CN107137723B - 一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系制备方法，采用原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米粒子方法，将柠檬酸具有核壳结构的油溶性上转换发光纳米粒子配体交换改性为水溶性，纳米粒子表面进行柠檬酸配体修饰；通过原位晶体生长的方法，在其表面均匀生长纳米金颗粒，得到原位生长纳米金修饰的上转换发光纳米粒子；将含有腙键和硫醇的聚乙二醇‑盐酸阿霉素链接到纳米金表面，即得到稀土上转换纳米体系。本发明还提供了纳米体系及其应用。本发明提供的纳米体系尺寸均一、稳定性好、生物相容性好，同时具有化疗和光热理疗的作用，可应用于上转换荧光成像、磁共振成像、抗癌药物输送和癌症的光热理疗等领域。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物材料技术领域，具体涉及一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系及其制备方法与应用。
背景技术
近些年来，荧光成像已经成为光学成像技术中的研究热点之一，这是由于荧光成像具有灵敏度高、对细胞和生物组织无损伤等优点。其中，稀土掺杂上转换发光纳米材料作为一种新型的荧光材料引起了人们的广泛关注，这是因为它通常是采用低能光激发(通常是近红外光980nm、808nm)，发射出高能光(红光、绿光、近红外光800nm)，这些优点可以消除生物背景荧光干扰。虽然，近红外激发的荧光成像从细胞到组织再到活体小动物都有很高的灵敏度，但毕竟其在组织中穿透深度是有限的，无法实现深层次组织和大动物的荧光成像。而磁共振成像(MRI)能够对组织进行三维成像，无穿透深度的限制，并且具有良好的空间分辨率。然而，MRI成像的灵敏度不够高，很难进行细胞和组织层次的成像。因此，将荧光成像和磁共振成像结合在一起，就可以同时实现成像的高灵敏度和高分辨率的结合。Gd元素作为稀土元素的一种，既可以作为上转换的基质材料，同时，由于Gd具有7个未成对的f电子，具有很好的顺磁性，被广泛应用于T1加权磁共振成像。因此，开发具有近红外荧光成像和MRI双模式成像探针将具有非常重要的意义。
在癌症诊疗技术领域，基于抗癌药物的化疗是有效的治疗手段之一。目前抗癌药物输送系统研究的热点主要集中在新型介孔纳米材料，但是由于这类纳米材料合成重复性不好、结构可控性差、药物负载率低、无靶向释放等缺点，限制了其在生物领域的应用。因此，有必要去发展其他类型的药物输送系统。其中，由于聚乙二醇良好的水溶性和生物相容性，基于pH响应的聚乙二醇的抗癌药物输送系统的巨大应用前景不容忽视。然而单一的治疗手段还不能满足现在癌症治疗的需求，所以将光热理疗与化疗相结合的协同双模态治疗手段，将大大提高癌症治疗的效果。但是，目前尚没有合适的材料及技术，能够实现这一要求。
发明内容
本发明的目的在于，是针对现有技术中的不足，提供一种用于多模态诊疗一体化的原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，实现多模式诊断和多模式治疗一体化，即荧光成像、磁共振成像、抗癌药物输送和光热理疗的一体化。
本发明的目的还在于，还提供该用于多模态诊疗一体化的高效制备方法与应用。
本发明提供的纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，可以实现将多模式的成像用于癌症疾病的诊断，并与多模式的治疗结合在一起，从而发展多模态诊断、治疗一体化，其对于癌症的协同化疗和光热理疗的技术推动作用是非常显著的。
本发明的修饰材料采用了纳米金晶体，在其他组分及制备工艺的配合下，使其不仅具有良好的生物相容性，并且具有较高的光热转换效率，成为了高效的光热转换剂，使其在原有的增强探针表面固定密度、及倍增效用之外，大幅提高了光热转换效果。
本发明的重点在于，采用配体交换的方法，用柠檬酸将具有核壳结构的油溶性上转换发光纳米粒子改性为水溶性，同时纳米粒子表面修饰有柠檬酸配体修饰；在室温下，通过原位晶体生长的方法，在其表面均匀生长纳米金晶体，得到原位生长纳米金修饰的上转换发光纳米粒子；最后，将含有腙键和硫醇的聚乙二醇-盐酸阿霉素链接到纳米金表面，即得到同时具有化疗和光热理疗协同作用的稀土上转换纳米体系。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，采用原位生长纳米金修饰的稀土上转换方法，其包括如下步骤：
(1)预备表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子，用柠檬酸钠将其改性，得到水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子；具体预备表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子；预备柠檬酸钠和二乙二醇原料，取柠檬酸钠与二乙二醇进行分散混合；预备三氯甲烷和甲苯原料，取表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子加入到三氯甲烷和甲苯，进行分散混合；将上述两种混合液混合分散，除去三氯甲烷和甲苯后，再维持2小时后，用乙醇和水离心洗涤产物，分散在高纯水中，得到水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子；
(2)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(1)制得的水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子进行分散混合；
(3)预备硼氢化钠原料，取硼氢化钠加入到步骤(2)制得的混合物进行分散混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液；
(4)预备硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素、氮-氮二甲基甲酰胺溶液，取硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行分散混合；
(5)预备磷酸，取磷酸加入到步骤(4)制得的混合物进行分散混合，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至PBS溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(6)取聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液；
(7)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换纳米体体系。
作为本发明进一步改进，所述步骤(2)至(3)具体还包括以下：
(2)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取体积比为1：1的高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(1)制得的水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(3)预备500至600μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(2)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液。
作为本发明进一步改进，所述步骤(4)至(6)具体包括以下：
(4)预备0.7至0.8g硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、0.02至0.03g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(5)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至PBS溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(6)取2.3至3mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
作为本发明进一步改进，所述表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子包括：NaYF4：Yb,Er@NaGdF4、NaYF4：Yb,Tm@NaGdF4、NaYF4：Yb,Ho@NaGdF4、以及NaYF4：Yb,Er,Tm@NaGdF4中的一种或多种。
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系，其是原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，包括聚乙二醇盐酸阿霉素前药(SH-PEG-DOX)与原位生长纳米金修饰的稀土上转换发光纳米粒子；所述聚乙二醇盐酸阿霉素前药(SH-PEG-DOX)由两端含有硫醇和酰肼的聚乙二醇和盐酸阿霉素制备而成；所述稀土上转换纳米粒子的表面包裹有惰性NaGdF4层，并且表面包覆一层惰性NaGdF4层的稀土上转换发光纳米粒子，表面还经过柠檬酸钠改性，再在其表面原位生长纳米金晶体。
作为本发明进一步改进，所述表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子包括：NaYF4：Yb,Er@NaGdF4、NaYF4：Yb,Tm@NaGdF4、NaYF4：Yb,Ho@NaGdF4、以及NaYF4：Yb,Er,Tm@NaGdF4中的一种或多种。
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用作荧光成像或磁共振成像的造影剂。
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于pH响应的药物释放。
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于光热成像。
一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于癌细胞的pH响应的药物释放和光热理疗双模式治疗。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，采用原位生长纳米金修饰的稀土上转换方法制备纳米体系，步骤少、制备过程高效、稳定、可重复性高；
(2)本发明利用柠檬酸和硼氢化钠的还原性，得到原位生长纳米金修饰的稀土上转换发光纳米粒子，该发光材料同时具有近红外荧光成像和MRI双模式成像探针的双重特点；
(3)本发明提高的原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，其分散性好、生物相容性好、光热转化效率高；
(4)本发明提供的原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系的应用，因其具有荧光/磁共振多模式成像、抗癌药物输送和光热理疗的多功能应用，可以用来实现靶向诊断和多模式治疗一体化。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和效果，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层的稀土铒掺杂的上转换纳米体系的荧光光谱图；
图2是本发明实施例2原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层的稀土铥掺杂的上转换纳米体系的TEM照片；
图3是本发明实施例7原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层的稀土铒/铥共掺杂的上转换纳米体系的磁共振成像图片；
图4是本发明实施例9原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层的稀土钬掺杂的上转换纳米体系的热成像照片。
图5是本发明实施例10原位生长纳米金修饰的上转换纳米体系的用于癌细胞的pH响应的药物释放和光热理疗双模式治疗的细胞存活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供的一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系制备方法，是采用原位生长纳米金修饰的稀土上转换的方法制备，其包括以下步骤：
(1)预备粒径在25至30nm表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铒掺杂上转换发光纳米粒子；
(2)预备1.0g柠檬酸钠和30mL二乙二醇，将柠檬酸钠与二乙二醇进行混合，在氩气中升温至110℃，维持30min；
(3)预备三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步骤(1)中表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铒掺杂上转换发光纳米粒子，将其加入到三氯甲烷和甲苯，进行分散混合；
(4)取步骤(3)制得的混合物与步骤(2)制得的混合物进行混合，在氩气中升温至130℃，混合维持1小时后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氩气氛中升温至170℃，保持2小时，反应结束后，用乙醇和水离心洗涤产物，分散在高纯水中；
(5)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取体积比为1：1的高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(4)制得的混合物进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(6)预备500μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(5)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土铒掺杂上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液(cit-UCNPs@Au)。
(7)预备0.7g硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、0.02g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(8)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(9)取2.5mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
(10)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铒掺杂上转换纳米体体系(UCNPs@Au-DOX)。
图1是本发明实施例1所制得原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铒掺杂上转换纳米体系，在980nm激光激发下的荧光光谱图，从图中均可以观察到位于540nm和654nm处的发射峰，对应于Er3+的4S3/2/2H11/2→4H15/2和4 F9/2→4I15/2跃迁，而980nm刚好位于生物组织的“光学窗口”，表明原位生长纳米金修饰的上转换纳米体系仍然保持良好的上转换荧光性能，非常适合于细胞和小动物活体成像。
实施例2：
本实施例提供的一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系制备方法，其与实施例1基本相同，其不同之处在于，其包括以下步骤：
(1)预备粒径在25至30nm表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铥掺杂上转换发光纳米粒子；
(2)预备1.0g柠檬酸钠和30mL二乙二醇，将柠檬酸钠与二乙二醇进行混合，在氩气中升温至110℃，维持30min；
(3)预备三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步骤(1)中表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铥掺杂上转换发光纳米粒子，将其加入到三氯甲烷和甲苯进行分散混合；
(4)取步骤(3)制得的混合物与步骤(2)制得的混合物进行混合，在氩气中升温至130℃，混合维持1小时后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氩气氛中升温至170℃，保持2小时，反应结束后，用乙醇和水离心洗涤产物，分散在高纯水中；
(5)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取体积比为1：1的高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(4)制得的混合物进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(6)预备550μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(5)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土铥掺杂上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液(cit-UCNPs@Au)。
(7)预备0.75g硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、0.025g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(8)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(9)取2.3mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
(10)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铥掺杂上转换纳米体体系(UCNPs@Au-DOX)。
图2是本发明实施例2中所得产品原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铥掺杂上转换纳米体系的TEM照片，从图中可以看出上转换纳米粒子周围均匀分布着纳米金晶体，说明该方法可有有效地得到形貌良好、生长均匀的原位生长纳米金修饰的稀土铥掺杂上转换纳米体系，纳米材料平均粒径约为30～50nm，因为小尺寸纳米粒子更容易被细胞内吞，有利于在生物体内循环，这对于其用于生物成像和治疗具有重要意义。
实施例3：
本实施例提供的一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系制备方法，其与实施例1及2基本相同，其不同之处在于，其包括以下步骤：
(1)预备粒径在25至30nm表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铒/铥共掺杂上转换发光纳米粒子；
(2)预备1.0g柠檬酸钠和30mL二乙二醇，将柠檬酸钠与二乙二醇进行混合，在氩气中升温至110℃，维持30min；
(3)预备三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步骤(1)中表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土铒/铥共掺杂上转换发光纳米粒子，将其加入到三氯甲烷和甲苯进行分散混合；
(4)取步骤(3)制得的混合物与步骤(2)制得的混合物进行混合，在氩气中升温至130℃，混合维持1小时后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氩气氛中升温至170℃，保持2小时，反应结束后，用乙醇和水离心洗涤产物，分散在高纯水中；
(5)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取体积比为1：1的高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(4)制得的混合物进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(6)预备600μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(5)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土铒/铥共掺杂上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液(cit-UCNPs@Au)。
(7)预备0.8g硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、0.02g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(8)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(9)取2.8mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
(10)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铒/铥共掺杂上转换纳米体体系(UCNPs@Au-DOX)。
实施例4：
本实施例提供的一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系制备方法，其与实施例1、2及3均基本相同，其不同之处在于，其包括以下步骤：
(1)预备粒径在25至30nm表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土钬掺杂上转换发光纳米粒子；
(2)预备1.0g柠檬酸钠和30mL二乙二醇，将柠檬酸钠与二乙二醇进行混合，在氩气中升温至110℃，维持30min；
(3)预备三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步骤(1)中表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土钬掺杂上转换发光纳米粒子，将其加入到三氯甲烷和甲苯，进行分散混合；
(4)取步骤(3)制得的混合物与步骤(2)制得的混合物进行混合，在氩气中升温至130℃，混合维持1小时后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氩气氛中升温至170℃，保持2小时，反应结束后，用乙醇和水离心洗涤产物，分散在高纯水中；
(5)预备高氯金酸水(1wt％)原料，取体积比为1：1的高氯金酸水(1wt％)加入到步骤(4)制得的混合物进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(6)预备550μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(5)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土钬掺杂上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液(cit-UCNPs@Au)。
(7)预备0.75g硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、0.03g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将硫醇聚乙二醇酰肼(MW：2000)、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(8)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素(SH-PEG-DOX)粉末；
(9)取3mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
(10)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土钬掺杂上转换纳米体体系(UCNPs@Au-DOX)。
实施例5：
本实施例提供的一种采用前述实施例1-4之一的方法制备的、用于多模态诊疗一体化的纳米体系，其是原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，其包括聚乙二醇盐酸阿霉素前药SH-PEG-DOX与原位生长纳米金修饰的稀土上转换发光纳米粒子；所述聚乙二醇盐酸阿霉素前药SH-PEG-DOX由两端含有硫醇和酰肼的聚乙二醇和盐酸阿霉素制备而成；所述稀土上转换纳米粒子的表面包裹有惰性NaGdF4层，并且表面包覆一层惰性NaGdF4层的稀土上转换发光纳米粒子，表面还经过柠檬酸钠改性后，在其表面原位生长而成的纳米金晶体。
所述表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子包括：NaYF4：Yb,Er@NaGdF4、NaYF4：Yb,Tm@NaGdF4、NaYF4：Yb,Er,Tm@NaGdF4以及NaYF4：Yb,Ho@NaGdF4中的一种或多种。
实施例6：
本实施例提供一种将实施例1-4制得的、实施例5提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，具体是将其用于荧光成像或磁共振成像的造影剂。
将该原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系作为造影剂，用于细胞荧光成像的方法，其包括以下步骤：
(1)预备实施例1原位生长的纳米金修饰的包裹有惰性NaGdF4层稀土铒掺杂上转换纳米体体系，用培养基配制成含300～400μg/mL的原位生长的包裹有惰性NaGdF4层纳米金修饰铒掺杂的稀土上转换纳米体系的溶液，形成第三分散液；
(2)将HeLa细胞在上述2mL培养基中培养0.5，1，2，4h；
(3)用磷酸缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的纳米材料洗去；
(4)将培养后的细胞在共聚焦显微镜上进行成像，成像过程使用0～500mW功率可调、连续波激发的稳态980nm激光器作为激发光源，收集到位于500～600nm、600～700nm的上转换发射光，用488nm激光器作为光源，收集DOX位于550-700nm的下转换发射光。
实施例7：
本实施例提供一种将实施例1-4制得的、实施例5提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，具体是将其用作制备荧光成像或磁共振成像的造影剂；该原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系用于磁共振成像的方法，其包括以下步骤：
(1)预备实施例3中原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土铒/铥共掺杂上转换纳米体系，用PBS将其配制成0～4mg/mL，超声5分钟，分散均匀，形成第四分散液；
(2)取不同浓度的第四分散液，在磁共振仪上分别测其磁共振成像。
图3是本发明实施例6所得原位生长纳米金修饰的稀土铒/铥共掺杂上转换纳米体系的磁共振成像图，通过不同Gd3+浓度对1/T1作图并线性拟合后的到得到弛豫常数r1，证实了所得原位生长纳米金修饰的稀土铒/铥共掺杂上转换纳米体系可用于磁共振成像。
实施例8：
本实施例提供一种将实施例1-4制得的、实施例5提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，具体将其用于pH响应的药物释放。
本实施例提供原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系用于pH响应的药物释放的方法，其包括以下步骤：
(1)预备实施例1原位生长纳米金修饰的包裹有惰性NaGdF4层稀土铒掺杂的上转换纳米体系，不同pH值(pH 4.5，6.0，7.4)的磷酸盐缓冲溶液，3只透析管；
(2)将(1)中的纳米体系用PBS配成3～4mg/mL，超声5分钟分散均匀，形成第五分散液；
(3)取相同浓度的第五分散液等量加入到3只透析管中，并置于不同pH的PBS缓冲溶液中，透析48h，前24h每隔2h取样，通过检测DOX在480nm处的吸收值计算出药物释放量。
实施例9：
本实施例提供一种将实施例1-4制得的、实施例5提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，是将其用于光热成像。
本实施例提供原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系用于体外光热成像的方法，其包括以下步骤：
(1)预备实施例4中的原位生长纳米金修饰的包裹有惰性NaGdF4层稀土钬掺杂的上转换纳米体系，6只玻璃样品瓶，连续激发的808nm激光器，高精度数显温度计，热成像照相机；
(2)将(1)中的纳米体系用PBS配成0-400μg/mL的溶液，超声5分钟分散均匀，形成第六分散液；
(3)分别取1mL不同浓度的第六分散液加入到6只玻璃样品瓶中，并固定于铁架台上，用1.5W/cm2的808nm激光器连续照射第六分散液，并用高精度数显温度计每隔20s记录下分散液的温度，同时用热成像照相机记录下不同时间的第六分散液的热成像照片。
图4是本发明实施例8所得的用于协同化疗和光热理疗的原位生长纳米金修饰的稀土钬掺杂上转换纳米体系用于光热成像的照片，从图中可以随着第六分散液浓度的增大，溶液温度升高的越高；同时，溶液的温度也随着照射时间延迟而升高，在8min之后，溶液的温度已趋于稳定，超过42℃证实了该纳米体系适用于癌细胞的光热理疗。
实施例10：
本实施例提供一种将实施例1-4制得的、实施例5提供的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，是将其用于癌细胞的pH响应的药物释放和光热理疗双模式治疗。
本实施例提供的原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系用于癌细胞的pH响应的药物释放和光热理疗双模式治疗的方法，其包括以下步骤：
(1)预备实施例6中第三分散液，配制成25，50，100，200μg/mL的DMEM培养基；预备实施例1中第一分散液，用DMEM配制成25，50，100，200μg/mL的培养基，形成第七分散；预备与第三分散液DOX浓度相当的纯DOX培养基，形成第八分散液；
(3)将HeLa细胞在上述培养基中分别培养4h；
(4)用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的纳米材料洗去；
(5)将培养后的细胞在用1.5W/cm2的808nm激光器连续照射8min，间隔8min再照射一次，再在培养箱中，继续培养24h。用CCK-8法，测定细胞的存活率；同时，分别钙黄绿素和碘化丙啶对活死细胞分别进行染色，用荧光显微镜分别在495nm激发下收集515nm的发射光，在528nm激发下收集617nm的激发光。
图5是本发明实施例9所得与不同浓度的第三分散液、第七分散液和第八分散液培养过后的细胞存活率。从图中，通过对照组，我们可以看出，当HeLa细胞与低浓度的第三分散液和第七分散液孵化时，其单独药物释放带来的化疗作用比单独光热理疗的效果要好，细胞存活率更低；而当HeLa细胞与高浓度的纳米体系孵化时，单独光热理疗的效果更好，细胞存活率更低。但是值得注意的是，不管是高浓度还是低浓度的样品，光照下的第三分散液的细胞存活率均最低，说明该纳米体系表现出良好的协同化疗与光热理疗的治疗效果。
本发明的重点在于，采用配体交换的方法，用柠檬酸将具有核壳结构的油溶性上转换发光纳米粒子改性为水溶性，同时纳米粒子表面修饰有柠檬酸配体修饰；在室温下，通过原位晶体生长的方法，在其表面均匀生长纳米金颗粒，得到原位生长纳米金修饰的上转换发光纳米粒子；最后，将含有腙键和硫醇的聚乙二醇-盐酸阿霉素链接到纳米金表面，即得到同时具有化疗和光热理疗协同作用的稀土上转换纳米体系。
本发明提供的原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，具有多模态诊断和多模式治疗一体化的功能，同时具有上转换发光成像、磁共振成像、pH响应抗癌药物释放和光热理疗的功能，且本发明提供的制备方法，具有工艺紧凑、高效、操作方便、结构易控、可重复性好等优势；本发明提供的纳米材料及应用，具有多种用途，并可以显著提升诊疗效果，可以实现对于癌症的协同化疗和光热理疗。
本发明不限于上述实施方式，采用与其相同或相似方法所得的其他原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系的方法，如不同稀土离子掺的上转换纳米晶(NaYF4:Yb,Er；NaGdF4:Yb,Er；NaGdF4:Yb,Tm等)、用于改性油溶性上转换纳米粒子的不同有机配体、不同结构的抗癌药物等均在本发明保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，其特征在于，其采用原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米粒子法制备，其包括如下步骤：
(1)预备表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子，用柠檬酸钠将其改性，得到水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子；
其特征在于，还包括步骤如下：
(2)预备1wt％高氯金酸水原料，取1wt％高氯金酸水加入到步骤(1)制得的水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子进行分散混合；
(3)预备硼氢化钠原料，取硼氢化钠加入到步骤(2)制得的混合物进行分散混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液；
(4)预备MW：2000硫醇聚乙二醇酰肼、盐酸阿霉素、氮-氮二甲基甲酰胺溶液，取MW：2000硫醇聚乙二醇酰肼、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行分散混合；
(5)预备磷酸，取磷酸加入到步骤(4)制得的混合物进行分散混合，直至将产物在pH8.0的PBS缓冲液中透析至PBS溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末；
(6)取聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液；
(7)取第一分散液与第二分散液进行混合，经离心、洗涤和分散得到原位生长纳米金修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换纳米体系。
2.根据权利要求1所述用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)至(3)具体包括以下：
(2)预备1wt％高氯金酸水原料，取体积比为1：1的1wt％高氯金酸水加入到步骤(1)制得的水溶性柠檬酸修饰的表面包裹有惰性NaGdF4层稀土上转换发光纳米粒子进行混合，在室温下避光搅拌2小时；
(3)预备500至600μL硼氢化钠，取硼氢化钠加入到步骤(2)制得的混合物进行混合，直至溶液至深红色，在水溶性稀土上转换发光纳米粒子表面原位生长小尺寸纳米金晶体，离心、洗涤，分散在高纯水中，形成第一分散液。
3.根据权利要求1所述用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)至(6)具体包括以下：
(4)预备0.7至0.8g MW：2000硫醇聚乙二醇酰肼、0.02至0.03g盐酸阿霉素、10mL氮-氮二甲基甲酰胺溶液，将MW：2000硫醇聚乙二醇酰肼、盐酸阿霉素与氮-氮二甲基甲酰胺溶液进行混合；
(5)预备10μL磷酸，取磷酸加入到步骤(7)制得的混合物进行分散混合，室温下避光搅拌48h，直至将产物在pH 8.0的PBS缓冲液中透析至PBS溶液不再变红，经冷冻干燥，得到两端含有腙键和硫醇的聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末；
(6)取2.3至3mg聚乙二醇盐酸阿霉素SH-PEG-DOX粉末溶解于高纯水中，形成第二分散液。
4.根据权利要求1～3之一所述用于多模态诊疗一体化的纳米体系的制备方法，其特征在于，所述表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子包括：NaYF4：Yb,Er@NaGdF4、NaYF4：Yb,Tm@NaGdF4、NaYF4：Yb,Ho@NaGdF4、以及NaYF4：Yb,Er,Tm@NaGdF4中的一种或多种。
5.一种由权利要求1～4任一项所述方法制备而成的用于多模态诊疗一体化的纳米体系，其特征在于，其是原位生长纳米金修饰的稀土上转换纳米体系，其包括聚乙二醇盐酸阿霉素前药SH-PEG-DOX与原位生长纳米金修饰的稀土上转换发光纳米粒子；所述聚乙二醇盐酸阿霉素前药SH-PEG-DOX由两端含有硫醇和酰肼的聚乙二醇和盐酸阿霉素制备而成；所述稀土上转换纳米粒子的表面包裹有惰性NaGdF4层，并且表面包覆一层惰性NaGdF4层的稀土上转换发光纳米粒子，表面还经过柠檬酸钠改性后，在其表面原位生长而成的纳米金晶体。
6.根据权利要求5所述用于多模态诊疗一体化的纳米体系，其特征在于，所述表面包裹有惰性NaGdF4层的油溶性稀土上转换发光纳米粒子包括：NaYF4：Yb,Er@NaGdF4、NaYF4：Yb,Tm@NaGdF4、NaYF4：Yb,Ho@NaGdF4、以及NaYF4：Yb,Er,Tm@NaGdF4中的一种或多种。
7.一种如权利要求5所述的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于制备荧光成像或磁共振成像的造影剂。
8.一种如权利要求5所述的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于制备pH响应释放的药物。
9.一种如权利要求5所述的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于制备光热成像材料。
10.一种如权利要求5所述的用于多模态诊疗一体化的纳米体系的应用，其特征在于，将其用于制备癌细胞的pH响应的药物释放和光热理疗的双模式诊断与治疗的药物。
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