CN116165388A - 一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及临床医学检验技术领域，且公开了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：1)样本预处理；2)红细胞裂解液重悬；3)加入细胞表面抗体孵育；4)固定破膜；5)加入细胞内部抗体孵育。该组织和体液标本处理方法，创新性的提出了多种体液标本处理技术，结合临床和动物实验标本的多样性，建立了尿液、粪便、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物12种体液标本的处理技术，从这些标本直接获取组织内炎症免疫效应细胞，是探讨组织局部免疫病理过程的一种比较安全和有用的检查方法，给无法进行手术切除组织，也无法进行组织穿刺检测的患者带来福音。

Description

一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法
技术领域
本发明涉及临床医学检验技术领域，具体为一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法。
背景技术
近几年肿瘤微环境的研究逐渐成为大家关注的热点，进而肿瘤浸润免疫细胞(T II Cs)进入大家的视野，T I I Cs与血液中的免疫细胞是两个概念，T I I Cs才是战斗在抗肿瘤细胞“一线”的战士，如果能从T I I Cs得到关于疾病早期诊断，治疗方案，预后判断的信息，对于临床和基础研究来说意义重大，基于流式细胞平台检测的T I I Cs主要涉及组织标本和体液标本两方面。
在组织标本方面：目前，学者们已经建立了适用于流式细胞平台的T I I Cs提取技术，例如从肺癌[1]，结直肠癌[2]，胃癌[3]，胰腺癌[4]等组织中提取T I I Cs，进行T II Cs表面抗原检测，其特点是：只检测表面抗原，不需要固定破膜，也不需要将荧光抗体导入细胞内部，即可直接进行流式细胞平台检测，对标本处理技术要求不高。
而对于流式细胞平台固定破膜检测项目，若使用现有的组织标本处理方法，会出现以下问题：1.会导致固定破膜操作时免疫细胞的细胞膜破裂，细胞裂解成碎片，导致固定破膜失败，无法进行流式细胞分析；2.固定破膜成功的，在导入荧光抗体后进行检测时出现细胞变形，无法划分细胞类型，不能满足检测需要；3.现有技术因不涉及细胞内部代谢靶蛋白的检测项目，会存在淋巴细胞分离液、商售血清等试剂的使用，影响细胞代谢状态从而造成检测结果的偏倚，不适用于检测项目；4.部分病人因各种原因无法进行手术切除的，只能进行穿刺诊断，现有的组织标本处理局限于新鲜组织或者蜡块组织，对组织块有量的要求，标本取材方面受到限制。
在体液标本检测方面：目前国内外还没有使用流式细胞平台检测体液标本免疫细胞内靶蛋白的体液标本处理技术方法，故而，提出了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法来解决上述问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，解决了多种类型临床标本和动物实验标本的处理技术难点，从而得到可用于固定破膜后进行细胞内代谢蛋白质和关键酶检测的肿瘤浸润免疫细胞(T I I Cs)悬液，实现基于流式细胞平台，构建T I I Cs代谢轮廓的目的，同时，为不同疾病患者和动物模型提供了便捷多样的取材方式，实现了从不同类型标本的角度构建T I I Cs立体代谢模型，寻找有价值的生物标志物的目的，从而成为临床诊断、分型、预后、分期、治疗和监测不可或缺的工具。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：
1)样本预处理；
2)红细胞裂解液重悬；
3)加入细胞表面抗体孵育；
4)固定破膜；
5)加入细胞内部抗体孵育。
优选的，所述样本分为组织样本和体液样本，所述组织样本分为软组织样本和硬组织样本。
优选的，所述软组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)尼龙网上搓成单细胞悬液；
4)细胞滤网过滤；
5)离心，去除组织细胞；
6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
优选的，所述软组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴2-18分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加0-37℃的1ⅹPBS冲洗，直至将组织搓完；
3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2m l红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2m l的0-37℃的1ⅹPBS，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0-37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
优选的，所述硬组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)酶解成单细胞悬液；
4)离心，去除组织细胞；
5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
优选的，所述硬组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在0-37℃1ⅹPBS中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入5-6倍的酶解液，35-39℃摇床消化30-40分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用0-37℃的1ⅹPBS冲洗3次；
3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml0-37℃1ⅹPBS，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0-37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
优选的，所述体液标本的处理方法中样本预处理包括：
1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；
2)0-37℃的1ⅹPBS冲洗；
3)一次性吸管移去上清液。
优选的，所述体液标本的处理方法具体为：
1)粪便用塑料容器取材后用0-37℃1ⅹPBS稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；
2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4ml进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；
详细操作步骤为：
1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，0-37℃1ⅹPBS冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件0-37℃，50g，离心2-8mi n，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；
2)条件0-37℃，300g，离心3-7mi n，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约150-200uL，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50uL吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；
3)加入450uL的1X红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育2-18mi n，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，具备以下有益效果：
1、该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，可用于组织标本和体液标本中T I I Cs内代谢蛋白和关键酶检测，创新性的提出了多种体液标本处理技术，基于本发明中组织标本的处理技术，结合临床和动物实验标本的多样性，建立了尿液、粪便、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物12种体液标本的处理技术，从这些标本直接获取组织内炎症免疫效应细胞，是探讨组织局部免疫病理过程的一种比较安全和有用的检查方法，给无法进行手术切除组织，也无法进行组织穿刺检测的患者带来福音。
2、该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，通过将现有组织标本处理技术进行改进，获得合格的T I I Cs悬液，能够继续进行固定破膜-将荧光抗体导入细胞内部的操作，从而利用流式细胞平台检测T I I Cs内部代谢相关靶蛋白和关键酶，最大限度地剔除或替换了影响细胞代谢的试剂，更符合细胞内代谢靶蛋白和关键酶检测项目需求，同时，本发明构建了不同细胞量标本的对应反应体系，实现了穿刺组织标本的检测，创新性的提出了多种体液标本处理技术，并且构建了反应体系以及对两种试验方案的确定，为肿瘤微环境和液体活检提供了新的研究角度。
附图说明
图1为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中肿瘤浸润性免疫细胞(T I I Cs)示意图；
图2为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中T I ICs细胞表面抗原检测(组织处理技术改进前后)结果对比图；
图3为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中T I ICs细胞内部抗原检测(组织处理技术改进前后)结果对比图；
图4为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中组织标本处理技术改进前后细胞形态对比图；
图5为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中组织标本处理操作流程图；
图6为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中体液标本处理操作流程图；
图7为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中组织标本(肝癌组织)检测实施例结果展示图；
图8为本发明提出的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法中体液标本(尿液)检测实施例结果展示图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
临床标本和科研标本的特点是白细胞和淋巴细胞的质和量因病而异，因物种而异，因标本类型而异，想要将多种类型的标本均与流式细胞平台的固定破膜检测项目相结合，关键是得到符合要求的肿瘤浸润性免疫细胞，而标本不同，检测目的不同，采用的处理方法也不同，因此，如何获取合格免疫细胞的技术手段尤为重要。
请参阅图1-8，本发明详细描述了如何从多种类型的体液标本和组织标本中获取合格的T I I Cs悬液，再通过固定破膜和荧光抗体导入细胞内部的操作后，进行流式细胞平台固定破膜检测得到理想的检测结果，体液标本包括：尿液、粪便、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物12种；组织标本包括：骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等软组织类的癌组织、上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的硬组织类的癌组织两类，可以是手术切除组织或穿刺组织。
实施例一：
一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：
1)样本预处理；
2)红细胞裂解液重悬；
3)加入细胞表面抗体孵育；
4)固定破膜；
5)加入细胞内部抗体孵育。
其中，样本分为组织样本和体液样本，组织样本分为软组织样本和硬组织样本。
而软组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在冷的(4℃)1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)尼龙网上搓成单细胞悬液；
4)细胞滤网过滤；
5)离心，去除组织细胞；
6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，软组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在冷的(4℃)1ⅹPBS中浸泡5分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴10分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加冷的(4℃)1ⅹPBS冲洗，直至将组织搓完；
3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件4℃，50g离心5分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件4℃，800g离心5分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置10分钟，条件4℃，400g离心5mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml冷的(4℃)1ⅹPBS，轻弹几下，条件4℃，400g离心5mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l冷的(4℃)1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用冷的(4℃)1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而硬组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在冷的(4℃)1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)酶解成单细胞悬液；
4)离心，去除组织细胞；
5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，硬组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在冷的(4℃)1ⅹPBS中浸泡5分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入5倍的酶解液，37℃摇床消化35分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用冷的(4℃)1ⅹPBS冲洗3次；
3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件4℃，50g离心5分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件4℃，800g离心5分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置10分钟，条件4℃，400g离心5mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml冷的(4℃)1ⅹPBS，轻弹几下，条件4℃，400g离心5mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l冷的(4℃)1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用冷的(4℃)1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系。后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而体液标本的处理方法中样本预处理包括：
1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；
2)冷的(4℃)1ⅹPBS冲洗；
3)一次性吸管移去上清液。
具体的，体液标本的处理方法具体为：
1)粪便用塑料容器取材后用冷的(4℃)1ⅹPBS稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；
2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4ml进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况依表1构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；
详细操作步骤为：
1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，冷的(4℃)1ⅹPBS冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件4℃，50g，离心5mi n，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；
2)条件4℃，300g，离心5mi n，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约180uL，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μL细胞悬液用冷的(4℃)1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50uL吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；
3)加入450uL的1X红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育10mi n，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
实施例二：
一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：
1)样本预处理；
2)红细胞裂解液重悬；
3)加入细胞表面抗体孵育；
4)固定破膜；
5)加入细胞内部抗体孵育。
其中，样本分为组织样本和体液样本，组织样本分为软组织样本和硬组织样本。
而软组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在37℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)尼龙网上搓成单细胞悬液；
4)细胞滤网过滤；
5)离心，去除组织细胞；
6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，软组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在37℃的1ⅹPBS中浸泡8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴18分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加37℃的1ⅹPBS冲洗，直至将组织搓完；
3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件37℃，50g离心8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件37℃，800g离心8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置18分钟，条件37℃，400g离心8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml的37℃的1ⅹPBS，轻弹几下，条件37℃，400g离心8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用37℃的1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而硬组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在37℃1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)酶解成单细胞悬液；
4)离心，去除组织细胞；
5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，硬组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在37℃1ⅹPBS中浸泡8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入6倍的酶解液，39℃摇床消化40分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用37℃的1ⅹPBS冲洗3次；
3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件37℃，50g离心8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件37℃，800g离心8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置18分钟，条件37℃，400g离心8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml 37℃1ⅹPBS，轻弹几下，条件37℃，400g离心8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系。后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而体液标本的处理方法中样本预处理包括：
1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；
2)37℃的1ⅹPBS冲洗；
3)一次性吸管移去上清液。
具体的，体液标本的处理方法具体为：
1)粪便用塑料容器取材后用37℃1ⅹPBS稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；
2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4ml进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况依表1构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；
详细操作步骤为：
1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，37℃1ⅹPBS冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件37℃，50g，离心8mi n，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；
2)条件37℃，300g，离心7mi n，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约200uL，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μL细胞悬液用37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50uL吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；
3)加入450uL的1X红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育18mi n，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
实施例三：
一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：
1)样本预处理；
2)红细胞裂解液重悬；
3)加入细胞表面抗体孵育；
4)固定破膜；
5)加入细胞内部抗体孵育。
其中，样本分为组织样本和体液样本，组织样本分为软组织样本和硬组织样本。
而软组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)尼龙网上搓成单细胞悬液；
4)细胞滤网过滤；
5)离心，去除组织细胞；
6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，软组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在0℃的1ⅹPBS中浸泡2分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴2分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加0℃的1ⅹPBS冲洗，直至将组织搓完；
3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0℃，50g离心2分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0℃，800g离心2分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2m l红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2分钟，条件0℃，400g离心2mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2m l 0℃的1ⅹPBS，轻弹几下，条件0℃，400g离心2mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0℃的1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而硬组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)酶解成单细胞悬液；
4)离心，去除组织细胞；
5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
具体的，硬组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在0℃1ⅹPBS中浸泡2分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入5倍的酶解液，35℃摇床消化30分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用0℃的1ⅹPBS冲洗3次；
3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0℃，50g离心2分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0℃，800g离心2分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2分钟，条件0℃，400g离心2mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml 0℃1ⅹPBS，轻弹几下，条件0℃，400g离心2mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0℃的1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后根据表1内容构建反应体系。后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
而体液标本的处理方法中样本预处理包括：
1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；
2)0℃的1ⅹPBS冲洗；
3)一次性吸管移去上清液。
具体的，体液标本的处理方法具体为：
1)粪便用塑料容器取材后用0℃1ⅹPBS稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；
2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4m l进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况依表1构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；
详细操作步骤为：
1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，0℃1ⅹPBS冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件0℃，50g，离心2mi n，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；
2)条件0℃，300g，离心3mi n，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约150uL，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μL细胞悬液用0℃的1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50uL吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；
3)加入450uL的1X红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育2mi n，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)，实验方案有两种，见表2和表3，可根据检测靶蛋白类型在两个方案中选择一个合适的。
实验例：
表1：各类标本不同细胞数对应反应体系的构建
Figure BDA0004072438470000181
表2：试验方案一
Figure BDA0004072438470000182
表3：试验方案二
Figure BDA0004072438470000183
本发明中流式细胞平台固定破膜检测项目，已用血液标本成功构建了方法学，基于此，本发明将标本类型进行扩展，逐步尝试组织中T I I Cs的检测，本发明按照目前现有的适用于流式细胞平台的组织处理方法，进行了标本处理，提取出组织中的T I I Cs进行检测(如图2改进前(左)和图3改进前(左))。
本发明用同一个患者的肝癌组织标本和血液标本检测结果进行对比，发现检测结果有明显差距，该差距与理论推理结果不符，理论上组织中T I I Cs的代谢调节应该比血液中免疫细胞的代谢调节更敏感，为了查找原因，本发明通过对现有技术方法提取出的免疫细胞进行镜检，发现中性粒细胞膜有破损现象，部分细胞核出现核固缩现象，淋巴细胞膜有破损，细胞膜有尾状突起，整体形态受到影响(如图4改进前(左))，经分析推测，想要检测的细胞内靶蛋白存在漏出的可能，造成结果偏差。
为获得合格的T I I Cs，本发明对现有的组织标本处理方法进行尝试改进，经过反复实践探索，对操作方法条件的逐一排除，最终确定问题的关键集中在影响细胞膜稳定性和细胞代谢的以下三点：一是标本处理温度，二是标本处理用到的淋巴细胞分离液，三是硬组织标本用酶法消化后，用统一购买的血清终止反应，由于购买的血清中各代谢物质与每个机体代谢状态不同，会影响细胞代谢，从而影响细胞内代谢蛋白检测结果。
针对第一点，本发明在标本处理的每一步都尝试了不同的处理温度(4℃、15℃、25℃、37℃)，最终确定标本处理(包括离心在内)的每一步最佳温度为4℃；另外将组织标本冰浴10分钟，也是首次研发出使T I I Cs细胞维持稳定代谢状态的技术；针对第二点，本发明采用逐步离心法替代淋巴细胞分离液提取T I I Cs，淋巴细胞分离液影响细胞膜稳定和细胞代谢，逐步离心法可保护细胞形态，简化操作步骤，降低试剂成本；针对第三点，本发明采用同一代谢状态下采集的患者本人血清作为硬组织标本酶法终止液，取代统一购买的血清，由于每个患者代谢状态都具有其特异性，这也是本发明寻找生物标志物的重要线索和依据，为了不改变细胞代谢状态，患者本人血清对细胞内代谢蛋白有维持和稳定的作用，避免了因购买血清中代谢物质对细胞代谢的影响，产生结果的偏倚。
改进前后的检测结果如图2、图3所示，通过前后对比可以看出，图2中对于细胞表面抗原(CD3，CD4，CD8，HLA-DR)检测结果无明显差异，这也是可以用现有标本处理技术顺利进行细胞分型等表面抗原检测的原因，但是对于胞内代谢蛋白检测项目来说，改进后的标本处理技术更适用，图3以同一标本同一种细胞内代谢蛋白(CPT1A:肉碱棕榈酰转移酶1A)的检测为例，检测结果具有显著差异。
技术发明操作要点：
1)标本处理温度：要求标本处理(包括离心在内)的每一步温度为4℃。
2)现有组织标本处理用到的淋巴细胞分离液影响细胞膜稳定性和细胞代谢，在本发明中被逐步离心法替换掉。
3)硬组织标本用酶法消化后，终止消化的终止液用相同代谢状态下采集的患者本人血清替代了统一购买的血清，避免了外界代谢物对细胞代谢的影响，从而得到准确的细胞内代谢蛋白检测结果。
本发明建立了从多种类型标本中，提取有效T I I Cs的技术方法，不使用影响细胞代谢的试剂，获得适用于流式细胞平台固定破膜检测项目的T I I Cs；根据标本的种类和特性，建立了不同的简单便捷、精准严谨的临床标本处理方法；本发明实现了临床患者和动物标本检测，因每个患者或物种都有其特异性，根据其细胞计数的结果，可选择适用体系和各试剂、抗体的用量，并设定相应的获取细胞的数目。
本发明的有益效果是：
1)该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，现有技术对于T I I Cs的研究大多集中在基因测序领域，少数会根据其表面的抗原进行流式细胞分型检测，基因测序是通过转录与翻译形成的蛋白表达，其过程存在不确定性，蛋白质才是细胞功能的执行者，本发明能够对组织和体液中免疫细胞直接检测细胞表面及内部蛋白的表达水平，与基因测序、代谢组学等手段相结合，可以为临床提供更有价值的生物标志物。
2)该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，目前尚无关于对T I I Cs进行固定破膜，将抗体导入细胞内部进行检测，并构建代谢模式的报道，本发明能够检测到组织和体液中T I I Cs的代谢状态，可以更直接地监测疾病状态，利用其独特的免疫学特性可为我们提供新的治疗机会，尤其是免疫治疗。
3)该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，由于各种标本类型具有不同特性，如何从中提取到数量多，质量好，符合固定破膜技术要求的免疫细胞是本发明的难点及创新点，本发明研究了如何从多种标本类型中提取到合格的T I I Cs进行流式细胞平台固定破膜检测项目的方法，且本发明标本来源不局限于人，动物实验亦适用。
4)该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，各种类型标本在临床和动物实验中的成熟应用，能够将大量基础研究中涉及的代谢蛋白和关键酶的检测应用于临床和动物标本检测，将以前从基因角度得到的结果从细胞内部蛋白表达水平得到验证，实现免疫细胞范畴的细胞立体活检和肿瘤微环境检测，体液检测能直接获取组织内炎症免疫效应细胞，是探讨组织局部免疫病理过程的一种比较安全和有用的检查方法。
5)该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，某些特殊部位切除活检困难，部分患者依从性差，难以耐受手术创伤；有些病变紧邻大血管，手术难度大风险高，费时且费用高，致使部分患者拒绝活检导致疾病的误诊和漏诊，本发明创造的体液标本处理技术，对某些无法手术切除组织也不能穿刺检测的患者是福音，对某些疾病，肿瘤以及免疫受损患者的器官感染等，体液标本经过本发明处理后基于流式细胞检测平台构建代谢轮廓，会成为辅助临床诊断和预后判断的重要手段，为科研进行各类标本T I I Cs的研究提供可以实现的手段，为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路。
另外，从图2中可以看出，同一组织标本(肝癌)T I I Cs细胞表面抗原(CD3，CD4，CD8，HLA-DR)的检测结果几乎不受影响(53.2％-52.96％；10.96％-11.07％)。
从图3中可以看出，同一组织标本(肝癌)T I I Cs细胞内部同一种代谢蛋白(CPT1A:肉碱棕榈酰转移酶1A)的检测结果呈现显著差异(24.52％-99.37％；65.66％-99.93％；51.08％-99.57％；53.2％-100％)。
如图4所示，改进前各类细胞有变形：中性粒细胞膜有破损现象，部分细胞核出现核固缩现象，淋巴细胞膜有破损，细胞膜有尾状突起，整体形态受到影响；改进后各类细胞无变形：中性粒细胞和淋巴细胞胞体大小正常，细胞膜结构完整，胞核舒展。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本预处理；
2)红细胞裂解液重悬；
3)加入细胞表面抗体孵育；
4)固定破膜；
5)加入细胞内部抗体孵育。
2.根据权利要求1所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述样本分为组织样本和体液样本，所述组织样本分为软组织样本和硬组织样本。
3.根据权利要求2所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述软组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)尼龙网上搓成单细胞悬液；
4)细胞滤网过滤；
5)离心，去除组织细胞；
6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
4.根据权利要求3所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述软组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴2-18分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加0-37℃的1ⅹPBS冲洗，直至将组织搓完；
3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8min，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml的0-37℃的1ⅹPBS，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8min，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50ul 0-37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，然后构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
5.根据权利要求2所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述硬组织样本处理方法中样本预处理包括：
1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹPBS中浸泡，并清洗组织中的血液；
2)组织剪碎后组织匀浆；
3)酶解成单细胞悬液；
4)离心，去除组织细胞；
5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。
6.根据权利要求5所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述硬组织样本处理方法具体为：
1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在0-37℃1ⅹPBS中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；
2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入5-6倍的酶解液，35-39℃摇床消化30-40分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用0-37℃的1ⅹPBS冲洗3次；
3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；
4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8min，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml 0-37℃1ⅹPBS，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8min，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50ul 0-37℃1ⅹPBS，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
7.根据权利要求2所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述体液标本的处理方法中样本预处理包括：
1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；
2)0-37℃的1ⅹPBS冲洗；
3)一次性吸管移去上清液。
8.根据权利要求7所述的一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，其特征在于，所述体液标本的处理方法具体为：
1)粪便用塑料容器取材后用0-37℃1ⅹPBS稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；
2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4ml进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；
详细操作步骤为：
1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，0-37℃1ⅹPBS冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件0-37℃，50g，离心2-8min，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；
2)条件0-37℃，300g，离心3-7min，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约150-200uL，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μL细胞悬液用0-37℃1ⅹPBS稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50uL吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；
3)加入450uL的1X红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育2-18min，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。
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