DE102014117532A1

DE102014117532A1 - Antimikrobielle photodynamische Therapie

Info

Publication number: DE102014117532A1
Application number: DE102014117532.8A
Authority: DE
Inventors: Eva-Maria Decker; Christiane von Ohle; Valentin Bartha
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2016-06-02
Also published as: WO2016083239A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung zweier Komponenten in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie (aPDT), eine im Rahmen der aPDT einsetzbare pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels aPDT.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung zweier Komponenten in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie (aPDT), eine im Rahmen der aPDT einsetzbare pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels aPDT.
Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT), auch photoaktivierte Desinfektion genannt, handelt es sich um eine in der Medizin etablierte adjuvante, nicht invasive und schmerzfreie Methode, um selektiv Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, biologische Zellen oder Moleküle, durch Lichtinduktion eines geeigneten photosensiblen Farbstoffes, der als Photosensitizer bezeichnet wird, zu inaktivieren. Dabei wird der photosensible Farbstoff nach lokaler Applikation und Bindung an die Zielstrukturen unter spezifischer Lichtanregung, beispielsweise mittels LED oder Laser, über Photonenabsorption in einen Triplettzustand überführt. Über zwei verschiedene Reaktionsmechanismen, Typ I oder II, können durch Elektronentransferreaktionen lokal Sauerstoffradikale (Singulettsauerstoff) und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS) entstehen, die die farbstoffmarkierten Zielstrukturen irreversibel zerstören, wobei das umliegende Gewebe verschont bleibt.
Neben vielfältigen Anwendungen bei Tumorbehandlungen oder in der Dermatologie spielt die aPDT in der Zahnmedizin in Ergänzung zu herkömmlichen klinischen Behandlungsmethoden mittlerweile eine wesentliche Rolle. Die Hauptanwendung der aPDT bei oralen bakteriellen Infektionen liegt in der Dekontamination der Zahnwurzeloberfläche in der Parodontologie bzw. der Implantatoberfläche in der Implantologie und bei Infektionen des endodontischen Systems, die eine Wurzelkanalbehandlung erfordern. Bei infizierten Schleimhautarealen sowie in der Kariologie, kommt diese gewebeschonende Methode ebenfalls zum Einsatz.
Neben der antibakteriellen Wirkung induziert der photobiologische Effekt der Bestrahlungsquelle selbst positive klinische Ergebnisse wie Entzündungshemmung, verbesserte Wundheilung und auch eine analgetische Wirksamkeit.
Die aPDT ist klinisch einfach durchführbar, es fehlt weitgehend an Nebenwirkungen, Resistenzen oder Allergien. Die aPDT stellt deshalb häufig eine mögliche Alternative zu der Verabreichung von Antibiotika dar.
In der zahnmedizinischen aPDT kommen verschiedene Photosensitizer in Kombination mit unterschiedlichen Bestrahlungsquellen zum Einsatz, wie beispielsweise Toluidinblau bzw. Toloniumchlorid, Methylenblau oder Indocyaningrün; vgl. Hopp und Biffar (2013), Photodynamische Therapie – Blau vs. Grün, Laser Journal 1: 14–25.
Auf dem deutschen Markt werden verschiedene kommerzielle aPDT-Systeme angeboten, wie beispielsweise "Fotosan 630" der Firma CMS Dental, Kopenhagen, in denen Toluidinblau in einer 0,01 %-igen Lösung und eine LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 630 nm eingesetzt werden. Ein weiteres System mit der Bezeichnung "Helbo" von Bredent Medical, Senden, setzt eine 1 %-ige Methylenblaulösung und einen Laser mit einer Wellenlänge von 660 nm ein. Das System "PadPlus" von Orange Dental GmbH, Biberach, setzt Toloniumchlorid in einer 0,00127 %-igen Lösung und eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 635 nm ein. Das System "PACT" von Cumdente GmbH, Tübingen, setzt Toluidinblau in einer 0,005 %-igen Lösung und einen Laser mit einer Wellenlänge von 635 nm ein.
Garcez et al. (2010), Antimicrobial mechanism behind photodynamic effect in the presence of hydrogen peroxide, Photochem. Photobiol. Sci. 10: 483–490, beschreiben die gleichzeitige Anwendung von Methylenblau und H₂O₂ in der photodynamischen Therapie bzgl. einiger pathogener Mikroorganismen. Diese Studie zeigt, dass die Anwendung von Methylenblau mit jeweils 10-minütiger Expositionszeit zu einer CFU-Reduktion von 0,5 log₁₀ Einheiten, und die Anwendung einer Kombination von Methylenblau und H₂O₂ und Laser zu einer CFU-Reduktion von 1,8 log₁₀ Einheiten führte. Die der aPDT vorgeschaltete H₂O₂-Behandlung bewirkte eine CFU-Reduktion von 1,4 log₁₀-Stufen und die nachgeschaltete H₂O₂-Behandlung hingegen eine stärkere Koloniereduktion um 2,8 log₁₀ Einheiten. Die in dieser Studie eingesetzten Ausgangs-CFU-Äquivalente lagen im Bereich von ca. 10⁷/ml. Die Erfinder waren nicht in der Lage, die in diesem Dokument dargestellten experimentellen Ergebnisse zu reproduzieren.
Lins et al. (2013), Enhancement of antimicrobial action of photodynamic therapy in the presence of hydrogen peroxide, in: Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education, Herausgeber: A. Méndez-Vilas, Formatex Research Center, Vol. 1: 367–371, beschreiben Experimente, in denen Bakterien zunächst nacheinander für 2 Minuten mit 20 µl Methylenblau behandelt wurden, dann für 10 Minuten an 20 µl H₂O₂ exponiert und anschließend mittels eines Lasers bestrahlt wurden. Die Ergebnisse erbrachten eine CFU-Reduktion, aber bei E. faecalis konnte keine Totaleliminierung festgestellt werden.
McCullagh und Robertson (2006), Photo-dynamic biocidal action of methylene blue and hydrogen peroxide on the cyanobacterium Synechococcus leopoliensis under visible light irradiation, J. Photochem. Photobiol. B. 83: 63–68, beschreiben eine kombinierte Methylenblau-H₂O₂-Anwendung in der aPDT auf ein Cyanobakterium im Rahmen von biologischer Gesteinszersetzung. Die Applikation von Methylenblau und H₂O₂ resultierte in einer Fluoreszenzabnahme eines spezifischen Pigments nach einer Belichtungsdauer von 90 bis 240 Minuten. Bei diesen Ergebnissen ist weder das Cyanobakterium noch die Bestrahlungsdauer oder das Fluoreszenzmaß in irgendeiner Weise auf das Verfahren der aPDT, wie es für die Klinik vorgesehen ist, übertragbar.
Stojicic et al. (2013), Ex vivo killing of Enterococcus faecalis and mixed plaque bacteria in planktonic and biofilm culture by modified photoactivated disinfection, Int. Endod. J. 46: 649–659, beschreiben eine zahnmedizinische Studie ex vivo, die Enterococcus faecalis und Plaquebakterien hinsichtlich konventioneller aPDT und einer modifizierten photodynamischen Therapie untersuchte. Die modifizierte aPDT bestand aus Mehrfachkombinationen von Methylenblau: mit niedrig dosiertem Chlorhexidin (CHX, 0,05 %) und Wasserstoffperoxid (0,5 %), einer Kombination aus Methylenblau, CHX und H₂O₂, einer Kombination aus Methylenblau, EDTA und H₂O₂ oder eine Kombination aus Methylenblau, CHX und EDTA mit Laserbestrahlung. Die antibakterielle Wirksamkeit der Kombination mit H₂O₂ war auf planktone Mikroorganismen nach der Auffassung der Autoren geringer als die Kombination von Methylenblau, CHX und EDTA. Allerdings ist die Kombination von CHX, EDTA und H₂O₂ im Zusammenhang mit Laserlichtanregung wegen der unbekannten Wechselwirkungen der verschiedenen reaktiven Gruppen mit dem Photosensitizer toxikologisch bedenklich im Hinblick auf einen klinischen Einsatz am Patienten.
Eick et al. (2013), Effect of photoactivated disinfection with a light-emitting diode on bacterial species and biofilms associated with periodontitis and peri-implantitis, Photodiagnosis Photodyn. Ther. 10: 156–167, beschreiben die Verabreichung von H₂O₂ und anschließend nach 1 Minute die Durchführung einer aPDT mit Toluidinblau. In dieser Studie wurden parodontalpathogene Einzelkeime und Bakteriengemische für die aPDT im Rahmen des Fotosan-Systems eingesetzt. Die Reduzierung der Bakterien war dabei zwar messbar, jedoch nach wie vor nicht zufriedenstellend.
Eine aktuelle Metaanalyse konnte für die Parodontalbehandlung bei der klinischen Anwendung der photodynamischen Therapie in Ergänzung zur konventionellen mechanischen Behandlung durch Scaling bzw. Wurzelglättung einen, wenn auch geringen und kurzfristigen, so doch messbaren Vorteil zeigen; vgl. Sgolastra et al. (2013), Adjunctive photodynamic therapy to non-surgical treatment of chronic periodontitis: a systematic review and meta-analysis, J. Clin. Periodontol. 40: 514–526.
Weitere kontrollierte klinische Studien mit Patienten mit chronischer Parodontitis haben jedoch gezeigt, dass durch den zusätzlichen Einsatz der aPDT keine statistisch signifikanten Unterschiede der klinischen Parameter, wie der Blutung nach Sondierung (BOP), dem Plaque-Index (PI) und dem Gingiva-Index (GI) oder der Mikrobiologie, nachzuweisen waren; vgl. Christodoulides et al. (2008), Photodynamic therapy as an adjunct to non-surgical periodontal treatment: a randomized, controlled clinical trial, J. Periodontol. 79: 1638–1644; Polansky et al. (2009), Clinical effectiveness of photodynamic therapy in the treatment of periodontitis, J. Clin. Periodontal. 36: 575–580; Theodoro et al. (2012), Clinical and microbiological effects of photodynamic therapy associated with nonsurgical periodontal treatment. A 6-month follow-up, Lasers Med. Sci. 27: 687–693.
Ein Review über die Wirksamkeit der photodynamischen Therapie auf Enterococcus faecalis in infizierten Wurzelkanälen zieht aus den Ergebnissen von 17 Studien, die zum Teil klinische Verbesserungen durch aPDT nachweisen, außerdem das Fazit, dass die Effizienz dieser Therapie hinsichtlich der Eliminierung der Bakterien in Wurzelkanälen zweifelhaft bleibt; vgl. Siddiqui et al. (2013), Bactericidal efficacy of photodynamic therapy against Enterococcus faecalis in infected root canals: a systematic literature review, Photodiagnosis Photodyn. Ther. 10: 632–643.
Die Limitation dieser grundsätzlich vorteilhaften Methode zeigt sich somit in der insuffizienten Abtötung von Mikroorganismen. Ursächlich können die mechanisch sehr stabilen Zellwände einiger Bakterien, wie zum Beispiel Enterokokken und Streptokokken, sein, die eine Aufnahme des Photosensitizers erschweren und damit den lichtinduzierten Abtötungsmechanismus außer Kraft setzen.
Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die bisher existierenden Behandlungskonzepte der aPDT weiter zu entwickeln und dabei deren Wirksamkeit zu verbessern. Insbesondere soll das Problem der insuffizienten Abtötung von Mikroorganismen reduziert oder ggf. sogar gelöst werden.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Toluidinblau und H₂O₂ in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie gelöst.
Toluidinblau, auch als Toloniumchlorid bezeichnet, hat die Summenformel C₁₅H₁₆CIN₃S, die CAS-Nr. 92-31-9. Es weist eine molare Masse von 308,85 g pro Mol auf.
Wasserstoffperoxid hat die Summenformel H₂O₂, die CAS-Nr. 7722-84-1 und weist eine molare Masse von 34,02 g pro Mol auf.
Erfindungsgemäß bedeutet "zeitgleiche Verabreichung", dass das Toluidinblau und H₂O₂ nicht hintereinander, wie bspw. bei Eick et al. (a.a.O.) sondern zur gleichen Zeit verabreicht werden, wobei ein minimaler Zeitversatz von ≤ 60 Sekunden, vorzugsweise ≤ 30 Sekunden, vorzugsweise ≤ 20 Sekunden, vorzugsweise ≤ 10 Sekunden, vorzugsweise ≤ 5 Sekunden, vorzugsweise ≤ 4 Sekunden, vorzugsweise ≤ 3 Sekunden, vorzugsweise ≤ 2 Sekunden, vorzugsweise ≤ 1 Sekunde, bzw. keinerlei Zeitversatz umfasst sind.
Dabei können nach einer Ausführungsvariante das Toluidinblau und H₂O₂ in jeweils getrennten Lösungen vorliegen und verabreicht werden, oder aber nach einer alternativen Ausführungsvariante in einer gemeinsamen Lösung vorliegen und verabreicht werden.
Erfindungsgemäß umfasst eine "Infektion" nicht nur das Eindringen von Mikroorganismen, sondern auch das Vorherrschen bzw. Vorhandensein von Mikroorganismen, beispielsweise in Flüssigkeiten eines Lebewesens, wie dem Speichel.
Unter "Behandlung" wird erfindungsgemäß jede Einwirkung auf die Mikroorganismen verstanden, die das Ziel hat, deren Lebensfähigkeit und/oder Vermehrung zu inhibieren oder zu vermindern.
Erfindungsgemäß umfasst die "photodynamische Therapie" die Anwesenheit einer Lichtquelle, die geeignet ist, das Toluidinblau anzuregen, um Sauerstoffradikale bzw. oxigenierte reaktive Moleküle zu bilden. Beispielsweise handelt es sich bei der Lichtquelle um eine Leuchtdiode (LED) mit einer Wellenlänge von ca. 560 bis 640 nm. Besonders geeignet ist eine LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 630 nm. Die Bestrahlungsdauer beträgt dabei vorzugsweise ca. 10 bis ca. 120 Sekunden, vorzugsweise ca. 60 Sekunden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Die Erfinder haben erkannt, dass die zeitgleiche Verabreichung von Toluidinblau und H₂O₂ in Gegenwart einer Lichtquelle, wie beispielsweise einer LED-Lichtquelle mit 630 nm, zu einer signifikanten Reduzierung der Lebensfähigkeit von Mikroorganismen führt. Dabei war besonders überraschend und auffällig, dass die Kombination von Toluidinblau und H₂O₂ nicht nur in einer additiven sondern in einer synergistischen Wirkverstärkung resultiert.
Die Erfinder konnten nachweisen, dass die erfindungsgemäße Verwendung, die von den Erfindern als "aPDT^puls" bezeichnet wird, deutlich bessere Ergebnisse liefert als die konventionelle aPDT, in der üblicherweise die Photosensitizer Methylenblau und/oder Toluidinblau ohne Zusatz von H₂O₂ zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäße zeitgleiche Verwendung von Toluidinblau und H₂O₂, die von den Erfindern auch als "Tol^plus" bezeichnet wird, liefert nach Erkenntnissen der Erfinder auch wesentlich bessere Ergebnisse als die zeitversetzte Verabreichung von H₂O₂ und Toluidinblau, wie bspw. bei Eick et al. (a.a.O.), oder die zeitversetzte Verabreichung von Methylenblau und H₂O₂. Außerdem werden durch die erfindungsgemäße zeitgleiche Verwendung von Toluidinblau und H₂O₂ überraschenderweise wesentlich bessere Ergebnisse erzielt als durch eine zeitgleiche Verabreichung von Methylenblau und H₂O₂.
Es versteht sich, dass nach und/oder vor der Verabreichung von Toluidinblau und H₂O₂ Vor- bzw. Nachbehandlungen durchgeführt werden können, bspw. mit Substanzen, die den Sauerstoffeintrag erhöhen, wie Kofaktoren, und Katalysatoren für die verstärkte Generierung phototoxisch induzierter Radikale bei der aPDT, und/oder Substanzen, die weitere synergistisch wirksame antibakterielle Effekte induzieren. Infrage kommen hierfür bspw. Vor- bzw. Nachbehandlungen mit H₂O₂, Substanzen, die den pH-Wert der lokalen Umgebung verändern, antiseptische Lösungen wie Chlorhexidinlösungen, antibakterielle Enzyme, die die Zellwand der Bakterien angreifen und ggf. die Penetration des Toluidinblaus erhöhen, etc.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung erfolgt eine zeitgleiche Verabreichung

– einer ersten Lösung von ≥ ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.-%, und weiter vorzugsweise ≤ ca. 1 Gew.-% Toluidinblau, und
– einer zweiten Lösung von ≥ ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,3 Gew.-%, höchst vorzugsweise von ca. 3 Gew.-%, und weiter vorzugsweise von ≤ ca. 5 Gew.-% H₂O₂.

Angegeben sind jeweils Endkonzentrationen. Wie die Erfinder feststellen konnten, ist selbst bei sehr hoher Verdünnung von Toluidinblau bzw. H₂O₂ aufgrund des überraschenden Synergismus noch eine antibakterielle Wirksamkeit feststellbar, wobei sich die angegebenen Konzentrationen als besonders vorteilhaft herausgestellt haben.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung wird Toluidinblau und H₂O₂ in Form einer einzigen Zusammensetzung verabreicht, die

– Toluidinblau in einer Konzentration von ≥ ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, und weiter vorzugsweise von ≤ ca. 32378 Mikromol/Liter (= 1 Gew.-%), und
– H₂O₂ in einer Konzentration von ≥ ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 88,2 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 882 Millimol/Liter, und weiter vorzugsweise von ≤ ca. 1470 Millimol/Liter (= 5 Gew.-%).

Angegeben sind jeweils Endkonzentrationen. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine zeitgleiche Verabreichung gewährleistet ist. Die Zusammensetzung kann entweder unmittelbar vor der Verabreichung oder aber, alternativ, zu einem früheren Zeitpunkt hergestellt werden. Die Erfinder haben festgestellt, dass aufgrund des synergistischen Effektes eine Wirkung bei bereits sehr niedrigen Konzentrationen von Toluidinblau und/oder H₂O₂ beobachtet wird. Die angegebenen Konzentrationen haben sich dabei als besonders geeignet herausgestellt.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt das Toluidinblau und/oder H₂O₂ in einer wässrigen Lösung, beispielsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vor.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass geeignete Trägermedien für Toluidinblau bzw. H₂O₂ zum Einsatz kommen, die eine unproblematische Anwendung am Patienten erlauben. Die Kochsalzlösung kann beispielsweise eine physiologische bzw. isotonische Kochsalzlösung sein, die ca. 9 g Natriumchlorid pro Liter Wasser aufweist.
Es versteht sich, dass das Toluidinblau und/oder H₂O₂ bzw. die diese enthaltenen Lösungen bzw. Zusammensetzungen in steriler Form bereitgestellt werden können.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei der Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen um die Behandlung einer oralen Infektion eines Lebewesens, vorzugsweise eines Menschen, durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen.
Wie die Erfinder zeigen konnten, ist die erfindungsgemäße Verwendung besonders für zahnmedizinische Anwendungen geeignet und liefert dort gute Ergebnisse.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Mikroorganismen ausgewählt aus Paradontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus:
Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypica
und oder aus endodontischen Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis;
und/oder aus
Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
Die Erfinder konnten belegen, dass die erfindungsgemäße Verwendung gegenüber den vorstehend genannten zahnmedizinisch hochrelevanten Mikroorganismen besonders gute Ergebnisse liefert.
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H₂O₂ zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
Die Vorteile, Merkmale und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gleichermaßen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, wobei das Kit einen ersten Behälter enthaltend eine vorzugsweise wässrige Lösung von Toluidinblau, und einen zweiten Behälter enthaltend eine vorzugsweise wässrige Lösung von H₂O₂ aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der erfindungsgemäße Photosensitizer und Wirkverstärker H₂O₂ separat bereitgestellt werden und beispielsweise unmittelbar vor der Behandlung gemischt und die gewünschten Konzentrationen eingestellt werden können. Der ggf. begrenzten Stabilität der Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H₂O₂ wird damit Rechnung getragen.
Es versteht sich, dass das Kit weitere Gegenstände, Reagenzien, Chemikalien etc. enthalten kann. Das Kit kann ferner eine Lichtquelle enthalten, wie eine LED- oder Laserlichtquelle, die eine beliebige Wellenlänge emittiert, wie beispielsweise 630 nm.
Die Merkmale, Vorteile, Eigenschaften und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung gelten für das erfindungsgemäße Kit gleichermaßen.
Nach einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Kits weist der erste Behälter eine erste Auslassöffnung und der zweite Behälter eine zweite Auslassöffnung auf, und die erste und zweite Auslassöffnung sind miteinander flüssigkeitsdicht und ggf. luftdicht verbindbar.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Inhalt des ersten Behälters in den zweiten Behälter, oder umgekehrt, überführbar ist, ohne dass es zu einer Kontamination kommen kann. Die Konzentrationen von Toluidinblau und H₂O₂ in dem ersten bzw. zweiten Behälter sind dabei so voreingestellt, dass nach dem Mischen der beiden Flüssigkeiten die gewünschten Endkonzentrationen vorliegen.
Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung des Kits ist der erste Behälter eine Spritze und der zweite Behälter eine Spritze, wobei die erste und zweite Spritze an ihrer jeweiligen Auslassöffnung ein Außengewinde aufweist und die zweite oder erste Spritze an ihrer Auslassöffnung ein zu dem Außengewinde komplementäres Innengewinde aufweist, wobei das Kit optional zusätzlich eine Kanüle mit einem Gewinde aufweist, das komplementär zu dem Außengewinde und/oder Innengewinde ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein einfach zu handhabendes Zweikomponentensystem bereitgestellt wird. Dieses kann beispielsweise am Behandlungsstuhl ("chairside") während der Behandlung zum Einsatz kommen. Vor der Applikation werden beide vordosierten Komponenten über einen Schraubverschluss miteinander verbunden und die beiden, vorzugsweise sterilen Lösungen gleichmäßig vermischt. Nach Befüllen der einen Spritze kann die Endlösung mittels einer Kanüle, vorzugsweise einer stumpfen Kanüle, im Rahmen der photodynamischen Therapie direkt am Patienten zum Beispiel in parodontale Taschen oder Wurzelkanäle appliziert werden. Ein derartiges Kit ist – zu anderen Zwecken – im Stand der Technik beschrieben, bspw. in der WO 01/51024 , deren Inhalt durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist. Ein solches Kit wird für die Verabreichung des Lokalantibiotikums "Atridox" eingesetzt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, das folgende Schritte aufweist:

1. Bereitstellen einer wässrigen Lösung von Toluidinblau und einer wässrigen Lösung von H₂O₂;
2. Zeitgleiche Verabreichung der Lösungen aus Schritt (1) in ein Lebewesen, und
3. Bestrahlen der einbrachten Lösungen mit einer Lichtquelle zur Induktion einer photodynamischen Reaktion des Toluidinblaus unter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies.

Es versteht sich, dass die in Schritt 1 bereitgestellten Lösungen auch durch eine Lösung verwirklicht werden können, die sowohl das Toluidinblau als auch das H₂O₂ in den gewünschten Konzentrationen enthält. Erfindungsgemäß umfassen "reaktive Sauerstoffspezies" Sauerstoffradikale (Singulettsauerstoff) und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS), die durch Elektronentransferreaktionen entstehen. Das Einbringen in Schritt (2) kann in infizierte Bereiche, zum Beispiel Zahnfleisch- und Knochentaschen, Wundflächen oder Wurzelkanäle erfolgen.
Sämtliche Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verwendung, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und des erfindungsgemäßen Kits gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen. Insbesondere die eingangs genannten Vor- und/oder Nachbehandlungen können vor bzw. nach Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen.
In der gesamten Anmeldung steht "ca." für circa und umfasst Werte, die im Bereich von ±10%, vorzugsweise ±5%, vorzugsweise ±3%, vorzugsweise ±2%, vorzugsweise ±1%, des konkret angegebenen Wertes liegen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Es versteht sich, dass einzelne Merkmale der Ausführungsbeispiele isoliert zur Spezifizierung, Klarstellung, Weiterbildung oder Verallgemeinerung der Erfindung herangezogen werden können. In den Ausführungsbeispielen wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
1: Prinzip der photodynamischen Therapie;
2: Modell eines kommerzialisierten Zweikomponenten-Photosensitizers;
3: Übersicht der konventionellen aPDT nach Firmenvorgabe. Fotosan: Tol und LED; Helbo: Met (1 %; 0,01 %) mit NaCl und Laser auf Paro-, Endo- und Karies-assoziierte Bakterien (log CFU/ml) mit Kochsalzkontrolle (NaCl) (mean, Clu, Cll: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
4: Tol^plus(Tol + H₂O₂)-Synergismus sowie konventionelle aPDT (Tol), Kochsalz- bzw. H₂O₂-Kontrollen an Paro-Cocktail-Bakterien (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
5: Paro-Cocktail – konventionelle aPDT (Tol) und Tol^plus (Tol + H₂O₂) (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
6: Endo-Cocktail – konventionelle aPDT (Tol), H₂O₂ Vorbehandlung mit aPDT und Tol^puls (Tol + H₂O₂) (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
7: Kario-Cocktail – konventionelle (Tol) sowie H₂O₂ Vorbehandlung mit aPDT und Tol^puls (Tol + H₂O₂) (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
8: Farbstoff- und Systemvergleich von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo) in Kombination mit H₂O₂ (Tol^puls [Tol + H₂O₂] und Met^puls [Met + H₂O₂]) an parodontalpathogenen Bakterien (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls);
9: Verdünnungsversuche (Original Tol^plus, Met^plus, Endkonzentrationen je 0,009 %) und 4 Verdünnungsstufen: 0,0009 %, 0,00009 %, 0,000009 %, 0,0000009 %) von Tol (rot, Fotosan) und Met (blau, Helbo) in Kombination mit H₂O₂ in der aPDT^puls am Paro-Cocktail (mean, Clu, CII: Mittelwert und obere, untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls).
Ausführungsbeispiele
1. Prinzip der photodynamischen Therapie
Das Prinzip der photodynamischen Therapie ist in der 1 dargestellt. A: Photonenabsorption, F: Fluoreszenzemission, H: Wärme, ISC: intersystem crossing, Übergang eines Elektrons von einem elektrisch angeregten Energieniveau in ein schwingungsangeregtes, elektronisches Energieniveau unter Spinumkehr, Beispiel: Übergang von Singulett- in Triplettzustand, P: Phosphoreszenz (aus: Dissertation: Fernanda Pereira Gonzales 2013, Fakultät für Chemie und Pharmazie der Universität Regensburg, "Photodynamic inactivation of microbial biofilms: impact of Hsp70 expression and non-invasive optical monitoring of oxygen during photodynamic inactivation").
Der photosensible Farbstoff bzw. Photosensitizer wird nach lokaler Applikation und Bindung an die Zielstrukturen, hier Bakterien- bzw. Pilzmembranen oder -zellwände, unter spezifischer Lichtanregung über Photonenabsorption in einen Triplettzustand überführt. Bei Reaktionen vom Typ I oder II können durch Elektronentransferreaktionen lokal Sauerstoffradikale, beispielsweise Singulett-Sauerstoff, und oxygenierte hochreaktive Moleküle (ROS, reactive oxygen species) entstehen, die die mit dem photosensiblen Farbstoff markierten Membranen oder Zellwände der Mikroorganismen irreversibel zerstören.
2. Beispiel für ein geeignetes Applikationssystem
In der 2 ist ein Beispiel für ein geeignetes Applikationssystem dargestellt. Das Toluidinblau und das H₂O₂ werden jeweils steril in Spritzen bereitgestellt. Dabei werden die Konzentrationen so gewählt, dass bei vollständigem Vermischen die gewünschten Endkonzentrationen, beispielsweise 0,009 Gew.-% (≙ 291 Mikromol pro Liter) Toluidinblau und 3 % (≙ 882 Millimol pro Liter) H₂O₂ vorliegen. In dem Beispiel weist die das Toluidinblau enthaltende Spritze an ihrer Auslassöffnung bzw. Düse ein Innengewinde auf, die das H₂O₂ enthaltende Spritze weist an ihrer Auslassöffnung bzw. Düse ein hierzu komplementäres Außengewinde auf. Die Gewindegestaltung kann auch anders herum erfolgen. Beide Spritzen sind verschlossen. Die Spritzen können vor der Verwendung miteinander verschraubt werden. Durch die Verschraubung werden die verschlossenen Spritzen an ihren Auslassöffnungen geöffnet und die beiden Komponenten können gemischt werden. Dazu werden abwechselnd die Stempel beider Spritzen betätigt und anschließend die Mischung in eine Spritze, im vorliegenden Beispiel in die ursprünglich das Toluidinblau enthaltende Spritze, überführt. Nun wird die leere ursprünglich das H₂O₂ enthaltende Spritze entfernt. Auf die die vollständig gemischte Zusammensetzung enthaltende Spritze wird eine stumpfe Kanüle aufgeschraubt. Die Zusammensetzung kann nunmehr direkt beispielsweise einem Patienten verabreicht werden.
3. Experimenteller Nachweis der synergistischen Wirkungsweise von Toluidinblau und H₂O₂
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Optimierung eines bereits kommerziell erhältlichen Systems zur photodynamischen Therapie (Fotosan 630 CMS Dental). Durch die neue Veränderung des eingesetzten Photosensitizers Toluidinblau (Tol) zu einem Zweikomponenten-Photosensitizer bestehend aus Toluidinblau und H₂O₂ (Tol^plus), die vorzugsweise aus Stabilitätsgründen unmittelbar vor dem Einsatz gemischt und in einem Applikationsschritt eingesetzt werden, wird eine hochsynergistische antimikrobielle Wirkungsverstärkung mit einer maximalen Keimzahlreduktion (CFU = 0) erreicht.
Da die photodynamische Therapie auf mikrobielle Reinkulturen einen stärkeren antibakteriellen Effekt aufweist, wie auch eigene Ergebnisse der Erfinder belegen, in der klinischen Situation in der Mundhöhle aber immer komplexe Bakteriengemische vorhanden sind, wurden gemischte Bakterienkulturen zur Wirksamkeitstestung verwendet.
Für die konventionelle antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) und die erfindungsgemäße antimikrobielle photodynamischer Therapie (aPDT^plus) wurden folgende mikrobielle planktone Testsysteme eingesetzt:

A. Repräsentativer Bakterien-Cocktail aus Paradontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen: Streptococcus gordonii (Sg, ATCC 3339), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa, ATCC 43718), Actinomyces viscosus (Av, DSM 43798), Fusobacterium nucleatum (Fn, ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (Pg, ATCC 33277), Veillonella atypica (Va, ATCC 17744). Die CFU-Anzucht (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 5 Tage unter anaeroben Bedingungen.
B. Repräsentativer Bakterien-Cocktail aus endodontischen, Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen: Enterococcus faecalis (Ef, ATCC 19433), Actinomyces naeslundii (An, ATCC 19039), Fusobacterium nucleatum (Fn, ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (Pg, ATCC 33277). Die CFU-Anzucht (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 5 Tage unter anaeroben Bedingungen.
C. Repräsentativer kariogener Bakterien-Cocktail: humaner Nativ-Speichel mit gleichen Anteilen von Streptococcus mutans (Sm, ATCC 25175). Die CFU-Anzuchtzeit (Inkubationsdauer) bei 37°C betrug 2 Tage unter anaeroben Bedingungen.

Die Ausgangsgesamtzellzahlen der für die aPDT/aPDT^puls eingesetzten Bakteriengemische betrugen durchschnittlich 2,3 × 10⁹/ml, d.h. es wurden Keimzahlen eingesetzt, die den im Mund vorkommenden Bakteriengemischen entsprechen oder darüber liegen, um bei klinisch relevanten Bakterienlasten maximale antibakterielle Effizienzen zu evaluieren.
Für die Durchführung der photodynamischen Therapie wurden zwei kommerzielle Systeme mit den zugehörigen Bestrahlungsquellen eingesetzt: Fotosan 630 (Toluidinblau; LED 630 nm) und Helbo (Methylenblau; Laser 660 nm).
Während bei Fotosan Toluidinblau als Farbstoff nach Herstellervorgabe in der Konzentration 0,01 % verwendet wird, ist bei Helbo Methylenblau in 100-facher Konzentration (1 %) als Photosensitizer integriert. Aufgrund der hohen Farbstoffdichte schreibt die Helbo-Herstelleranweisung im Gegensatz zum Fotosan-System nach Bindung des Methylenblaus an die Zielzellen vor der Laserbestrahlung einen Spülschritt mit Kochsalzlösung vor, um eine Verschattung des Laserlichts und damit eine Beeinträchtigung des antibakteriellen photodynamischen Effektes zu vermeiden. In den von den Erfindern durchgeführten systemvergleichenden Versuchen wurden deshalb parallel zum Fotosan-System mit Toluidin (0,01 % Ausgangskonzentration, 0,009 % Endkonzentration in Tol^plus) das Methylenblau des Helbo-Systems unverdünnt (1 %) (nach Herstellerangabe), zusätzlich in 0,01 % Ausgangskonzentration, 0,009 % Endkonzentration in Met^plus sowie im Verdünnungsversuch in weiteren gleichen Konzentrationen wie jenen des Toluidins getestet.
Die Statistik der experimentellen Daten wurde nach log₁₀-Transformation der CFU/ml-Werte mittels ANOVA-Analyse und Tukey-Kramer-Test durchgeführt. Die Ergebnisse in den zugehörigen Figuren geben die Mittelwerte mit den entsprechenden 95 %-igen Konfidenzintervallen (Clu: obere Grenze; Cll: untere Grenze) wieder. Die Anzahl der Versuche lag zwischen n = 15 (4), n = 10 (3, 5–8) und n = 3 (9).
3.1 Antimikrobielle Wirkung der aPDT mit herstellerspezifischer Anwendungsvorschrift (default) auf Paradontitis-/Periimplantitits-(Paro), Wurzelkanalinfektions-(Endo) und Karies-(Kario)assoziierte Mikroorganismen

(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Fn, Pg, Va; siehe vorstehend unter A)
(Endo-Cocktail bestehend aus Ef, An, Fn, Pg; siehe vorstehend unter B)
(Kario-Cocktail bestehend aus humanen Speicherbakterien und Sm; siehe vorstehend unter C)
(3)

Bei der default-Anwendung der photodynamischen Therapie nach Herstellervorgaben von System 1 (Fotosan) und 2 (Helbo) auf Parodontitis-/Periimplantitis-, Wurzelkanalinfektions- und Karies-assoziierte Bakterien, wichen die mikrobiologischen Ergebnisse der meisten Proben deutlich von den herstellerspezifischen prognostizierten antibakteriellen Erfolgsquoten von 99 % log₁₀ CFU-Reduktion ab.

Die Ergebnisse sind in der 3 und in der Tabelle 1 dargestellt.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	2,071	1,706	1,777	0,592	0,524
Behandlung		NaCl	Paro Tol	Endo Tol	Kario Tol	Paro Met	Paro Met (0,01 %)
95 % Konf.-intervall oben	Clu	9,220	7,149	7,513	7,442	8,628	8,696
95 % Konf.-intervall unten	Cll	8,642	6,571	6,935	6,864	8,050	8,118
Mittelwert	mean	8,931	6,860	7,224	7,153	8,339	8,407
Statistik	Tukey-Test	A	B	B	B	A	A
n = 10	p-Wert (***bezüglich NaCl und Met)		p < 0,0001***	p < 0,0001***	p < 0,0001***

Tabelle 1

Insgesamt zeigt die aPDT des Fotosan-Systems mit Toluidin die bessere antibakterielle Wirksamkeit im Vergleich zum Helbo-System mit Methylenblau. Auf Parodontitis-assoziierte Bakterien bewirkte die aPDT mit Toluidin eine log₁₀ CFU-Reduktion von 99 % (2,07 log¹⁰ CFU-Einheiten), auf Wurzelkanalinfektions- und Karies-assoziierte Bakterien eine Reduktion von 85 % (1,71 log₁₀ CFU-Einheiten) und 88 % (1,78 log₁₀ CFU-Einheiten).
Die Methylenblau-basierte aPDT von Helbo hingegen zeigte statistisch signifikant schwächere antibakterielle Aktivitäten: Die Reduktion der log₁₀ CFU-Einheiten auf Paradontitis-assoziierte Mikroorganismen betrug lediglich 29 % (0,59 log₁₀ CFU-Einheiten) im Vergleich zur Herstellerangabe von 99 %, die des analog zu Toluidinblau verdünnten Methylenblaus 26 % (0,52 log₁₀ CFU-Einheiten).
Die bei endodontischen und kariogenen Erregern im Gegensatz zu parodontalpathogenen Keimen geringere log₁₀ CFU-Reduktion spiegelt die zunehmende Unempfindlichkeit dieser Bakteriengruppen gegenüber der aPDT wider.
3.2 Synergistische Wirkung des neuen Zweikomponenten-Photosensitizers Tol^plus (Tol + H₂O₂) (Fotosan 630) im aPDT^plus-System im Vergleich zum herkömmlichen aPDT-System an Parodontitis-/Periimplantitis-assoziierte Mikroorganismen (Paro)

(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(4)

Die default-Anwendung an aPDT mit dem reinen Toluidinfarbstoff (Fotosan) nach Herstellervorgabe erbrachte auch in diesen Experimenten eine CFU-Wachstumsreduktion von ca. 2 log₁₀-Einheiten. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der 4 und Tabelle 2 dargestellt.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	1,948	1,140	4,853	3,980	8,908
Behandlung		NaCl	Default (Tol_LED)	H₂O₂	H₂O_{2_}(Tol_LED)	(Tol_LED_H₂O₂	Tol^plus_LED
95 % Konf.-intervall oben	Clu	9,574	7,626	8,434	4,721	5,594	0,666
95 % Konf.-intervall unten	Cll	8,242	6,294	7,102	3,389	4,262	–0,666
Mittelwert	mean	8,908	6,960	7,768	4,055	4,928	0,000
Statistik	Tukey-Test	A	B	AB	C	C	D
n = 15	p-Wert (***bezüglich aller Proben)						p < 0,0001***

Tabelle 2

Die ausschließliche Wasserstoffperoxid-Behandlung der Bakterien führte nur zu einer CFU-Reduktion von etwa 1 log₁₀-Stufe. Die der herstellerspezifischen (default) photodynamischen Therapie vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Exposition der Bakterien resultierte in einer CFU-Abnahme um 4,9 log₁₀-Stufen, die der nach default-Vorgaben durchgeführten aPDT nachgeschaltete H₂O₂-Behandlung induzierte eine CFU-Reduktion von etwa 4 log Einheiten. Die erfindungsgemäße gleichzeitige Verabreichung von Toluidin mit H₂O₂ (Tol^plus) zeigte nach photodynamischer Behandlung mit LED-Bestrahlung den stärksten überhaupt möglichen antibakteriellen Effekt mit einer CFU-Reduktion von 8,9 log₁₀ Einheiten auf 0 und belegt damit einen maximalen antibakteriellen Synergismus der Toluidin-H₂O₂-Mischung auf die Testkeime.
3.3 Effizienzerweiterung des antibakteriellen Wirkungsspektrums der neuen Zweikom ponenten-Photosensitizer-Rezeptor Tol^plus im aPDT^plus-System auf zahnmedizinisch relevante Pathogenitätskeimgruppen
3.3.1 Parodontitis-/Periimplantitis-assoziierte Mikroorganismen

(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(5)

Auf die oben genannte Bakteriengruppe bewirkte die default photodynamische Therapie mit reinem Toluidin eine CFU-Reduktion um 2,1 log₁₀-Einheiten. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der 5 und der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	2,071	8,931
Behandlung		NaCl	Default (Tol_LED)	Tol^plus_LED
95 % Konf.-intervall oben	Clu	9,305	7,234	0,374
95 % Konf.-intervall unten	Cll	8,557	6,486	–0,374
Mittelwert	mean	8,931	6,860	0,000
Statistik	Tukey-Test	A	B	C
n = 10	p-Wert (***bezüglich aller Proben)			p < 0,0001***

Tabelle 3

Die neue Tol^plus-Formulierung des Photosensitizers reduzierte unter LED-Bestrahlung das bakterielle Koloniewachstum maximal um 8,9 log₁₀-Einheiten auf 0.
3.3.2 Wurzelkanal-assoziierte Infektionserreger

(Endo-Cocktail bestehend aus Ef, An, Fn, Pg)
(6)

Da gerade bei der Wurzelkanalbehandlung nicht eliminierte und im Wurzelkanalsystem verbliebene Mikroorganismen ein hohes Risiko bezüglich Persistenz und klinischem Misserfolg darstellen, ist die antibakterielle Effizienzverbesserung von hohem Interesse. Das antibakterielle Potential der reinen Toluidin-assoziierten photodynamischen Therapie nach Herstellervorschrift (default) belief sich auf eine CFU-Reduktion von unter einer log₁₀-Stufe (0,7). Die der default-aPDT vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Behandlung der Bakterien resultierte in einer log₁₀ CFU-Reduktion um etwa 4. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der 6 und Tabelle 4 dargestellt.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	0,683	3,944	7,907
Behandlung		NaCl	Default (Tol_LED)	H₂O₂_(Tol_LED)	H₂O₂_Tol^plus_LED
95 % Konf.-intervall oben	Clu	8,466	7,783	4,522	0,559
95 % Konf.-intervall unten	Cll	7,348	6,666	3,404	–0,559
Mittelwert	mean	7,907	7,224	3,963	0,000
Statistik	Tukey-Test	A	A	B	C
n = 10	p-Wert (***bezüglich aller Proben)				p < 0,0001***

Tabelle 4

Die erfindungsgemäß vorgestellte Photosensitizer-Rezeptur (Tol^plus) (Toluidin + H₂O₂) im Rahmen der photodynamischen Therapie bewirkte auch bei dieser Bakteriengruppe eine hochsynergistische Wirkungsverstärkung und maximal mögliche log₁₀ CFU-Reduktion um 7,9 Einheiten auf 0.
Bei diesem Keimspektrum ist für die vollständige Dekontamination eine der aPDT^plus vorgeschaltete, zusätzliche Wasserstoffperoxid-Exposition der Bakterien erforderlich. Klinisch erfolgen im Verlauf der Wurzelkanalaufbereitung in Ergänzung zur mechanischen Bearbeitung der Kanalwände wiederholte Spülschritte, so dass eine der photodynamischen Therapie (aPDT^plus) vorausgehende H₂O₂-Spülung gut integrierbar ist.
3.3.3 Karies-assoziierte Speichelbakterien

(Kario-Cocktail bestehend aus humanen Speichelbakterien und Sm)
(7)

Bei der Behandlung kariöser Läsionen kommt die photodynamische Therapie zur Desinfektion der Kavität adjuvant zur Exkavation zum Einsatz. Gerade bei der Desinfektion pulpa-naher kariöser Läsionen kann die photodynamische Therapie bei der schrittweisen Exkavation zur Schonung der Hartsubstanz und des Pulpagewebes einen wichtigen antibakteriellen Beitrag leisten. Es wird Bezug genommen auf die 7 und Tabelle 5.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	1,010	3,892	8,164
Behandlung		NaCl	Default (Tol_LED)	H₂O₂_Tol_LED in NaCl	H₂O₂_Tol^plus_LED in NaCl
95 % Konf.-intervall oben	Clu	8,387	7,377	4,494	0,223
95 % Konf.-intervall unten	Cll	7,940	6,930	4,048	–0,223
Mittelwert	mean	8,164	7,153	4,271	0,000
Statistik	Tukey-Test	A	B	C	D
n = 10	p-Wert (***bezüglich aller Proben)				p < 0,0001***

Tabelle 5

Die humanen nativen Speichelbakterien supplementiert mit Streptocuccus mutans als Haupt-Karies-Auslöser reagierten auf die default-aPDT mit einer CFU-Reduktion von nur einer log₁₀-Stufe und zeigten sich damit als sehr behandlungsunempfindlich. Eine letztendlich erfolgreiche Behandlung machte ein mehrstufiges Verfahren erforderlich, in dem ebenfalls die hochsynergistische Wirkung von Tol^plus gezeigt werden konnte. Die zusätzliche vorgeschaltete Wasserstoffperoxid-Exposition zeigte nach der Toluidinanwendung (Tol) mit LED-Bestrahlung in Kochsalzlösung eine Koloniereduktion von knapp 4 log₁₀-Einheiten. Der Einsatz des synergistischen Tol^plus (Tol + H₂O₂) im gleichen Versuchsansatz induzierte die maximale CFU-Reduktion von 8,1 log₁₀-Einheiten auf 0.
3.4 Farbstoff- und Systemvergleich von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo)
3.4.1 Einsatz von Toluidin und Methylenblau in Kombination mit H₂O₂ als Tol^plus und Met^plus im optimierten aPDT^plus-System

(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(8)

Zur Abgrenzung der Wirkungsmechanismen von Toluidin und Methylenblau im Rahmen der aPDT wurden in direktem Vergleich Versuche nach Firmenvorgaben und nach Modifikation der beiden Photosensitizer mit H₂O₂ durchgeführt. Das Ergebnis ist in der 8 und Tabelle 6 unten gezeigt.

log₁₀ CFU-Reduktion zur Kontrolle (NaCl)		Kontrolle	2,071	8,931	0,592	3,212
Behandlung		NaCl	Default (Tol_LED)	Tol^plus_LED	Default (Met_NaCl_Laser)	Met^plus_NaCl_Laser
95 % Konf.-intervall oben	Clu	9,354	7,283	0,423	8,761	6,141
95 % Konf.-intervall unten	Cll	8,508	6,437	–0,423	7,916	5,296
Mittelwert	mean	8,931	6,860	0,000	8,339	5,718
Statistik	Tukey-Test	A	B	D	A	C
n = 10	p-Wert (***bezüglich aller Proben)			p < 0,0001*

Tabelle 6

Die photodynamische Therapie nach Firmenvorschrift (default) resultierte bei Parodontitis-assoziierten Bakterien in einer CFU-Reduktion von 2 log₁₀-Stufen nach reiner Toluidin-Anwendung (Fotosan) und 0,59 log₁₀-Stufen nach reiner Methylenblau-Applikation (Helbo) (vgl. 8). Das Fotosan-System mit Toluidin zeigte damit eine statisch signifikant höhere Wirksamkeit als das Helbo-System mit Methylenblau bei Behandlung von gleichem Keimspektrum und Bakterienausgangszahl.
Die neue erfindungsgemäße Tol^plus-Rezeptur (Tol + H₂O₂) bewirkte eine hochsynergistische Maximalreduktion des Koloniewachstums von 8,9 log₁₀-Stufen auf 0. Der antibakterielle Effekt des mit Wasserstoffperoxid gemischten Methylenblaus (Met^plus, Met + H₂O₂) war zwar stärker als die default-Rezeptur (log₁₀ CFU-Reduktion von 3,2 vs. 0,59), aber statistisch signifikant geringer als der Effekt nach Tol^plus-Applikation.
3.4.2 Verdünnungsversuch von Toluidin (Fotosan) und Methylenblau (Helbo) mit Tol^plus und Met^plus im optimierten aPDT^plus-System

(Paro-Cocktail bestehend aus Sg, Aa, Av, Fn, Pg, Va)
(9)

Zur weiteren Abgrenzung der Wirkungsmechanismen von Toluidin und Methylenblau wurden in gleicher Weise Farbstoffverdünnungen in seriellen vier (1:10)-Schritten durchgeführt und nach Zugabe von H₂O₂ jeweils die spezifischen Kombinationen der gleichen Verdünnungen (Tol^plus, Met^plus) im Rahmen der aPDT^plus hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit als Photosensitizer untersucht. Das Ergebnis des Experimentes ist in der 9 und Tabelle 7 dargestellt.
Die synergistisch wirksame Tol^plus-Rezeptur (Tol + H₂O₂) (Tol^plus, Endkonzentration 0,009%) mit LED-Belichtung bewirkte in diesem Verdünnungsversuch die höchst mögliche CFU-Reduktion der parodontalpathogenen Bakterien von 8,9 log₁₀-Einheiten auf CFU 0 und zeichnete sich durch die statistisch signifikante höchst antibakterielle Wirksamkeit im Vergleich zu den entsprechend verdünnten Met^plus-Proben (Met^plus, Endkonzentration 0,009 % + H₂O₂) aus.
Selbst die 1:10 (0,0009 %) verdünnte Tol^plus-Anwendung in der photodynamischen Therapie war statistisch signifikant antibakteriell wirksamer als die gleichverdünnte Met^plus-Rezeptur. Erst ab der Verdünnungsstufe 1:100 (0,00009 %) überlappten die 95 %-igen Konfidenzintervalle der Tol^plus und Met^plus behandelten und bestrahlten Bakterienproben bezüglich ihrer Kolonieanzahl, wobei auch in den höheren Verdünnungsstufen für Toluidin tendenziell eine höhere CFU-Reduktion zu erkennen war. Beide mit Wasserstoffperoxid kombinierten Farbstoffe zeigten im Vergleich zur Negativkontrolle (Kochsalzbehandlung) bis zur Testkonzentration von (0,000009 %) noch statistisch signifikant höhere bakterielle Aktivitäten, die vermutlich auf die beiden Farbstoff-Formulierungen gemeinsame antibakterielle Wasserstoffperoxid-Aktivität zurückzuführen ist. Nur Tol^plus induzierte auch noch in der höchsten Testverdünnung (0,0000009 %) eine von der Negativkontrolle verschiedene statistisch signifikant höhere antibakterielle Wirksamkeit.
4. Vergleich Tol^plus-Met^plus
Der Farbstoff- und Systemvergleich von Toluidinblau und Methylenblau in Kombination mit Wasserstoffperoxid (Tol^plus, Met^plus) im Rahmen der photodynamischen Therapie zeigte in allen Experimenten eindeutig, dass ausschließlich Tol^plus als hochsynergistische Photosensitizer-Formulierung in der Lage war, eine bakterielle Koloniedichte von knapp 9 log₁₀ CFU-Einheiten auf 0 zu reduzieren. Die entsprechende Methylenblaukombination bewirkte zwar auch eine Abnahme der log₁₀ CFU-Einheiten, jedoch konnte ein der Toluidin-Formulierung entsprechender Effekt, nämlich die Totaleliminierung der Bakterien, in keiner Farbstoffkonzentration nachgewiesen werden. Gerade dieses Potential der Maximal-Bakterizidie von Tol^plus ist für orale chirurgische Interventionen und Infektionsbehandlungen von größter klinischer Bedeutung und Relevanz.
5. Fazit
Die Erfinder konnten anhand einer Vielzahl von Experimenten belegen, dass die Kombination von Toluidinblau und H₂O₂ eine Weiterentwicklung und hochsynergistisch wirksame Optimierung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie unter Anwendung einer Lichtquelle darstellt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Verwendung von Toluidinblau und H₂O₂ in zeitgleicher Verabreichung zur Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine zeitgleiche Verabreichung – einer ersten Lösung von ≥ ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,09 Gew.-%, weiter vorzugsweise ca. ≤ 1,0 Gew.-% Toluidinblau, und – einer zweiten Lösung von ≥ ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,3 Gew.-%, höchst vorzugsweise von ca. 3 Gew.-%, vorzugsweise ≤ ca. 5 Gew.-% H₂O₂ erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung verabreicht wird, die – Toluidinblau in einer Konzentration von ≥ ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von ≤ 32378 Mikromol/Liter, und – H₂O₂ in einer Konzentration von ≥ ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 88,2 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 882 Millimol/Liter, vorzugsweise von ≤ ca. 1470 Millimol/Liter.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Toluidinblau und/oder H₂O₂ in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vorliegt.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Behandlung einer oralen Infektion ausgelöst durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen handelt.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Parodontitis-/Periimplantitisrelevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypica; und/oder aus endodontischen, Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis; und/oder aus Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Toluidinblau und H₂O₂ zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, die – Toluidinblau in einer Konzentration von ≥ ca. 0,0291 Mikromol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 0,291 Mol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 2,91 Mikromol/Liter, weiter vorzugsweise von ≥ ca. 29,1 Mol/Liter, höchst vorzugsweise von ca. 291 Mikromol/Liter, , und vorzugsweise von ca. ≤ ca. 32378 Mikromol/Liter, und – H₂O₂ in einer Konzentration von ≥ ca. 8,82 Millimol/Liter, vorzugsweise von ≥ ca. 8,82 Millimol/Liter, höchst vorzugsweise von 882 Millimol/Liter, vorzugsweise von ≤ ca. 1470 Millimol/Liter aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Toluidinblau und/oder H₂O₂ in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen Kochsalzlösung vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherige Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Behandlung einer oralen Infektion durch zahnmedizinisch relevante Mikroorganismen handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherige Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Parodontitis-/Periimplantitis-relevanten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Streptococcus gordonii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinomycetes viscosus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Veillonella atypica; und/oder aus endodontischen, Wurzelkanalinfektions-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Enterococcus faecalis, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis; und/oder aus Karies-assoziierten Mikroorganismen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: Speichelmikroorganismen und Streptococcus mutans.
Kit zur Behandlung einer Infektion durch Mikroorganismen mittels antimikrobieller photodynamischer Therapie, aufweisend: – einen ersten Behälter enthaltend eine wässrige Lösung von Toluidinblau, und – einen zweiten Behälter enthaltend eine wässrige Lösung von H₂O₂.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der – erste Behälter eine Lösung von ≥ ca. 0,0000009 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,000009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,00009 Gew.-%, weiter vorzugsweise ≥ ca. 0,0009 Gew.-%, höchst vorzugsweise ca. 0,009 Gew.-%, und vorzugsweise ≤ ca. 1 Gew.-% Toluidinblau aufweist, und/oder der – zweite Behälter eine Lösung von ≥ ca. 0,03 Gew.-%, vorzugsweise ≥ ca. 0,3 Gew.-%, höchst vorzugsweise von 3 Gew.-%, und vorzugsweise ≤ ca. 5 Gew.-% H₂O₂ aufweist.
Kit nach Anspruch 12 oder 13, wobei der erste Behälter eine erste Auslassöffnung aufweist und der zweite Behälter eine zweite Auslassöffnung aufweist und die erste und zweite Auslassöffnung flüssigkeitsdicht miteinander verbindbar sind.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter eine erste Spritze ist und der zweite Behälter eine zweite Spritze ist, wobei die erste oder zweite Spritze an ihrer Auslassöffnung ein Außengewinde aufweist und die zweite oder erste Spritze an ihrer Auslassöffnung ein zu dem Außengewinde komplementäres Innengewinde aufweist, wobei das Kit optional zusätzlich eine Kanüle mit einem Gewinde aufweist, das komplementär zu dem Außengewinde und/oder Innengewinde ist.