材料的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：制备稀土离子掺杂上转换纳米材料NaYF4:Yb,Tm@Silane；
S11：称取醋酸钇、醋酸镱、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法制备NaYF4:Yb,Tm；具体步骤为：
A、称取0.798mmol醋酸钇[(CH3COO)3Y·4H2O]、0.2mmol醋酸镱
[(CH3COO)3Yb·4H2O]和0.002mmol醋酸铥[(CH3COO)3Tm·4H2O]放入的三颈烧瓶中；
B、向三颈烧瓶中加入溶剂6ml油酸(OA)和15ml十八碳烯(ODE)混合,在室温下持续通氮气并搅拌5分钟；
C、将反应溶液升温至130℃保持30分钟左右，直至溶液中的粉末完全溶解并形成均匀的澄清溶液，随后将溶液降至室温；
D、将2.5mmol氢氧化钠(NaOH)和4mmol氟化铵(NH4F)加入到一定量的甲醇中，超声至粉末完全溶于甲醇；
E、将溶解有氢氧化钠(NaOH)和氟化铵(NH4F)的甲醇溶液逐滴加入到降至室温的反应溶液中，搅拌15分钟；
F、将反应溶液加热至125℃保持30分钟左右，直至观察到溶液中不再有泡沫，即甲醇与环己烷被完全除去；
G、将反应溶液升温至320℃保持1.5小时；
H、反应结束后将反应溶液自然降至室温，用无水乙醇、环己烷离心洗涤3次后将NaYF4:Yb,Tm沉淀溶解分散于环己烷中备用。
S12：将所合成的NaYF4:Yb,Tm与三甲氧基十八烷基硅烷以2：3的质量比溶于四氢呋喃(THF)当中超声处理30分钟，将混合物注入锥形烧瓶内pH≈9的氨水中，然后将锥形烧瓶避光静置于室温下，水解3-5小时后进行透析，水解结束后，将溶液转移至透析袋并置于去离子水中透析24小时，最终获得NaYF4:Yb,Tm@Silane。
如图2中a所示，NaYF4:Yb,Tm呈大小均一的六边形，分散性良好。
如图2中b所示，NaYF4:Yb,Tm@Silane中硅烷包覆均匀。
如图2中c所示，NaYF4:Yb,Tm@Silane中有Si-O-Si键的形成，进一步说明了硅烷的成功包覆。
如图2中d所示，与六角相结构的标准卡片相比，我们所合成粒子的六方相结构图谱与之具有高度的一致性，这进一步说明了粒子的成功合成。
如图2中e所示，可以看到包覆前粒子在450nm和470nm附近表现出了很强的发射，而在包覆过后虽然粒子的发光强度有所下降，但仍有较强的发光。
步骤2：制备核壳结构的稀土离子掺杂上转换纳米材料NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane：
S21：称取醋酸铒、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法制备NaErF4:Tm；具体步骤为：
A、称取0.995mmol醋酸铒[(CH3COO)3Er·4H2O]和0.005mmol醋酸
[(CH3COO)3Tm·4H2O]放入三颈烧瓶中；
B、向三颈烧瓶中加入溶剂6ml油酸(OA)和15ml十八碳烯(ODE)混合，在室温下持续通氮气并搅拌5分钟；
C、将反应溶液升温至130℃保持30分钟左右，直至溶液中的粉末完全溶解并形成均匀的澄清溶液，随后将溶液降至室温；
D、将2.5mmol氢氧化钠(NaOH)和4mmol氟化铵(NH4F)加入到一定量的甲醇中，超声至粉末完全溶于甲醇；
E、将溶解有氢氧化钠(NaOH)和氟化铵(NH4F)的甲醇溶液逐滴加入到降至室温的反应溶液中，搅拌15分钟；
F、将反应溶液加热至125℃保持30分钟左右，直至观察到溶液中不再有泡沫即甲醇与环己烷被完全除去；
G、将反应溶液升温至320℃保持1.5小时；
H、反应结束后将反应溶液自然降至室温，用无水乙醇、环己烷离心洗涤3次后将沉淀NaErF4:Tm溶解分散于环己烷中备用；
S22：称取醋酸钇、醋酸镱，将NaErF4:Tm包覆，制备得NaErF4:Tm@NaYF4:Yb；具体步骤为：
A、称取0.8mmol醋酸钇[(CH3COO)3Y·4H2O]和0.2mmol醋酸镱
[(CH3COO)3Yb·4H2O]放入三颈烧瓶中；
B、向三颈烧瓶中加入溶剂6ml油酸(OA)和15ml十八碳烯(ODE)混合,在室温下持续通氮气并搅拌5分钟；
C、将反应溶液升温至130℃保持30分钟左右，直至溶液中的粉末完全溶解并形成均匀的澄清溶液，随后将溶液降至室温；
D、将溶解有NaErF4：Tm纳米粒子的环已烷溶液逐滴加入到降至室温的反应溶液中，搅拌片刻；
E、将2.5mmol氢氧化钠(NaOH)和4mmol氟化铵(NH4F)加入到一定量的甲醇中，超声至粉末完全溶于甲醇；
F、将溶解有氢氧化钠(NaOH)和氟化铵(NH4F)的甲醇溶液逐滴加入到降至室温的反应溶液中，搅拌15分钟；
G、将反应溶液加热至125℃保持30分钟左右，直至观察到溶液中不再有泡沫，即甲醇与环己烷被完全除去；
H、将反应溶液升温至320℃保持1.5小时；
I、反应结束后将反应溶液自然降至室温，用无水乙醇、环己烷离心洗涤3次后将沉淀NaErF4:Tm@NaYF4:Yb溶解分散于环己烷中备用；
S23：将合成的NaErF4:Tm@NaYF4:Yb与三甲氧基十八烷基硅烷以2：3的质量比溶于四氢呋喃(THF)中，之后将一定量的二氢卟吩e6(Ce6)分子加入到混合溶液当中，超声处理30分钟后，将混合物快速注入锥形烧瓶内pH≈9的氨水中，然后将锥形烧瓶避光静置于室温下，水解3-5小时后进行透析；水解结束后，将溶液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中进行透析，并置于去离子水中透析24小时，最终获得
NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane。
如图3中a及b所示，NaErF4:Tm和NaErF4:Tm@NaYF4:Yb都呈大小均一的六边形，分散性良好。
如图3中c所示，NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Silane@Ce6可见硅烷层最外侧有薄层有机物包覆。
如图3中d所示，NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Silane@Ce6中有Si-O-Si键的形成，进一步说明了硅烷的成功包覆。
如图3中e所示，与六角相结构的标准卡片相比，我们所合成粒子的六方相结构图谱与之具有高度的一致性，这进一步说明了粒子的成功合成。
如图3中f所示，可以看到最初的核NaErF4:Tm在660nm处的发光强度是较弱的，在包覆了Yb离子掺杂的NaYF4壳后，发光强度有着显著的提升；而在包覆硅烷后，强度又有所降低，但与最初的核相比，它的发光强度仍有很大提升。
如图3中g所示，我们选用ABDA探针来测试材料产生单线态氧的能力，该探针的吸收中心在260nm附近，单线态氧的产生可以猝灭探针的吸收，可以看到随着辐照时间的增加，探针的吸收峰也逐渐降低，这表明该材料具有良好的产生单线态氧的能力。
步骤三：制备蓝藻复合纳米材料；
将PCC7942型蓝藻菌株放在新鲜的BG11培养基中进行培养，每天对其进行光照12小时，其余时间放置在暗处；待蓝藻的浓度达到CFU＝108时，向其中加入200ul5mg/ml的等量的步骤一及步骤二制备的上转换纳米材料；共同孵育4小时后，对溶液进行离心处理，得到的沉淀物即为复合纳米材料，将沉淀物质放入PBS缓冲液中保存以便后续实验的使用。
进一步地，蓝藻菌株的种类有很多，也可选择其他型号的藻种，配合相应的培养基即可。
实施例2
本实施例提供了实施例1所述的制备方法制备得到的用于光动力治疗牙周炎的蓝藻复合纳米材料，如图4所示，从图中可以看到上转换纳米粒子成功加载到了蓝藻内部。
实施例3
本实施例提供了实施例2所述的蓝藻复合纳米材料在治疗牙周炎药物中的应用，将所制备的复合纳米材料注射于患处后用980nm波长的近红外光对患处进行照射，被激发的光敏剂会产生大量的单线态氧用于患处的抗菌，而产生的大量氧一方面可以缓解抗菌光动力治疗(aPDT)中的乏氧(缺氧)问题；另一方面也可以缓解牙周袋乏氧的微环境，从而在一定程度上抑制厌氧菌的繁殖。
收集生长状态好的具核梭杆菌细胞(1×108CFUml-120ml)，接种于24孔板中，每孔1.5ml，培养48小时待形成致密生物膜；将实施例1中所制备的NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Silane@Ce6和NaYF4:Yb,Tm@Silane以1：1的比例加入至蓝藻中，与蓝藻共孵育2小时以后形成蓝藻复合纳米材料；然后按顺序向不同的孔中分别加入：即对照组、仅两种上转换纳米材料的UCNPs组(其中NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Silane@Ce6与NaYF4:Yb,Tm@Silane的比例为1：1)、仅PCC7942型蓝藻的PCC7942组以及载有两种上转换纳米粒子的蓝藻、PCC+UCNPs组(即蓝藻复合纳米材料)。然后将实验分为两个大组，即非光照组和光照组，非光照组在加入各物质后不再进行处理，而光照组则会对各孔用980nm的近红外光照射10min进行光动力治疗。治疗过后用MTT染料对各孔进行处理，在37℃条件下孵育1-2小时，然后将染料吸出后加入溶剂DMSO并在摇床上孵育15分钟；最后用酶标仪(SpectraMax)测量OD540的数值(如下表1)，来分析生物膜的代谢活性。
| 对照组 | UCNPs组 | PCC7942组 | PCC+UCNPs组 | |
| 非光照组 | 0.949 | 0.899 | 0.862 | 0.719 |
| 光照组 | 0.912 | 0.626 | 0.579 | 0.371 |
表1
活细菌中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细菌无此功能；二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜(zā)，用酶标仪在540nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细菌数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细菌的数量，OD值越大，活细菌数量越多。
因此表1中的数据表明：对照组当中的活细菌数量最多，而经过不同的材料治疗后，细菌数量有不同程度地降低；其中可以看到经过本申请所制备的蓝藻复合纳米材料加光照进行治疗过后，细菌数量最少，表明抗菌治疗效果最好，图5中也给出了不同材料对f.nucleatum形成的生物膜的抗菌能力的对比图。
当然，本申请中蓝藻也可替换为其他可进行光合作用的藻类，如：小球藻、莱茵衣藻等，根据选定藻种与光合作用相关色素的吸收光谱，再选择合适的上转换纳米材料，如本申请选择的蓝藻菌株，其吸收在430nm-480nm的蓝光范围内，因而制备了蓝色发光的上转换粒子用于制备后续的复合纳米材料。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (11)
1.一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料，其特征在于：包括以下成分：蓝藻、两种上转换纳米材料以及光敏剂；在近红外光激发下，两种所述上转换材料分别发射红光和蓝光。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗菌光动力治疗的复合纳米材料，其特征在于：所述红光激发光敏剂产生活性氧，所述蓝光使蓝藻进行光合作用产生氧气，进而解决aPDT治疗中的缺氧问题。
3.根据权利要求1所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料，其特征在于：所述蓝藻可以将过度光照下产生的氧气转化为热量，起到进一步消散细菌生物膜的作用。
4.根据权利要求1所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料，其特征在于：所述光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)、酞菁、姜黄素或聚乙烯亚胺。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法：其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：制备稀土离子掺杂上转换纳米材料NaYF4:Yb,Tm@Silane；
具体步骤为：称取醋酸钇、醋酸镱、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合；通过高温共沉淀法制备NaYF4:Yb,Tm；将制备得到的NaYF4:Yb,Tm与三甲氧基十八烷基硅烷溶于四氢呋喃(THF)中，超声处理后注入氨水中，然后避光静置，水解透析，得到NaYF4:Yb,Tm@Silane；
步骤2：制备核壳结构的稀土离子掺杂上转换纳米材料NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane；具体步骤为：称取醋酸铒、醋酸铥与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法制备得到NaErF4:Tm；称取醋酸钇、醋酸镱与油酸和十八碳烯混合通过高温共沉淀法将NaErF4:Tm包覆形成β相核壳结构，得到NaErF4:Tm@NaYF4:Yb；将制备得到的NaErF4:Tm@NaYF4:Yb与三甲氧基十八烷基硅烷溶于四氢呋喃(THF)中，再加入一定量的二氢卟吩e6分子，超声处理后注入氨水中，然后避光静置，水解透析，得到NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane。
步骤3：将蓝藻菌株放在培养基中培养，待蓝藻菌株浓度达到设定浓度时，向其中加入等量的步骤1及步骤2中制得的NaYF4:Yb,Tm@Silane与NaErF4:Tm@NaYF4:Yb@Ce6@Silane，共同孵育数小时后，对溶液进行离心处理，得到的沉淀物即为复合纳米材料。
6.根据权利要求5所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1中NaYF4:Yb,Tm与三甲氧基十八烷基硅烷的质量比为2:3；所述氨水的pH值约为9。
7.根据权利要求5所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2中NaErF4:Tm@NaYF4:Yb与三甲氧基十八烷基硅烷的质量比为2:3；所述氨水的pH值约为9；所述透析所用透析袋的截留分子量为8000-14000。
8.根据权利要求5所述的一种用于抗菌光动力治疗牙周炎的复合纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤3中蓝藻的设定浓度为CFU＝108。
9.一种纳米药物，其特征在于：部分或全部包含权利要求1-4任一项所述的复合纳米材料。
10.如权利要求9所述的纳米药物在牙周炎抗菌光动力治疗中的应用。
11.如权利要求9所述的纳米药物在消散菌斑生物膜及炎症免疫调节药物中的应用。
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| 梅方宇;马巍;毕良佳;: "光动力疗法对牙周病主要致病菌的杀灭效果的研究进展", 口腔医学, no. 05, 3 May 2018 (2018-05-03) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116173205B (zh) | 2024-09-17 |
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