WO2016083239A1 - Antimikrobielle photodynamische therapie - Google Patents

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WO2016083239A1
WO2016083239A1 PCT/EP2015/077124 EP2015077124W WO2016083239A1 WO 2016083239 A1 WO2016083239 A1 WO 2016083239A1 EP 2015077124 W EP2015077124 W EP 2015077124W WO 2016083239 A1 WO2016083239 A1 WO 2016083239A1
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WO
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liter
microorganisms
apdt
toluidine blue
photodynamic therapy
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PCT/EP2015/077124
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Eva-Maria DECKER
Christiane VON OHLE
Valentin BARTHA
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
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    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
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    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to the use of two components in simultaneous administration for the treatment of an infection caused by microorganisms by means of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), a usable within the aPDT pharmaceutical composition and a kit for the treatment of infection by microorganisms using aPDT.
  • aPDT antimicrobial photodynamic therapy
  • Antimicrobial photodynamic therapy also known as photoactivated disinfection
  • aPDT photoactivated disinfection
  • a suitable photosensitive material Dye which is referred to as photosensitizer inactivate.
  • the photosensitive dye after local application and binding to the target structures under specific light excitation, for example by means of LED or laser, transferred via photon absorption in a triplet state.
  • electron-transfer reactions can locally generate oxygen radicals (singlet oxygen) and oxygenated highly reactive molecules (ROS), irreversibly destroying the dye-labeled target structures while sparing the surrounding tissue.
  • aPDT plays in dentistry in addition to conventional clinical treatment methods now an essential role.
  • the main use of aPDT in oral bacterial infections is decontamination of the tooth root surface in periodontology or the implant surface in implantology and in infections of the endodontic system, which require a root canal treatment.
  • this tissue-conserving method is also used.
  • the aPDT is clinically easy to perform, it is largely lacking in side effects, resistance or allergies. The aPDT is therefore often a possible alternative to the administration of antibiotics.
  • various photosensitizers are used in combination with different radiation sources, for example toluidine blue or tolonium chloride, methylene blue or indocyanine green; see. Hopp and Biffar (2013), Photodynamic Therapy - Blue Vs. Green, Laser Journal 1: 14-25.
  • the aPDT upstream H 2 0 2 treatment caused a CFU reduction of 1, 4 log-io stages and the downstream H 2 0 2 treatment, however, a stronger colony reduction by 2.8 log- ⁇ units.
  • the starting CFU equivalents used in this study ranged from about 10 7 / ml.
  • the inventors have not been able to reproduce the experimental results presented in this document. Lins et al. (2013), Enhancement of antimicrobial action of photodynamic therapy in the presence of hydrogen peroxide, in: Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education, published by: A. Mendez-Vilas, Formatex Research Center, Vol.
  • the modified aPDT consisted of multiple combinations of methylene blue: low-dose chlorhexidine (CHX, 0.05%) and hydrogen peroxide (0.5%), a combination of methylene blue, CHX, and H 2 O 2 , a combination of methylene blue, EDTA, and H 2 0 2 or a combination of methylene blue, CHX and EDTA with laser irradiation.
  • CHX low-dose chlorhexidine
  • hydrogen peroxide 0.5%
  • a combination of methylene blue, CHX, and H 2 O 2 a combination of methylene blue, EDTA, and H 2 0 2
  • the antibacterial activity of the combination with H 2 O 2 was lower on planktonic microorganisms in the opinion of the authors than the combination of methylene blue, CHX and EDTA.
  • WO 2009/123575 discloses a photosensitizing composition for the treatment of dental microbial infections.
  • This contains either perfluorodecahydronaphthalene as an oxygen carrier, H 2 O 2 as an oxidizing agent and Tween X100 as a surfactant [ET2, ET6], or only perfluorodecahydronaphthalene (as an oxygen carrier) and H 2 O 2 (as an oxidizing agent) [Sol A + B] or perfluorodecahydronaphthalene (as an oxygen carrier) alone [Sol A].
  • WO 2013/177674 describes an apparatus for use in phototherapy. Experimental data are not disclosed.
  • the limitation of this basically advantageous method is thus evident in the insufficient killing of microorganisms.
  • the cause may be the mechanically very stable cell walls of some bacteria, such as enterococci and streptococci, which make it difficult to pick up the photosensitizer and thus override the light-induced killing mechanism.
  • This object is achieved by the use of toluidine blue and H 2 O 2 in simultaneous administration for the treatment of an infection triggered by microorganisms by means of antimicrobial photodynamic therapy.
  • Toluidine blue also known as tolonium chloride, has the empirical formula Ci 5 H 16 CIN 3 S, the CAS no. 92-31 -9. It has a molar mass of 308.85 g per mole.
  • Hydrogen peroxide has the empirical formula H 2 0 2 , the CAS no. 7722-84-1 and has a molar mass of 34.02 g per mole.
  • “simultaneous administration” means that the toluidine blue and H 2 O 2 are not consecutive, as for example in Eick et al. (aaO) but administered at the same time, with a minimum time offset of ⁇ 60 seconds, preferably ⁇ 30 seconds, preferably ⁇ 20 seconds, preferably ⁇ 10 seconds, preferably ⁇ 5 seconds, preferably ⁇ 4 seconds, preferably ⁇ 3 seconds, preferably ⁇ 2 seconds, preferably ⁇ 1 second, or no time offset are included.
  • the toluidine blue and H 2 0 2 in each case
  • an “infection” includes not only the penetration of microorganisms, but also the prevalence or presence of microorganisms, for example in liquids of a living being, such as saliva.
  • treatment means any action on the microorganisms which has the purpose of inhibiting or reducing their viability and / or multiplication.
  • the "photodynamic therapy” includes the presence of a
  • the light source is a laser diode, for example having a wavelength of about 630-650 nm, or a light-emitting diode (LED), for example having a wavelength of about 560 to 640 nm.
  • LED light-emitting diode
  • Particularly suitable is an LED light source with a wavelength of 630 nm.
  • the irradiation time is preferably about 10 to about 120 seconds, preferably about 60 seconds.
  • the inventors have recognized that the simultaneous administration of toluidine blue and
  • H 2 0 2 in the presence of a light source results in a significant reduction in the viability of Microorganisms leads. It was particularly surprising and conspicuous that the combination of toluidine blue and H 2 0 2 results not only in an additive but in a synergistic effect enhancement.
  • aPDT pulse provides significantly better results than the conventional aPDT, in which usually the photosensitizers methylene blue and / or toluidine blue are used without the addition of H 2 0 2 .
  • the simultaneous use according to the invention of toluidine blue and H 2 O 2 which is also referred to by the inventors as “Tol lus " provides the inventors also much better results than the time-delayed administration of H 2 0 2 and toluidine blue, such as in at Eick et al. (supra), or the delayed administration of methylene blue and H 2 0 2 .
  • significantly better results are achieved by the simultaneous use of toluidine blue and H 2 O 2 according to the invention than by a simultaneous administration of methylene blue and H 2 O 2 .
  • Pre- or post-treatments can be carried out, for example, with substances that increase the oxygen input, such as cofactors, and catalysts for the increased generation of phototoxic induced radicals in the aPDT, and / or substances that induce further synergistic antibacterial effects.
  • substances that increase the oxygen input such as cofactors, and catalysts for the increased generation of phototoxic induced radicals in the aPDT, and / or substances that induce further synergistic antibacterial effects.
  • pre-treatment or post-treatment with H 2 O 2 substances which change the pH of the local environment, antiseptic solutions such as chlorhexidine solutions, antibacterial enzymes which attack the cell wall of the bacteria and possibly the penetration of toluidine. increase blue, etc.
  • Toluidine blue in a concentration of> about 0.0291 micromoles / liter, preferably of> about 0.291 mol / liter, more preferably of> about 2.91 micromol / liter, more preferably of> about 29.1 mol / liter , most preferably from about 291 micromoles / liter, and more preferably from ⁇ about 32378 micromoles / liter ( 1 wt%), and
  • H 2 0 2 in a concentration of> about 8.82 millimoles / liter, preferably of> about 88.2 millimoles / liter, most preferably of about 882 millimoles / liter, and more preferably of ⁇ about 1470 millimoles / Liter ( 5% by weight). contains.
  • compositions may be prepared either immediately prior to administration or, alternatively, at an earlier point in time.
  • the inventors have found that due to the synergistic effect, an effect at already very low concentrations of toluidine blue and / or H 2 0 2 is observed.
  • concentrations given have proven to be particularly suitable.
  • the toluidine blue and / or H 2 0 2 is present in an aqueous solution, for example in an aqueous saline solution.
  • the saline solution can be, for example, a physiological or isotonic saline solution containing about 9 g of sodium chloride per liter of water.
  • Solutions or compositions can be provided in sterile form.
  • a preferred embodiment of the invention is in the treatment of infection caused by microorganisms to treat an oral infection of a living being, preferably a human, by dental relevant microorganisms.
  • the use according to the invention is particularly suitable for dental applications and gives good results there.
  • the microorganisms are selected from
  • Periodontitis / peri-implantitis-relevant microorganisms preferably from the group consisting of:
  • Streptococcus gordonii Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypica and / or from endodontic root canal infection-associated microorganisms, preferably selected from the group consisting of: Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis; and / or out
  • Caries-associated microorganisms preferably from the group consisting of: salivary microorganisms and Streptococcus mutans.
  • the inventors were able to prove that the use according to the invention provides particularly good results in comparison to the above-mentioned highly relevant dental microorganisms.
  • a further subject of the present invention relates to a pharmaceutical composition containing toluidine blue and H 2 0 2 for the treatment of an infection by microorganisms by means of antimicrobial photodynamic therapy.
  • Another object of the present invention relates to a kit for the treatment of a
  • kits comprises a first container containing a preferably aqueous solution of toluidine blue, and a second container containing a preferably aqueous solution of H 2 0 2 .
  • Impact amplifier H 2 0 2 are provided separately and, for example, mixed immediately before the treatment and the desired concentrations can be adjusted.
  • the possibly limited stability of the composition comprising toluidine blue and H 2 0 2 is thus taken into account. It is understood that the kit contains other items, reagents, chemicals etc.
  • the kit may contain.
  • the kit may further include a light source, such as an LED or laser light source emitting any wavelength, such as 630 nm.
  • the first container has a first outlet opening and the second container has a second outlet opening, and the first and second outlet openings are liquid-tight and possibly airtight connectable.
  • This measure has the advantage that the contents of the first container in the second container, or vice versa, can be transferred without causing contamination.
  • concentrations of toluidine blue and H 2 O 2 in the first and second containers are preset in such a way that after mixing the two liquids, the desired final concentrations are present.
  • the first container is a syringe and the second container is a syringe, wherein the first and second syringe has an external thread at their respective outlet opening and the second or first syringe has an internal thread complementary to the external thread at its outlet opening, wherein the kit optionally additionally has a cannula with a thread which is complementary to the external thread and / or internal thread.
  • This measure has the advantage that an easy-to-use two-component system is provided. This can be used, for example, on the chair during treatment. Before application, both pre-dosed components are connected to one another via a screw cap and the two, preferably sterile, solutions are mixed uniformly. After filling a syringe, the final solution can be applied by means of a cannula, preferably a blunt cannula, in the context of photodynamic therapy directly on the patient, for example in periodontal pockets or root canals.
  • a kit is - for other purposes described in the prior art, for example in WO 01/51024, the content of which is incorporated by reference into the present application. Such a kit is used for the administration of the local antibiotic "Atridox".
  • Another object of the present invention relates to a
  • a method for treating an infection caused by microorganisms by means of antimicrobial photodynamic therapy comprising the following steps:
  • the solutions provided in step 1 can also be realized by a solution containing both the toluidine blue and the H 2 O 2 in the desired concentrations.
  • reactive oxygen species include oxygen radicals (singlet oxygen) and oxygenated highly reactive molecules (ROS) formed by electron transfer reactions.
  • the introduction in step (2) can take place in infected areas, for example gum and bone pockets, wound surfaces or root canals.
  • Fig. 1 Principle of photodynamic therapy
  • Fig. 2 model of a commercialized two-component photosensitizer
  • Fig. 3 Overview of the conventional aPDT according to company specifications. Photos: Toi and LED;
  • Helbo Met (1%, 0.01%) with NaCl and laser on paro, endo and caries-associated bacteria (log CFU / ml) with saline control (NaCl) (mean, Clu, Cll: mean and upper, lower limit of 95% confidence interval);
  • Fig. 4 Tol lus (Tol + H 2 0 2 ) - synergism and conventional aPDT (Toi), saline or
  • H 2 O 2 controls on Paro cocktail bacteria (mean, Clu, Cll: mean and upper, lower limit of the 95% confidence interval);
  • Fig. 5 Paro-cocktail - conventional aPDT (Toi) and Tol plus (Tol + H 2 0 2 ) (mean, Clu, Cll:
  • Fig. 6 Endo-cocktail - conventional aPDT (Toi), H 2 0 2 pretreatment with aPDT and Tol plus (Tol + H 2 0 2 ) (mean, Clu, CM: mean and upper, lower limit of the 95% confidence interval) ;
  • Fig. 7 Kario-cocktail - conventional (Toi) and H 2 0 2 pretreatment with aPDT and
  • Fig. 8 Dye and system comparison of toluidine (Fotosan) and methylene blue (Helbo) in combination with H 2 0 2 (Tol plus [Tol + H 2 0 2 ] and Met plus [Met + H 2 0 2 ]) at periodontal - pathogenic bacteria (mean, Clu, CM: mean and upper, lower limit of the 95% confidence interval);
  • Fig. 9 Dilution tests (original Tol lus , Met lus , final concentrations each 0.009%) and 4 dilution stages: 0.0009%, 0.00009%, 0.000009%, 0.0000009%) of Toi (red, Jardinan) and Met (blue, Helbo) in combination with H 2 0 2 in the aPDT lus on the Paro cocktail (mean, Clu, CM: mean and upper, lower limit of the 95% confidence interval).
  • FIG. A The principle of photodynamic therapy is shown in FIG. A:
  • the photosensitive dye or photosensitizer is after local application and
  • Target structures here bacterial or fungal membranes or cell walls
  • electron transfer reactions can locally generate oxygen radicals, for example singlet oxygen, and oxygenated reactive oxygen species (ROS), which irreversibly destroy the photosensitive dye-labeled membranes or cell walls of the microorganisms.
  • ROS oxygenated reactive oxygen species
  • FIG. 2 shows an example of a suitable application system.
  • Toluidine blue and the H 2 O 2 are each provided sterile in syringes.
  • the syringe containing the toluidine blue has an internal thread at its outlet opening or nozzle, and the syringe containing the H 2 O 2 has at its outlet opening or nozzle a complementary external thread. The threading can also be done the other way round. Both syringes are closed. The syringes can be screwed together before use.
  • the sealed syringes are opened at their outlet openings and the two components can be mixed.
  • the pistons of both syringes are actuated alternately and then the mixture is transferred into a syringe, in the present example into the syringe originally containing the toluidine blue.
  • the empty syringe originally containing the H 2 O 2 is removed.
  • a blunt cannula is screwed onto the syringe containing the fully mixed composition.
  • the composition can now be administered directly to a patient, for example. 3.
  • aPDT antimicrobial photodynamic therapy
  • aPDT plus antimicrobial photodynamic therapy
  • Streptococcus gordonii (Sg, ATCC 3339), Aggregatibacter actinomycetemcomitans ⁇ Aa, ATCC 43718), Actinomyces viscosus ⁇ Av, DSM 43798), Fusobacterium nucleatum (Fn, ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis ⁇ Pg, ATCC 33277), Veillonella atypica ⁇ Va, ATCC 17744).
  • the CFU culture (incubation period) at 37 ° C was 5 days under anaerobic conditions.
  • Enterococcus faecalis Es, ATCC 19433
  • Actinomyces naeslundii ⁇ An ATCC 19039
  • Fusobacterium nucleatum Fn, ATCC 10953
  • Porphyromonas gingivalis Pg, ATCC 33277.
  • the CFU culture (incubation period) at 37 ° C was 5 days under anaerobic conditions.
  • Representative cariogenic bacterial cocktail human native saliva with equal proportions of Streptococcus mutans (Sm, ATCC 25175).
  • the CFU culture time (incubation period) at 37 ° C was 2 days under anaerobic conditions.
  • Bacterial mixtures averaged 2.3 ⁇ 10 9 / ml, ie bacterial counts corresponding to or above the bacterial mixtures occurring in the mouth in order to evaluate maximum antibacterial efficiencies at clinically relevant bacterial loads.
  • photos to 630 toluidine blue, LED 630 nm
  • Helbo methylene blue, laser 660 nm
  • Concentration 0.01% is integrated with Helbo Methylene Blue in 100-fold concentration (1%) as photosensitizer. Due to the high dye density, the Helbo manufacturer's instructions, unlike the Jardinan system, after binding the methylene blue to the target cells prior to laser irradiation, preclude a rinsing step with saline to avoid shading of the laser light and thus impairment of the antibacterial photodynamic effect.
  • Germinating lower log- ⁇ CFU reduction reflects the increasing insensitivity of these bacterial groups to the aPDT.
  • the exclusive hydrogen peroxide treatment of the bacteria resulted only in a CFU reduction of about 1 logio-stage.
  • the manufacturer-specific (default) photodynamic therapy upstream hydrogen peroxide exposure of the bacteria resulted in a CFU decrease by 4.9 logio-stages, the following default settings performed aPDT downstream H 2 0 2 treatment induced a CFU reduction of about 4 log units.
  • the simultaneous administration of toluidine with H 2 O 2 ( toluene ) according to the invention showed, after photodynamic treatment with LED irradiation, the strongest possible antibacterial effect with a CFU reduction of 8.9 log Io Units to 0, thus demonstrating a maximum antibacterial synergism of the toluidine-H 2 C> 2 mixture on the test microbes.
  • the novel Tol lus formulation (Tol + H 2 O 2 ) according to the invention produced a highly synergistic
  • Different concentrations of toluidine were used in the default and synergistic modes in a range of 0.01% to 00127%, as well as different excitation options of the photosensitizer by two different light emitting diodes (LED) and a laser light source.
  • LED light emitting diodes
  • Exposure time of photosensitizer 60 sec
  • irradiation time 60 sec.
  • the bacterial target group was, as illustrated above, a plankton periodontitis-associated bacterial cocktail (Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemocitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis and Veillonella atypica (Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)).
  • Colony formation CFU / ml
  • the microbial vitality i. the percentage of living in percent was determined by fluorescence labeling with live / dead dyes by fluorescence microscopy.
  • Table 8 log CFU / ml of the Paro-Cocktails after photodynamic therapy with strictlyan (FS), PadPlus (PP) and PACT; aPDT: conventional photodynamic therapy, aPDT plus : modification according to the invention, log CFU reduction is the reduction of the CFU after treatment of the samples in comparison to the saline control
  • Table 9 Vitality (%) of the Paro-Cocktail after photodynamic therapy with strictlyan (FS), PadPlus (PP) and PACT; aPDT: Conventional photodynamic therapy, aPDT plus : modification according to the invention, log Vit reduction is the reduction of vitality after treatment of the samples in comparison to the saline control
  • Table 10 log CFU / mm 2 of the paro biofilm after photodynamic therapy with strictlyan (FS) and PACT; aPDT: conventional photodynamic therapy, aPDT lus : modification according to the invention, * log CFU reduction is the reduction of the CFU after treatment of the samples in comparison to the saline control
  • the antibacterial efficacy of the PDT systemsutzan and PACT in the default mode on the PA biofilms amounts to a statistically significant CFU reduction of 1.98 log units for photos and with 0.51 log units for PACT to a non-statistical one significant reduction (Table 10).
  • the biofilm treatment with the aPDT plus method modified according to the invention achieved statistically highly significant CFU reductions of 5.06 log units with the furnishan system and 4.51 log units after PACT application compared to the negative control and also to the aPDT-related data.
  • This result demonstrates that the toluidine supplementation according to the invention has an antibacterial effect which is clearly superior to the default mode of the systems, not only on plankton but also on the periodontitis pathogens which have become more resistant to biofilm formation.
  • Table 1 1 Vitality of the Paro biofilm after photodynamic therapy with predominantly (FS) and PACT; aPDT: Conventional photodynamic therapy, aPDT plus : modification according to the invention, log Vit reduction is the reduction of vitality after treatment of the samples in comparison to the saline control
  • Combination of toluidine blue and H 2 0 2 represents a further development and highly synergistic optimization of antimicrobial photodynamic therapy using a light source.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung zweier Komponenten in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie (aPDT), eine im Rahmen der aPDT einsetzbare pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels aPDT.

Description

Antimikrobielle photodynamische Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung zweier Komponenten in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie (aPDT), eine im Rahmen der aPDT einsetzbare pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels aPDT.
Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT), auch photoaktivierte Desinfektion genannt, handelt es sich um eine in der Medizin etablierte adjuvante, nicht invasive und schmerzfreie Methode, um selektiv Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, biologische Zellen oder Moleküle, durch Lichtinduktion eines geeigneten photosensiblen Farbstoffes, der als Photosensitizer bezeichnet wird, zu inaktivieren. Dabei wird der photosensible Farbstoff nach lokaler Applikation und Bindung an die Zielstrukturen unter spezifischer Lichtanregung, beispielsweise mittels LED oder Laser, über Photonenabsorption in einen Triplettzustand überführt. Über zwei verschiedene Reaktionsmechanismen, Typ I oder II, können durch Elektronentransferreaktionen lokal Sauerstoffradikale (Singu- lettsauerstoff) und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS) entstehen, die die farbstoffmarkierten Zielstrukturen irreversibel zerstören, wobei das umliegende Gewebe verschont bleibt.
[0003] Neben vielfältigen Anwendungen bei Tumorbehandlungen oder in der Dermatologie spielt die aPDT in der Zahnmedizin in Ergänzung zu herkömmlichen klinischen Behandlungsmethoden mittlerweile eine wesentliche Rolle. Die Hauptanwendung der aPDT bei oralen bakteriellen Infektionen liegt in der Dekontamination der Zahnwurzeloberfläche in der Parodontologie bzw. der Implantatoberfläche in der Implantologie und bei Infektionen des endodontischen Systems, die eine Wurzelkanalbehandlung erfordern. Bei infizierten Schleimhautarealen sowie in der Kariologie, kommt diese gewebeschonende Methode ebenfalls zum Einsatz.
[0004] Neben der antibakteriellen Wirkung induziert der photobiologische Effekt der
Bestrahlungsquelle selbst positive klinische Ergebnisse wie Entzündungshemmung, verbesserte Wundheilung und auch eine analgetische Wirksamkeit. Die aPDT ist klinisch einfach durchführbar, es fehlt weitgehend an Nebenwirkungen, Resistenzen oder Allergien. Die aPDT stellt deshalb häufig eine mögliche Alternative zu der Verabreichung von Antibiotika dar.
In der zahnmedizinischen aPDT kommen verschiedene Photosensitizer in Kombination mit unterschiedlichen Bestrahlungsquellen zum Einsatz, wie beispielsweise Toluidinblau bzw. Toloniumchlorid, Methylenblau oder Indocyaningrün; vgl. Hopp und Biffar (2013), Photodynamische Therapie - Blau vs. Grün, Laser Journal 1 :14-25.
Auf dem deutschen Markt werden verschiedene kommerzielle aPDT-Systeme angeboten, wie beispielsweise "Fotosan 630" der Firma CMS Dental, Kopenhagen, in denen Toluidinblau in einer 0,01 %-igen Lösung und eine LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 630 nm eingesetzt werden. Ein weiteres System mit der Bezeichnung "Helbo" von Bre- dent Medical, Senden, setzt eine 1 %-ige Methylenblaulösung und einen Laser mit einer Wellenlänge von 660 nm ein. Das System "PadPlus" von Orange Dental GmbH, Biberach, setzt Toloniumchlorid in einer 0,00127 %-igen Lösung und eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 635 nm ein. Das System "PACT" von Cumdente GmbH, Tübingen, setzt Toluidinblau in einer 0,005 %-igen Lösung und einen Laser mit einer Wellenlänge von 635 nm ein.
Garcez et al. (2010), Antimicrobial mechanism behind photodynamic effect in the presence of hydrogen peroxide, Photochem. Photobiol. Sei. 10:483-490, beschreiben die gleichzeitige Anwendung von Methylenblau und H202 in der photodynamischen Therapie bzgl. einiger pathogener Mikroorganismen. Diese Studie zeigt, dass die Anwendung von Methylenblau mit jeweils 10-minütiger Expositionszeit zu einer CFU-Reduktion von 0,5 log-ιο Einheiten, und die Anwendung einer Kombination von Methylenblau und H202 und Laser zu einer CFU-Reduktion von 1 ,8 log-ιο Einheiten führte. Die der aPDT vorgeschaltete H202-Behandlung bewirkte eine CFU-Reduktion von 1 ,4 log-io-Stufen und die nachgeschaltete H202-Behandlung hingegen eine stärkere Koloniereduktion um 2,8 log-ιο Einheiten. Die in dieser Studie eingesetzten Ausgangs-CFU-Äquivalente lagen im Bereich von ca. 107/ml. Die Erfinder waren nicht in der Lage, die in diesem Dokument dargestellten experimentellen Ergebnisse zu reproduzieren. [0009] Lins et al. (2013), Enhancement of antimicrobial action of photodynamic therapy in the presence of hydrogen peroxide, in: Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education, Herausgeber: A. Mendez-Vilas, Formatex Research Center, Vol. 1 :367-371 , beschreiben Experimente, in denen Bakterien zunächst nacheinander für 2 Minuten mit 20 μΙ Methylenblau behandelt wurden, dann für 10 Minuten an 20 μΙ H202 exponiert und anschließend mittels eines Lasers bestrahlt wurden. Die Ergebnisse erbrachten eine CFU-Reduktion, aber bei E. faecalis konnte keine Totalel- iminierung festgestellt werden.
[0010] McCullagh und Robertson (2006), Photo-dynamic biocidal action of methylene blue and hydrogen peroxide on the cyanobacterium Synechococcus leopoliensis under visible light Irradiation, J. Photochem. Photobiol. B. 83:63-68, beschreiben eine kombinierte Methyl- enblau-H202-Anwendung in der aPDT auf ein Cyanobakterium im Rahmen von biologischer Gesteinszersetzung. Die Applikation von Methylenblau und H202 resultierte in einer Fluoreszenzabnahme eines spezifischen Pigments nach einer Belichtungsdauer von 90 bis 240 Minuten. Bei diesen Ergebnissen ist weder das Cyanobakterium noch die Bestrahlungsdauer oder das Fluoreszenzmaß in irgendeiner Weise auf das Verfahren der aPDT, wie es für die Klinik vorgesehen ist, übertragbar.
[0011] Stojicic et al. (2013), Ex vivo killing of Enterococcus faecalis and mixed plaque bacteria in planktonic and biofilm culture by modified photoactivated disinfection, Int. Endod. J.
46:649-659, beschreiben eine zahnmedizinische Studie ex vivo, die Enterococcus faecalis und Plaquebakterien hinsichtlich konventioneller aPDT und einer modifizierten photodynamischen Therapie untersuchte. Die modifizierte aPDT bestand aus Mehrfachkombinationen von Methylenblau: mit niedrig dosiertem Chlorhexidin (CHX, 0,05 %) und Wasserstoffperoxid (0,5 %), einer Kombination aus Methylenblau, CHX und H202, einer Kombination aus Methylenblau, EDTA und H202 oder eine Kombination aus Methylenblau, CHX und EDTA mit Laserbestrahlung. Die antibakterielle Wirksamkeit der Kombination mit H202 war auf planktone Mikroorganismen nach der Auffassung der Autoren geringer als die Kombination von Methylenblau, CHX und EDTA. Allerdings ist die Kombination von CHX, EDTA und H202 im Zusammenhang mit Laserlichtanregung wegen der unbekannten Wechselwirkungen der verschiedenen reaktiven Gruppen mit dem Photosensitizer toxikologisch bedenklich im Hinblick auf einen klinischen Einsatz am Patienten. Eick et al. (2013), Effect of photoactivated disinfection with a light-emitting diode on bacterial species and biofilms associated with Periodontitis and peri-implantitis, Photodi- agnosis Photodyn. Ther. 10:156-167, beschreiben die Verabreichung von H202 und anschließend nach 1 Minute die Durchführung einer aPDT mit Toluidinblau. In dieser Studie wurden parodontalpathogene Einzelkeime und Bakteriengemische für die aPDT im Rahmen des Fotosan-Systems eingesetzt. Die Reduzierung der Bakterien war dabei zwar messbar, jedoch nach wie vor nicht zufriedenstellend.
Die WO 2009/123575 offenbart eine photosensibilisierende Zusammensetzung zur Behandlung von dentalen mikrobiellen Infektionen. Diese enthält entweder Perfluorode- cahydronaphthalen als Sauerstoffträger, H202 als oxidierenden Agens und Tween X100 als Surfactant [ET2, ET6], oder nur Perfluorodecahydronaphthalen (als Sauerstoffträger) und H202 (als oxidierendes Agens) [Sol A+B] oder Perfluorodecahydronaphthalen (als Sauerstoffträger) allein [Sol A].
Die WO 2013/177674 beschreibt eine Apparatur zur Anwendung in der Phototherapie. Experimentelle Daten werden nicht offenbart.
Eine aktuelle Metaanalyse konnte für die Parodontalbehandlung bei der klinischen Anwendung der photodynamischen Therapie in Ergänzung zur konventionellen mechanischen Behandlung durch Scaling bzw. Wurzelglättung einen, wenn auch geringen und kurzfristigen, so doch messbaren Vorteil zeigen; vgl. Sgolastra et al. (2013), Adjunctive photodynamic therapy to non-surgical treatment of chronic Periodontitis: a systematic review and meta-analysis, J. Clin. Periodontol. 40: 514-526.
Weitere kontrollierte klinische Studien mit Patienten mit chronischer Parodontitis haben jedoch gezeigt, dass durch den zusätzlichen Einsatz der aPDT keine statistisch signifikanten Unterschiede der klinischen Parameter, wie der Blutung nach Sondierung (BOP), dem Plaque-Index (PI) und dem Gingiva-Index (Gl) oder der Mikrobiologie, nachzuweisen waren; vgl. Christodoulides et al. (2008), Photodynamic therapy as an adjunct to non- surgical periodontal treatment: a randomized, controlled clinical trial, J. Periodontol. 79: 1638-1644; Polansky et al. (2009), Clinical effectiveness of photodynamic therapy in the treatment of Periodontitis, J. Clin. Periodontal. 36: 575-580; Theodora et al. (2012), Clinical and microbiological effects of photodynamic therapy associated with nonsurgical periodontal treatment. A 6-month follow-up, Lasers Med. Sei. 27: 687-693.
Ein Review über die Wirksamkeit der photodynamischen Therapie auf Enterococcus faecalis in infizierten Wurzelkanälen zieht aus den Ergebnissen von 17 Studien, die zum Teil klinische Verbesserungen durch aPDT nachweisen, außerdem das Fazit, dass die Effizienz dieser Therapie hinsichtlich der Eliminierung der Bakterien in Wurzelkanälen zweifelhaft bleibt; vgl. Siddiqui et al. (2013), Bactericidal efficacy of photodynamic therapy against Enterococcus faecalis in infected root canals: a systematic literature review, Photodiagnosis Photodyn. Ther. 10: 632-643.
Die Limitation dieser grundsätzlich vorteilhaften Methode zeigt sich somit in der insuffizienten Abtötung von Mikroorganismen. Ursächlich können die mechanisch sehr stabilen Zellwände einiger Bakterien, wie zum Beispiel Enterokokken und Streptokokken, sein, die eine Aufnahme des Photosensitizers erschweren und damit den lichtinduzierten Abtötungsmechanismus außer Kraft setzen.
Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die bisher existierenden Behandlungskonzepte der aPDT weiter zu entwickeln und dabei deren Wirksamkeit zu verbessern. Insbesondere soll das Problem der insuffizienten Abtötung von Mikroorganismen reduziert oder ggf. sogar gelöst werden.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Toluidinblau und H202 in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie gelöst.
Toluidinblau, auch als Toloniumchlorid bezeichnet, hat die Summenformel Ci5H16CIN3S, die CAS-Nr. 92-31 -9. Es weist eine molare Masse von 308,85 g pro Mol auf.
Wasserstoffperoxid hat die Summenformel H202, die CAS-Nr. 7722-84-1 und weist eine molare Masse von 34,02 g pro Mol auf. [0023] Erfindungsgemäß bedeutet "zeitgleiche Verabreichung", dass das Toluidinblau und H202 nicht hintereinander, wie bspw. bei Eick et al. (a.a.O.) sondern zur gleichen Zeit verabreicht werden, wobei ein minimaler Zeitversatz von < 60 Sekunden, vorzugsweise < 30 Sekunden, vorzugsweise < 20 Sekunden, vorzugsweise < 10 Sekunden, vorzugsweise < 5 Sekunden, vorzugsweise < 4 Sekunden, vorzugsweise < 3 Sekunden, vorzugsweise < 2 Sekunden, vorzugsweise < 1 Sekunde, bzw. keinerlei Zeitversatz umfasst sind.
[0024] Dabei können nach einer Ausführungsvariante das Toluidinblau und H202 in jeweils
getrennten Lösungen vorliegen und verabreicht werden, oder aber nach einer alternativen Ausführungsvariante in einer gemeinsamen Lösung vorliegen und verabreicht werden.
[0025] Erfindungsgemäß umfasst eine "Infektion" nicht nur das Eindringen von Mikroorganismen, sondern auch das Vorherrschen bzw. Vorhandensein von Mikroorganismen, beispielsweise in Flüssigkeiten eines Lebewesens, wie dem Speichel.
[0026] Unter "Behandlung" wird erfindungsgemäß jede Einwirkung auf die Mikroorganismen verstanden, die das Ziel hat, deren Lebensfähigkeit und/oder Vermehrung zu inhibieren oder zu vermindern.
[0027] Erfindungsgemäß umfasst die "photodynamische Therapie" die Anwesenheit einer
Lichtquelle, die geeignet ist, das Toluidinblau anzuregen, um Sauerstoffradikale bzw. oxigenierte reaktive Moleküle zu bilden. Beispielsweise handelt es sich bei der Lichtquelle um Laserdiode, bspw. mit einer Wellenlänge von ca. 630-650 nm, oder eine Leuchtdiode (LED), bspw. mit einer Wellenlänge von ca. 560 bis 640 nm. Besonders geeignet ist eine LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 630 nm. Die Bestrahlungsdauer beträgt dabei vorzugsweise ca. 10 bis ca. 120 Sekunden, vorzugsweise ca. 60 Sekunden.
[0028] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
[0029] Die Erfinder haben erkannt, dass die zeitgleiche Verabreichung von Toluidinblau und
H202 in Gegenwart einer Lichtquelle, wie beispielsweise einer Laser- oder LED- Lichtquelle mit 630 nm, zu einer signifikanten Reduzierung der Lebensfähigkeit von Mikroorganismen führt. Dabei war besonders überraschend und auffällig, dass die Kombination von Toluidinblau und H202 nicht nur in einer additiven sondern in einer synergistischen Wirkverstärkung resultiert.
[0030] Die Erfinder konnten nachweisen, dass die erfindungsgemäße Verwendung, die von den
Erfindern als "aPDTpuls" bezeichnet wird, deutlich bessere Ergebnisse liefert als die konventionelle aPDT, in der üblicherweise die Photosensitizer Methylenblau und/oder Toluidinblau ohne Zusatz von H202 zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäße zeitgleiche Verwendung von Toluidinblau und H202, die von den Erfindern auch als "Tol lus" bezeichnet wird, liefert nach Erkenntnissen der Erfinder auch wesentlich bessere Ergebnisse als die zeitversetzte Verabreichung von H202 und Toluidinblau, wie bspw. bei Eick et al. (a.a.O.), oder die zeitversetzte Verabreichung von Methylenblau und H202. Außerdem werden durch die erfindungsgemäße zeitgleiche Verwendung von Toluidinblau und H202 überraschenderweise wesentlich bessere Ergebnisse erzielt als durch eine zeitgleiche Verabreichung von Methylenblau und H202.
[0031] Es versteht sich, dass nach und/oder vor der Verabreichung von Toluidinblau und H202
Vor- bzw. Nachbehandlungen durchgeführt werden können, bspw. mit Substanzen, die den Sauerstoffeintrag erhöhen, wie Kofaktoren, und Katalysatoren für die verstärkte Generierung phototoxisch induzierter Radikale bei der aPDT, und/oder Substanzen, die weitere synergistisch wirksame antibakterielle Effekte induzieren. Infrage kommen hierfür bspw. Vor- bzw. Nachbehandlungen mit H202, Substanzen, die den pH-Wert der lokalen Umgebung verändern, antiseptische Lösungen wie Chlorhexidinlösungen, antibakterielle Enzyme, die die Zellwand der Bakterien angreifen und ggf. die Penetration des Toluidin- blaus erhöhen, etc.
[0032] Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung erfolgt eine zeitgleiche
Verabreichung einer ersten Lösung von > ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.-%, und weiter vorzugsweise
< ca. 1 Gew.-% Toluidinblau, und einer zweiten Lösung von > ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,3 Gew.-%, höchst vorzugsweise von ca. 3 Gew.-%, und weiter vorzugsweise von < ca. 5 Gew.-% H202.
[0033] Angegeben sind jeweils Endkonzentrationen. Wie die Erfinder feststellen konnten, ist selbst bei sehr hoher Verdünnung von Toluidinblau bzw. H202 aufgrund des überraschenden Synergismus noch eine antibakterielle Wirksamkeit feststellbar, wobei sich die angegebenen Konzentrationen als besonders vorteilhaft herausgestellt haben.
[0034] Nach einer bevorzugten Weiterbildung werden Toluidinblau und H202 in Form einer
einzigen Zusammensetzung verabreicht, die
Toluidinblau in einer Konzentration von > ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von > ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, und weiter vorzugsweise von < ca. 32378 Mikromol/Liter (= 1 Gew.-%), und
H202 in einer Konzentration von > ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von > ca. 88,2 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 882 Millimol/Liter, und weiter vorzugsweise von < ca. 1470 Millimol/Liter (= 5 Gew.-%). enthält.
[0035] Angegeben sind jeweils Endkonzentrationen. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine zeitgleiche Verabreichung gewährleistet ist. Die Zusammensetzung kann entweder unmittelbar vor der Verabreichung oder aber, alternativ, zu einem früheren Zeitpunkt hergestellt werden. Die Erfinder haben festgestellt, dass aufgrund des synergistischen Effektes eine Wirkung bei bereits sehr niedrigen Konzentrationen von Toluidinblau und/oder H202 beobachtet wird. Die angegebenen Konzentrationen haben sich dabei als besonders geeignet herausgestellt.
[0036] Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt das Toluidinblau und/oder H202 in einer wässrigen Lösung, beispielsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vor.
[0037] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass geeignete Trägermedien für Toluidinblau bzw.
H202 zum Einsatz kommen, die eine unproblematische Anwendung am Patienten erlauben. Die Kochsalzlösung kann beispielsweise eine physiologische bzw. isotonische Kochsalzlösung sein, die ca. 9 g Natriumchlorid pro Liter Wasser aufweist.
[0038] Es versteht sich, dass das Toluidinblau und/oder H202 bzw. die diese enthaltenen
Lösungen bzw. Zusammensetzungen in steriler Form bereitgestellt werden können.
[0039] Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei der Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen um die Behandlung einer oralen Infektion eines Lebewesens, vorzugsweise eines Menschen, durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen.
[0040] Wie die Erfinder zeigen konnten, ist die erfindungsgemäße Verwendung besonders für zahnmedizinische Anwendungen geeignet und liefert dort gute Ergebnisse.
[0041] In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Mikroorganismen ausgewählt aus
Paradontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus:
Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypica und oder aus endodontischen Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Por- phyromonas gingivalis; und/oder aus
Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
[0042] Die Erfinder konnten belegen, dass die erfindungsgemäße Verwendung gegenüber den vorstehend genannten zahnmedizinisch hochrelevanten Mikroorganismen besonders gute Ergebnisse liefert.
[0043] Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H202 zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
[0044] Die Vorteile, Merkmale und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gleichermaßen.
[0045] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Behandlung einer
Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, wobei das Kit einen ersten Behälter enthaltend eine vorzugsweise wässrige Lösung von Toluidinblau, und einen zweiten Behälter enthaltend eine vorzugsweise wässrige Lösung von H202 aufweist.
[0046] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der erfindungsgemäße Photosensitizer und
Wirkverstärker H202 separat bereitgestellt werden und beispielsweise unmittelbar vor der Behandlung gemischt und die gewünschten Konzentrationen eingestellt werden können. Der ggf. begrenzten Stabilität der Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H202 wird damit Rechnung getragen. Es versteht sich, dass das Kit weitere Gegenstände, Reagenzien, Chemikalien etc.
enthalten kann. Das Kit kann ferner eine Lichtquelle enthalten, wie eine LED- oder Laserlichtquelle, die eine beliebige Wellenlänge emittiert, wie beispielsweise 630 nm.
Die Merkmale, Vorteile, Eigenschaften und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für das erfindungsgemäße Kit gleichermaßen.
Nach einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Kits weist der erste Behälter eine erste Auslassöffnung und der zweite Behälter eine zweite Auslassöffnung auf, und die erste und zweite Auslassöffnung sind miteinander flüssigkeitsdicht und ggf. luftdicht verbindbar.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Inhalt des ersten Behälters in den zweiten Behälter, oder umgekehrt, überführbar ist, ohne dass es zu einer Kontamination kommen kann. Die Konzentrationen von Toluidinblau und H202 in dem ersten bzw. zweiten Behälter sind dabei so voreingestellt, dass nach dem Mischen der beiden Flüssigkeiten die gewünschten Endkonzentrationen vorliegen.
Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung des Kits ist der erste Behälter eine Spritze und der zweite Behälter eine Spritze, wobei die erste und zweite Spritze an ihrer jeweiligen Auslassöffnung ein Außengewinde aufweist und die zweite oder erste Spritze an ihrer Auslassöffnung ein zu dem Außengewinde komplementäres Innengewinde aufweist, wobei das Kit optional zusätzlich eine Kanüle mit einem Gewinde aufweist, das komplementär zu dem Außengewinde und/oder Innengewinde ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein einfach zu handhabendes Zweikomponentensystem bereitgestellt wird. Dieses kann beispielsweise am Behandlungsstuhl ("chairside") während der Behandlung zum Einsatz kommen. Vor der Applikation werden beide vordosierten Komponenten über einen Schraubverschluss miteinander verbunden und die beiden, vorzugsweise sterilen Lösungen gleichmäßig vermischt. Nach Befüllen der einen Spritze kann die Endlösung mittels einer Kanüle, vorzugsweise einer stumpfen Kanüle, im Rahmen der photodynamischen Therapie direkt am Patienten zum Beispiel in parodontale Taschen oder Wurzelkanäle appliziert werden. Ein derartiges Kit ist - zu anderen Zwe- cken - im Stand der Technik beschrieben, bspw. in der WO 01/51024, deren Inhalt durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist. Ein solches Kit wird für die Verabreichung des Lokalantibiotikums "Atridox" eingesetzt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellen einer wässrigen Lösung von Toluidinblau und einer wässrigen Lösung von H202;
2. Zeitgleiche Verabreichung der Lösungen aus Schritt (1 ) in ein Lebewesen, und
3. Bestrahlen der einbrachten Lösungen mit einer Lichtquelle zur Induktion einer photodynamischen Reaktion des Toluidinblaus unter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies.
Es versteht sich, dass die in Schritt 1 bereitgestellten Lösungen auch durch eine Lösung verwirklicht werden können, die sowohl das Toluidinblau als auch das H202 in den gewünschten Konzentrationen enthält. Erfindungsgemäß umfassen "reaktive Sauerstoffspezies" Sauerstoffradikale (Singulettsauerstoff) und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS), die durch Elektronentransferreaktionen entstehen. Das Einbringen in Schritt (2) kann in infizierte Bereiche, zum Beispiel Zahnfleisch- und Knochentaschen, Wundflächen oder Wurzelkanäle erfolgen.
Sämtliche Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und des erfindungsgemäßen Kits gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen. Insbesondere die eingangs genannten Vor- und/oder Nachbehandlungen können vor bzw. nach Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen. [0056] In der gesamten Anmeldung steht "ca." für circa und umfasst Werte, die im Bereich von ± 10%, vorzugsweise ± 5%, vorzugsweise ± 3%, vorzugsweise ± 2%, vorzugsweise ± 1 %, des konkret angegebenen Wertes liegen.
[0057] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu
erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0058] Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Es versteht sich, dass einzelne Merkmale der Ausführungsbeispiele isoliert zur Spezifizierung, Klarstellung, Weiterbildung oder Verallgemeinerung der Erfindung herangezogen werden können. In den Ausführungsbeispielen wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 : Prinzip der photodynamischen Therapie;
Fig. 2: Modell eines kommerzialisierten Zweikomponenten-Photosensitizers;
Fig. 3: Übersicht der konventionellen aPDT nach Firmenvorgabe. Fotosan: Toi und LED;
Helbo: Met (1 %; 0,01 %) mit NaCI und Laser auf Paro-, Endo- und Kariesassoziierte Bakterien (log CFU/ml) mit Kochsalzkontrolle (NaCI) (mean, Clu, Cll: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
Fig. 4: Tol lus (Tol+H202) - Synergismus sowie konventionelle aPDT (Toi), Kochsalz- bzw.
H202-Kontrollen an Paro-Cocktail-Bakterien (mean, Clu, Cll: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
Fig. 5: Paro-Cocktail - konventionelle aPDT (Toi) und Tolplus (Tol+H202) (mean, Clu, Cll:
Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls); Fig. 6: Endo-Cocktail - konventionelle aPDT (Toi), H202 Vorbehandlung mit aPDT und Tolplus (Tol+H202) (mean, Clu, CM: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
Fig. 7: Kario-Cocktail - konventionelle (Toi) sowie H202 Vorbehandlung mit aPDT und
Tolplus (T0I+H2O2) (mean, Clu, CM : Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
Fig. 8: Farbstoff- und Systemvergleich von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo) in Kombination mit H202 (Tolplus [Tol+H202] und Metplus [Met+H202]) an parodontal- pathogenen Bakterien (mean, Clu, CM: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
Fig. 9: Verdünnungsversuche (Original Tol lus, Met lus, Endkonzentrationen je 0,009 %) und 4 Verdünnungsstufen: 0,0009 %, 0,00009 %, 0,000009 %, 0,0000009 %) von Toi (rot, Fotosan) und Met (blau, Helbo) in Kombination mit H202 in der aPDT lus am Paro-Cocktail (mean, Clu, CM: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls).
Ausführungsbeispiele
1 . Prinzip der photodynamischen Therapie
Das Prinzip der photodynamischen Therapie ist in der Fig. 1 dargestellt. A:
Photonenabsorption, F: Fluoreszenzemission, H: Wärme, ISC: intersystem crossing, Übergang eines Elektrons von einem elektrisch angeregten Energieniveau in ein schwin- gungsangeregtes, elektronisches Energieniveau unter Spinumkehr, Beispiel: Übergang von Singulett- in Triplettzustand, P: Phosphoreszenz (aus: Dissertation: Fernanda Pereira Gonzales 2013, Fakultät für Chemie und Pharmazie der Universität Regensburg, "Photo- dynamic inactivation of microbial biofilms: impact of Hsp70 expression and non-invasive optical monitoring of oxygen during photodynamic inactivation"). [0060] Der photosensible Farbstoff bzw. Photosensitizer wird nach lokaler Applikation und
Bindung an die Zielstrukturen, hier Bakterien- bzw. Pilzmembranen oder -zellwände, unter spezifischer Lichtanregung über Photonenabsorption in einen Triplettzustand überführt. Bei Reaktionen vom Typ I oder II können durch Elektronentransferreaktionen lokal Sauerstoffradikale, beispielsweise Singulett-Sauerstoff, und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS, reactive oxygen species) entstehen, die die mit dem photosensiblen Farbstoff markierten Membranen oder Zellwände der Mikroorganismen irreversibel zerstören.
2. Beispiel für ein geeignetes Applikationssvstem
[0061] In der Fig. 2 ist ein Beispiel für ein geeignetes Applikationssystem dargestellt. Das
Toluidinblau und das H202 werden jeweils steril in Spritzen bereitgestellt. Dabei werden die Konzentrationen so gewählt, dass bei vollständigem Vermischen die gewünschten Endkonzentrationen, beispielsweise 0,009 Gew.-% (= 291 Mikromol pro Liter) Toluidinblau und 3 % (= 882 Millimol pro Liter) H202 vorliegen. In dem Beispiel weist die das Toluidinblau enthaltende Spritze an ihrer Auslassöffnung bzw. Düse ein Innengewinde auf, die das H202 enthaltende Spritze weist an ihrer Auslassöffnung bzw. Düse ein hierzu komplementäres Außengewinde auf. Die Gewindegestaltung kann auch anders herum erfolgen. Beide Spritzen sind verschlossen. Die Spritzen können vor der Verwendung miteinander verschraubt werden. Durch die Verschraubung werden die verschlossenen Spritzen an ihren Auslassöffnungen geöffnet und die beiden Komponenten können gemischt werden. Dazu werden abwechselnd die Stempel beider Spritzen betätigt und anschließend die Mischung in eine Spritze, im vorliegenden Beispiel in die ursprünglich das Toluidinblau enthaltende Spritze, überführt. Nun wird die leere ursprünglich das H202 enthaltende Spritze entfernt. Auf die die vollständig gemischte Zusammensetzung enthaltende Spritze wird eine stumpfe Kanüle aufgeschraubt. Die Zusammensetzung kann nunmehr direkt beispielsweise einem Patienten verabreicht werden. 3. Experimenteller Nachweis der svnergistischen Wirkungsweise von Toluidinblau
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Optimierung eines bereits kommerziell erhältlichen Systems zur photodynamischen Therapie (Fotosan 630 CMS Dental). Durch die neue Veränderung des eingesetzten Photosensitizers Toluidinblau (Toi) zu einem Zweikomponenten-Photosensitizer bestehend aus Toluidinblau und H202 (Tol lus), die vorzugsweise aus Stabilitätsgründen unmittelbar vor dem Einsatz gemischt und in einem Applikationsschritt eingesetzt werden, wird eine hochsynergistische antimikrobielle Wirkungsverstärkung mit einer maximalen Keimzahlreduktion (CFU = 0) erreicht.
Da die photodynamische Therapie auf mikrobielle Reinkulturen einen stärkeren antibakteriellen Effekt aufweist, wie auch eigene Ergebnisse der Erfinder belegen, in der klinischen Situation in der Mundhöhle aber immer komplexe Bakteriengemische vorhanden sind, wurden gemischte Bakterienkulturen zur Wirksamkeitstestung verwendet.
Für die konventionelle antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) und die erfindungsgemäße antimikrobielle photodynamischer Therapie (aPDTplus) wurden folgende mikrobielle planktone Testsysteme eingesetzt:
A. Repräsentativer Bakterien-Cocktail aus Paradontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen:
Streptococcus gordonii (Sg, ATCC 3339), Aggregatibacter actinomycetemcomitans {Aa, ATCC 43718), Actinomyces viscosus {Av, DSM 43798), Fusobacterium nucleatum (Fn, ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis {Pg, ATCC 33277), Veillonella atypica {Va, ATCC 17744). Die CFU-Anzucht (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 5 Tage unter anaeroben Bedingungen. B. Repräsentativer Bakterien-Cocktail aus endodontischen, Wurzelkanalinfektions- assoziierten Mikroorganismen:
Enterococcus faecalis (Ef, ATCC 19433), Actinomyces naeslundii {An, ATCC 19039), Fusobacterium nucleatum (Fn, ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (Pg, ATCC 33277). Die CFU-Anzucht (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 5 Tage unter anaeroben Bedingungen.
C. Repräsentativer kariogener Bakterien-Cocktail: humaner Nativ-Speichel mit gleichen Anteilen von Streptococcus mutans (Sm, ATCC 25175). Die CFU-Anzuchtzeit (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 2 Tage unter anaeroben Bedingungen.
Die Ausgangsgesamtzellzahlen der für die aPDT/aPDTplus eingesetzten
Bakteriengemische betrugen durchschnittlich 2,3 x 109/ml, d.h. es wurden Keimzahlen eingesetzt, die den im Mund vorkommenden Bakteriengemischen entsprechen oder darüber liegen, um bei klinisch relevanten Bakterienlasten maximale antibakterielle Effizienzen zu evaluieren.
Für die Durchführung der photodynamischen Therapie wurden zwei kommerzielle
Systeme mit den zugehörigen Bestrahlungsquellen eingesetzt: Fotosan 630 (Toluidinblau; LED 630 nm) und Helbo (Methylenblau; Laser 660 nm).
Während bei Fotosan Toluidinblau als Farbstoff nach Herstellervorgabe in der
Konzentration 0,01 % verwendet wird, ist bei Helbo Methylenblau in 100-facher Konzentration (1 %) als Photosensitizer integriert. Aufgrund der hohen Farbstoffdichte schreibt die Helbo-Herstelleranweisung im Gegensatz zum Fotosan-System nach Bindung des Methylenblaus an die Zielzellen vor der Laserbestrahlung einen Spülschritt mit Kochsalzlösung vor, um eine Verschattung des Laserlichts und damit eine Beeinträchtigung des antibakteriellen photodynamischen Effektes zu vermeiden. In den von den Erfindern durchgeführten systemvergleichenden Versuchen wurden deshalb parallel zum Fotosan- System mit Toluidin (0,01 % Ausgangskonzentration, 0,009 % Endkonzentration in Tol lus) das Methylenblau des Helbo-Systems unverdünnt (1 %) (nach Herstellerangabe), zusätzlich in 0,01 % Ausgangskonzentration, 0,009 % Endkonzentration in Metplus sowie im Verdünnungsversuch in weiteren gleichen Konzentrationen wie jenen des Toluidins getestet.
[0071] Die Statistik der experimentellen Daten wurde nach log-io-Transformation der CFU/ml- Werte mittels ANOVA-Analyse und Tukey-Kramer-Test durchgeführt. Die Ergebnisse in den zugehörigen Figuren geben die Mittelwerte mit den entsprechenden 95 %-igen Konfidenzintervallen (Clu: obere Grenze; Gl: untere Grenze) wieder. Die Anzahl der Versuche lag zwischen n=15 (Fig. 4), n=10 (Fig. 3, 5-8) und n=3 (Fig. 9).
3.1 Antimikrobielle Wirkung der aPDT mit herstellerspezifischer Anwendungsvorschrift (default) auf Paradontitis-ZPeriimplantitits- (Paro), Wurzelkanalinfektions- (Endo) und Karies- (Kario) assoziierte Mikroorganismen
(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Fn, Pg, Va; siehe vorstehend unter A) (Endo-Cocktail bestehend aus Ef, An, Fn, Pg; siehe vorstehend unter B)
(Kario-Cocktail bestehend aus humanen Speicherbakterien und Sm; siehe vorstehend unter C)
(Fig. 3)
[0072] Bei der default-Anwendung der photodynamischen Therapie nach Herstellervorgaben von
System 1 (Fotosan) und 2 (Helbo) auf Parodontitis-/Periimplantitis-, Wurzelkanalinfektions- und Karies-assoziierte Bakterien, wichen die mikrobiologischen Ergebnisse der meisten Proben deutlich von den herstellerspezifischen prognostizierten antibakteriellen Erfolgsquoten von 99 % logio CFU-Reduktion ab. [0073] Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 und in der Tabelle 1 dargestellt.
Figure imgf000020_0001
Tabelle 1
[0074] Insgesamt zeigt die aPDT des Fotosan-Systems mit Toluidin die bessere antibakterielle
Wirksamkeit im Vergleich zum Helbo-System mit Methylenblau. Auf Parodontitis- assoziierte Bakterien bewirkte die aPDT mit Toluidin eine log-ιο CFU-Reduktion von 99 % (2,07 log10 CFU-Einheiten), auf Wurzelkanalinfektions- und Karies-assoziierte Bakterien eine Reduktion von 85 % (1 ,71 log CFU-Einheiten) und 88 % (1 ,78 log CFU- Einheiten).
[0075] Die Methylenblau-basierte aPDT von Helbo hingegen zeigte statistisch signifikant
schwächere antibakterielle Aktivitäten: Die Reduktion der log-ιο CFU-Einheiten auf Para- dontitis-assoziierte Mikroorganismen betrug lediglich 29 % (0,59 log-ιο CFU-Einheiten) im Vergleich zur Herstellerangabe von 99 %, die des analog zu Toluidinblau verdünnten Methylenblaus 26 % (0,52 log CFU-Einheiten).
[0076] Die bei endodontischen und kariogenen Erregern im Gegensatz zu parodontalpathogenen
Keimen geringere log-ιο CFU-Reduktion spiegelt die zunehmende Unempfindlichkeit dieser Bakteriengruppen gegenüber der aPDT wider. 3.2 Svnergistische Wirkung des neuen Zweikomponenten-Photosensitizers Tolplus (Tol+HpO?) (Fotosan 630) im aPDT lus-Svstem im Vergleich zum herkömmlichen aPDT-Svstem an Parodontitis-ZPeriimplantitis-assoziierte Mikroorganismen (Paro)
(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(Fig. 4)
Die default-Anwendung an aPDT mit dem reinen Toluidinfarbstoff (Fotosan) nach Herstellervorgabe erbrachte auch in diesen Experimenten eine CFU-Wachstumsreduktion von ca. 2 log-io-Einheiten. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der Fig. 4 und Tabelle 2 dargestellt.
Figure imgf000021_0001
Tabelle 2 Die ausschließliche Wasserstoffperoxid-Behandlung der Bakterien führte nur zu einer CFU-Reduktion von etwa 1 logio-Stufe. Die der herstellerspezifischen (default) photodynamischen Therapie vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Exposition der Bakterien resultierte in einer CFU-Abnahme um 4,9 logio-Stufen, die der nach default-Vorgaben durchgeführten aPDT nachgeschaltete H202-Behandlung induzierte eine CFU-Reduktion von etwa 4 log Einheiten. Die erfindungsgemäße gleichzeitige Verabreichung von Toluidin mit H202 (Tol lus) zeigte nach photodynamischer Behandlung mit LED-Bestrahlung den stärksten überhaupt möglichen antibakteriellen Effekt mit einer CFU-Reduktion von 8,9 log-io Einheiten auf 0 und belegt damit einen maximalen antibakteriellen Synergismus der Toluidin-H2C>2-Mischung auf die Testkeime.
3.3 Effizienzerweiterung des antibakteriellen Wirkungsspektrums der neuen Zweikom- ponenten-Photosensitizer-Rezeptor Tolplus im aPDTplus-System auf zahnmedizinisch relevante Pathogenitätskeimgruppen
3.3.1 Parodontitis-ZPeriimplantitis-assoziierte Mikroorganismen
(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(Fig. 5)
Auf die oben genannte Bakteriengruppe bewirkte die default photodynamische Therapie mit reinem Toluidin eine CFU-Reduktion um 2,1 log-io-Einheiten. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der Fig. 5 und der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt.
Figure imgf000022_0001
Tabelle 3 Die neue Tol lus-Formulierung des Photosensitizers reduzierte unter LED-Bestrahlung das bakterielle Koloniewachstum maximal um 8,9 log-io-Einheiten auf 0. 3.3.2 Wurzelkanal-assoziierte Infektionserreger
(Endo-Cocktail bestehend aus Ef, An, Fn, Pg)
(Fig. 6)
Da gerade bei der Wurzelkanalbehandlung nicht eliminierte und im Wurzelkanalsystem verbliebene Mikroorganismen ein hohes Risiko bezüglich Persistenz und klinischem Misserfolg darstellen, ist die antibakterielle Effizienzverbesserung von hohem Interesse. Das antibakterielle Potential der reinen Toluidin-assoziierten photodynamischen Therapie nach Herstellervorschrift (default) belief sich auf eine CFU-Reduktion von unter einer log-io-Stufe (0,7). Die der default-aPDT vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Behandlung der Bakterien resultierte in einer log-ιο CFU-Reduktion um etwa 4. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der Fig. 6 und Tabelle 4 dargestellt.
Figure imgf000023_0001
Tabelle 4
[0081] Die erfindungsgemäß vorgestellte Photosensitizer-Rezeptur (Tol lus) (Toluidin+H202) im
Rahmen der photodynamischen Therapie bewirkte auch bei dieser Bakteriengruppe eine hochsynergistische Wirkungsverstärkung und maximal mögliche log-ιο CFU-Reduktion um 7,9 Einheiten auf 0.
[0082] Bei diesem Keimspektrum ist für die vollständige Dekontamination eine der aPDTplus vorgeschaltete, zusätzliche Wasserstoffperoxid-Exposition der Bakterien erforderlich. Klinisch erfolgen im Verlauf der Wurzelkanalaufbereitung in Ergänzung zur mechanischen Bearbeitung der Kanalwände wiederholte Spülschritte, so dass eine der photodynamischen Therapie (aPDTplus) vorausgehende H202-Spijlung gut integrierbar ist.
3.3.3 Karies-assoziierte Speichelbakterien
(Kario-Cocktail bestehend aus humanen Speichelbakterien und Sm)
(Fig. 7)
Bei der Behandlung kariöser Läsionen kommt die photodynamische Therapie zur Desinfektion der Kavität adjuvant zur Exkavation zum Einsatz. Gerade bei der Desinfektion pulpa-naher kariöser Läsionen kann die photodynamische Therapie bei der schrittweisen Exkavation zur Schonung der Hartsubstanz und des Pulpagewebes einen wichtigen antibakteriellen Beitrag leisten. Es wird Bezug genommen auf die Fig. 7 und Tabelle 5.
Figure imgf000024_0001
Tabelle 5 Die humanen nativen Speichelbakterien supplementiert mit Streptocuccus mutans als
Haupt-Karies-Auslöser reagierten auf die default-aPDT mit einer CFU-Reduktion von nur einer logio-Stufe und zeigten sich damit als sehr behandlungsunempfindlich. Eine letztendlich erfolgreiche Behandlung machte ein mehrstufiges Verfahren erforderlich, in dem ebenfalls die hochsynergistische Wirkung von Tol lus gezeigt werden konnte. Die zusätzli- che vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Exposition zeigte nach der Toluidinanwendung (Toi) mit LED-Bestrahlung in Kochsalzlösung eine Koloniereduktion von knapp 4 log-i0- Einheiten. Der Einsatz des synergistischen Tol lus (Tol+H202) im gleichen Versuchsansatz induzierte die maximale CFU-Reduktion von 8,1 log-io-Einheiten auf 0.
3.4 Farbstoff- und Svstemvergleich von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo)
3.4.1 Einsatz von Toluidin und Methylenblau in Kombination mit Η?0? als Tolplus und Metplus im optimierten aPDTplus-Svstem
(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(Fig. 8)
Zur Abgrenzung der Wirkungsmechanismen von Toluidin und Methylenblau im Rahmen der aPDT wurden in direktem Vergleich Versuche nach Firmenvorgaben und nach Modifikation der beiden Photosensitizer mit H202 durchgeführt. Das Ergebnis ist in der Fig. 8 und Tabelle 6 unten gezeigt.
Figure imgf000025_0001
Tabelle 6 [0086] Die photodynamische Therapie nach Firmenvorschrift (default) resultierte bei Parodontitis- assoziierten Bakterien in einer CFU-Reduktion von 2 log-io-Stufen nach reiner Toluidin- Anwendung (Fotosan) und 0,59 log-io-Stufen nach reiner Methylenblau-Applikation (Helbo) (vgl. Fig. 8). Das Fotosan-System mit Toluidin zeigte damit eine statisch signifikant höhere Wirksamkeit als das Helbo-System mit Methylenblau bei Behandlung von gleichem Keimspektrum und Bakterienausgangszahl.
[0087] Die neue erfindungsgemäße Tol lus-Rezeptur (Tol+H202) bewirkte eine hochsynergistische
Maximalreduktion des Koloniewachstums von 8,9 log-io-Stufen auf 0. Der antibakterielle Effekt des mit Wasserstoffperoxid gemischten Methylenblaus (Metplus, Met+H202) war zwar stärker als die default-Rezeptur (log-ιο CFU-Reduktion von 3,2 vs. 0,59), aber statistisch signifikant geringer als der Effekt nach Tol lus-Applikation.
3.4.2 Verdünnungsversuch von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo) mit Tolplus und Met lus im optimierten aPDT lus-Svstem
(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(Fig. 9)
[0088] Zur weiteren Abgrenzung der Wirkungsmechanismen von Toluidin und Methylenblau
wurden in gleicher Weise Farbstoffverdünnungen in seriellen vier (1 :10)-Schritten durchgeführt und nach Zugabe von H202 jeweils die spezifischen Kombinationen der gleichen Verdünnungen (Tol lus, Met lus) im Rahmen der aPDT lus hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit als Photosensitizer untersucht. Das Ergebnis des Experimentes ist in der Fig. 9 und Tabelle 7 dargestellt.
Figure imgf000027_0001
Tabelle 7
[0089] Die synergistisch wirksame Tolplus-Rezeptur (Tol+H202) (Tolplus, Endkonzentration 0,009%) mit LED-Belichtung bewirkte in diesem Verdünnungsversuch die höchst mögliche CFU- Reduktion der parodontalpathogenen Bakterien von 8,9 log-io-Einheiten auf CFU 0 und zeichnete sich durch die statistisch signifikante höchst antibakterielle Wirksamkeit im Vergleich zu den entsprechend verdünnten Metplus-Proben (Metplus, Endkonzentration 0,009 % + H202) aus.
[0090] Selbst die 1 :10 (0,0009 %) verdünnte Tol lus-Anwendung in der photodynamischen
Therapie war statistisch signifikant antibakteriell wirksamer als die gleichverdünnte Met lus- Rezeptur. Erst ab der Verdünnungsstufe 1 :100 (0,00009 %) überlappten die 95 %-igen Konfidenzintervalle der Tol lus und Met lus behandelten und bestrahlten Bakterienproben bezüglich ihrer Kolonieanzahl, wobei auch in den höheren Verdünnungsstufen für Toluidin tendenziell eine höhere CFU-Reduktion zu erkennen war. Beide mit Wasserstoffperoxid kombinierten Farbstoffe zeigten im Vergleich zur Negativkontrolle (Kochsalzbehandlung) bis zur Testkonzentration von (0,000009 %) noch statistisch signifikant höhere bakterielle Aktivitäten, die vermutlich auf die beiden Farbstoff-Formulierungen gemeinsame antibakterielle Wasserstoffperoxid-Aktivität zurückzuführen ist. Nur Tol lus induzierte auch noch in der höchsten Testverdünnung (0,0000009 %) eine von der Negativkontrolle verschiedene statistisch signifikant höhere antibakterielle Wirksamkeit.
4. Vergleich Tol lus - Met lus
[0091] Der Farbstoff- und Systemvergleich von Toluidinblau und Methylenblau in Kombination mit Wasserstoffperoxid (Tol lus, Met lus) im Rahmen der photodynamischen Therapie zeigte in allen Experimenten eindeutig, dass ausschließlich Tol lus als hochsynergistische Photosensitizer-Formulierung in der Lage war, eine bakterielle Koloniedichte von knapp 9 log-ιο CFU-Einheiten auf 0 zu reduzieren. Die entsprechende Methylenblaukombination bewirkte zwar auch eine Abnahme der log-ιο CFU-Einheiten, jedoch konnte ein der Tolui- din-Formulierung entsprechender Effekt, nämlich die Totaleliminierung der Bakterien, in keiner Farbstoffkonzentration nachgewiesen werden. Gerade dieses Potential der Maxi- mal-Bakterizidie von Tol lus ist für orale chirurgische Interventionen und Infektionsbehandlungen von größter klinischer Bedeutung und Relevanz. 5. Antibakterieller Wirkungsvergleich verschiedener kommerzieller Toluidin-basierter PDT-Systeme an planktonen Parodontitis-assoziierten Bakterien und Paro-Biofilmen unter konventioneller default- und erfindungsgemäß modifizierter Photosensitizer-Anwendung.
[0092] Um die oben erläuterte antibakteriell synergistische Wirkung des Photosensitizers
Toluidinblau mit Wasserstoffperoxid (3%) (Tol lus) in simultaner Anwendung im Rahmen der photodynamischen Therapie auch in einem breiteren Wirkungsbereich zu untersuchen, wurden die folgenden Ergänzungsversuche durchgeführt. Dabei kamen verschiedene Toluidinkonzentrationen im Default- und im synergistischen Modus in einem Anwendungsbereich von 0,01 % bis 00127% zum Einsatz, sowie unterschiedliche Anregungsoptionen des Photosensitizers durch zwei verschiedene Leuchtdioden (LED) und eine Laser- Lichtquelle.
[0093] Spezifikation der drei photodynamischen Testsysteme
* Fotosan 630, CMS Dental, Kopenhagen: Tol.-Konz.: 0,01 Gew.-%, LED: 630 nm;
* PadPlus, Orange Dental GmbH, Biberach (Tol.-Konz.: 0,00127 Gew.-%, LED: 635nm;
* PACT, Cumdente, Tübingen (Tol.-Konz.: 0,005 Gew.-%, Laser: 635nm)
Bedingungen der photodynamischen Therapie nach Herstellerangaben: Einwirkzeit des Photosensitizers: 60 sec, Bestrahlungszeit: 60 sec.
5.1 Untersuchung der antibakteriellen Wirkungseffizienz der neuen Toluidinkombinati- on an Hand dreier kommerzieller Toluidin-basierten photodynamischen Therapiesysteme (aPDTplus) an planktonen Parodontitis-assoziierten Pathogenen im Vergleich zur jeweiligen konventionellen aPDT durch Detektion der Koloniebildung (1 a) (CFU/ml) und mikro- biellen Vitalität (1 b)
In Ergänzung zu dem in der erfindungsgemäßen Toluidinoptimierung eingesetzten photodynamischen Therapiesystem Fotosan 630 wurden die PDT-Systeme PadPlus, Orange Dental GmbH, Biberach, und PACT, Cumdente, Tübingen, hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirkungseffizienz vor und nach synergistischer Toluidinanreicherung untersucht. Dabei wurden die jeweiligen systemeigenen Photosensitizerformulierungen mit Wasserstoffperoxid supplementiert.
[0096] Die bakterielle Zielgruppe war wie oben dargestellt ein planktoner Parodontitis- assoziierter Bakteriencocktail (Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetem- comitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis und Veillonella atypica (Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)). Die Koloniebildung (CFU/ml) erfolgte über 5 Tage bei 37°C unter anaeroben Bedingungen. Die mikrobielle Vitalität, d.h. der Lebendanteil in Prozent, wurde nach Fluoreszenzmarkierung mit Lebend-/Totfarbstoffen fluoreszenzmikroskopisch ermittelt.
[0097] Die statistische Auswertung wurde nach Iog10 Transformation der CFU/ml Daten mittels
ANOVA-Analyse und Tukey-Kramer-Test durchgeführt (Signifikanzniveau: α = 0,001 ). Es wurden je sechs Versuchsserien zu jeder Bedingung untersucht. Die folgenden Tabellen beinhalten die 95-prozentigen Konfidenzintervalle mit den zugehörigen Mittelwerten.
Figure imgf000030_0001
Tabelle 8: log CFU/ml des Paro-Cocktails nach photodynamischer Therapie mit Fotosan (FS), PadPlus (PP) und PACT; aPDT: Konventionelle photodynamische Therapie, aPDTplus: erfindungsgemäße Modifizierung, log CFU Reduktion ist die Reduktion der CFU nach Behandlung der Proben im Vergleich zur Kochsalzkontrolle
[0098] Die photodynamische planktone Bakterienbehandlung der drei PDT-Systeme im
konventionellen default-Modus zeigte im Vergleich zur Kochsalzkontrolle die höchste antibakterielle Wirksamkeit mit 2 log CFU Reduktions-Einheiten nach PadPlus- Anwendung, gefolgt von 1 ,73 log CFU Reduktion nach Fotosan Einsatz und 0,85 log CFU Reduktion nach Behandlung mit PACT. Die erfindungsgemäß modifizierte Toluidinformu- lierung bewirkte nach aPDTplus Anwendung aller drei Systemen eine hochsignifikante log CFU Reduktion (FS: 9,10; PACT: 8,03; PP: 7,43) im Vergleich zur Negativkontrolle sowie auch zur jeweiligen konventionellen aPDT (Tab. 8)
Figure imgf000031_0001
Tabelle 9: Vitalität (%) des Paro-Cocktails nach photodynamischer Therapie mit Fotosan (FS), PadPlus (PP) und PACT; aPDT: Konventionelle photodynamische Therapie, aPDTplus: erfindungsgemäße Modifizierung, log Vit Reduktion ist die Reduktion der Vitalität nach Behandlung der Proben im Vergleich zur Kochsalzkontrolle
[0099] Die mikrobielle Vitalität wurde nach konventioneller photodynamischer Bakterienbehandlung (aPDT) im Vergleich zur Kochsalzkontrolle statistisch signifikant reduziert (Reduktion der Vitalität bei PadPlus um 57,5%, bei Fotosan um 45,8%, bei PACT um 36,7%). Nach Anwendung der erfindungsgemäß modifizierten aPDTplus auf die PA-Pathogene wurden mit allen drei Systemen eine gesteigerte hochsignifikante Vitalitätsreduktion erzielt, die derjenigen nach default Behandlung weit überlegen war (Vitalitätsreduktion bei PadPlus um 72,5%, bei Fotosan um 71 ,3%, bei PACT um 66,7%) (Tab. 9)
5.2 Erweiterung des antimikrobiellen Wirkungsnachweises der synergistischen Tolui- din-Wasserstoffperoxid-Formulierung an Parodontitis-assoziierten Biofilmen durch Detek- tion der Koloniebildung (2a) (CFU/ml) und mikrobiellen Vitalität (2b)
[00100] Mit den gleichen Parodontitis-assoziierten Mikroorganismen wie unter 5.1 beschrieben wurden Biofilme über 24h bei 37°C unter anaeroben Bedingungen angezüchtet. Diese wurden mit den zwei PDT-Systemen Fotosan und PACT behandelt und den gleichen photodynamischen Bedingungen ausgesetzt wie die planktonen Bakterien.
Figure imgf000031_0002
Tabelle 10: log CFU/mm2 des Paro-Biofilms nach photodynamischer Therapie mit Fotosan (FS) und PACT; aPDT: Konventionelle photodynamische Therapie, aPDT lus: erfindungsgemäße Modifizierung, *log CFU Reduktion ist die Reduktion der CFU nach Behandlung der Proben im Vergleich zur Kochsalzkontrolle [00101] Die antibakterielle Wirksamkeit der PDT-Systeme Fotosan und PACT im default Modus auf die PA-Biofilme beläuft sich auf eine statistisch signifikante CFU Reduktion von 1 ,98 log Einheiten für Fotosan und mit 0,51 log Einheiten für PACT auf eine nicht statistisch signifikante Reduktion (Tab. 10). Die Biofilmbehandlung mit der erfindungsgemäß modifizierten aPDTplus Methode erzielte statistisch hochsignifikante CFU Reduktionen von 5,06 log Einheiten mit dem Fotosan System und 4,51 log Einheiten nach PACT Anwendung im Vergleich zur Negativkontrolle und auch zu den aPDT-bezogenen Daten. Dieses Ergebnis belegt, dass die erfindungsgemäße Toluidinsupplementierung nicht nur auf planktone, sondern auch auf die durch Biofilmformation resistenter gewordenen Parodontitis- Pathogene eine dem default-Modus der Systeme evident überlegene antibakterielle Wirkung besitzt.
Figure imgf000032_0001
Tabelle 1 1 : Vitalität des Paro-Biofilms nach photodynamischer Therapie mit Fotosan (FS) und PACT; aPDT: Konventionelle photodynamische Therapie, aPDTplus: erfindungsgemäße Modifizierung, log Vit Reduktion ist die Reduktion der Vitalität nach Behandlung der Proben im Vergleich zur Kochsalzkontrolle
[00102] Die Reduktion der mikrobiellen Vitalität von PA-Biofilmen durch die zwei PDT-Systeme war statistisch signifikant verschieden von der Vitalität der Negativkontrolle (aPDT: FS 49,17 % PACT 35% Vitalitätsreduktion) (Tab. 1 1 ). Nach aPDTplus-Anwendung mit erfindungsgemäß modifiziertem Toluidin zeigten beide Systeme statistisch signifkante Vitalitätsreduktionen zur Kochsalzkontrolle aber keine statistisch signifkanten Unterschiede zur Vitalität nach konventioneller aPDT Behandlung (aPDTplus: PACT 60,8%; FS 57,5% Vitalitätsreduktion) (Tab. 1 1 ). Die Vitalitätswerte der PA-Biofilme lagen im Vergleich zu den planktonen Parodontitis-Pathogenen (Tab. 9) nach konventioneller photodynamischer Therapie bei Fotosan und PACT im ähnlichen Bereich, nach modifizierter aPDTplus Anwendung waren die Biofilm-Vitalitäten etwas höher als die Vitalitäten der planktonen Keime. [00103] Da die fluoreszenzgestützten Vitalitäten, d.h. die Lebendanteile der Bakterienzellen, ein breites Spektrum unterschiedlicher Lebenszustände ("viability") von hoch vital (logarithmische Vermehrungsphase) bis gerade noch vital, aber nicht mehr vermehrungsfähig umfassen, ist dieser Messparameter für die Charakterisierung der Lebensfähigkeit von Mikroorganismen nach antiseptischen Behandlungen als weniger trennscharf zu bewerten wie die Koloniebildung mit den zwei Optionen: Wachstum oder kein Wachstum.
6. Fazit
[00104] Die Erfinder konnten anhand einer Vielzahl von Experimenten belegen, dass die
Kombination von Toluidinblau und H202 eine Weiterentwicklung und hochsynergistisch wirksame Optimierung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie unter Anwendung einer Lichtquelle darstellt.
[00105] Die erfindungsgemäße Toluidin-Modifizierung bewirkte in drei verschiedenen
kommerziellen PDT-Systemen (FS, PP, PACT) unabhängig von der Toluidinkonzentration und der Art der Bestrahlungsquelle (LED oder Laser) eine hochsignifkante synergistisch wirksame antibakterielle Wirkungsverbesserung (CFU Reduktion um 9,1 - 7,4 log Einheiten) der modifizierten PDT-Systeme (aPDTplus) im Vergleich zum konventionellen Therapieansatz (CFU Reduktion um 2,0 - 0,9 log Einheiten) am Beispiel planktoner Parodonti- tis-assoziierter Pathogene. Dies gilt wie an zwei PDT-Systemen (FS und PACT) gezeigt auch hinsichtlich der korrespondierenden 24h Paro-Biofilme (aPDTplus: log CFU Reduktion um 5,1 - 4,5; aPDT: log CFU Reduktion um 2,0 - 0,5).

Claims

Patentansprüche
1 . Verwendung von Toluidinblau und H202 in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine zeitgleiche Verabreichung einer ersten Lösung von > ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,09 Gew.-%, weiter vorzugsweise ca. < 1 ,0 Gew.-% Toluidinblau, und
einer zweiten Lösung von > ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,3 Gew.- %, höchst vorzugsweise von ca. 3 Gew.-%, vorzugsweise < ca. 5 Gew.-% H202 erfolgt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung verabreicht wird, die
Toluidinblau in einer Konzentration von > ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von > ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von < 32378 Mikromol/Liter, und
H202 in einer Konzentration von > ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von > ca. 88,2 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 882 Millimol/Liter, vorzugsweise von < ca. 1470 Millimol/Liter.
4. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Toluidinblau und/oder H202 in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vorliegt.
5. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Behandlung einer oralen Infektion ausgelöst durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen handelt.
6. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Parodontitis-/Periimplantitis- relevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus:
Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypi- ca;
und/oder aus
endodontischen, Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus:
Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis]
und/oder aus
Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus:
Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H202 zur
Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, die
Toluidinblau in einer Konzentration von > ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von > ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von > ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, , und vorzugsweise von ca. < ca. 32378 Mikromol/Liter, und
H202 in einer Konzentration von > ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von > ca. 8,82 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von 882 Millimol/Liter, vorzugsweise von < ca. 1470 Millimol/Liter aufweist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Toluidinblau und/oder H202 in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vorliegt.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherige Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Behandlung einer oralen Infektion durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen handelt.
1 1 . Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherige Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Paro- dontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemco- mitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingi- valis, Veillonella atypica;
und/oder aus
endodontischen, Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Enterococcus faecalis, Actinomyces naes- lundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis;
und/oder aus Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
12. Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, aufweisend: einen ersten Behälter enthaltend eine wässrige Lösung von Toluidinblau, und einen zweiten Behälter enthaltend eine wässrige Lösung von H202.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter eine Lösung von > ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise > ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.- %, und vorzugsweise < ca. 1 Gew.-% Toluidinblau aufweist, und/oder der
zweite Behälter eine Lösung von > ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise > ca. 0,3 Gew.-%, höchst vorzugsweise von 3 Gew.-%, und vorzugsweise < ca. 5 Gew.-% H202 aufweist.
14. Kit nach Anspruch 12 oder 13, wobei der erste Behälter eine erste Auslassöffnung aufweist und der zweite Behälter eine zweite Auslassöffnung aufweist und die erste und zweite Auslassöffnung flüssigkeitsdicht miteinander verbindbar sind.
15. Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter eine erste Spritze ist und der zweite Behälter eine zweite Spritze ist, wobei die erste oder zweite Spritze an ihrer Auslassöffnung ein Außengewinde aufweist und die zweite oder erste Spritze an ihrer Auslassöffnung ein zu dem Außengewinde komplementäres Innengewinde aufweist, wobei das Kit optional zusätzlich eine Kanüle mit einem Gewinde aufweist, das komplementär zu dem Außengewinde und/oder Innengewinde ist.
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