CN116171157A

CN116171157A - 使用抗血小板剂治疗血栓形成和相关病症

Info

Publication number: CN116171157A
Application number: CN202180034756.6A
Authority: CN
Inventors: S·杰克森; S·肖恩瓦尔德
Original assignee: Heart Research Institute Ltd; University of Sydney
Current assignee: Heart Research Institute Ltd
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2023-05-26
Also published as: EP4149477A4; WO2021226677A1; CA3177787A1; AU2021271402A1; JP2023526058A; EP4149477A1; KR20230067577A; US20230226070A1

Abstract

本公开涉及抗血小板剂用于治疗受试者的血栓形成和相关病状的用途。所述抗血小板剂，优选地如TGX221或AZD6482等磷酸肌醇3‑激酶β(PI3Kβ)抑制剂可以单独施用或与溶栓剂，优选地重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)和/或抗凝剂，优选地阿加曲班(argatroban)组合施用。

Description

使用抗血小板剂治疗血栓形成和相关病症

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年5月14号提交的澳大利亚临时专利申请第2020901558号的优先权，所述澳大利亚临时专利申请的内容以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本公开涉及血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的治疗性和预防性治疗的领域。本公开提供了受试者的血栓形成以及相关病状的新的治疗性和预防性治疗，所述治疗包括向所述受试者施用抗血小板剂。所述抗血小板剂可以单独施用或与溶栓剂和/或抗凝剂组合施用。

背景技术

人们愈发意识到由广泛的各种病因造成的血栓形成的临床发病率越来越高。

血栓形成的过程是血液内的凝血因子与细胞组分之一，即血小板之间的复杂相互作用。涉及血栓形成病症的病理学以及抑制血小板功能的这些细胞片段在如心肌梗塞和中风等病状中具有保护性。血小板内的生化途径之一被称为PI 3-激酶β(PI3Kβ)。此途径的药理学拮抗剂(AZD6482)先前已被证明阻断血小板功能。现有的抗血小板疗法(阿司匹林(aspirin)和氯吡格雷(clopidogrel)等)与出血并发症相关，其中一些出血并发症可能危及生命。

发明内容

本公开基于发明人令人惊讶的发现，即抗血小板剂可以增强已知治疗对血栓形成以及相关病状的功效。因此，本公开提供了用于治疗血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的辅助疗法，所述辅助疗法包括施用抗血小板剂。

一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗血小板剂。

一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗血小板剂，并且其中所述方法进一步包括同时、顺序或单独施用溶栓剂和/或抗凝剂。

另一方面，本公开提供了抗血小板剂在制造用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的药物中的用途。

另一方面，本公开提供了抗血小板剂在制造用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的药物中的用途，其中制备所述抗血小板剂用于与溶栓剂和/或抗凝剂同时、顺序或单独施用。

另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的抗血小板剂。

另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的抗血小板剂，其中所述抗血小板剂用于与溶栓剂和/或抗凝剂同时、顺序或单独施用。

另一方面，本公开提供了一种改善向有需要的受试者施用的溶栓剂的功效的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

另一方面，本公开提供了一种降低接受溶栓剂和/或抗凝剂的受试者的出血的风险的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

另一方面，本公开提供了一种抑制接受溶栓剂和/或抗凝剂的受试者的再次血栓形成的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

另一方面，本公开提供了一种抑制受试者的再次血栓形成的方法，所述受试者已接受或被认为适合接受血栓切除术，和/或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗，和/或症状性脑出血(sICH)的风险增加，和/或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化性疾病(ICAD)或有罹患ICAD的风险，所述方法包括向所述受试者施用抗血小板剂，其中向所述受试者同时、单独或顺序施用所述抗血小板剂与溶栓剂和/或抗凝剂。

每个方面的具体实施例贯穿整个说明书进行描述，包含在从属权利要求中。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包含以进一步展示本公开的某些方面。参照这些附图中的一个或多个附图，结合本文中呈现的具体实施例的详细说明，可以更好地理解本公开。

图1展示了原位颈动脉溶栓(iCAT)中风模型。iCAT模型结合了由电解损伤诱导的颈总动脉的血栓性闭塞，以允许实时监测闭塞和再通事件(A)。在颈动脉的血栓性闭塞之后，对侧颈动脉的短暂狭窄诱导了同侧脑灌注不足，足以诱导梗塞(<25％基线流量)，可通过MCA区域之上的激光多普勒血流仪进行监测(B)。在中风发作后90分钟使用激光散斑对比成像进行脑灌注分析可高度预测24小时结果(C)，包含梗塞进展和死亡率(D)。

图2展示了由小鼠颈动脉的电解损伤诱导的闭塞性血栓形成模型(本文中称为“颈动脉血栓形成模型”)。图A提供了展示诱导血栓性闭塞和施用测试治疗剂的示意图，如本文所描述。图B示出了在实验完成时切除的小鼠颈动脉的横切面，固定并用卡斯塔莱斯染色剂(Carstair's stain)进行染色，以鉴定富含血小板(紫色)、纤维蛋白(深红色)、RBCS(橙色/棕色)和胶原蛋白(蓝色)的区域，其中左图描绘了假手术后的实验，中间图和右图描绘了电解损伤后10分钟(中)和闭塞后60分钟(右)。

图3展示了在血栓性闭塞的小鼠模型中，rt-PA疗法后短暂再通和再次血栓形成的发生。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数。在每个实验结束时，血管被切除、固定并处理用于组织学。切片使用卡斯塔莱斯染色剂进行染色，血小板染色为蓝色/紫色，纤维蛋白呈深红色/红色，红细胞染色为橙色/棕色，并且胶原蛋白/血管壁呈亮蓝色(如所描述的)。右上图示出了仅施用媒剂后的颈动脉横切面。右下图示出了施用rt-PA后的颈动脉横切面。

图4展示了抗凝剂疗法改善了tPA介导的小鼠颈动脉的再通。所述图表示展示每个指定血流类别的动物的百分比(如本文实例2所描述的)，其中n表示每个队列中共有“n”只动物。

图5展示了辅助抗血小板剂促进了rtPA介导的溶栓并减少再次血栓形成。所述图表示展示每个指定血流类别的动物的百分比，其中n表示每个队列中共有“n”只动物。治疗剂量方案：rtPA-组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；TGX221(2.5mg/kg)；AZD6482(2.5mg/kg)。

图6展示了PI 3-激酶β(PI3Kβ抑制剂TGX221和AZD6482是等效的)-当与rtPA组合以促进溶栓时，在体内实现相当的抗血小板功效。上图示出了施用rtPA与TGX221后随时间流逝的颈动脉血流。下图示出了施用rtPA与AZD6482后随时间流逝的颈动脉血流。

图7展示了抗血小板TGX221(相当于AZD6482)与抗凝剂(阿加曲班(argatroban))和溶栓剂(rtPA)的共同施用显著改善了颈动脉再通并防止再次闭塞。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数。

图8展示了TGX221/AZD6482在以下情况下没有增加尾部出血——(i)单独；(ii)当与溶栓剂(例如rt-PA)组合时；或(iii)在与溶栓剂和抗凝剂(例如阿加曲班)的三联疗法组合中。

图9展示了因特格林(Integrilin)与阿加曲班和rt-PA组合改善了再通，然而代价是出血和死亡率增加。

图10展示了使用抗血小板剂、抗凝剂和抗血栓形成剂的‘三联疗法’(此处例示为TGX221-阿加曲班-tPA)降低了脑梗塞和中风相关死亡率，具有出色的功能结果。小鼠在中风发作后5分钟静脉内用媒剂、单个、双重或三联疗法进行治疗，并恢复到24小时。根据功能缺陷(在旷场分析中使用行进距离进行评估)、脑梗塞(用TTC染色进行评估)和24小时的脑灌注对结果进行分类。相对于假手术动物的功能评估轻度、中度和重度功能。所述图表示呈现每个评分的动物的百分比(％)。

图11展示了使用抗血小板剂、抗凝剂和抗血栓形成剂的‘三联疗法’(此处例示为TGX221-阿加曲班-tPA)改善了颈动脉再通和脑灌注，并且在恢复后24小时减少梗塞体积。上排示出了中风发作后90分钟的脑灌注成像、闭塞后60分钟的颈动脉再通和施用媒剂后梗塞体积的成像。下排示出了中风发作后90分钟的脑灌注成像、闭塞后60分钟的颈动脉再通和施用TGX221-阿加曲班-tPA后梗塞体积的成像。

图12展示了使用抗血小板剂、抗凝剂和抗血栓形成剂的‘三联疗法’(此处例示为TGX221-阿加曲班-tPA和AZD-阿加曲班-tPA)改善了老化凝块的溶解。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数(每个条形底部以白色表示的值)。

具体实施方式

一般技术和定义

除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，免疫学、分子生物学、免疫组织化学、生物化学、肿瘤学和药理学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

除非另有说明，否则本公开是使用分子生物学、重组DNA技术、免疫学和药理学的常规技术进行的。此类程序描述于以下：例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,纽约的冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratories,New York),第四版(2012),全I、II和III卷；《DNA克隆：实用的方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,全I和II卷,(D.N.Glover,第二版,1995),牛津的IRL出版社(IRL Press,Oxford),全文；《寡核苷酸合成：实用的方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)》(M.J.Gait编辑1984)牛津的IRL出版社,全文；以及具体地Gait,第1-22页中的论文；Atkinson等人,第35-81页；Sproat等人,第83-115页；以及Wu等人,第135-151页；4.《核酸杂交：实用的方法(Nucleic AcidHybridization A Practical Approach)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,1985)牛津的IRL出版社,全文；《固定化细胞和酶：实用的方法(Immobilized Cells and Enzymes:APractical Approach)》(1986)牛津的IRL出版社,全文；Perbal,B.,分子克隆实用指南(1984)以及《酶学方法(Methods In Enzymology)》(S.Colowick和N.Kaplan编辑,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.),全套。

本领域的技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本公开容易进行变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。

本公开的范围不受本文所述的具体实施例的限制，这仅出于例示的目的。如本文所述，功能等效的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

本公开的任何特定方面或实施例或实施例的每个特征可以在进行必要的更改后适用于本公开的任何其它方面或实施例或实施例。

贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一个和多个)。

如本文所使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“a(一个/一种)”、“和”、以及“所述(the)”包含这些单词的复数形式。例如，对“细菌”的引用包含多个此类细菌，并且对“过敏原”的引用是对一个或多个过敏原的引用。

在本文中，术语“约”涵盖与所述术语相关的任何值的10％容差。为免生疑问，应当理解，术语“约”包含对整数的具体提及(例如，“约10”应理解为包含对10的明确提及)。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。

贯穿本说明书，可以以范围格式呈现本公开的各个方面和组分。范围格式被包含是出于方便起见，并且不应该被解释为是对本发明的范围的固定限制。因此，除非另有说明，否则对范围的描述应当被认为已经明确地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，对如1至5等范围的描述应当被认为是具有明确公开的子范围，从1至2、1至3、1至4、2至3、2至4、2至5、3至4等，以及所提及范围内的单独和部分数字，例如，1、2、3、4和5。无论所公开的范围有多广，这都适用。当需要具体值时，这些值将在说明书中指示。

贯穿本说明书，单词“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。

治疗

如本文所使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”及其变体是指被设计成在临床病理学过程期间改变所治疗的受试者或细胞的天然过程的临床干预。期望的治疗效果包含，例如降低疾病进展率、改善或减轻疾病病况以及缓解或改善预后。因此，期望的效果包含组织再灌注，或恢复通过闭塞血管的血流。如本文所使用的，术语“改善”应理解为意指受试者的死亡率降低、应答幅度增加、治疗时间减少、疾病进展减少、病理症状减少。因此，对本文所公开的治疗方法的应答改善包含本文所描述的一种或多种效果的改进。例如，本文所公开的治疗可以导致以下中的任何一种或多种的减少：血栓形成、血管阻力、血管阻塞、血管闭塞、血栓数量、整个脉管系统的血栓形成程度、一种或多种炎症介质、血清铁蛋白水平、出血、呼吸困难、或本文所公开的或已知由血栓形成引起或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状所引起的其它影响。本文所公开的治疗可以导致以下中的任何一种或多种的增加：血栓降解、血氧水平、血小板水平、凝血因子、或本文所公开的或已知由血栓形成引起或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状所引起的其它影响。减少或增加可以是任何可测量的减少或增加，并且可以相对于未接受本文所公开的治疗的受试者的所述症状的发展或发生来确定。

如本文所使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”等可以与术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”互换使用。相对于在没有本文所公开的任何治疗的情况下所述影响的发展或发生，术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”将用于意指阻碍、减少、限制或预防血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的本文所描述的一种或多种影响。

血栓形成

如本文所使用的，术语“血栓形成”包含血栓的形成。术语“血栓”意指在血管内局部形成的血小板和/或纤维蛋白以及其它血液组分的固体块。动脉血栓和静脉血栓在成分和外观上有所不同。动脉血栓通常由血小板聚集体构成，外观呈“白色血栓”，而静脉血栓主要由纤维蛋白和红细胞构成，并且因此通常称为“红色血栓”。通俗地，血栓被称为“血凝块”。

如本文所使用的，术语“治疗血栓形成”或“治疗由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状”包含溶解血栓的方法和抑制血栓形成的方法。因此，本文所公开的方法可以是治疗性的、预防性的或两者同时进行。

疾病病状

本文所公开的方法可以用于治疗血栓形成和/或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状。由血栓形成或与之相关的疾病或病状可能至少部分特征在于对脉管系统的内皮细胞损伤。损伤可能是由于各种原因。例如，损伤可能是由于对内皮细胞的物理或生物化学损害。

由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状包含但不限于：中风(具体地缺血性中风，如急性缺血性中风)、心肌梗塞(具体地急性心肌梗塞)、心绞痛、短暂性脑缺血发作、冠状动脉疾病、外周血管疾病、具有弥漫性血栓形成/血小板消耗组分的病状，如弥散性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒综合征、败血症血栓并发症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、抗磷脂综合征、肝素诱导性血小板减少症和先兆子痫/子痫；静脉血栓形成，如深静脉血栓形成、肺栓塞和静脉闭塞性疾病；血液学病状，如骨髓增生性疾病，包含血小板增多症、镰状细胞疾病、经皮冠状动脉介入术(PCI)或其它血管中的介入术、支架放置、动脉内膜切除术、冠状动脉和其它血管移植手术、手术或机械损伤的血栓并发症，如意外或手术创伤后的组织挽救、包含皮肤和肌肉皮瓣的重建手术、继发于如血管炎、动脉炎、肾小球肾炎、炎性肠病和器官移植排斥反应等血管损伤/炎症的血栓形成；如偏头痛、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)等病状；血小板可能导致血管壁中潜在炎性疾病过程的病状，如动脉粥样硬化斑块形成/进展、狭窄/再狭窄，炎性病状如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)，其中血小板和血小板衍生因子与免疫疾病过程、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)和COVID-19相关血栓形成有关。因此，本文所公开的方法可以用于治疗血栓炎性病症，或用于治疗患有急性肺损伤或有患有急性肺损伤风险的受试者。例如，由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状包含中风(具体地缺血性中风，如急性缺血性中风)、心肌梗塞(具体地急性心肌梗塞)、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)和COVID-19相关血栓形成。本文所公开的方法在治疗中风(具体地缺血性中风，如急性缺血性中风)上特别有效。本文所公开的方法在治疗心肌梗塞(具体地急性心肌梗塞)上也特别有效。本文所公开的方法在治疗深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)和COVID-19相关血栓形成上也特别有效。

应当理解，本文所公开的方法可以用于治疗血栓栓塞。栓塞可能使受试者身体的另一个器官或区域，如肺、脑、胃肠道、肾、腿或其它器官中的血管闭塞。

本文所公开的方法可以用于抑制已经患有血栓形成或血管闭塞的受试者中的再次血栓形成或再次血管闭塞。还可以应用本文所公开的方法以改善组织再灌注或恢复血流通过受试者的血管。

血栓形成可能局部发生在受试者的动脉、静脉、微脉管系统或外周脉管系统中的任何一个或多个中。

受试者

如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物，包含但不限于人、非人灵长类动物、牲畜(例如绵羊、马、牛、猪、驴)、伴侣动物(例如，如狗和猫等宠物)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)、表演动物(例如赛马、骆驼、灵缇犬)或圈养野生动物。在一个实施例中，“受试者”是人。典型地，术语“受试者”和“患者”可以互换使用，尤其是关于人受试者。

抗血小板剂

在本文所公开的方法中可以使用任何已知的抗血小板剂。另外，抗血小板剂可以通过进行一种或多种已知的血小板聚集测定来进行鉴定，其中如果测试剂抑制了血小板聚集，则将其鉴定为抗血小板剂。例如，一种合适的血小板聚集测定描述于WO2004016607。可替代地，任何可用的血小板功能分析仪(PFA)可以用于将药剂确定鉴定为抗血小板剂。PFA可商购获得，包含PFA-100(可从德国慕尼黑的西门子公司(Siemens,Munich,Germany)获得)。

本文所公开的方法中可以使用的已知抗血小板剂包含例如，乙酰水杨酸(阿司匹林，阿萨芬(Asaphen)、安特罗芬(Entrophen)、诺瓦森(Novasen))、COX-1抑制剂、P2Y12受体拮抗剂(包含例如，氯吡格雷(clopidogrel)(波立维(Plavix))、替卡格雷(ticagrelor)(布里林塔(Brilinta)、普拉格雷(prasugrel)(伊芬特(Effient))、噻氯匹定(ticlopidine)(抵克利德(Ticlid))、坎格雷洛(Cangrelor)中的任何一种或多种)、可逆或不可逆P2Y12受体拮抗剂、伊洛前列素(Iloprost)、前列环素(Prostacyclin)、磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂(包含例如双嘧达莫(Dipyridamole))、双嘧达莫/阿司匹林(阿格瑞诺(Aggrenox))、NO衍生、蛋白酶激活受体1(PAR1)抑制剂(或凝血酶受体抑制剂)(包含例如沃拉帕沙(Vorapaxar))、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂(包含例如依替巴肽(eptifibatide)(因特格林)、阿格拉司他(Aggrastat)、阿昔单抗(Abciximab)(瑞普(ReoPro))等等。由任何监管机构批准用于人治疗性用途的任何抗血小板剂可以用于本文所公开的方法和用途。因此例如，可以使用由美国FDA批准用于人治疗性用途的任何抗血小板抑制剂，例如，阿司匹林、约斯普拉拉(Yosprala)、阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班(Tirofibran)、噻氯匹定、氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、坎格雷洛、双嘧达莫、西洛他唑(Clisostazol)或沃拉帕沙。本文所公开的抗血小板剂中的任何一种或多种抗血小板剂可以以任意组合用于本文所公开的方法或用途中。

抗血小板剂可以是PI 3-激酶β抑制剂。合适的PI 3-激酶β抑制剂包含但不限于WO2004016607中描述的那些抑制剂。本文所公开的PI 3-激酶β抑制剂可以是一种式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中，

R¹是H、OH、OCH₃、OCF₃、F、Cl、CF₃、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R²是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或呈R或S构型的(CH₂)_n-芳基；

R³是以下中的一个或多个：H、F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R⁵、NO₂、CF₃、经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的芳基、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OR⁵、OSO₂-芳基、经取代的或未经取代的胺、NHCOR⁵、NHSO₂R⁵、CONHR⁵或SO₂NHR⁵；

R₄是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R⁵是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

n是1至6的整数；

X¹是C或N；

X²是C或N；并且

Y是N或O。

在一些实施例中，PI 3-激酶β抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R¹是H、OH、OCH₃、OCF₃、F、Cl、CF₃、C₁-C₆支链或直链烷基；

R²是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或呈R或S构型的芳基；

R³是以下中的一个或多个：H、F、Cl、Br、CN、CO₂H、CO₂R⁵、NO₂、CF₃、支链或直链C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的芳基、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OR⁵、经取代的或未经取代的胺、NHCOR⁵、NHSO₂R⁵、CONHR⁵或SO₂NHR⁵；

R₄是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基；

R⁵是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基；

X¹是C或N；

X²是C或N；并且

Y是N或O。

磷酸肌醇3-激酶β抑制剂可以是式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中R是H或CO₂H。

磷酸肌醇3-激酶β抑制剂可以是式IIa的化合物：

或其药学上可接受的盐。

磷酸肌醇3-激酶β抑制剂可以是式(III)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中R是H或CO₂H。R为H的式(III)的化合物也称为TGX-221。R为CO₂H的式(III)的化合物也称为AZD6482。

磷酸肌醇3-激酶β抑制剂可以是式(IIIa)的化合物：

或其药学上可接受的盐。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以选自由以下组成的组：

(±)-7-甲基-9-{[甲基(苯基)氨基]甲基}-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(4-氟苯基氨基)乙基]-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-224)；

(±)-9-(1-(3,4-双氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-237)；

(±)-9-(1-(2,5-双氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-238)；

(±)-9-(1-(3,5-双氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；

(±)-9-[l-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基吡啶并[1,2-a J嘧啶-4-酮(TGX-240)；

(±)-9-[1-(4-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-243)；

(±)-9-(1-(3,4-双氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-244)；

(±)-9-[1-(3氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-247)；

(±)-9-[l-(3-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-248)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(2-噻唑基氨基)乙基]-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-261)；

(±)-7-甲基-9-[1-(3-甲基苯基氨基)乙基]-2-吗啉-4-基-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-262)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[l-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基]吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-264)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]-吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸(KN-309)；

(±)2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯(KN-321)；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苄腈(KN-320)；

(±)-7-甲基-2-(吗啉-4-基)-9-(l-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)吡啶并[l,2-a]嘧啶-4-酮(KN-325)；以及

(±)-2-(4-吗啉基)-8[1-(苯基氨基)乙基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-280)。

在一些实施例中，PI 3-激酶β抑制剂选自由以下组成的组：

(±)-2-(4-吗啉基)-8[1-(苯基氨基)乙基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-280)，

或其药学上可接受的盐。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以选自由以下组成的组：

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苄腈；

(±)2-({l-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯；以及

(±)-7-甲基-2-(吗啉-4-基)-9-(l-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基)乙基)吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮，

或其药学上可接受的盐。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以是(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸或其药学上可接受的盐。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以是(-)-2-({1R-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸或其药学上可接受的盐。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以是(+)-2-({1S-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸或其药学上可接受的盐。

(-)-2-({1R-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸也称为AZD6482。AZD6482可从商业供应商获得，如MedChemExpress公司(MedChemExpress)(澳大利亚)和开曼化学公司(Cayman Chemical)(美国)。

式(I)、式(II)和式(IIa)的化合物可以通过WO 2004016607中描述的方法进行制备。当这些化合物包含手性中心时，所描述的方法和用途扩展到包含所有对映异构体和非对映异构体，以及其以任何比例的混合物。本文所描述的方法和用途进一步扩展到分离的对映异构体(例如，式(III)和式(IIIa)的化合物)或对映异构体对。分离对映异构体和非对映异构体的方法是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，所述化合物是外消旋混合物。在其它实施例中，化合物以对映异构体纯的形式存在。式(III)和式(IIIa)的化合物可以通过WO 2009093972中描述的方法进行制备。

所述PI 3-激酶β抑制剂可以是对映异构体纯的(-)2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸或其药学上可接受的盐。

如本文所使用的，术语“对映异构体纯的”意指基本上不含另一个对映异构体的(-)2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸，即2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸的(+)-对映异构体。包含(-)2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸的2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸的单个对映异构体以及获得单个对映异构体的方法描述于WO 2009093972。术语“对映异构体纯的”意指例如2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸的对映异构体之一的对映异构体过量(ee)≥95％。在一些实施例中，本发明的2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸的纯对映异构体可以以高对映异构体纯度获得，例如≥99.8％对映异构体过量(ee)，例如99.9％ee的(-)2-[(lR)-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-25 4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸。

所述对映异构体纯的(-)2-[(1R)-1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[l,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸可以呈中性形式。中性形式可能更稳定，更容易处理和储存，更容易纯化并且更容易以可重复的方式合成。

本发明进一步涉及对映异构体纯的(-)2-[1-(7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基)乙基氨基]苯甲酸或其药学上可接受的盐，其呈可以为无定形、至少部分地结晶或基本上结晶的固态。结晶形式可能更稳定，更容易处理和储存，并且更容易纯化和更容易以可重复的方式合成。示例固态形式描述于WO 2009093972。

在此说明书的上下文中，术语“烷基”是指直链或支链饱和脂肪烃自由基。优选地，烷基具有1至6个碳，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等所例示。烷基任选地被选自以下的一个或多个基团取代：卤素，如F、Cl、Br或I；CN；CO₂R⁵；NO₂；CF₃；经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基；经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基；经取代的或未经取代的芳基；OCF₃、OR⁵、经取代的或未经取代的胺；NHCOR⁵；NHSO₂R⁵；CONHR⁵；或SO₂NHR⁵，其中R⁵是H、经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的芳基。

术语“环烷基”是指非杂环(即，碳环)或杂环。在此方面非杂环的实例是经取代的或未经取代的环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环己二酮、环戊二酮、醌等。合适的杂环烷基包含经取代的或未经取代的吡咯烷、哌啶、哌嗪、2-哌啶酮、氮杂环己烷-2-酮和吗啉基团。环烷基任选地在一个或多个位置处被以下取代：卤素，如F、Cl、Br或I；CN；CO₂R⁵；NO₂；CF₃，经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基；经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基；经取代的或未经取代的芳基；OCF₃、OR⁵、经取代的或未经取代的胺；NHCOR⁵；NHSO₂R⁵；CONHR⁵；或SO₂NHR⁵，其中R⁵是H、经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的芳基。

术语“芳基”是指芳香族环或杂芳香族环。芳基的实例是吡咯烷、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、呋喃、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、1,2,3,4-噁三唑、1,2,3,5-噁三唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,2,5-噻二唑、1,3,4-噻二唑、1,2,3,4-噻三唑、1,2,3,5-噻三唑、四唑、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、茚、萘、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、萘啶、蝶啶、芴、咔唑、咔啉、吖啶、吩嗪和蒽。芳基任选地在一个或多个位置处被以下取代：卤素，如F、Cl、Br或I；CN；CO₂R⁵；NO₂；CF⁵，经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基；经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基；经取代的或未经取代的芳基；OCF₃、OR⁵、经取代的或未经取代的胺；NHCOR⁵；NHSO₂R⁵；CONHR⁵；或SO₂NHR⁵，其中R⁵是H、经取代的或未经取代的C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的芳基。

如本文所使用的，术语“选择性PI 3-激酶β抑制剂”是指抑制PI 3-激酶β比PI 3-激酶家族的其它异构体有效至少≥10倍，优选地≥20倍，更优选地≥30倍的化合物。“选择性PI 3-激酶β抑制剂”化合物被理解为与如L Y294002或渥曼青霉素(wortmannin)等常规和通常指定为PI 3-激酶β抑制剂的化合物相比，对于PI 3-激酶β更有选择性。选择性抑制PI 3-激酶β表达或活性的任何类型的化合物可以用作本发明的方法中的选择性PI 3-激酶β抑制剂。

式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)和式(IIIa)的化合物也都包含水合物和溶剂化物。溶剂化物是由溶剂的分子与化合物缔合形成的络合物。

化合物可以以药学上可接受的盐的形式使用。此类盐是本领域的技术人员熟知的。S.M.Berge等人在《药物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)》,1977,66:1-19中详细描述了药学上可接受的盐。通过使游离碱化合物与合适的有机酸反应，药学上可接受的盐可以在化合物的最终分离和纯化期间原位制备或单独地制备。合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或由有机酸制备。此类无机酸的实例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。适当的有机酸可以选自脂肪族、脂环族、芳香族、杂环族、羧酸和磺酸类有机酸，其实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、富马酸、马来酸和吡咯酸。化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包含由锂、钠、钾、镁、钙、铝和锌制成的金属盐，以及由如胆碱、二乙醇胺和吗啉等有机碱制成的有机盐。

式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)和式(IIIa)的化合物还扩展到包含具有可以在体内裂解以提供化合物的生理可裂解的离去基团的所有衍生物。

溶栓剂

如本文所使用的，术语“溶栓剂”包含在帮助溶解血栓中药理学上有效的酶或化合物。溶栓剂可以是一种溶栓剂或多于一种溶栓剂的组合。可以用于本文所描述的方法和用途的合适的溶栓剂的实例包含组织纤溶酶原激活剂，替奈普酶(tenectoplase)、链激酶(streptokinase)、尿激酶(urokinase)、瑞替普酶(reteplase)、尿激酶原(prourokinase)、阿尼普酶(anistreplase)或其它已知纤维蛋白溶酶或化合物中的一种或多种。然而，本领域技术人员可以理解，上面未提及的其它溶栓剂也将合适于在本文所公开的方法中使用。

例如，溶栓剂可以是组织纤溶酶原激活剂(tPA)或其变体(也称为纤维蛋白激酶；外源性纤溶酶原激活剂；t-PA；TPA；

)。tPA包含重组tPA。tPA可以从商业供应商处获得，如/>

可从加利福尼亚州南旧金山的基因泰克公司(Genentech,South SanFrancisco,California)获得的阿替普酶(alteplase)。可替代地，tPA可以重组产生或由来源纯化。

另一个示例溶栓剂是替奈普酶(也称为TNKase和Metalyse)。替奈普酶是人组织纤溶酶原激活剂(tPA)的修饰形式，与纤维蛋白组合并且将纤溶酶原转化为纤溶酶并且通过重组DNA技术产生。

另一个示例溶栓剂是链激酶(也称为链球菌溶纤维蛋白酶；纤溶酶激酶；

和/>

)，由水解-CONH-连接(肽键)的溶血链球菌精心加工的酶，并且是纤溶酶原的激活剂，因此产生溶解纤维蛋白的纤溶酶。链激酶可以重组产生或由来源纯化。

又另一个示例溶栓剂是尿激酶(也称为

和/>

)。尿激酶是将纤溶酶原激活为纤溶酶并且存在于哺乳动物血液和尿液中的丝氨酸蛋白酶。

又另一个示例溶栓剂是尿激酶原(酶激活)(也称为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂；单链尿激酶原；scu-PA；pro-UK；pro u-PA；PUK；

)。尿激酶原是尿激酶的单链酶原形式，具有内在溶栓活性，并且由约411个氨基酸残基组成，分子量为约50,000道尔顿。尿激酶原可以从尿液或从肾组织培养物中提取并纯化或可以重组产生。

本文所公开的溶栓剂中的任何溶栓剂可以与单个抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)组合(即，同时、顺序或单独施用)用于本文所公开的方法和用途。本公开证实了通过将溶栓剂与抗血小板剂(并且具体地与磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)组合施用，可以实现特定优势。

另外，本文所公开的溶栓剂中的任何溶栓剂可以与抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)以及抗凝剂(包含本文所公开的如肝素等抗凝剂中的任何抗凝剂)组合(即，同时、顺序或单独施用)用于本文所公开的方法和用途。本公开还证实了通过将溶栓剂与抗血小板剂(并且具体地与磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)以及抗凝剂组合施用，可以实现特定优势。此类优势包含例如，减少受试者的出血(或降低出血风险)，或减少出血增加(或降低出血风险的增加)，这通常伴随着抗凝剂和/或溶栓剂的施用。因此，抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂的组合施用(即，同时、顺序或单独施用)(并且具体地，抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂中的每一种的组合施用)已在本文中示出向受试者施用是安全的。本文所公开的组合疗法的有利安全特性表示了对先前使用的可替代的治疗方案的改进。

抗凝剂

如本文所使用的，术语“抗凝剂”包含在预防或减少血液凝固中药理学上有效的酶或化合物。抗凝剂也可以被称为血液稀释剂。本文所描述的方法和用途涵盖使用选自由以下组成的组的一种或多种抗凝剂：维生素K拮抗剂(或香豆素抗凝剂)、低分子量肝素(LMWH)、直接凝血酶抑制剂(DTI)或Xa因子抑制剂。LMWH包含例如，贝米肝素(Bemiparin)、舍托肝素(Certoparin)、达肝素(Dalteparin)、依诺肝素(Enoxaparin)、那曲肝素(Nadroparin)、帕那肝素(Parnaparin)、瑞维肝素(Reviparin)和亭扎肝素(Tinzaparin)。DTI包含例如，来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班、达比加群(dabigatran)和抗凝血酶III。比伐卢定(安高玛斯(Angiomax))可用作注射用粉末。阿加曲班(阿科瓦(Acova))可用于通过注射施用。达比加群(普拉达萨(Pradaxa))可用于口服施用。抗凝血酶III(Thrombate III)可用作注射用粉末。Xa因子抑制剂包含例如，阿哌沙班(apixaban)、磺达肝癸钠(fondaparinux)、利伐沙班(rivaroxaban)和依度沙班(edoxaban)。阿哌沙班(艾乐妥(Eliquis))可用于口服施用。磺达肝癸钠(阿里克斯特拉(Arixtra))可用于通过注射施用。利伐沙班(拜瑞妥(Pradaxa))可用于口服施用。依度沙班(萨瓦伊萨(Savaysa))可用于口服施用。本文所描述的方法和用途还涵盖使用选自由以下组成的组的一种或多种抗凝剂：华法林(warfarin)、阿加曲班、水蛭素和肝素。

以上抗凝剂中的任何抗凝剂可以用于本文所公开的方法和用途。因此，抗凝剂可以是维生素K拮抗剂、香豆素抗凝剂、LMWH、DTI或Xa因子抑制剂中的任何一种或多种。抗凝剂可以是本文所公开的特定抗凝剂中以任何组合的任何一种或多种抗凝剂。本文所公开的抗凝剂中的任何抗凝剂可以与单个抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)组合(即，同时、顺序或单独施用)用于本文所公开的方法和用途。另外，本文所公开的抗凝剂中的任何抗凝剂可以与抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)以及溶栓剂(包含本文所公开的如tPA等溶栓剂中的任何溶栓剂)组合(即，同时、顺序或单独施用)用于本文所公开的方法和用途。

本领域技术人员可以理解，上面未列出的另外的抗凝剂也将适用于在本文所描述的方法和用途。

施用

术语“施用(administration of)”和/或“施用(administering)”化合物应理解为意指向需要治疗的个体提供本公开的化合物。可以通过任何合适的方式提供化合物。例如，本文所公开的药剂或化合物中的任何一种或多种药剂或化合物可以静脉内或动脉内施用。

本公开的方法可以在接受溶栓剂和/或抗凝剂之前，在受试者接受溶栓剂和/或抗凝剂时，或在受试者接受溶栓剂和/或抗凝剂之后进行。在一个实例中，受试者正在接受溶栓剂和/或抗凝剂。在一个实例中，受试者已开具溶栓剂和/或抗凝剂，但仍待接受溶栓剂和/或抗凝剂。在一个实例中，受试者已接受溶栓剂和/或抗凝剂，例如正在用溶栓剂和/或抗凝剂进行治疗。在一个实例中，受试者正在接受溶栓剂组织纤溶酶原激活剂和抗凝剂。所述抗凝剂可以是例如肝素或阿加曲班。在另一个实例中，受试者已接受溶栓剂组织纤溶酶原激活剂，并且然后施用抗凝剂组合抗血小板剂。

可以在特定患者群体中进行本公开的方法。例如，受试者可能已经历或即将经历一种或多种适于治疗中风(例如，急性缺血性中风)的程序。此类程序的非限制性实例包含血栓切除术(也称为血管内血栓切除术或EVT)、支架置入术或本领域已知的任何其它合适的程序。

可以对已接受血栓切除术(例如，经由动脉导管)的受试者进行本公开的方法。可以对被认为适合接受血栓切除术的受试者进行本公开的方法，例如通过满足当前的指南，包含但不限于颈内动脉、近端大脑中动脉(MCA)M1段的大血管闭塞(LVO)，或在中风症状发作后6小时或最多24小时内出现颈动脉和颅内大动脉的串联闭塞。血栓切除术是使用凝块取出装置的程序，所述凝块取出装置可以用于去除可能对溶栓有抵抗力的血栓，例如大的脑血管中的血栓。可以使用任何合适的凝块取出装置，例如支架取出器，或任何合适的、可商购获得的凝块取出装置。受试者可能在血栓切除术后再通不良或再通失败。受试者可能在血栓切除术后经历脑灌注不足。受试者可能在血栓切除术后经历了再次闭塞。受试者可能在血栓切除术后经历血流减少。受试者可能在血栓切除术后经历再次血栓形成，或者在通过血栓切除术去除一个或多个血栓后出现一个或多个另外的血栓。

可以对已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗的受试者进行本公开的方法。可以使用任何合适的支架，例如颅内支架、自膨胀颅内动脉粥样硬化支架等。受试者可能已经历永久性颅内支架置入术。受试者可能已接受多于一个支架。

可以对症状性脑出血(sICH)的风险增加的受试者进行本公开的方法。出血性转化和其更严重的形式，实质性出血(PH)，是急性中风治疗的并发症。“sICH”可以定义为治疗的36小时内介入后非增强CT扫描(sICH的经修改SITS-MOST定义)的实质性血肿(PH)I型或II型，或缺血区外出血，与NIHSS(美国国立卫生研究院中风量表)≥4分恶化相关。“sICH”的可替代定义将由本领域技术人员理解。

可以对已被诊断患有颅内动脉粥样硬化疾病(ICAD)或有罹患ICAD风险的受试者进行本公开的方法。ICAD在非裔美国人、亚洲人(中国、日本、韩国、印度)和西班牙裔人群中非常普遍。可以对已被诊断患有动脉粥样硬化病变和/或颅内血管内血管狭窄的受试者进行本公开的方法。

可以向已接受或被认为适合接受血栓切除术的受试者，或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗的受试者，或症状性脑出血(sICH)的风险增加的受试者，或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化疾病(ICAD)或有罹患ICAD风险的受试者施用抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)与本文所公开的抗凝剂中的任何抗凝剂的组合中的任何组合施用。

类似地，可以向已接受或被认为适合接受血栓切除术的受试者，或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗的受试者，或症状性脑出血(sICH)的风险增加的受试者，或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化疾病(ICAD)或有罹患ICAD风险的受试者施用抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)与本文所公开的溶栓剂(如tPA)中的任何溶栓剂的组合中的任何组合施用。

进一步地，可以向已接受或被认为适合接受血栓切除术的受试者，或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗的受试者，或症状性脑出血(sICH)的风险增加的受试者，或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化疾病(ICAD)或有罹患ICAD风险的受试者施用抗血小板剂(如磷酸肌醇3-激酶β抑制剂，包含式(I)、式(II)、式(IIa)、式(III)或式(IIIa)的抑制剂)与本文所公开的抗凝剂中的任何抗凝剂以及本文所公开的溶栓剂(如tPA)中的任何溶栓剂的组合中的任何组合施用。

本文所公开的方法和用途涉及在合适的起点施用，如抗血小板剂等药剂。合适的起点可以由治疗医疗团队确定，例如，基于受试者表现出的症状(包含一个或多个生物标志物)。评估症状的合适方法是本领域已知的。例如，当受试者表现出以下症状中的任何一种或多种症状时，可以施用抗血小板剂：血管阻力增加；血氧水平降低；血栓降解产物水平升高；一种或多种炎性标志物水平升高；血清铁蛋白水平升高；血小板水平降低；凝血因子水平降低；出血增加；要求机械通气。抗血小板剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的12小时内开始。例如，抗血小板剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的0.5、1、2、4、4.5、5、6、8、10或12小时内开始。例如，抗血小板剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的2或4.5小时内开始。例如，抗血小板剂可以在符合条件的患者中在1、2、3、4.5、9或24小时内开始。例如，抗血小板剂可以在符合条件的患有急性中风和/或急性心肌梗塞的患者中在1、2、3、4.5、9或24小时内开始。可替代地，抗血小板剂可以在受试者表现出本文所公开的症状中的任何一种或多种症状后尽快施用。抗血小板剂可以施用足以达到有益治疗结果(例如，本文所公开的症状中的任何一种或多种症状的改善)的持续时间。抗血小板剂可以施用以下持续时间，所述持续时间相当于本文所公开的溶栓剂或抗凝剂中的任何溶栓剂或抗凝剂的施用持续时间，或者以其它方式施用以治疗血栓形成，如中风。抗血小板剂可以施用以下持续时间，例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约24小时、约48小时、约一周、约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月或约六个月。

在一些实例中，本文所公开的方法和用途涉及向受试者施用抗血小板剂，其中向受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂与溶栓剂和/或抗凝剂。抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的12小时内开始。例如，抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的0.5、1、2、4、4.5、5、6、8、10或12小时内开始。例如，抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的1、2、3、4.5、9或24小时内开始。例如，抗血小板剂、溶栓剂和/或抗凝剂可以在受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的2或4.5小时内开始。

施用药剂可以在合适的终点停止。合适的终点可以由治疗医疗团队确定，例如，基于受试者表现出的症状(包含生物标志物)。例如，当受试者表现出以下症状中的任何一种或多种症状时，可以停止抗血小板剂：血管阻力降低；血氧水平升高；血栓降解产物水平降低；一种或多种炎性标志物水平降低；血清铁蛋白水平降低；血小板水平升高；凝血因子水平升高；出血减少；不再要求机械通气。

血管阻力的变化可能是肺血管阻力的变化。确定血管阻力的方法在本领域中是已知的。一种此类方法是基于超声心动图的使用。可替代地或另外地，可以使用经导管。可以使用侵入性或非侵入性方法。血氧水平降低可能需要经由面罩或机械呼吸机或经由插管向受试者施用氧气。可以监测任何合适的血栓降解产物。例如，血栓降解产物可以是如D-二聚体等纤维蛋白降解产物。可以监测任何合适的炎性标志物。例如，一种或多种炎性标志物可以包括C反应蛋白、血浆粘度和红细胞沉降率。

剂量

本文所公开的药剂可以以任何治疗有效量施用于受试者。如本文所使用的，术语“治疗有效量”包含无毒但足够量的用于提供期望的治疗效果的相关药剂或化合物。应理解，期望的治疗效果可以是期望的预防性效果。本领域技术人员应理解，所需的药剂或化合物的确切量可以基于许多因素而变化，但可以由本领域技术人员确定。在本文所公开的药剂先前已知适于以已知剂量(如批准剂量)进行施用的情况下，已知剂量可以用于本文所公开的方法。还应理解，鉴于本文中已经证实的抗血栓形成剂和/或抗凝剂的改进的功效是由于与抗血小板剂共同施用的结果，因此本文所公开的方法中使用的抗血栓形成剂和/或抗凝剂的剂量可以相对于先前使用的(如先前批准的)剂量减少。

当抗血小板剂是式(III)或式(IIIa)的化合物时，抗血小板剂可以以适于维持0.5微摩尔与1.5微摩尔之间或0.8微摩尔与1.2微摩尔之间的血浆浓度的剂量施用。例如，抗血小板剂可以以适于维持约1微摩尔血浆浓度的剂量施用。式III或式(IIIa)的化合物可以以30mg至185mg的剂量施用于受试者，例如在三小时时间段内。例如，式(III)或式(IIIa)的化合物可以以121.5mg、30.38mg、60.75mg或182.25mg的剂量施用于受试者，例如在三小时时间段内。

更通常地，PI 3-激酶β抑制剂的治疗有效量预计在每kg体重约0.05mg至约100mg的范围内，或在每kg体重约0.05mg至约50mg的范围内，或在每kg体重约0.05mg至约25mg的范围内，或在每kg体重约0.5mg至约10mg的范围内，或在每kg体重约0.5mg至约5mg的范围内。本领域技术人员将能够例如基于达到期望血浆浓度所需的量确定PI 3-激酶β抑制剂的治疗有效量。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与如t-PA等溶栓剂共同施用。溶栓剂可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。向受试者施用的t-PA的剂量取决于所治疗的病状。t-PA可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。例如，用于治疗成人急性缺血性中风的推荐剂量是以0.9mg/kg(最大90mg)的剂量进行静脉(IV)施用，在60分钟内进行输注，在1分钟内将总剂量的10％作为初始IV团注施用。对于肺栓塞，成人的推荐剂量是在2小时内静脉内施用100mg，当部分凝血活酶时间或凝血酶时间恢复到正常两倍或更少时，在t-TPA输注快结束时或结束之后立即开始或恢复肝素疗法。对于急性心肌梗塞，推荐剂量基于患者的体重，并且不应超过100mg。

当静脉内施用(任选地与全氟化学乳液一起)溶栓剂tPA时，在一个实例中，tPA的治疗有效量是在三小时时间段内静脉内施用的约10mg至150mg的范围内。优选以在第一小时内施用60mg(其中6mg至10mg在1分钟至2分钟内作为团注进行施用)，在第二小时内施用20mg，并且在第三小时内施用20mg，来施用100mg的剂量。对于较小的患者(小于65Kg)，可以在3小时内施用1.25mg/Kg的剂量。参见例如，《医师案头参考(PHYSICIAN'S DESKREFERENCE)》,新泽西州奥拉德尔的医学经济学公司(Medical Economics Company Inc.,Oradell,New Jersey),988-989(1989)，所述文献的内容通过引用并入本文。

在本文所描述的方法中，根据用于t-PA的产品信息，抗血小板剂可以向已施用或正在施用组织纤溶酶原激活剂的受试者施用。组织纤溶酶原激活剂可以以0.6mg/kg至0.9mg/kg的剂量静脉内施用。以0.6mg/kg至0.9mg/kg的剂量静脉内施用。

在本文所公开的方法和用途中，溶栓剂可以以低剂量施用。令人惊奇的是，抗血小板剂与溶栓剂的共同施用可以减少达到治疗效果所需的溶栓剂的剂量，例如，可以使用一半或四分之一剂量的溶栓剂(相对于产品信息中提供的剂量)。这具有降低出血风险的优势，并且尤其是当与改变血小板功能的如阿司匹林等抗凝剂或药剂一起施用时。因此例如，溶栓剂可以是tPA，其可以以低剂量施用。例如，tPA的剂量可以小于约0.9mg/kg、或小于约0.8mg/kg、或小于约0.7mg/kg、或小于约0.6mg/kg、或小于约0.5mg/kg、或小于约0.4mg/kg、或小于约0.3mg/kg、或小于约0.2mg/kg、或小于或等于约0.1mg/kg。在其它实施例中，tPA的剂量可以介于约0.1mg/kg与约0.9mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.8mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.7mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.6mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.5mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.4mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.3mg/kg之间、或介于约0.1mg/kg与约0.2mg/kg之间。在一个实施例中，tPA的剂量为约0.6mg/kg。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与链激酶共同施用。向受试者施用的链激酶的剂量取决于所治疗的病状。链激酶可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。例如，用于成人急性MI的推荐剂量是在60分钟内静脉内输注1,500,000单位的总剂量。对于肺栓塞、DVT、动脉血栓形成或栓塞的治疗，推荐的成人治疗是优选地在7天内静脉内施用150,000单位的负荷剂量，该负荷剂量在30分钟内输注入到外周静脉中。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与替奈普酶共同施用。向受试者施用的替奈普酶的剂量取决于所治疗的病状。替奈普酶可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。推荐剂量基于体重，并且施用是在5-10秒内通过IV团注注射。最大剂量为10,000IU(50mg)。替奈普酶在心肌梗塞后溶栓方面的临床功效与阿替普酶(rt-PA)类似。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与瑞替普酶共同施用。向受试者施用的瑞替普酶的剂量取决于所治疗的病状。瑞替普酶可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。瑞替普酶可以作为lO+lO U双团注注射进行施用。10U的瑞替普酶对应于17.4mg的瑞替普酶蛋白质块。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与阿尼普酶共同施用。向受试者施用的阿尼普酶的剂量取决于所治疗的病状。阿尼普酶可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。推荐剂量为两至五分钟内静脉内施用30个单位。

本文所描述的方法和用途中使用的抗血小板剂可以与尿激酶共同施用。向受试者施用的尿激酶的剂量取决于所治疗的病状。尿激酶可以根据任何监管机构批准的产品信息进行施用。例如，详细说明批准剂量和适应症的产品信息可在线公开获得，如由监管机构(包含FDA)或由如MIMS等药物资源。用于成人肺栓塞的推荐剂量是10分钟内4,400IU/kg的负荷剂量，随后12小时内4,400IU/千克/小时的维持剂量。

所属领域的技术人员应了解，在不脱离本公开的一般宽范围的情况下，可以对上述实施例作出许多变化和/或修改。因此，本发明的实施例应被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。

不应因为对本说明书中包含的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论在每个所附权利要求的优先权日期之前就已经存在而将其视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本公开相关的领域中的公知常识。

实例

现在将通过参考以下非限制性实例进一步描述本文所公开的发明。

实例1：由小鼠颈动脉的电解损伤诱导的闭塞性血栓形成(随后在指示的情况下进行中风诱导)。

如下制备实验性小鼠模型。

材料

rtPA购自勃林格殷格翰有限公司(Boehringer Ingelheim Pty Ltd)(澳大利亚新南威尔士州北莱德(North Ryde,NSW,Australia)，如先前所描述进行透析和活动评估(Samson,Nevin和Medcalf.《血栓形成与止血杂志(JTH.)》2008.6(12):2218-2220)。因特格林(依替巴肽)源自拜耳先灵公司(Schering)，而阿加曲班(阿加特拉(Argatra))购自三菱制药(Mitsubishi Pharma)。

动物和手术准备

C57Bl/6J小鼠购自澳大利亚生物资源公司(Australian BioResources)(澳大利亚新南威尔士州商业登记注册处(ABR,NSW,Australia))，或在澳大利亚悉尼大学(theUniversity of Sydney,Australia)的实验动物服务(the Laboratory Animal Services，LAS)进行繁殖。所有动物都在12小时明/暗循环条件下进行饲养，其中随意进食和饮水。对于所有研究，使用了年龄为8-12周龄(20-30g)之间的雄性小鼠。所有研究都根据出于科学目的护理和使用动物的澳大利亚业务守则(《出于科学目的护理和使用动物的国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)澳大利亚守则(National Health and Medical ResearchCouncil(NHMRC)Australian code for the care and use of animals for scientificpurposes)》,第8版堪培拉(Canberra:国家卫生和医学研究委员会(2013))的要求，由悉尼大学动物伦理委员会(the University of Sydney Animal Ethics Committee)(2014/647；2018/1343；2018/1331)批准。

用5％异氟醚诱导麻醉，并且在整个程序期间经由鼻锥以1.5-2.5％(1-1.2升/分钟)的氧气维持。在切口部位处施加局部麻醉剂(1％利多卡因(Xylocaine)，澳大利亚新南威尔士州的阿斯利康公司(AstraZeneca,NSW,Australia))。使用反馈控制的热毯(英国肯特郡的哈佛仪器有限公司(Harvard Apparatus Ltd.,Kent,UK))将直肠温度维持在37℃。在程序前施加Poly Visc^TM润滑眼膏(澳大利亚新南威尔士州的爱尔康实验室有限公司(Alcon Laboratories Pty Ltd,NSW,Australia))。将小鼠放置在立体定位框架中，以允许在用于成像的俯卧位与用于颈动脉手术操作的仰卧位之间旋转(SGM-4头支架用于小鼠，日本成重科学仪器实验室(Narishige Scientific Instrument Laboratory,Japan))。

在颈部腹侧开一个内侧切口以进入左右颈动脉，其中一条或两条颈动脉与迷走神经和周围结缔组织分离。将超声多普勒血流探针连接到左颈动脉以监测血流(0.5mm内径，MC0.5PSB-NH-JN-WC60-CRA10-GA，美国纽约州的跨音速系统公司(Transonic SystemsInc,NY,USA))。将血流探针连接到多普勒流量计(TS420，美国纽约州的跨音速系统公司)，使用PowerLab数据采集系统(澳大利亚新南威尔士州的埃德仪器公司(ADInstruments,NSW,Australia))记录数据。使用LabChart软件(版本7.0，澳大利亚新南威尔士州的埃德仪器公司)记录平均血流量，并且根据体重(毫升/分钟/100克)进行校正。

颈动脉的血栓性闭塞

电解损伤诱导了左颈动脉的血栓形成(颈动脉血栓形成模型)，如先前所描述(图1和2A)(Sturgeon.S.A.JC、Angus.J.A.、Wright.C.E.“folts和动脉血栓形成的电解方法在小动物抗血栓形成分子研究中的适用(Adaptation of the folts and electrolyticmethods of arterial thrombosis for the study of anti-thrombotic molecules insmall animals)”.《药理毒理学方法杂志(Journal of Pharmacological andToxicological Methods)》.2006；53:20-29；Mangin P、Yap CL、Nonne C、Sturgeon SA、Goncalves I、Yuan Y等人“凝血酶克服了与血小板gpvi/fcrγ缺乏相关的血栓形成缺陷(Thrombin overcomes the thrombosis defect associated with platelet gpvi/fcrgamma deficiency)”.《血液学(Blood.)》2006；107:4346-4353；Schoenwaelder SM、OnoA、Sturgeon S、Chan SM、Mangin P、Maxwell MJ等人“鉴定独特的调节血小板中整合素αiibβ3粘合功能的合作磷酸肌醇3-激酶信号传导机制(Identification of a unique co-operative phosphoinositide 3-kinase signaling mechanism regulating integrinalpha iib beta 3adhesive function in platelets)”.《生物化学杂志(J Biol Chem.》2007；282:28648-28658；Schoenwaelder SM等人“14-3-3ζ调节了与血小板磷脂酰丝氨酸暴露和促凝血功能相关的线粒体呼吸储备(14-3-3zeta regulates the mitochondrialrespiratory reserve linked to platelet phosphatidylserine exposure andprocoagulant function)”.《自然通讯(Nature Communications)》.2016；7:1-15)。为了实施电解损伤，在左颈动脉下方放置了钩形铂电极，并且在远端夹住颈动脉以诱导瘀滞(微型小弹簧镊夹具，18055-05，加拿大的精细科学工具公司(Fine Science Tools,Canada))。使用病变制造装置(53500型，意大利弗吉尼亚州科梅里奥的乌戈巴西勒公司(Ugo Basile,Comerio,VA,Italy))通过铂电极连续递送电流(8mA)，持续3分钟，并且在损伤期间不断用盐水冲洗所述部位，以使电流有效地传导到血管。受伤后立即松开夹具，更换血流探针，并且监测血流闭塞(通过血流量减少至0毫升/分钟/100克指示)。使用卡斯塔莱斯染色剂评估由电解损伤引发的血管损伤(图2B)，导致发生富含纤维蛋白(红色)和血小板(紫色)的血栓。

递送溶栓和辅助疗法

在稳定颈动脉闭塞后15-20分钟经由颈静脉内递送溶栓和辅助疗法。小鼠被随机分配以进行治疗，操作员对治疗分配不知情。治疗包含rtPA(10mg/kg；30分钟内1mg/kg团注+9mg/kg输注)、水蛭素(单次团注0.3mg/kg)、因特格林(4mg/kg重复团注，间隔15分钟)或阿加曲班(80μg/kg团注；40微克/千克/分钟输注)的单个或联合方案。所有治疗均与rtPA疗法同时递送。使用哈佛设备泵(目录号704504；澳大利亚新南威尔士州的Pump Elite 11I/W单注射器泵)递送治疗。治疗开始后同时监测颈动脉血流和LDF持续60分钟。

另外的用于缺血性中风诱导的手术程序

用于中风诱导的对侧颈动脉短暂狭窄

颈动脉闭塞十分钟后(定义为0毫升/分钟/100克的流量)，开始结扎诱导的右(对侧)颈动脉狭窄，以在缺血持续期间(25、45、60分钟)减少同侧灌注＜基线的25％，而维持对侧灌注>基线的25％。用激光多普勒血流计(LDF)连续监测灌注。缺血后，切除结扎以恢复通过对侧颈动脉的最大血流，并且在闭塞后使动物恢复持续24小时，并评估脑梗塞和功能结果。

脑灌注监测

用激光散斑对比成像(LSCI)和激光多普勒血流计(LDF)通过小鼠颅骨进行脑灌注监测。沿头皮、中线上方和前囟上开纵向切口，在耳朵之间开横向切口，以使皮肤收缩。

(i)激光散斑对比成像(LSCI)：脑灌注的激光散斑对比成像(LSCI)(指定的通量单位)是使用moor FLPI-2血流成像仪和相关软件(Moor FLPI-2测量V1.1，英国的摩尔仪器公司(Moor Instruments,UK))获得的。在颈动脉操作前(3分钟，“基线”)、对侧狭窄后15-30分钟(“双侧闭塞/狭窄后”)和闭塞后24小时(3分钟，“24小时”)进行成像。每个记录周期以30秒的间隔捕获图像，时间过滤器为250帧(1帧/10秒)，并且曝光时间为20毫秒。针对每只小鼠的“基线”读数调整增益，并用于每个后续读数(增益范围：最小145，最大180)。使用MoorFLPI-2Review V4.0软件(英国的摩尔仪器公司)进行分析。通过沿着眼窝到λ之间的矢状缝线，沿着人字缝和颞肌边界追踪，从生成的颅骨彩色图像创建半球兴趣区(ROI)。再通之后和24小时的通量值表示为每个半球平均基线通量的百分比。

ii)激光多普勒血流计(LDF)：对于手术程序期间的灌注监测，如先前所描述的使用LDF进行修改(Tomkins AJ等人《在栓塞性中风的大鼠模型中，富含血小板的凝块对通过溶栓疗法进行裂解具有抗性(Platelet rich clots are resistant to lysis bythrombolytic therapy in a rat model of embolic stroke)》.《实验和转化中风医学(Experimental and Translational Stroke Medicine)》.2015；7:1-9)。在基线LSCI测量之后，将定制的2×2×2mm硅胶探针支架中的两个光纤激光多普勒探针(P10d和VP10M200ST，英国的摩尔仪器公司)固定在颅骨表面。将探针定位在大脑中动脉(MCA)区域的每个半球中：前囟后侧1mm以及颞肌边界外侧1mm。使用连接到PowerLab和Labchart软件的moorVMS-LDF2(英国的摩尔仪器公司)分析灌注，允许直接与iCAT颈动脉血流数据进行比较。“基线”计算为受伤前5分钟的平均灌注，并且所有后续记录均以基线的百分比表示。在程序期间获得连续的LDF测量值，直到右颈动脉夹具或狭窄被移除后10分钟。然后取出探针支架以进行双侧闭塞/狭窄后LSCI。

术后恢复

小鼠在闭塞后恢复持续24小时，以评估脑梗塞(TTC染色)。小鼠手术后在恢复后2-24小时在温暖的环境(26-28℃)中恢复，其中加热柜(目录号ASSWC24；澳大利亚新南威尔士州的艾伯乐科技公司(Able Scientific,NSW,Australia))用于控制过夜恢复期间的术后温度。

脑梗塞评估

为了对中风体积进行定量，用异氟醚深度麻醉小鼠并经心灌注冷盐水。取出大脑并使用Kopf小鼠脑块切成2mm的连续冠状脑切片。将脑切片在37℃下在含1％的2,3,5-氯化三苯四唑(TTC，美国密苏里州的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,MO,USA))的盐水中温育14分钟(每侧7分钟)。在10％中性缓冲福尔马林中过夜固定后，在平板扫描仪(爱普生完美V700(Epson Perfection V700))上对脑切片进行成像，并使用Image J软件进行梗塞分析。在切割的切片中，对前四个切片进行定量以评估脑梗塞。对实验组不知情的研究者对梗塞体积进行定量。计算每个切片顶部和底部的总面积和梗塞面积，并且然后取平均值以提供每个切片的总体积和病变体积。梗塞体积表现为整个大脑病变体积的总和。

实例2：rt-PA疗法后的短暂再通和再次血栓形成。

C57BL/6雄性小鼠通过手术制备用于电解损伤和静脉内治疗施用。如实例1和图2所描述的诱导闭塞性血栓形成。颈动脉闭塞后15分钟，如实例1所描述的递送rtPA(10mg/kg)，或仅递送媒剂(盐水/羟乙基哌嗪乙磺酸)。治疗开始后监测血流，持续60分钟，并且如实例1所示对再通进行分类。简而言之，再通通过血流回流确定，并且分类为稳定再通(稳定流量)、不稳定再通(波动流量)、短暂再通伴随再次闭塞或没有再通。

结果展示于图3中。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数。在每个实验结束时，血管被切除、固定并处理用于组织学。切片使用卡斯塔莱斯染色剂进行染色，血小板染色为蓝色/紫色，纤维蛋白呈深红色/红色，红细胞染色为橙色/棕色，并且胶原蛋白/血管壁呈亮蓝色(如所描述的)。

此数据证实，rtPA可以在大约25％的血管中诱导颈动脉的凝块溶解和再通，但是这种再通是短暂的，并且大多数血管在治疗后再次闭塞。因此，此数据证实，rt-PA单一疗法诱导小鼠颈动脉的短暂再通，并且纤维蛋白溶解后的再次血栓形成与发生富集血小板的血栓相关。

实例3：抗凝剂疗法改善了tPA介导的小鼠颈动脉的再通。

C57BL/6雄性小鼠接受如实例1所描述的颈动脉血栓形成模型程序，其中利用标准损伤参数(8mA，3分钟)在颈动脉中诱导了闭塞性血栓形成。所施用的治疗包含单独媒剂(盐水/羟乙基哌嗪乙磺酸)或双重疗法(rtPA加水蛭素；rtPA加阿加曲班)，在中风诱导发作开始后5分钟(对应于颈动脉闭塞后15分钟)进行静脉内递送。rtPA以10mg/kg(团注/输注方案)进行施用，水蛭素(0.3mg/kg)作为单次团注给予，而阿加曲班作为团注输注(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60分钟)给予。

结果展示于图4中。所述条形图表示展示每个指定血流类别的动物的百分比(如实例2所描述的)，其中n表示每个队列中共有“n”只动物。

此数据证实，抗凝剂(此处使用水蛭素或阿加曲班进行例示)与rt-PA的组合改善了溶栓并减少血管再次闭塞。在不希望受理论约束的情况下，这可能是由于水蛭素和阿加曲班抑制从溶解的凝块释放的凝血酶的能力。值得注意的是，rt-PA疗法后形成的血栓富含血小板。

实例4：辅助抗血小板剂促进了rtPA介导的溶栓并减少再次血栓形成。

在C57BL/6雄性小鼠的颈动脉中诱导电解损伤，并且在颈动脉闭塞后15分钟施用溶栓疗法，如实例1所描述的。所施用的治疗包含单独媒剂(盐水/羟乙基哌嗪乙磺酸)、双重疗法(rtPA加TGX221；rtPA加AZD6482)。治疗剂量方案如下：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；TGX221(2.5mg/kg)；AZD6482(2.5mg/kg)。治疗开始后监测再通，持续60分钟，并且如实例2所描述的表征闭塞。

结果展示于图5中。所述图表示展示每个指定血流类别的动物的百分比，其中n表示每个队列中共有“n”只动物。此数据证实，抗血小板剂(此处使用两种PI3Kβ抑制剂中的每一种——TGX221和AZD6482进行例示)与rtPA共同施用改善了溶栓和血管再次闭塞，超过单独使用rtPA所达到的。

实例5：PI3Kβ抑制剂TGX221和AZD6482是等效的-当与rtPA组合以促进溶栓时，在体内实现相当的抗血小板功效。

在C57BL/6雄性小鼠的颈动脉中诱导电解损伤，并且在颈动脉闭塞后15分钟施用溶栓疗法，如实例1所描述的。施用的治疗包含rtPA加TGX221与rtPA加AZD6482的比较。治疗开始后监测再通，持续60分钟，并且如实例2所描述的表征闭塞。血流痕迹取自7个独立实验中的一个代表性实验。治疗剂量方案如下：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；TGX221(2.5mg/kg)；AZD6482(2.5mg/kg)。

结果展示于图6中。此数据证实，PI3Kβ抑制剂TGX221和AZD6482是等效的抗血小板剂，并且与rtPA组合使用在体内达到了类似的功效，均有效增强了再通。

实例6：抗血小板TGX221(相当于AZD6482)与抗凝剂(阿加曲班)和溶栓剂(rtPA)的共同施用显著改善了颈动脉再通并防止再次闭塞。

C57BL/6雄性小鼠通过手术制备用于电解损伤和静脉内治疗施用，如实例1所描述的。利用标准电解损伤参数(8mA，3分钟)在C57BL/6小鼠的颈动脉中诱导了闭塞性血栓形成。在颈动脉闭塞后15分钟静脉内递送单个、双重或三联疗法，其中闭塞的特征在于没有血流通过颈动脉(0毫升/分钟)。治疗开始后监测血流，持续60分钟，并且如实例2所概述对再通进行分类。治疗给药方案如下：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；Arg-阿加曲班(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60分钟)；^#Integ-因特格林(4mg/kg，每15分钟团注一次)；^aTGX221(2.5mg/kg；剪掉前15分钟单次团注)。

结果展示于图7中。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数。这些研究首次证实了三联疗法(抗凝剂加抗血小板剂(此处使用TGX221进行例示)与溶栓剂(此处使用rtPA进行例示)的共同施用对改善再通以及减少溶栓剂诱导的溶栓(例如，rtPA介导的溶栓)后再次闭塞的显著益处。

实例7：TGX221在以下情况下没有增加尾部出血——单独；当与溶栓剂(例如rt-PA)组合时；或在与溶栓剂和抗凝剂(例如阿加曲班)的三联疗法组合中。

使用3mm尾部剪掉测定评估出血。在尾部出血开始前10分钟施用药物治疗(团注)。当使用30分钟输注时，输注结束后立即开始尾部出血实验。药物施用后，使用手术刀片取出3mm长的尾尖切片，并且将尾尖浸入温热的盐水中。监测出血直至停止并记录时间。监测尾巴另外2分钟，以确保所述尾巴不会再次出血。如果尾巴确实再次出血，则还会记录再次出血的时间长度。当出血停止至少2分钟或去除尾尖后30分钟时，实验结束。使用2种方法定量血红蛋白[(i，ii)使用Abs 575nm；(iii)按照制造商的说明使用比色血红蛋白测定(西格玛奥德里奇公司，血红蛋白测定试剂盒MAK115)]。治疗给药方案如下：rtPA(10mg/kg：30分钟内1mg/kg团注，9mg/kg输注)；因特格林(1-10mg/kg，每15分钟团注一次)；TGX221(2.5mg/kg；剪掉前15分钟单次团注)；Arg-阿加曲班(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60)。另外：(i)最初进行因特格林的剂量应答研究，以表征此抑制剂在小鼠血液/血小板中的作用。施用3.0和4.0mg/kg因特格林^TM分别导致PPACK-抗凝PRP中ADP诱导的聚集的大约60％(‘中风’剂量)和80％(‘AMI’剂量)抑制，并且因此用于进一步的实验以检查单独或与rtPA组合的功效。数据呈现为平均值±SEM。

结果展示于图8中。这些研究证实，当TGX221(相当于AZD6482)与溶栓剂(此处使用rt-PA进行例示)一起施用时，即使使用非常高剂量的rt-PA–20mg/kg，出血特性也有希望。这与因特格林形成鲜明对比，当因特格林单独施用(3mg/kg及以上)或与rt-PA(10mg/kg)组合施用时，会导致出血显著增加。此外，此数据突出了TGX221当用于与溶栓剂(此处使用rt-PA进行例示)和抗凝剂(此处使用阿加曲班进行例示)组合的三联疗法组合中时的令人印象深刻的安全性。

实例8：因特格林与阿加曲班和rt-PA组合改善了再通，然而代价是出血和死亡率增加。

C57BL/6小鼠接受iCAT程序用于中风诱导。简而言之，在C57BL/6小鼠的颈动脉中诱导电解损伤，并且在闭塞后15分钟施用溶栓疗法，如实例1所描述的。治疗开始后监测再通，持续60分钟，并且如实例2所描述的表征闭塞。动物恢复到24小时。治疗剂量方案如下：rtPA–组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；阿加曲班(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60分钟)；因特格林(4mg/kg，每15分钟团注一次)。结果展示于图9A中。所述图表示展示每个指定血流类别的动物的百分比，其中n表示每个队列中共有“n”只动物。术后恢复的死亡率被定量为队列的百分比，并且当与仅施用媒剂或rtPA/阿加曲班队列(低于30％)相比时，rtPA/阿加曲班/因特格林队列中的死亡率显著增加(>50％)。

另外，在开始治疗施用后15分钟，进行尾部横断(3mm)，并且将尾尖浸入温热(37℃)盐水中，以从尾部收集血液(如“方法”中所描述的)。在30分钟内评估血流，并且记录任何血流停止和再出血的时间段。所有小鼠在剪掉后30分钟停止血液监测和采集。按照制造商的说明(西格玛奥德里奇公司，血红蛋白测定试剂盒MAK115)使用比色血红蛋白测定评估收集样品中的血红蛋白含量。使用相对于媒剂的单向ANOVA分析数据。结果展示于图9B中。条形图描绘了平均值±SD，其中^***P<0.0005，^nsP>0.05。

这些研究证实，抗血小板剂因特格林与溶栓剂rtPA和抗凝剂阿加曲班的组合增强了被血栓闭塞的颈动脉的稳定再通。然而，将因特格林与rtPA和阿加曲班组合的溶栓益处伴随着出血的增加。这些结果证实了将特定的抗血小板剂TGX221或AZD6482与溶栓剂(如rtPA)和抗凝剂(如阿加曲班)组合作为促进溶栓的安全选择的另外的优势。

实例9：rtPA、阿加曲班和TGX221的‘三联疗法’降低了脑梗塞和中风相关死亡率，具有出色的功能结果。

C57BL/6小鼠接受假手术或颈动脉血栓形成模型程序，以及用于缺血性中风诱导的另外的手术程序，如实例1所描述的。小鼠在中风发作后5分钟静脉内用媒剂、单个、双重或三联疗法进行治疗，并恢复到24小时。根据功能缺陷(在旷场分析中使用行进距离进行评估)、脑梗塞(用TTC染色进行评估)和24小时的脑灌注对结果进行分类。相对于假手术动物的功能评估轻度、中度和重度功能。治疗给药方案如下：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；阿加曲班(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60分钟)；TGX221(2.5mg/kg；单次团注)。结果在图10中示出。所述图表示呈现每个分数的动物的百分比(％)。总n：未处理＝19；rtPA/阿加曲班＝19；rtPA/阿加曲班/TGX221＝6；rtPA/水蛭素＝8。

这些发现突出了用抗血小板剂(此处通过TGX221进行例示)、抗凝剂(此处通过阿加曲班进行例示)和抗血栓形成剂(此处通过tPA进行例示)的组合进行治疗导致血管再通率高，脑灌注改善，梗塞负担减轻并功能恢复改善(参见例如实例10)。重要的是，这种抗血小板剂、抗凝剂和抗血栓形成剂(此处通过TGX221-阿加曲班-tPA疗法进行例示)的三联组合疗法没有诱导出血并发症，并大大降低了24小时内与中风相关的死亡率。当用啮齿动物的改良Rankin量表(mRS)进行评估时，大多数用TGX221-阿加曲班-tPA进行治疗的动物中的轻度效果突出了这种抗血小板剂、抗凝剂和抗血栓形成剂(此处通过TGX221-阿加曲班-tPA疗法进行例示)的三联组合疗法带来的总体改善。

实例10：rtPA、阿加曲班和TGX221的三联疗法改善了颈动脉再通和脑灌注，并且在恢复后24小时减少了梗塞体积。

C57BL/6雄性小鼠接受了颈动脉血栓形成模型程序，以及用于缺血性中风诱导的另外的手术程序，如实例1所描述的。随后以下给药方案进行静脉内治疗施用：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；Arg-阿加曲班(80μg/kg团注；40微克/千克/分钟输注60分钟)；TGX221(2.5mg/kg；单次团注)。图11中展示了具体结果。

图11中的图像表示了媒剂和三联疗法治疗的代表性实验的中风结果(如实例9所描述的)，展示了三联疗法后中风结果的改善，所述中风结果的改善包含脑再灌注改善(左)，颈动脉闭塞后的血流改善(再通)和恢复后的脑梗塞减少。此数据提供了进一步的证据，证实用抗血小板剂(此处通过TGX221进行例示)、抗凝剂(此处通过阿加曲班进行例示)和抗血栓形成剂(此处通过tPA进行例示)的组合治疗导致治疗性结果的改善。

实例11：rtPA、阿加曲班和TGX221的三联疗法改善了老化凝块的溶解。

C57BL/6雄性小鼠通过手术制备用于电解损伤和静脉内治疗施用，如实例1所描述的。利用标准电解损伤参数(8mA，3分钟)在C57BL/6小鼠的颈动脉中诱导了闭塞性血栓形成。在颈动脉闭塞后15、120或270分钟静脉内递送单个、双重或三联疗法，其中闭塞的特征在于没有血流通过颈动脉(0毫升/分钟)。治疗开始后监测血流，持续60分钟，并且如实例2所概述对再通进行分类。治疗给药方案如下：rtPA–重组组织纤溶酶原激活剂(10mg/kg)；Arg-阿加曲班(80ug/kg团注；40微克/千克/分钟输注60；^*80ug/kg团注；80微克/千克/分钟输注60分钟)；TGX221(2.5mg/kg；单次团注15分钟；^TGX221/^AZD(2.5mg/kg；2倍团注-间隔15分钟)。

图12中展示了结果。条形图表示呈现为具有每个血流类别的动物的百分比，其中“n”表示所分析的实验总数。这些研究首次证实了rtPA、抗凝剂(阿加曲班)加抗血小板剂(TGX221或AZD6482)的三联疗法组合的共同施用对改善旧凝块的再通的显著益处，所述旧凝块对rtPA介导的溶解产生抗性。所述研究还证实了rtPA、抗凝剂(阿加曲班)加抗血小板剂(TGX221或AZD6482)的三联疗法组合在4.5小时的老化凝块中提供的益处，所述老化凝块对rtPA/阿加曲班双重疗法溶解的施用无应答。

Claims

1.一种治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗血小板剂，并且其中所述方法进一步包括同时、顺序或单独施用溶栓剂和/或抗凝剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括同时、顺序或单独施用溶栓剂和抗凝剂。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗血小板剂是磷酸肌醇3-激酶β抑制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述磷酸肌醇3-激酶β抑制剂是式II的化合物或其药学上可接受的盐：

其中R是H或CO₂H。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述磷酸肌醇3-激酶β抑制剂是式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐：

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶栓剂是组织纤溶酶原激活剂。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是治疗遭受脉管系统的内皮细胞损伤或有遭受脉管系统内皮细胞损伤风险的受试者的方法。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有所述受试者的动脉、静脉和/或微脉管系统中的血栓形成。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是治疗中风或急性心肌梗塞的方法。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受或被认为适合接受血栓切除术，和/或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗，和/或症状性脑出血(sICH)的风险增加，和/或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化疾病(ICAD)或有罹患ICAD的风险。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者已施用溶栓剂，并且在停止施用组织纤溶酶原激活剂之后施用所述抗血小板剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗血小板剂与抗凝剂同时施用。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述受试者表现出以下症状中的任何一种或多种症状时，施用所述抗血小板剂：

-血管阻力增加；

-血氧水平降低；

-血栓降解产物水平升高；

-一种或多种炎性标志物水平升高；

-血清铁蛋白水平升高；

-血小板水平降低；

-凝血因子水平降低；

-出血增加；

-要求机械通气。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述受试者表现出以下症状中的任何一种或多种症状时，停止施用所述抗血小板剂：

-血管阻力减小；

-血氧水平增加；

-血栓降解产物水平降低；

-一种或多种炎性标志物水平降低；

-血清铁蛋白水平降低；

-血小板水平增加；

-凝血因子水平增加；

-出血减少；

-不再要求机械通气。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中

-所述血管阻力是肺血管阻力；

-所述血氧水平降低需要经由面罩或机械呼吸机或经由插管向所述受试者施用氧气；

-所述血栓降解产物是D-二聚体；和/或

-所述一种或多种炎性标志物包括C反应蛋白、血浆粘度和红细胞沉降率。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中在所述受试者表现出所述症状中的任何一种或多种症状的12小时内开始用所述抗血小板剂进行治疗。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是预防性治疗方法。

18.根据权利要求17所述的方法，其中同时、单独或顺序向所述受试者施用所述抗血小板剂与抗凝剂。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗血小板剂是式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐：

所述式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐以30mg至185mg的剂量向所述受试者施用。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述式IIIa的化合物以121.5mg的剂量向所述受试者施用。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述式IIIa的化合物向所述受试者静脉内施用。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述式IIIa的化合物向所述受试者静脉内施用持续3个小时。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者已静脉内施用或正在静脉内施用0.6mg/kg至0.9mg/kg剂量的组织纤溶酶原激活剂。

24.一种抗血小板剂在制造用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的药物中的用途，其中制备所述药物用于与溶栓剂和/或抗凝剂同时、顺序或单独施用。

25.一种用于治疗有需要的受试者的血栓形成或由血栓形成引起或与之相关的疾病或病状的抗血小板剂，其中所述抗血小板剂用于与溶栓剂和/或抗凝剂同时、顺序或单独施用。

26.根据权利要求24所述的用途或根据权利要求25所述的供使用的抗血小板剂，其由权利要求2至23中任一项的特征进行修饰。

27.一种改善向有需要的受试者施用的溶栓剂的功效的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

28.一种降低接受溶栓剂和/或抗凝剂的受试者的出血的风险的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

29.一种抑制接受溶栓剂和/或抗凝剂的受试者的再次血栓形成的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或顺序施用抗血小板剂。

30.一种抑制受试者的再次血栓形成的方法，所述受试者已接受或被认为适合接受血栓切除术，和/或已用支架进行治疗或将要用支架进行治疗，和/或症状性脑出血(sICH)的风险增加，和/或已被诊断患有颅内动脉粥样硬化性疾病(ICAD)或有罹患ICAD的风险，所述方法包括向所述受试者施用抗血小板剂，其中向所述受试者同时、单独或顺序施用所述抗血小板剂与溶栓剂和/或抗凝剂。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述抗血小板剂是磷酸肌醇3-激酶β抑制剂。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述磷酸肌醇3-激酶β抑制剂是式II的化合物或其药学上可接受的盐：

其中R是H或CO₂H。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述磷酸肌醇3-激酶β抑制剂是式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐：

34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中所述溶栓剂是组织纤溶酶原激活剂。

35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中所述方法包括同时、顺序或单独施用抗血小板剂、溶栓剂和抗凝剂。