CN116162112A - 氧化异阿朴菲生物碱的n-杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法和应用 - Google Patents
氧化异阿朴菲生物碱的n-杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一系列氧化异阿朴菲生物碱的N‑杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法和应用，属于医药技术领域。本发明所述配合物的合成方法包括：将氯双(1‑氮杂苯并蒽酮)铂(II)二聚体和NHC配体置于极性溶剂中，在体系呈碱性的条件下进行配位反应，反应结束后，加入饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，即得；其中，NHC配体为双(咪唑‑1‑丙基)甲烷、双(咪唑‑1‑丁基)甲烷、双(咪唑‑1‑戊基)甲烷、双(咪唑‑1‑己基)甲烷或双(咪唑‑1‑异丙基)甲烷。申请人的试验结果表明，本发明所述配合物对某些肿瘤细胞株具有显著的增殖抑制活性，同时还具有较高的生理稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
1965年Rosenberg等发现顺铂具有显著的抗癌活性(Rosenberg,BL,etal.Nature,1969)，开创了无机抗癌药物的先河，并形成了以顺铂、卡铂、奥沙利铂等为代表的系列临床铂类抗癌药物，由于临床铂类化合物存在严重的毒副性、耐药性等问题因此，进一步探索高校、低毒、无交叉耐药性等新型铂类抗肿瘤药物具有重要临床需求意义。
氧化异阿朴菲是一种特殊的生物碱化合物，广泛存在于天然产物中，具有一定的生物活性。在本申请人之前的研究成果(公布号为CN103421048A的发明专利申请)中，采用6-羟基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂溶解于极性溶剂中进行配位反应得到一氯·二甲基亚砜·6-羟基氧化异阿朴啡合铂(II)，其结构如式(A)所示：
(A)。但该配合物的抗肿瘤活性不够理想，在对HepG2、SK-OV-3、SK-OV-3/DDP、BEL-7404、T-24等人类肿瘤细胞株增殖抑制活性筛查中，仅对SK-OV-3/DDP表现出一定的体外活性(IC50值为4.45±0.36μM)，且体内肿瘤生长抑制活性也较差。其主要原因可能是其脂容性较差。N-杂环卡宾(N-heterocyclic carbenes，NHC)是药物化学中常用于调控化合物脂溶性的方调控其药效的重要官能团。目前尚未见有将氧化异阿朴菲以及NHC同时进行配位的铂类配合物的合成及其活性研究的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖且抗肿瘤活性显著的氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物为具有下述通式(I)所示结构的配合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1为(CH2)2CH3、(CH2)3CH3、(CH2)4CH3、(CH2)5CH3或CH(CH3)2。
本发明所述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物的合成方法主要包括以下步骤：取下述式(Ⅱ)所示化合物和NHC配体置于极性溶剂中，调节体系呈碱性，在加热或不加热条件下进行配位反应，反应结束后，向其中加入饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，即得到相应的目标配合物粗品；其中，
所述的NHC配体为双(咪唑-1-丙基)甲烷、双(咪唑-1-丁基)甲烷、双(咪唑-1-戊基)甲烷、双(咪唑-1-己基)甲烷或双(咪唑-1-异丙基)甲烷；
上述合成方法中，所述的极性溶剂具体可以是选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、乙二醇甲醚和水中的一种或两种以上的组合。极性溶剂的用量可以根据需要进行确定，以能够充分溶解所参加反应的原料为宜。具体的，以0.1mmol的式(II)所示化合物为基准计算，全部原料所用极性溶剂的总用量通常为10～200mL，优选为15～40mL。当极性溶剂的加入量较大时，在停止反应后，反应后溶液可能呈澄清状态，此时可将反应后溶液通过减压蒸馏等方法除去大部分极性溶剂(通常为除去占极性溶剂加入量的80～95％)，然后经冷却、静置后会有目标配合物析出。
上述合成方法中，具体是调节体系呈弱碱性，优选是调节体系的pH＝9～10，更优选pH＝9～9.5。通常采用弱碱性物质来调节体系的碱性，如碳酸盐(具体如碳酸钠和/或碳酸钾等)。所述碳酸盐的加入量优选为式(II)所示化合物摩尔用量的2～5倍，这样可以使体系处理有利于反应进行的碱性环境。
上述合成方法中，配位反应在加热条件下进行相对于在不加热条件下进行可以提高反应速率，进一步优选是在大于或等于40℃条件下进行，更优选是在50℃至极性溶剂的沸点温度之间进行。反应是否完全采用薄层层析(TLC)跟踪检测。所述NHC配体的加入量优选为式(II)所示化合物摩尔用量的1～4倍。为了提高目标配合物的产率，本发明所述合成方法中的配位反应优选是在气氛保护(如氮气、氩气等)下进行。
在配位反应结束后，通过加入饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液使目标配合物以沉淀的形式析出，所述饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液通常是以体积上相对过量于反应后所得溶液的量进行加入，优选饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液的加入量为反应后所得溶液体积的1.5～2倍。
上述方法合成得到的是目标配合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高目标配合物的纯度。在本申请中，具体可以采用硅胶柱层析以获得纯化后的目标配合物，柱层析时以二氯甲烷与甲醇或乙醇组成的混合溶剂为洗脱剂，其中二氯甲烷与甲醇(或者是二氯甲烷与乙醇)的体积比优选为500：1～10：1，更优选为200：1～100：1。
本发明所述合成方法中涉及的原料式(Ⅱ)所示化合物的名称为氯双(1-氮杂苯并蒽酮)铂(II)二聚体，其可参考现有文献(Gaillard,Sylvain,Hamel,et al.Iridiumcomplexes inhibit tumor necrosis factor-alpha by utilizing light and mixedligands[J].Journal of Organometallic Chemistry,2016,808:122-127.)进行制备，也可自行设计合成路线进行制备，优选按下述方法进行制备：
取氯铂酸盐和氧化异阿朴菲置于由2-甲氧基乙醇和水按3：1组成的混合溶剂中，在气氛保护(如氮气、氩气等)及加热条件下进行反应，反应结束后，除去溶剂，干燥，即得。
在上述式(Ⅱ)所示化合物的制备方法中，所述的氯铂酸盐优选为氯铂酸钠或氯铂酸钾，氯铂酸盐和氧化异阿朴菲的摩尔比优选为1：1～1：5；所述反应优选在50～80℃条件下进行。
本发明所述合成方法中涉及的NHC配体双(咪唑-1-丙基)甲烷、双(咪唑-1-丁基)甲烷、双(咪唑-1-戊基)甲烷、双(咪唑-1-己基)甲烷或双(咪唑-1-异丙基)甲烷的结构分别如下述式(L1)～(L5)所示：
本发明所述合成方法中涉及的NHC配体可参考现有文献(Henkelis J J,Carruthers C J,Chambers S E,et al.Metallo-cryptophanes decorated with bis-N-heterocyclic carbene ligands:self-assembly and guest uptake into a non porouscrystalline lattice.[J].Journal of the American Chemical Society,2014,136(41):14393-14396.)进行制备，也可自行设计合成路线进行制备。具体可按下述合成路线及方法进行制备：
当R'为(CH2)2CH3、(CH2)3CH3、(CH2)4CH3、(CH2)5CH3或CH(CH3)2时，对应反应得到的NHC配体分别为双(咪唑-1-丙基)甲烷(本申请中也简称为配体L1)、双(咪唑-1-丁基)甲烷(本申请中也简称为配体L2)、双(咪唑-1-戊基)甲烷(本申请中也简称为配体L3)、双(咪唑-1-己基)甲烷(本申请中也简称为配体L4)或双(咪唑-1-异丙基)甲烷(本申请中也简称为配体L5)。
具体的NHC配体合成方法为：取N-烷基咪唑类化合物和二溴甲烷(N-烷基咪唑类化合物和二溴甲烷的摩尔比通常为2：1)置于容器中，加入一定量的乙腈(以1mmol的N-烷基咪唑类化合物为基准计算，全部原料所用乙腈的总用量通常为1.5～2mL)，于室温条件下避光反应至完全，反应结束后，抽滤，收集沉淀，沉淀经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体，即为相应的NHC配体。在柱层析时以二氯甲烷与甲醇组成的混合溶剂为洗脱剂，其中二氯甲烷与甲醇的体积比优选为5：1～50：1，更优选为10：1～20：1。
本申请中，当加入的NHC配体为双(咪唑-1-丙基)甲烷时，通式(I)所示配合物中的R＝(CH2)2CH3，此时对应的目标配合物简称为Pt-NHC-1；
当加入的NHC配体为双(咪唑-1-丁基)甲烷时，通式(I)所示配合物中的R＝(CH2)3CH3，此时对应的目标配合物简称为Pt-NHC-2；
当加入的NHC配体为双(咪唑-1-戊基)甲烷时，通式(I)所示配合物中的R＝(CH2)4CH3，此时对应的目标配合物简称为Pt-NHC-3；
当加入的NHC配体为双(咪唑-1-己基)甲烷时，通式(I)所示配合物中的R＝(CH2)5CH3，此时对应的目标配合物简称为Pt-NHC-4；
当加入的NHC配体为双(咪唑-1-异丙基)甲烷时，通式(I)所示配合物中的R＝CH(CH3)2，此时对应的目标配合物简称为Pt-NHC-5。
本发明还包括上述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步包括一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗上有效剂量的上述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物或其药学上可接受的盐。
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物及其合成方法，申请人的试验结果表明，这些配合物对某些肿瘤细胞株如人三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制活性，同时还具有较高的生理稳定性，有望开发成抗肿瘤药物。
附图说明
图1为按本发明实施例1所述方法制得的最终产物Pt-NHC-1在生理缓冲溶液条件下作用24h及48h的HPLC检测结果图。
图2为按本发明实施例5所述方法制得的最终产物Pt-NHC-2在生理缓冲溶液条件下作用24h及48h的HPLC检测结果图。
图3为按本发明实施例8所述方法制得的最终产物Pt-NHC-3在生理缓冲溶液条件下作用24h及48h的HPLC检测结果图。
图4为按本发明实施例12所述方法制得的最终产物Pt-NHC-4在生理缓冲溶液条件下作用24h及48h的HPLC检测结果图。
图5为按本发明实施例15所述方法制得的最终产物Pt-NHC-5在生理缓冲溶液条件下作用24h及48h的HPLC检测结果图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下的实施例中涉及的式(Ⅱ)所示化合物根据下述合成路线及制备方法制备得到：
具体的制备方法为：
取四氯铂酸钾(0.3mmol)和氧化异阿朴菲(0.6mmol)置于容器中，加入8mL由2-甲氧基乙醇和水按3：1的体积比组成的混合溶剂，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至80℃回流反应48h，反应物冷却至室温，静置，收集沉淀，烘干，得到棕色固体。
对所得要棕色固体进行核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱表征，确定上述所得棕色固体为本发明所述方法中涉及的原料式(Ⅱ)所示化合物：
以下的实施例中涉及的NHC配体根据下述合成路线及制备方法制备得到：
制备方法：称取12.0mmol的N-烷基咪唑类化合物和6.0mmol二溴甲烷置于100mL圆底烧瓶中，向瓶中加入20mL乙腈，在室温条件下避光反应12h，反应结束后，抽滤，收集沉淀，上硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1～20：1，体积比)，得到相应的NHC配体(白色固体)。具体表征如下：
双(咪唑-1-丙基)甲烷(配体L1)：产率约为78％。1H NMR(400MHz,DMS O-d6)δ9.79–9.50(m,2H),8.22–8.04(m,2H),7.92(d,J＝1.8Hz,2H),6.70(d,J＝4.3Hz,2H),4.20(t,J＝7.1Hz,4H),1.83(q,J＝7.3Hz,4H),0.88(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ137.53,123.16,122.23,50.77,22.64,10.47.ESI-MS calced for C13H22N4,M＝234.1844found：m/z 233.17[M-2Br-H]+。
双(咪唑-1-丁基)甲烷(配体L2)：产率约为50％。1H NMR(600MHz,DMS O-d6)δ9.50(t,J＝1.6Hz,2H),8.03(t,J＝1.8Hz,2H),7.94(t,J＝1.8Hz,2H),6.66(s,2H),4.24(t,J＝7.3Hz,4H),1.83–1.76(m,4H),1.32–1.26(m,4H),0.91(t,J＝7.4Hz,6H)。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ137.93,123.66,122.63,58.80,49.56,31.52,19.25,13.82.ESI-MS calced forC15H26N4,M＝262.2157 foun d：m/z 261.20[M-2Br-H]+。
双(咪唑-1-戊基)甲烷(配体L3)：产率约为50％。1H NMR(600MHz,DMS O-d6)δ9.68(d,J＝1.9Hz,2H),8.13(t,J＝1.8Hz,2H),7.94(t，J＝1.8Hz,2H),6.75(s,2H),4.22(t,J＝7.3Hz,4H),1.86–1.75(m,4H),1.35–1.19(m,8H),0.87(t,J＝7.2Hz,6H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ137.51,123.11,122.18,58.05,49.27,28.80,27.60,21.55,13.79.ESI-MScalced for C17H30N4,M＝290.2470found：m/z 289.24[M-2Br-H]+。
双(咪唑-1-己基)甲烷(配体L4)：产率约为40％。1H NMR(600MHz,DMS O-d6)δ9.65(d,J＝1.6Hz,2H),8.12(t,J＝1.9Hz,2H),7.93(t,J＝1.8Hz,2H),6.74(s,2H),4.22(t,J＝7.3Hz,4H),1.80(t,J＝7.2Hz,4H),1.27(h,J＝3.4Hz,12H),0.87–0.84(m,6H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ137.50,128.90,128.21,123.11,122.18,58.08,49.29,30.58,29.08,25.14,21.90,13.87.ESI-MS calce d for C19H34N4,M＝318.2783found：m/z 317.27[M-2Br-H]+。
双(咪唑-1-异丙基)甲烷(配体L5)：产率约为70％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.82(d,J＝1.7Hz,2H),8.21(t,J＝1.9Hz,2H),8.07(t,J＝1.9Hz,2H),6.74(s,2H),4.70(p,J＝6.6Hz,2H),1.50(d,J＝6.7Hz,12H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ135.95,121.75,120.68,57.21,52.20,21.47.ESI-MS calced for C15H26N4,M＝234.1844 found：m/z 233.1757[M-2Br-H]+。
实施例1：目标配合物Pt-NHC-1的合成
取式(Ⅱ)所示化合物(0.2mmol)、双(咪唑-1-丙基)甲烷(0.4mmol)和碳酸钠(1mmol)置于容器中，然后加入8mL乙二醇甲醚(此时体系的pH＝9.5)，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至90℃回流反应12h，反应物冷却至室温，向反应所得料液中加入饱和六氟磷酸钾水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，用水清洗，烘干后上硅胶柱层析分离纯化(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇＝200：1，体积比)，得到黄色固体产物，产率37％。
对本实施例所得产物进行表征：
1)核磁氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝6.4Hz,1H),8.50(dd,J＝7.2,1.0Hz,1H),8.45–8.41(m,1H),8.14(d,J＝1.0Hz,1H),8.02(d,J＝6.4Hz,1H),7.86(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.79(d,J＝2.0Hz,1H),7.76(d,J＝2.1Hz,1H),7.69(d,J＝2.0Hz,1H),7.64(dd,J＝3.1,1.6Hz,2H),7.44(s,1H),6.30(d,J＝13.6Hz,2H),4.35–4.26(m,1H),4.18(dtd,J＝25.8,7.9,5.3Hz,3H),1.82(d,J＝8.0Hz,1H),1.72(dd,J＝7.4,5.7Hz,1H),1.69–1.64(m,1H),1.63–1.56(m,1H),0.64(t,J＝7.3Hz,3H),0.58(t,J＝7.3Hz,3H)。
2)核磁碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ183.26,175.93,162.37,161.38,152.41,149.11,145.45,142.29,135.24,133.92,133.52,132.17,131.78,131.31,128.79,122.96,122.62,122.60,122.17,122.06,121.76,63.03,52.18,51.79,23.94,23.74,11.02,10.96。
3)电喷雾质谱：M＝657.1942found：m/z 657.19[M-PF6]+。
因此，可确定本实施例所得黄色固体产物为目标配合物Pt-NHC-1，分子式为C29H28ON5PtPF6，其结构如下式所示：
实施例2：目标配合物Pt-NHC-1的合成
重复实施例1，不同的是：用水代替乙二醇甲醚作为反应溶剂。产率35％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-1。
实施例3：目标配合物Pt-NHC-1的合成
重复实施例1，不同的是：配位反应改在40℃条件下进行。产率30％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-1。
实施例4：目标配合物Pt-NHC-1的合成
重复实施例1，不同的是：用碳酸钾代替碳酸钠。产率35％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-1。
实施例5：目标配合物Pt-NHC-2的合成
取式(Ⅱ)所示化合物(0.2mmol)、双(咪唑-1-丁基)甲烷(0.4mmol)和碳酸钠(1mmol)置于容器中，然后加入8mL乙二醇甲醚(此时体系的pH＝9.5)，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至90℃回流反应12h，反应物冷却至室温，向反应所得料液中加入饱和六氟磷酸钾水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，用水清洗，烘干后上硅胶柱层析分离纯化(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇＝200：1，体积比)，得到黄色固体产物，产率49％。
对本实施例所得产物进行表征：
1)核磁氢谱分析：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.57(d,J＝6.3Hz,1H),8.49(dd,J＝7.2,1.1Hz,1H),8.43(dd,J＝8.4,1.1Hz,1H),8.13(dd,J＝8.3,7.2Hz,1H),8.02(d,J＝6.4Hz,1H),7.85(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.80(dd,J＝11.9,2.0Hz,2H),7.70(d,J＝2.0Hz,1H),7.64(dd,J＝7.0,1.6Hz,2H),7.43(s,1H),6.36(s,1H),6.28(s,1H),4.23(d,J＝6.9Hz,4H),1.66(d,J＝3.9Hz,4H),1.19–0.85(m,4H),0.73(dt,J＝9.7,7.3Hz,6H)。
2)核磁碳谱：13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ182.55,175.06,161.65,160.65,151.51,148.37,144.75,141.61,134.52,133.20,132.82,131.44,131.04,130.59,128.08,122.23,121.95,121.43,121.35,121.03,120.95,62.24,49.79,49.41,32.08,31.91,18.75,18.71,12.98,12.96。
3)电喷雾质谱：M＝685.2255found：m/z 685.22[M-PF6]+。
因此，可确定本实施例所得黄色固体产物为目标配合物Pt-NHC-2，分子式为C31H32ON5PtPF6，其结构如下式所示：
实施例6：目标配合物Pt-NHC-2的合成
重复实施例5，不同的是：配位反应改在25℃条件下进行。产率45％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-2。
实施例7：目标配合物Pt-NHC-2的合成
重复实施例5，不同的是：配位反应的时间改为24h。产率48％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-2。
实施例8：目标配合物Pt-NHC-3的合成
取式(Ⅱ)所示化合物(0.2mmol)、双(咪唑-1-戊基)甲烷(0.4mmol)和碳酸钠(1mmol)置于容器中，然后加入8mL乙二醇甲醚(此时体系的pH＝9.5)，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至90℃回流反应12h，反应物冷却至室温，向反应所得料液中加入饱和六氟磷酸钾水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，用水清洗，烘干后上硅胶柱层析分离纯化(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇＝200：1，体积比)，得到黄色固体产物，产率45％。
对本实施例所得产物进行表征：
1)核磁氢谱分析：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝6.4Hz,1H),8.51(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.45(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),8.15(dd,J＝8.3,7.3Hz,1H),8.02(d,J＝6.4Hz,1H),7.87(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.76(dd,J＝12.0,2.0Hz,2H),7.69(d,J＝2.0Hz,1H),7.67–7.62(m,2H),7.44(s,1H),6.28(d,J＝10.0Hz,2H),4.20(d,J＝3.5Hz,4H),1.79(tp,J＝9.2,5.0Hz,1H),1.68(d,J＝9.2Hz,2H),1.59(q,J＝7.3Hz,1H),1.12(dd,J＝6.5,3.9Hz,6H),0.90(dddd,J＝22.8,12.7,8.1,5.7Hz,2H),0.70(d,J＝3.7Hz,6H)。
2)核磁碳谱：13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ183.00,175.49,162.10,161.12,151.93,148.82,145.19,142.05,134.97,133.67,133.28,131.88,131.48,131.07,128.52,122.65,122.31,121.87,121.81,121.53,121.45,62.74,50.44,50.07,30.12,29.99,27.89,27.87,21.53,21.47,13.56,13.53。
3)电喷雾质谱：M＝713.2568found：m/z 713.25[M-PF6]+。
因此，可确定本实施例所得黄色固体产物为目标配合物Pt-NHC-3，分子式为C33H36ON5PtPF6，其结构如下式所示：
实施例9：目标配合物Pt-NHC-3的合成
重复实施例8，不同的是：用乙二醇代替乙二醇甲醚作为反应溶剂。产率42％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-3。
实施例10：目标配合物Pt-NHC-3的合成
重复实施例8，不同的是：用乙腈代替乙二醇甲醚作为反应溶剂。产率40％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-3。
实施例11：目标配合物Pt-NHC-3的合成
重复实施例8，不同的是：第二步反应中用碳酸钾代替碳酸钠。产率44％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-3。
实施例12：目标配合物Pt-NHC-4的合成
取式(Ⅱ)所示化合物(0.2mmol)、双(咪唑-1-己基)甲烷(0.4mmol)和碳酸钠(1mmol)置于容器中，然后加入8mL乙二醇甲醚(此时体系的pH＝9.5)，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至90℃回流反应12h，反应物冷却至室温，向反应所得料液中加入饱和六氟磷酸钾水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，用水清洗，烘干后上硅胶柱层析分离纯化(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇＝200：1，体积比)，得到黄色固体产物，产率59％。
对本实施例所得产物进行表征：
1)核磁氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,J＝6.1Hz,1H),8.45(d,J＝8.7Hz,1H),8.39(d,J＝8.8Hz,1H),8.10(d,J＝7.8Hz,1H),7.97(t,J＝6.5Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝17.8Hz,2H),7.62(d,J＝30.5Hz,3H),7.38(t,J＝7.5Hz,1H),6.25(d,J＝14.5Hz,2H),4.30–4.00(m,4H),1.81–1.46(m,4H),1.22–0.97(m,10H),0.95–0.81(m,2H),0.60(t,J＝6.6Hz,6H)。
2)核磁碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ182.13,174.58,161.19,160.28,151.02,147.91,144.33,141.17,134.07,132.79,132.40,130.97,130.59,130.20,127.60,121.77,121.38,120.93,120.75,120.66,61.87,49.56,49.20,29.76,29.69,29.60,29.49,24.57,20.82,20.80,12.80。
3)电喷雾质谱：M＝741.2881found：m/z 741.28[M-PF6]+。
因此，可确定本实施例所得黄色固体产物为目标配合物Pt-NHC-4，分子式为C35H40ON5PtPF6，其结构如下式所示：
实施例13：目标配合物Pt-NHC-4的合成
重复实施例12，不同的是：用N,N-二甲基甲酰胺代替乙二醇甲醚作为反应溶剂。产率54％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-4。
实施例14：目标配合物Pt-NHC-4的合成
重复实施例12，不同的是：配位反应改在50℃条件下进行，反应的时间为12h。产率52％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-4。
实施例15：目标配合物Pt-NHC-5的合成
取式(Ⅱ)所示化合物(0.2mmol)、双(咪唑-1-异丙基)甲烷(0.4mmol)和碳酸钠(1mmol)置于容器中，然后加入8mL乙二醇甲醚(此时体系的pH＝9.5)，将容器移至油浴中，在氮气保护下加热至90℃回流反应12h，反应物冷却至室温，向反应所得料液中加入饱和六氟磷酸钾水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，用水清洗，烘干后上硅胶柱层析分离纯化(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇＝200：1，体积比)，得到黄色固体产物，产率79％。
对本实施例所得产物进行表征：
1)核磁氢谱：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51–8.44(m,2H),8.44–8.36(m,1H),8.13(d,J＝1.1Hz,1H),8.09–8.04(m,1H),7.88–7.82(m,1H),7.79(q,J＝2.1Hz,2H),7.77–7.72(m,2H),7.60(d,J＝1.2Hz,1H),7.46(s,1H),6.31(s,2H),4.79(dd,J＝13.4,6.7Hz,2H),1.73(d,J＝6.7Hz,3H),1.65(d,J＝6.8Hz,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,3H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H)。
2)核磁碳谱：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ182.74,175.19,161.76,161.22,151.93,148.40,144.63,141.35,134.74,133.44,132.98,131.72,131.13,130.83,128.29,122.48,122.41,122.22,121.65,118.29,118.08,62.59,52.19,52.08,24.68,24.58,20.50,20.13。
3)电喷雾质谱：M＝657.1942found：m/z 657.19[M-PF6]+。
因此，可确定本实施例所得黄色固体产物为目标配合物Pt-NHC-5，分子式为C29H28ON5PtPF6，其结构如下式所示：
实施例16：目标配合物Pt-NHC-5的合成
重复实施例15，不同的是：用二甲基亚砜代替乙二醇甲醚作为反应溶剂。产率75％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-5。
实施例17：目标配合物Pt-NHC-5的合成
重复实施例15，不同的是：用碳酸钾代替碳酸钠。产率77％。
对本实施例所得产物进行核磁氢谱、核磁碳谱、电喷雾质谱分析，确定本实施例所得产物为目标配合物Pt-NHC-5。
实验例1：本发明所述配合物对多种肿瘤细胞株进行体外抑制活性实验
1、细胞株与细胞培养
本实验选用细胞株：MDA-MB-231(人三阴乳腺癌细胞)、4T1(小鼠三阴乳腺癌细胞)、CT-26(小鼠结肠癌细胞)。
所有细胞株均培养在含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640或DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5％ CO2孵箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。
2、待测化合物的配制
五个待测化合物Pt-NHC-1、Pt-NHC-2、Pt-NHC-3、Pt-NHC-4、Pt-NHC-5分别按本发明实施例1、实施例5、实施例8、实施例12、实施例15所述方法制备，所得产物用甲醇重结晶2次得到，其纯度≥95％，将其DMSO储液(浓度为0.002mol/L)通过RPMI-1640或DMEM培养基依次稀释成五个浓度梯度，分别为40、20、10、5、2.5μmol/L，其中助溶剂DMSO终浓度≤1％。分别测试不同梯度浓度下各个目标配合物对各种肿瘤细胞的增殖抑制程度，用以拟合计算半数抑制浓度，即IC50值。所有测试至少独立重复三次。
3、细胞生长抑制实验(MTT法)
(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的培养液配制细胞悬液，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000-10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)5％ CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底60～70％，每孔加入一定浓度梯度的药物20μL，每个浓度梯度设5个复孔；
(3)5％ CO2，37℃孵育48h，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为630nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)；
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：
计算配合物对肿瘤细胞生长的抑制率。进一步通过Bliss软件对五个浓度梯度的抑制率数据进行拟合，求出产物对不同肿瘤细胞株的半数抑制浓度(IC50值，单位μmol/L)，结果如下表1所示：
表1：Pt-NHC-1～5和顺铂对3种肿瘤细胞株的IC50值(μM)
注：MDA-MB-231(人三阴乳腺癌细胞)、4T1(小鼠三阴乳腺癌细胞)、CT-26(小鼠结肠癌细胞)，所选用的化合物初筛浓度均为20μM。
从体外抗肿瘤活性测试结果来看，本发明所述配合物Pt-NHC-1～5均具有良好的抗癌活性，对人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制活性均比顺铂更好，且配合物对三阴乳腺癌细胞表现出一定程度的选择性。其中，配合物Pt-NHC-4对MDA-MB-231细胞的抑制活性最好。
综上所述，本发明所述配合物总体表现出了一定的体外抗肿瘤活性，对癌细胞具有一定的毒性选择性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
实验例2：本发明所述配合物的生物稳定性实验
(1)取Pt-NHC-1(按本发明实施例1所述方法制得)的10μL DMSO储液(2×10-3mol/L)加入到1mL PBS溶液中，在37℃孵育24h和48h,孵育完后用Waters 2950 HPLC检测其变化情况，其结果如图1所示。
(2)取Pt-NHC-2(按本发明实施例5所述方法制得)的10μL DMSO储液(2×10-3mol/L)加入到1mL PBS溶液中，在37℃孵育24h和48h,孵育完后用Waters 2950 HPLC检测其变化情况，其结果如图2所示。
(3)取Pt-NHC-3(按本发明实施例8所述方法制得)的10μL DMSO储液(2×10-3mol/L)加入到1mL PBS溶液中，在37℃孵育24h和48h,孵育完后用Waters 2950 HPLC检测其变化情况，其结果如图3所示。
(4)取Pt-NHC-4(按本发明实施例12所述方法制得)的10μL DMSO储液(2×10-3mol/L)加入到1mL PBS溶液中，在37℃孵育24h和48h,孵育完后用Waters 2950 HPLC检测其变化情况，其结果如图4所示。
(5)取Pt-NHC-5(按本发明实施例15所述方法制得)的10μL DMSO储液(2×10-3mol/L)加入到1mL PBS溶液中，在37℃孵育24h和48h,孵育完后用Waters 2950 HPLC检测其变化情况，其结果如图5所示。
由图1至图5可知，5个配合物分别作用24h和48h后，均无明显其它成分的峰出现，说明这5个配合物在生理缓冲溶液中均是稳定的。
Claims (9)
1.具有下述通式(I)所示结构的氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1为(CH2)2CH3、(CH2)3CH3、(CH2)4CH3、(CH2)5CH3或CH(CH3)2。
2.权利要求1所述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物的合成方法，其特征是，主要包括以下步骤：取下述式(Ⅱ)所示化合物和NHC配体置于极性溶剂中，调节体系呈碱性，在加热或不加热条件下进行配位反应，反应结束后，向其中加入饱和六氟磷酸钾水溶液或饱和六氟磷酸钠水溶液，静置，有沉淀析出，收集沉淀，即得到相应的目标配合物粗品；其中，
所述的NHC配体为双(咪唑-1-丙基)甲烷、双(咪唑-1-丁基)甲烷、双(咪唑-1-戊基)甲烷、双(咪唑-1-己基)甲烷或双(咪唑-1-异丙基)甲烷；
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述配位反应在气氛保护条件下进行。
4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征是，所述的极性溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、乙二醇甲醚和水中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征是，调节体系的pH＝9～10。
6.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征是，所述配位反应在大于或等于40℃条件下进行。
7.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征是，还包括对制得的目标配合物粗品进行纯化的步骤。
8.权利要求1所述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种药物组合物，其中含有治疗上有效剂量的权利要求1所述氧化异阿朴菲生物碱的N-杂环卡宾型环金属铂配合物或其药学上可接受的盐。
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