CN116157510A - 用于制造多能干细胞的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法和所产生的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体。本文还提供了使用所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物治疗对其有需要的受试者的方法。

Description

用于制造多能干细胞的材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月17日提交的美国序列号63/040,373、2020年6月17日提交的美国序列号63/040,374、2020年6月17日提交的美国序列号63/040,392、2020年6月17日提交的美国序列号63/040,397、2020年6月17日提交的美国序列号63/040,398的权益，这些专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
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本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交，文件名为″14620-526-228_SEQ_LISTING″，创建日期为2021年5月30日，并且大小为21,884字节。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
1.技术领域
本文尤其提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法和所产生的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体及其用途。
2.背景技术
多能干细胞诸如胚胎干细胞(ES)和诱导性多能干细胞(iPSC)具有在体内分化和产生多种细胞类型的增殖和发育能力。因此，这些细胞的治疗和科学潜力是不确定的，但也是非同寻常的，特别是在据说已有研究揭示体细胞中的基因表达谱可被改变，从而表观地将它们重新编程为多能干细胞之后(参见例如，Takahashi，K.，&Yamanaka，S，Nat.Rev.Mol.Cell Bio1.，2016，17(3)：183-93)。
胚胎干细胞可衍生自哺乳动物胚泡的内细胞团，参见例如Human Genes andGenomes：Science，Health，Society(Rosenberg，L.E.&Rosenberg，D.D.，第1版2012)。另外，体细胞核移植(SCNT)介导的重编程也已用于生成多能ES细胞，并且在一些情况下生成克隆动物(Wilmut，I.等人，Nature，1997，385：810-813；Wakayama，T.等人，Nature，1998，394：369-374)。然而，SCNT受到各种技术(例如，表观遗传)障碍的困扰，因为胚胎的破坏和将哺乳动物遗传信息引入未受精卵中受到争议(Matoba，S.&Zhang，Y.，出处同上；Kastenberg，Z.J.&Odorico，J.S.，Transplant Rev.，2008，22(3)：215-22)。
将体细胞重编程为多能干细胞的替代技术仍然是令人感兴趣的。当Yamanaka等人报道转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc可赋予成年体细胞多能性并用于生成诱导性多能干细胞(iPSC)时，iPSC技术作为此类替代方案之一出现(Takahashi，K.，&Yamanaka，S，Cell，2006，126(4)：663-76；Wemig，M.等人，Nature，2007，448：318-324；Maherali，N.等人，Cell Stem Cell，2007，1(1)：55-70)。
3.发明内容
针对这一背景，仍然需要用于将体细胞重编程为多能状态的改进的材料和方法。在一个方面，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在某些实施方案中，该活化培养物还包含IL-2。
在某些实施方案中，该病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
在某些实施方案中，该方法还包括从受试者获得该细胞的分离群体。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是终末分化的细胞。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是人细胞。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-20天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-17天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-15天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-13天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-11天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-9天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-7天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-5天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养1-3天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养12-72小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养12-60小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养12-48小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养12-36小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养12-24小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养8-16小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养4-8小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养2-4小时。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养至多3天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养约3天。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养50小时至80小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养55小时至75小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养60小时至75小时。在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养70小时至75小时。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-100％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-95％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-90％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-85％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-80％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-75％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-70％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-65％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-60％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-55％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-50％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-45％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-40％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含15％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含25％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含30％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-30％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-25％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-20％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含5％-15％的γδT细胞。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括富集该细胞的分离群体中的γδT细胞。
在某些实施方案中，该γδT细胞通过细胞-细胞团块富集来富集。在某些实施方案中，该γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9+γδT细胞。
在某些实施方案中，该γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
在某些实施方案中，该一种或多种重编程因子选自由以下组成的组：OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc。
在某些实施方案中，在步骤(d)中，在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，该饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在某些实施方案中，该方法还包括分离和/或纯化所产生的iPSC。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用分离的iPSC。
在某些实施方案中，该方法还包括将iPSC离体分化为期望细胞类型的细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用分化的细胞。在某些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者患有造血系统的过度增生性障碍或癌症。
在某些实施方案中，所产生的iPSC对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。在某些实施方案中，所产生的iPSC衍生自γδT细胞。在某些实施方案中，所产生的iPSC具有TRG和TRD基因座的重排基因。在某些实施方案中，所产生的iPSC不衍生自αβT细胞。
在某些实施方案中，所产生的iPSC不从TCRA和TCRB基因座产生聚合酶链式反应(PCR)产物。在一些实施方案中，所产生的iPSC具有Vγ9和Vδ2基因排列。在某些实施方案中，所产生的iPSC是基因组稳定的，没有染色体丢失。在某些实施方案中，通过核型分析确定所产生的iPSC的基因组稳定性。在某些实施方案中，所产生的iPSC在过继后能够在无饲养培养基中生长。
在另一方面，本文提供了根据本文提供的方法产生的诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一方面，本文提供了包含本文提供的iPSC和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本文提供了根据本文提供的方法产生的分化的细胞。
在另一方面，本文提供了包含本文提供的分化的细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又一方面，本文提供了治疗对其有需要的受试者的方法，其包括：(i)从受试者获得包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞群；(ii)根据本文提供的产生iPSC的方法将细胞群中的γδT细胞重编程以产生iPSC；以及(iii)任选地在将iPSC分化成一种或多种期望类型的细胞之后，向该受试者施用所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者患有造血系统的过度增生性障碍或癌症。
在另一方面，本文提供了诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该iPSC的分离群体包含多能细胞，其中该多能细胞表达一种或多种重编程因子，并且/或者其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列。
在另一方面，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：(a)执行富集和/或活化细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤；以及(b)执行将γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤。在另一方面，本文提供了根据本文提供的方法产生的诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一方面，本文提供了包含多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含用于表达一种或多种重编程因子的工具，并且/或者其中该多能细胞包含用于编码TRG和TRD基因重排的工具。
4.附图说明
图1描绘了在用Zol+IL-2+IL-15培养PBMC的不同天，富集的细胞-细胞团块中TCRVγ9+γδT细胞的丰度。代表性FACS图中的数字示出了在用Zol+IL-2+IL-15刺激的PBMC的第3天(左列)、第8天(中间列)和第13天(右列)全PBMC中的TCRγδ和αβT细胞(顶行)和γδT细胞中的TCRVγ9+细胞(底行)的频率。箭头表示亲本和子代门。
图2A-图2B描绘了对衍生自用Zol+IL-2+IL-15刺激3天的PBMC培养物的iPSC集落的显微镜观察。图2A描绘了代表性显微图像，其示出了MEF饲养层上的iPSC为具有紧密且平滑的边界和致密的细胞内边界的圆形集落。背景中的伸长细胞是丝裂霉素-C处理的MEF饲养层。图2B描绘了代表性显微图像，其示出了来自三个单独克隆的不同传代(即，第3、4、5和7次传代)的iPSC集落。iPSC集落在经照射的MEF饲养层上。
图3描绘了使用IdentiCloneTMTCRG基因重排测定评估TRG基因座处的基因重排。从所有五个集落中分离基因组DNA。根据制造商的方案，使用来自IdentiCloneTMTCRG基因重排测定试剂盒的引物进行基因组PCR。代表性峰描绘了来自克隆A、B、C、D和E的基因组PCR的扩增子的大小(以碱基对计)。
图4描绘了iPSC集落中TRG和TRD基因座基因重排的评估。代表性琼脂糖凝胶图像示出了由Vγ9或Vδ2正向引物与各种连接区引物的组合介导的来自克隆A、B和C的基因组DNA的扩增。作为阴性对照，使用22Rv1细胞系基因组DNA。
图5描绘了代表性序列比对，其示出了从扩增子(来自克隆B)获得的序列与人TCRVγ9和Vδ2序列之间的相似性。
图6A-图6D描绘了五个iPSC克隆的基因组DNA扩增的扩增子与TRGV9和TRDV2之间的序列同源性的评估。从所有五个iPSC克隆中分离基因组DNA，并用针对TCRVγ9(FP)、JP1/JP2、JP或J1/J2(RV)和TCRVδ2(FP)、Jδ1(RP)或Jδ3(RP)的引物进行基因组PCR。将扩增产物凝胶洗脱，顶部克隆并测序。对序列进行针对全人基因组的BLAST。图6A：克隆A；图6B：克隆C：图6C：克隆D；图6D：克隆E。代表性序列比对示出了扩增子与TRGV9和TRDV2基因序列之间的序列同源性。
图7A-图7C描绘了γδT细胞衍生的iPSC的表征。图7A描绘了代表性琼脂糖凝胶图像，其示出了来自A、B和C iPSC克隆的Oct3/4、Nanog、Sox2、Lin28、仙台病毒(SeV)、GAPDH、TCRα和β的RT-PCR扩增子。图7B示出了重叠免疫组织化学(IHC)图像，其显现iPSC克隆中对DAPI(仅蓝色)、标志物(Nanog/Oct 3/4/Sox2：仅红色)或DAPI+标志物(粉红色)阳性的细胞。图7C描绘了代表性直方图，其示出了iPSC克隆A、B、C、D和E中对SSEA-4和TRA 1-60表面表达以及Oct-3和Sox2细胞内表达阳性的细胞的频率。
图8A-图8D描绘了经由核型分析评估iPSC克隆B、C、D和E的基因组稳定性。图8A：克隆B；图8B：克隆D；图8C：克隆C；图8D：克隆E。
图9示出了代表性明视野显微图像，其描绘了来自在不同基质和培养基组合的存在下过继至在无饲养条件的所有五个克隆(克隆A-E)的基于饲养的iPSC集落。
5.具体实施方式
本公开部分地提供了用于从T细胞，特别是从γδT细胞产生iPSC的改进的方法。
γδT细胞是表达与αβT细胞(人外周血中T淋巴细胞的主要子集)所表达的TCR不同的TCR的T淋巴细胞的子集(Kalyan，S.&Kabelitz，D.，Cell Mol.Immunol.，2013，10(1)：21-29)。Vγ9Vδ2 T细胞是γδT细胞的主要子集，并且表现出针对肿瘤细胞的显著效应子功能(Tyler，C.J.等人，Cellular Immunology，2015，296(1)：10-21；Silva-Santos.B.，Nat RevImmunol.，2015，15：683-91)。此外，与αβT细胞不同，Vγ9Vδ2 T细胞的抗原识别和抗肿瘤功效是主要组织相容性复合物(MHC)不受限的(Kalyan，S.&Kabelitz，出处同上)。由于这些原因，Vγ9Vδ2 T细胞被认为是癌症免疫疗法的有吸引力的选择，并且已在临床上被探索和利用(Kakimi，K.等人，Transl Lung Cancer Res.，2014，3(1)：23-33)。
5.1.定义
如本文所用，术语″约″或″大约″是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围可以是关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％。
″细胞培养基″(本文也称为″培养基″或″培养物″或″培养基″)是含有维持细胞活力和支持增殖的营养物的用于培养细胞的培养基。细胞培养基可含有适当组合的以下任何物质：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物，以及其他组分诸如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。本文提供了一些非限制性示例。
如本文所用，″细胞系″是指通常衍生自单个祖细胞或衍生自限定的和/或基本上相同的祖细胞群的大体上或基本上相同的细胞群。细胞系可能已经或可能能够在培养物中维持延长的时期(例如，数月、数年、无限期的时间段)。它可能已经历了自发的或诱导的转化过程，从而赋予细胞无限的培养寿命。细胞系包括本领域公认的所有细胞系。应当理解，细胞随时间获得突变和可能的表观遗传变化，使得细胞系的单个细胞的至少一些特性可能彼此不同。
如本文所用，术语″分化(differentiate、differentiation)″等是指未特化的(或未定向的)或较少特化的细胞获得特化细胞例如血细胞或肌细胞的特征的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系中占据更特化(或定向)位置的细胞。当细胞在分化途径中进行到某一点时，它被定向：在正常情况下，其会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下不能分化成不同的细胞类型或恢复到低分化的细胞类型。
如本文所用，术语″编码″是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可被称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
如本文所用，术语″外源″旨在表示将所提及的分子或所提及的活性引入宿主细胞。例如，可通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，诸如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质诸如质粒来引入分子。因此，当用于编码核酸的表达时，该术语是指将编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语″内源″是指存在于宿主细胞中的所提及的分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在细胞内而不是外源的编码核酸的表达
如本文所用，术语″表达″是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，包括但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。″表达产物″包括由基因转录的RNA和由基因转录的mRNA翻译得到的多肽。
如本文所用，术语″诱导性多能干细胞″或″iPSC″是指由分化的成体细胞产生的干细胞，该成体细胞已被诱导或改变(即重编程)成能够分化成所有三种胚层或真皮层的组织的细胞：中胚层、内胚层和外胚层。
如本文所用，术语″分离的″等在用于提及细胞时旨在意指当所提及的细胞在自然界中被发现时基本上不合至少一种组分的细胞。该术语包括从在其自然环境中发现的一些或所有组分中去除的细胞。该术语还包括当细胞在非天然存在的环境中被发现时从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞。因此，分离的细胞部分或完全与在自然界中发现的或在非天然存在的环境中生长、储存或存在的其他物质分离。分离的细胞的具体示例包括部分纯的细胞、基本上纯的细胞和在非天然存在的培养基中培养的细胞。
如本文所用，术语″纯化″等是指提高纯度。例如，纯度可增加到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文所用，术语″多能性″是指细胞形成身体或体细胞(即胚胎本身)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一类多能干细胞，其能够从三个胚层即外胚层、中胚层和内胚层的每一者形成细胞。多能性是发育潜能的连续统一体，范围从不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如，上胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。
如本文所用，术语″群体″当用于提及T淋巴细胞时，是指包括两个或更多个T淋巴细胞的一组细胞。T淋巴细胞的分离群体可具有仅一种类型的T淋巴细胞，或两种或更多种类型的T淋巴细胞。T淋巴细胞的分离群体可以是一种类型的T淋巴细胞的同质群体或两种或更多种类型的T淋巴细胞的异质群体。T淋巴细胞的分离群体还可以是具有T淋巴细胞和至少一种除T淋巴细胞以外的细胞例如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等的异质群体。该异质群体可具有0.01％至约100％的T淋巴细胞。因此，T淋巴细胞的分离群体可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T淋巴细胞。T淋巴细胞的分离群体可仅包括一种类型的T淋巴细胞，或多于一种类型的T淋巴细胞的混合物。T淋巴细胞的分离群体可包括一种或多种或所有不同类型的T淋巴细胞，包括但不限于本文公开的那些。T淋巴细胞的分离群体可包括所有已知类型的T淋巴细胞。在包括多于一种类型T淋巴细胞的T淋巴细胞的分离群体中，每种类型的T淋巴细胞的比例可在0.01％至99.99％的范围内。分离群体也可以是T淋巴细胞的克隆群体，其中该群体的所有T淋巴细胞是单个T淋巴细胞的克隆。
″重组″多核苷酸是不处于其天然状态的多核苷酸，例如，该多核苷酸包含在自然界中未发现的核苷酸序列，或该多核苷酸处于不同于其天然存在的上下文中，例如，与其通常在自然界中邻近的核苷酸序列分离，或与其通常不邻近的核苷酸序列相邻(或邻接)。例如，可将所讨论的序列克隆到载体中，或者与一种或多种附加的核酸重组。
如本文所用，″重编程″是指改变或逆转体细胞的分化状态的过程。在重编程之前，细胞可以是部分分化的或终末分化的。重编程包括体细胞(例如T细胞)的分化状态完全逆转为多能状态。重编程还包括体细胞的分化状态部分逆转为使细胞在进行附加的操作诸如本文所述的那些时更容易完全重编程为多能状态的状态。此类接触可导致细胞表达特定基因，该表达有助于重编程。在本发明的某些实施方案中，体细胞的重编程使体细胞成为多能性和ES样状态。所得细胞在本文中称为重编程多能体细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，重编程还包括体细胞的分化状态部分逆转为多潜能状态。
重编程不同于简单地维持已经是多能的细胞的现有未分化状态或维持已经是多潜能细胞(例如造血干细胞)的细胞的现有未完全分化状态。重编程也不同于促进已经是多能或多潜能的细胞的自我更新或增殖。在一些实施方案中，本文所述的方法有助于通过重编程建立多能状态。在一些实施方案中，本文所述的方法可在完全分化的细胞和/或特定类型的细胞(例如，γδT细胞)上实施，而不是在已经是多潜能或多能的细胞上实施。
如本文所用，″重编程因子″是指例如在体外促进或有助于细胞重编程的基因、RNA或蛋白质。用于在体外将体细胞重编程为多能性的感兴趣的重编程因子的示例是Oct3/4、Klf4、c-Myc、Nanog、Sox2和Lin28，以及可在例如体外重编程体细胞的方法中替代这些中的一种或多种的任何基因/蛋白质。
如本文所用，术语″T淋巴细胞″和″T细胞″可互换使用，并且是指完成胸腺成熟并且在免疫系统中具有多种作用的主要类型的白细胞，包括体内特异性外源抗原的鉴定和其他免疫细胞的活化和失活。T淋巴细胞可以是任何T淋巴细胞，诸如培养的T淋巴细胞，例如原代T淋巴细胞，或来自培养的T细胞系的T淋巴细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T淋巴细胞。T淋巴细胞可以是CD3+细胞。T淋巴细胞可以是任何类型的T淋巴细胞并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞、调节T细胞、γδT细胞(γδT细胞)等。T淋巴细胞可以是T调节细胞，其包括nTreg(天然Treg)、iTreg(可诱导Treg)、CD8+Treg、Tr1调节细胞和Th3细胞。其他类型的辅助T细胞包括细胞如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞。其他类型的记忆T细胞包括细胞诸如中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。T淋巴细胞还可指遗传工程化T淋巴细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞。T淋巴细胞也可分化自干细胞、永久性造血内皮、CD34+细胞、HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多潜能祖细胞或T细胞祖细胞。
如本文所用，术语″γδT细胞″是指在其表面上具有包含γ链和δ链的T细胞受体的T细胞。
如本文所用，术语″选择性标记″是指当表达时赋予细胞选择性表型的基因、RNA或蛋白质，该选择性表型诸如对细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的抗性(例如抗生素抗性)、营养原养型或可用作区分表达蛋白质的细胞与不表达蛋白质的细胞的基础的特定蛋白质的表达。可容易地检测其表达的蛋白质，诸如荧光或发光蛋白质或作用于底物以产生有色、荧光或发光物质(″可检测标记″)的酶，构成选择性标记的子集。与通常在多能细胞中选择性或专一性表达的基因的天然表达控制元件连接的选择性标记的存在使得鉴定和选择已被重编程为多能状态的体细胞成为可能。可使用多种选择性标记基因，诸如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-Nv乙酰转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和hisD基因。可检测标记包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝宝石、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白和这些中的任一种的变体。发光蛋白诸如荧光素酶(例如，萤火虫或海肾荧光素酶)也是有用的。如本领域技术人员显而易见的，如本文所用，术语″选择性标记″可指基因或该基因的表达产物，例如编码的蛋白质。
在一些实施方案中，选择性标记赋予表达它的细胞相对于不表达它或以显著较低水平表达它的细胞的增殖和/或存活优势。当细胞维持在某些条件下，即″选择性条件″下时，通常发生此类增殖和/或存活优势。为了确保有效的选择，可将细胞群维持在一定条件下并维持足够的时间段，使得不表达该标记的细胞不增殖和/或不存活并从细胞群中消除，或者它们的数量减少到细胞群的仅非常小的部分。通过在选择性条件下维持细胞群以基本上或完全消除不表达赋予增殖和/或存活优势的标记的细胞来选择表达该标记的细胞的方法在本文中称为″正选择″，并且该标记被称为″可用于正选择″。负选择和用于负选择的标记在本文所述的某些方法中也是感兴趣的。相对于不表达该标记或以显著较低水平表达该标记的细胞，这些标记的表达赋予表达该标记的细胞增殖和/或存活缺陷(或，以另一种方式考虑，不表达该标记的细胞相对于表达该标记的细胞具有增殖和/或存活优点)。因此，当在选择性条件下维持足够的时间时，可从细胞群中大量或完全消除表达该标记的细胞。
如本文所用，″饲养细胞″或″饲养″是描述一种类型的细胞与第二种类型的细胞共培养以提供其中第二种类型的细胞可生长、扩增或分化的环境的术语，因为饲养细胞提供用于支持第二种细胞类型的刺激、生长因子和营养物。饲养细胞任选地来自与其所支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人细胞，包括干细胞，可由小鼠胚胎成纤维细胞或无限增殖化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一个示例中，外周血衍生细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。当与其他细胞共培养时，通常可通过照射或用抗有丝分裂剂诸如丝裂霉素处理使饲养细胞失活，以防止它们生长超过它们所支持的细胞。饲养细胞可包括内皮细胞、基质细胞(例如，上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。在不限制前述内容的情况下，一种特定的饲养细胞类型可以是人饲养，诸如人皮肤成纤维细胞。另一种饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。通常，各种饲养细胞可部分用于维持多能性、指导向某种谱系分化、增强增殖能力和促进成熟为特化细胞类型，诸如效应细胞。
如本文所用，″无饲养″(FF)环境是指基本上不含饲养或基质细胞和/或未通过饲养培养细胞进行预调理的环境诸如培养条件、细胞培养物或培养基。″预调理″培养基是指在培养基中培养饲养细胞一段时间(诸如至少一天)后收获的培养基。预调理培养基含有许多介质物质，包括培养基中培养的饲养细胞分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施方案中，无饲养环境不合饲养和基质细胞两者，并且也不通过培养饲养细胞进行预调理。
术语″多能性相关基因″是指其在正常条件下(例如，在不存在经设计以改变基因表达的遗传工程或其他操纵的情况下)的表达发生在多能干细胞中并且通常限于多能干细胞并且本身对于其功能同一性至关重要的基因。应当理解，由与多能性功能相关的基因编码的多肽可作为母体因子存在于卵母细胞中。该基因可由胚胎的至少一些细胞表达，例如在整个植入前时期的至少一部分和/或在成体的生殖细胞前体中表达。
术语″多能性因子″用于指多能性相关基因的表达产物，例如由该基因编码的多肽。在一些实施方案中，多能性因子是通常基本上不在构成成年动物身体的体细胞类型中表达的因子(生殖细胞或其前体除外)。例如，多能性因子可以是其在ES细胞中的平均水平比其在成年哺乳动物体内存在的那些终末分化的细胞类型中的平均水平高至少50倍或100倍的因子。在一些实施方案中，多能性因子是维持体内ES细胞和/或使用常规方法衍生的ES细胞的生存力或多能状态所必需的因子。因此，如果编码该因子的基因被敲除或抑制(即，其表达被消除或显著降低)，则ES细胞不形成、不死亡或在一些实施方案中不分化。在一些实施方案中，抑制其功能与ES细胞中的多能性相关的基因的表达(导致例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)产生活的但不再多能的细胞。在一些实施方案中，该基因的特征在于当细胞分化成终末分化的细胞时其在ES细胞中的表达降低(导致例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。
如本文所用，″多能性诱导基因″是指其表达有助于将体细胞重编程为多能状态的基因。″多能性诱导因子″是指多能性诱导基因的表达产物。多能性诱导因子可以但不必是多能性因子。外源引入的多能性诱导因子的表达可以是瞬时的，即，为了诱导多能性和/或建立稳定的多能状态，在至少部分重编程期间可能需要它，但之后不需要维持多能性。例如，该因子可诱导其功能与多能性相关的内源基因的表达。然后这些基因可将重编程的细胞维持在多能状态。
″多核苷酸″在本文中与″核酸″可互换使用以表示核苷的聚合物。通常，本发明的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然存在于DNA或RNA中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。然而，该术语涵盖包含核苷或核苷类似物的分子，该核苷或核苷类似物含有化学或生物学修饰的碱基、经修饰的主链等，无论是否在天然存在的核酸中发现，并且此类分子对于某些应用可能是优选的。当本申请涉及多核苷酸时，应理解提供了DNA、RNA两者并且在每种情况下提供了单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用，″多核苷酸序列″可指多核苷酸材料本身和/或生物化学表征特定核酸的序列信息(即用作碱基缩写的字母序列)。除非另有说明，否则本文提供的多核苷酸序列以5′至3′方向提供。
″多肽″是指氨基酸的聚合物。术语″蛋白质″和″多肽″在本文中可互换使用。肽是相对短的多肽，通常长度在约2与60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有蛋白质中最常见的氨基酸，诸如20个L-氨基酸。然而，可使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可被修饰，例如，通过添加化学实体诸如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于缀合、官能化的接头等。具有与其共价或非共价结合的非多肽部分的多肽仍被认为是″多肽″。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生，通过化学方法诸如常规固相肽合成等合成。如本文所用，术语″多肽序列″或″氨基酸序列″可指多肽材料本身和/或生物化学表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的字母或三字母代码序列)。除非另有说明，否则本文提供的多肽序列以N-末端至C-末端的方向提供。
术语″处理(treat、treating、treatment)″等，当应用于分离的细胞时，包括使细胞经受任何种类的过程或条件或对细胞进行任何种类的操作或程序。当应用于受试者时，该术语是指向个体提供医学或外科关注、护理或管理。
5.2.缩写
本公开中使用的缩写列表提供于下表1中。
表1.缩写
Figure BDA0004113264850000161
Figure BDA0004113264850000171
5.3.产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法
在一个方面，本文提供了用于将体细胞(例如，T细胞)重编程为低分化状态的方法。所得细胞在本文中称为重编程体细胞。重编程体细胞可以是不同分化状态的重编程体细胞。在一些实施方案中，重编程体细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。本公开部分地基于以下令人惊讶的发现：多种因子的组合，例如唑来膦酸和白介素-15(IL-15)的组合，可活化γδT细胞，并因此提高在用转录因子转化的非多能哺乳动物T细胞中诱导多能性的效率。因此，在一个方面，本公开提供了在非多能哺乳动物γδT细胞(例如，Vγ9+γδT细胞)中诱导多能性的方法，其中该方法包括使外周血单核细胞(PBMC)与包含IL-15和唑来膦酸的活化培养物接触。
在一些实施方案中，本文提供了重编程体细胞的方法，其包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为低分化状态的条件下培养所转导的γδT细胞。在一些实施方案中，该低分化状态是多潜能状态。在一些实施方案中，该低分化状态是多能状态。
在一些更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在某些实施方案中，该活化培养物还包含一种或多种附加剂或化合物，例如以提高活化或诱导的效率。在一个实施方案中，该活化培养物还包含白介素-2(IL-2)。
因此，在一些实施方案中，本文提供了重编程体细胞的方法，其包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为低分化状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在一些更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括从受试者获得该细胞的分离群体。在某些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，该受试者是人。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是外周血细胞、脐带血细胞或骨髓细胞。在一个实施方案中，该细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。
用于鉴定具有低分化状态或多能状态的重编程哺乳动物体细胞的方法是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，通过选择表达适当的选择性标记的细胞来鉴定重编程体细胞。在一些实施方案中，进一步评估重编程体细胞的多能性特征。多能性特征的存在表明体细胞已被重编程为多能状态。
细胞的分化状态是连续谱，在该谱的一端是终末分化状态，在另一端是去分化状态(多能状态)。如本文所用，重编程是指改变或逆转体细胞分化状态的过程，该体细胞可以是部分分化的或终末分化的。重编程包括体细胞分化状态的完全逆转以及部分逆转。换句话讲，如本文所用，术语″重编程″包括细胞的分化状态沿谱向低分化状态的任何移动。例如，重编程包括将多潜能细胞逆转回多能细胞，将终末分化的细胞逆转回多潜能细胞或多能细胞。在一个实施方案中，体细胞的重编程使体细胞一直转变回到多能状态。在另一个实施方案中，体细胞的重编程使体细胞转变回到多潜能状态。因此，如本文所用，术语″低分化状态″是相对术语，包括完全去分化状态和部分分化状态。
术语″多能性特征″是指与多能性相关的许多特征，包括例如分化成所有类型的细胞的能力和多能细胞的独特表达模式，包括多能性基因的表达、其他ES细胞标志物的表达以及在整体水平上称为″干细胞分子标签″或″干性″的独特表达谱。
因此，为了评估重编程体细胞的多能性特征，可分析这些细胞的不同生长特征和ES细胞样形态。在一些实施方案中，可将细胞皮下注射到免疫失能的SCID小鼠中以诱导畸胎瘤(ES细胞的标准测定)。Es样细胞可分化成胚状体(另一种ES特异性特征)。此外，ES样细胞可通过添加某些已知驱动分化成特定细胞类型的生长因子而在体外分化。以诱导端粒酶活性为标志的自我更新能力是可被监测的另一种多能性特征。
在一些实施方案中，重编程体细胞的功能测定可通过将它们引入胚泡中以确定细胞是否能够产生所有细胞类型来进行。如果重编程的细胞能够形成身体的几种细胞类型，则它们是多潜能的；如果重编程的细胞能够形成身体的所有细胞类型，包括生殖细胞，则它们是多能的。
在其他实施方案中，可检查重编程体细胞中单个多能性基因的表达以评估它们的多能性特征。
另外，可评估其他ES细胞标志物的表达。阶段特异性胚胎15抗原-1、-3和-4(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4)是在早期胚胎发育中特异性表达的糖蛋白，并且是ES细胞的标志物(Solter和Knowles，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569；Kannagi等人，1983，EMBO J 2：2355-2361)。
碱性磷酸酶(AP)表达升高是与未分化的胚胎干细胞相关的另一种标志物(Wobus等人，1984，Exp.Cell 152：212-219；Pease等人，1990，Dev.Biol.141：322-352)。其他干/祖细胞标志物包括中间神经丝巢蛋白(Lendah1等人，1990，Cell 60：585-595；Dah-Istrand等人，1992，J.Cell Sci.103：589-597)、膜糖蛋白prominin/AC133(Weigmann等人，1997，Proc.Natl.Acad.USA 94：12425-12430；Corbeil等人，1998，Blood 91：2625-22626)、转录因子Tcf-4(Korinek等人，1998，Nat.Genet.19：379-383；Lee等人，1999，J.Biol.Chem.274.1566-1572)和转录因子Cdx1(Duprey等人，1988，Genes Dev.2：1647-1654vSubramania′n等人，1998，Differentiation 64：11-18)。
在一些实施方案中，重编程体细胞的表达谱可用于评估它们的多能性特征。已知多能细胞(诸如胚胎干细胞)和多潜能细胞(诸如成体干细胞)具有独特的全局基因表达谱模式。这种独特的模式称为″干细胞分子标签″或″干性″。参见例如，Ramalho-Santos等人，Science 298：597-600(2002)；Ivanova等人，Science 298：601-604。
体细胞可被重编程以获得全套多能性特征，并且因此是多能的。另选地，体细胞可被重编程以仅获得多能性特征的子集。在另一个替代方案中，体细胞可被重编程为多潜能的。
活化培养
在某些实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养第一段时间。在某些实施方案中，该第一时间段为1-20天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-17天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-15天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-13天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-11天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-9天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-7天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-5天。在某些实施方案中，该第一时间段为1-3天。在某些实施方案中，该第一时间段为12-72小时。在某些实施方案中，该第一时间段为12-60小时。在某些实施方案中，该第一时间段为12-48小时。在某些实施方案中，该第一时间段为12-36小时。在某些实施方案中，该第一时间段为12-24小时。在某些实施方案中，该第一时间段为8-16小时。在某些实施方案中，该第一时间段为4-8小时。在某些实施方案中，该第一时间段为2-4小时。在某些实施方案中，该第一时间段为4-8小时。在某些实施方案中，该第一时间段为50-80小时。在某些实施方案中，该第一时间段为4-8小时。在某些实施方案中，该第一时间段为55-75小时。在某些实施方案中，该第一时间段为4-8小时。在某些实施方案中，该第一时间段为60-75小时。在某些实施方案中，该第一时间段为4-8小时。在某些实施方案中，该第一时间段为70-75小时。在某些实施方案中，该第一时间段为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
在某些实施方案中，其中该细胞的分离群体在活化培养物中培养不长于某一时间段。例如，该细胞的分离群体在活化培养物中培养至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。在一个具体实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养至多5天。在一个具体的优选实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养至多3天。在一个具体的优选实施方案中，该细胞的分离群体在活化培养物中培养约3天。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-100％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-95％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-90％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-85％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-80％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-75％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-70％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-65％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-60％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-55％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-50％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-45％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-40％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含15％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含25％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含30％-35％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-30％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-25％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-20％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体包含5％-15％的γδT细胞。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含约100％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％的γδT细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％或少于约30％的γδT细胞。
在一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约60％的γδT细胞。在另一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约55％的γδT细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约50％的γδT细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约45％的γδT细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约40％的γδT细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体包含少于约35％的γδT细胞。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-100％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-95％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-90％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-85％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-80％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-75％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-70％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-65％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-60％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-55％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-50％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-45％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-40％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-35％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-30％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-25％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-20％TCRVγ9+ T细胞。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含5％-15％TCRVγ9+ T细胞。
在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含约100％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％TCRVγ9+T细胞(又称Vγ9+T细胞)。在某些实施方案中，在活化培养物中培养第一时间段后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％或少于约30％TCRVγ9+T细胞。
在一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约60％TCRVγ9+ T细胞。在一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约55％TCRVγ9+ T细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约50％TCRVγ9+T细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约45％TCRVγ9+ T细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约40％TCRVγ9+ T细胞。在又一个实施方案中，在活化培养物中培养第一段时间后，该细胞的分离群体中的γδT细胞包含少于约35％TCRVγ9+ T细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括富集该细胞的分离群体中的γδT细胞。在某些实施方案中，该γδT细胞通过细胞-细胞团块富集来富集。
在某些实施方案中，步骤(b)中活化的γδT细胞的至少一部分是Vγ9+γδT细胞。
在某些实施方案中，步骤(b)中活化的γδT细胞的至少一部分是Vγ9δ2+γδT细胞。
细胞
本公开基于以下发现：细胞的分离群体(例如γδT细胞的分离群体)可通过活化(例如，在唑来膦酸和IL-15存在下)和引入转录因子(例如，通过仙台病毒载体)而被活化并重编程为多能性。
本公开的细胞的分离群体包括不是干细胞、生殖细胞或iPSC的身体的任何T细胞。非iPSC的非限制性示例是源自身体任何组织的T细胞，包括内部器官、皮肤、骨、血液、神经组织和结缔组织。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是血细胞。在某些实施方案中，血细胞合适地是外周血单核细胞(PMBC)，并且可包括在从造血干细胞到最终分化成外周血的整个分化过程中存在的所有类型的血细胞。在一个实施方案中，血细胞包括例如造血干细胞、淋巴干细胞、淋巴树突细胞祖细胞、淋巴树突细胞、T淋巴细胞祖细胞、T细胞、B淋巴细胞祖细胞、B细胞、浆细胞、NK祖细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。
在一些实施方案中，该细胞的分离群体可以是外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或它们的组合。在一些实施方案中，该细胞的分离群体是外周血单核(PBMC)细胞。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是T细胞。在一些实施方案中，该T细胞的分离群体可选自由CD4+/CD8+双阳性T细胞、细胞毒性T细胞、Th3(Treg)细胞、Th9细胞、Thαβ辅助细胞、Tfh细胞、干细胞记忆TSCM细胞、中枢记忆TCM细胞、效应记忆TEM细胞、效应记忆TEMRA细胞、γδT细胞以及它们的任何组合组成的组。
在一些实施方案中，该细胞的分离群体来源于容易获得且需要最小侵入的细胞类型，诸如成纤维细胞、皮肤细胞、脐带血细胞、外周血细胞和肾上皮细胞。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是终末分化的细胞。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是终末分化的T细胞。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是终末分化的PBMC细胞。在某些实施方案中，该细胞的分离群体是终末分化的γδT细胞。
本公开的细胞的分离群体可来源于哺乳动物，优选地人，但包括但不限于非人灵长类、鼠类(即小鼠和大鼠)、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊科动物、猪科动物、山羊科动物等。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体是人细胞。
在一些实施方案中，该细胞的分离群体是人PBMC细胞。
多能性相关基因引入
本公开还涉及将作为多能性相关基因的内源基因座引入活化的细胞群中。在一些实施方案中，可使用表达载体引入此类多能性相关基因。在一些实施方案中，可使用具有靶向期望基因座的至少一种sgRNA的CRISPR活化系统来引入此类多能性相关基因。在一些实施方案中，此类多能性相关基因可通过从已引入靶细胞中的重组表达盒表达而引入。在一些实施方案中，此类多能性相关基因可通过在外源重编程转录因子多肽的存在下温育细胞来引入。
在某些实施方案中，用于引入多能性相关基因的表达载体包括诸如来自腺病毒、仙台病毒、疱疹病毒或逆转录病毒诸如慢病毒载体的经修饰的病毒多核苷酸。表达载体不限于重组病毒，并且包括非病毒载体，诸如DNA质粒和体外转录的mRNA。在一个优选的实施方案中，使用仙台病毒载体。
为了解决由携带整合的外源序列的靶细胞基因组引起的安全性问题，已开发了许多修改的遗传方案并可用于本文所述的生产方法中。这些方案产生具有潜在降低风险的iPS细胞，并且包括递送重编程基因的非整合腺病毒(Stadtfeld，M.等人，Science，2008，322：945-949)、重编程质粒的瞬时转染(Okita，K.等人，Science，2008，322：949-953)、piggyBac转座系统(Woltjen，K.等人，Nature，2009，458：766-770；Yusa等人，Nat.Methods，2009，6：363-369；Kajji，K.等人(2009))、Cre可切除病毒(Soldner，F.等人，Cell，2009，136：964-977)和基于oriP/EBNA1的附加型表达系统(Yu，J.等人，Science，2009，324(5928)：797-801)。
多能性相关基因(编码重编程转录因子的基因)的非限制性示例是Oct3/4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Nr5a2、Glis1、Cebpa、Esrrb和Rexl。在一些实施方案中，该内源基因座是Oct4或Sox2。
在某些实施方案中，该细胞的分离群体内源表达至少一种或多种选自由Oct3/4多肽、Klf4多肽、c-Myc多肽、Sox2多肽、Nanog多肽、Lin28多肽、Nr5a2多肽、Glis1多肽、Cebpa多肽、Esrrb多肽和Rex1多肽组成的组的蛋白质。在某些实施方案中，该细胞的分离群体不内源表达任何重编程转录因子。
在某些实施方案中，这些重编程因子包含Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在某些实施方案中，这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc和Lin28。
在某些实施方案中，这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc。
外源引入的多能性基因可以几种方式进行。在一个实施方案中，外源引入的多能性基因可从与多能性基因的内源染色体基因座不同的染色体基因座表达。此类染色体基因座可以是具有开放染色质结构的基因座，并且含有体细胞非必需的基因。换句话讲，期望的染色体基因座含有其破坏不会导致细胞死亡的基因。示例性染色体基因座包括例如小鼠ROSA 26基因座和II型胶原(Col2a1)基因座(参见Zambrowicz等人，1997)
外源引入的多能性基因可由诱导型启动子表达，使得它们的表达可根据需要调节。
在另一个实施方案中，外源引入的多能性基因可单独或作为从多能细胞制备的cDNA表达文库的一部分被瞬时转染到细胞中。此类多能细胞可以是胚胎干细胞、卵母细胞、卵裂球、内细胞团细胞、胚胎生殖细胞、胚状体(胚胎)细胞、桑椹胚衍生的细胞、畸胎瘤(畸胎癌)细胞和取自胚胎发育过程后期的多潜能部分分化的胚胎干细胞。
通过常规技术制备cDNA文库。简而言之，从感兴趣的生物体中分离mRNA。RNA指导的DNA聚合酶用于使用mRNA作为模板的第一链合成。使用DNA指导的DNA聚合酶进行第二链合成，这产生cDNA产物。在促进cDNA克隆的常规处理之后，将cDNA插入表达载体中，使得cDNA可操作地连接到至少一个调控序列。与cDNA文库结合使用的表达载体的选择不限于特定的载体。任何适用于小鼠细胞的表达载体都是合适的。在一个实施方案中，驱动cDNA表达构建体表达的启动子是诱导型启动子。术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调控序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中。例如，当与DNA序列可操作地连接时控制其表达的多种表达控制序列中的任一种可用于这些载体以表达cDNA。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子(其表达由T7 RNA聚合酶指导)、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列，以及它们的各种组合。应当理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质类型等因素。此外，也应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和载体编码的任何其他蛋白质诸如抗生素标记的表达。
外源引入的多能性基因可由诱导型启动子表达。如本文所用，术语″诱导型启动子″是指在不存在诱导物(诸如化学剂和/或生物剂)的情况下不指导可操作地连接的基因(包括cDNA)的表达或指导低水平表达并且响应于诱导物其指导表达的能力增强的启动子。示例性诱导型启动子包括例如响应于重金属(CRC Boca Raton，Fla.(1991)，167-220；Brinster等人Nature(1982)，296，39-42)、热休克、激素(Lee等人P.N.A.S.USA(1988)，85，1204-1208；(1981)，294，228-232；Klock等人Nature(1987)，329，734-736；Israel和Kaufman，Nucleic Acids Res.(1989)，17，2589-2604)的启动子，响应于化学剂诸如葡萄糖、乳糖、半乳糖或抗生素的启动子。
四环素诱导型启动子是响应于抗生素的诱导型启动子的示例。参见Gossen等人，2003。四环素诱导型启动子包含与一个或多个四环素操纵子可操作地连接的最小启动子。四环素或其类似物之一的存在导致转录活化因子与四环素操纵子序列结合，这活化最小启动子并因此活化相关cDNA的转录。四环素类似物包括与四环素显示出结构同源性并能够活化四环素诱导型启动子的任何化合物。示例性四环素类似物包括例如多西环素、金霉素和无水四环素。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了携带至少一种多能性基因的体细胞，该多能性基因在诱导型启动子下表达为转基因。有可能具有此类可诱导多能性转基因的体细胞更易于被重编程。
本公开的工程化体细胞中的任一种可用于该方法中。在一个实施方案中，该方法中使用的体细胞仅包含一个与第一选择性标记连接的内源多能性基因，并且进行选择步骤以选择该第一选择性标记的表达。在另选的实施方案中，该方法中使用的体细胞包含任意数量的内源多能性基因，每个内源多能性基因分别与不同的选择性标记连接，并且进行选择步骤以选择这些选择性标记的至少一个子集。例如，可进行选择步骤以选择与各种内源多能性基因连接的所有选择性标记。
在另选的实施方案中，该方法中使用的体细胞包含与内源多能性基因和在诱导型启动子下表达为转基因的附加多能性基因连接的选择性标记。对于这些细胞，重编程的方法可包括诱导多能性转基因的表达并选择选择性标记的表达。
在某些实施方案中，在上述方法中描述的步骤(d)中，在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，该饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的存在下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在无饲养条件下培养所转导的γδT细胞。在某些实施方案中，在步骤(d)中，在iMatrix-511包被的板中培养所转导的γδT细胞。
在某些实施方案中，在步骤(d)之后，该方法还包括分离和/或纯化所产生的iPSC的步骤(e)。
在某些更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；用编码一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在某些更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；用编码一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条wr培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；用编码一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，使得在该活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞；用编码一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，使得在该活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞；通过细胞-细胞团块富集进一步富集γδT细胞；用编码一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，使得在该活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞；任选地通过细胞-细胞团块富集进一步富集γδT细胞；用编码选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组的一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，使得在该活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞；任选地通过细胞-细胞团块富集进一步富集γδT细胞；用编码选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组的一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在一层或多层饲养层的存在下在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
在其他更具体的实施方案中，本文提供了产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：从受试者(例如，人)获得细胞的分离群体(例如终末分化的细胞，诸如外周血单核细胞(PBMC))；使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；在该活化培养物中培养该细胞的分离群体约3天，使得在该活化培养物中培养后，该细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞；任选地通过细胞-细胞团块富集进一步富集γδT细胞；用编码选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组的一种或多种重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导γδT细胞；以及在包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的单层饲养层的存在下在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
衍生自γδT细胞的iPSC
在某些实施方案中，所产生的iPSC衍生自γδT细胞。在某些实施方案中，所产生的iPSC具有TRG和TRD基因座的重排基因。在某些实施方案中，所产生的iPSC不从TCRG和TCRD基因座产生聚合酶链式反应(PCR)产物。
在某些实施方案中，所产生的iPSC不衍生自αβT细胞。
在某些实施方案中，所产生的iPSC对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
在某些实施方案中，所产生的iPSC是基因组稳定的，没有染色体丢失。在一个实施方案中，通过核型分析确定所产生的iPSC的基因组稳定性。
在某些实施方案中，所产生的iPSC在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在某些实施方案中，该方法还包括在体外或离体将所产生的iPSC分化成期望的细胞类型。在某些实施方案中，该方法还包括在体外将所产生的iPSC分化成期望的细胞类型。在某些实施方案中，该方法还包括离体将所产生的iPSC分化成期望的细胞类型。
在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用所产生的iPSC。
在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用由本文所产生的iPSC分化的分化的细胞。
5.4.T细胞衍生的诱导性多能干细胞(iPSC)
本文还提供了具有新型特征的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体。在一些实施方案中，该iPSC的分离群体包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞，并且包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体根据本文所述的方法(例如，在第5.3节中)产生。
在某些实施方案中，这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组。
在某些实施方案中，这些重编程因子包含Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在某些实施方案中，这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc和Lin28。
在某些实施方案中，这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体衍生自γδT细胞。在某些实施方案中，该iPSC的分离群体具有TRG和TRD基因座的重排基因。在某些实施方案中，该iPSC的分离群体不从TCRG和TCRD基因座产生PCR产物。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体不衍生自αβT细胞。在某些实施方案中，该iPSC的分离群体不具有TRA和TRB基因座的重排基因。在某些实施方案中，该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失。在一个实施方案中，通过核型分析确定该iPSC的分离群体的基因组稳定性。
在某些实施方案中，该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在一些实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中(i)该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，(ii)这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组，(iii)该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性；(iv)该iPSC的分离群体衍生自γδT细胞，而不衍生自αβT细胞；(v)该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；(vi)该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；和/或(vii)该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且其中这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且其中这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且其中这些重编程因子是Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组，并且该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且该iPSC的分离群体衍生自γδT细胞，而不衍生自αβT细胞。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，并且该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组，该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性；该iPSC的分离群体衍生自γδT细胞，而不衍生自αβT细胞；该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含表达一种或多种重编程因子的多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，这些重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组，该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性；该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性；该iPSC的分离群体衍生自γδT细胞，而不衍生自αβT细胞；该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，该iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性；该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的；并且该iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一个具体实施方案中，本文提供了包含多能细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中该多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列或具有TRG和TRD基因座的重排基因，该iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物；并且该iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失，例如，如通过核型分析确定的。
5.5.药物组合物
本文还提供了″药物组合物″，其包含根据本文所述的方法所产生的iPSC或由其分化的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载剂。在一个具体实施方案中，所产生的iPSC或由其分化的细胞以治疗有效量存在。在一个具体实施方案中，所产生的iPSC或由其分化的细胞以预防有效量存在。该药物组合物可根据本文提供的方法和用途使用。因此，例如，可将药物组合物施用于受试者以实施本文提供的治疗或预防方法和用途。本文提供的药物组合物可被配制成与预期的施用方法或途径相容；示例性施用途径在本文中阐述。
药物组合物通常包含治疗有效量的至少一种所产生的iPSC或由其分化的细胞和药学上可接受的载剂。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、缓冲剂、润滑剂、填充剂和/或稀释剂。例如，合适的载剂可以是生理盐水溶液。可使用的典型缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或它们的混合物。缓冲剂组分还可包括水溶性试剂，诸如磷酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸以及它们的盐。
载剂可含有用于改变或维持药物组合物的pH、渗透压、粘度或稳定性的其他药学上可接受的赋形剂。在一个具体实施方案中，载剂是水性缓冲液。在一个具体实施方案中，载剂包含例如氯化钠。
本文提供的药物组合物还可含有用于改变或维持本文所述的所产生的iPSC或由其分化的细胞的施用速率的其他药学上可接受的配制剂。此类配制剂包括例如本领域技术人员在制备缓释或控释制剂中已知的那些物质。关于药学上可接受的配制剂，参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.18042)第1435-1712页，和The Merck Index，第12版(1996，Merck Publishing Group，Whitehouse，NJ)。
在具体实施方案中，药物组合物提供在单次使用的容器(例如，单次使用的小瓶、安瓿、注射器或自动注射器)中。在具体实施方案中，药物组合物提供在多次使用的容器(例如，多次使用的小瓶或药筒)中。任何药物递送装置都可用于递送本文描述的iPSC或药物组合物，包括静脉内输注。
药物组合物可被配制成与如本文所述的其预期施用途径相容。
药物组合物还可包含保护组合物免于从身体降解或消除的载剂。药物组合物中可包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、抗坏血酸、硫柳汞。
5.6.治疗方法和用途
本文还提供了通过本公开的方法产生的重编程体细胞，包括重编程多能体细胞诸如iPSC。用于生成期望细胞类型的细胞的这些方法具有广泛的应用。例如，这些方法在治疗或预防病症中具有医学应用。
因此，在一个方面，本文提供了用于治疗或预防哺乳动物的疾病或障碍的方法。在一个实施方案中，该方法以从个体获得体细胞开始，将通过本发明的方法如此获得的体细胞重编程以获得iPSC。然后在适于iPSC发育成期望细胞类型的细胞的条件下培养iPSC。收获期望细胞类型的发育细胞并将其引入个体以治疗疾病或障碍。在另一个实施方案中，该方法以从个体获得体细胞开始，根据本发明的方法将体细胞重编程。然后在适于iPSC发育成期望器官的条件下培养iPSC，收获iPSC并将其引入个体以治疗疾病或障碍。
在一些实施方案中，本发明的重编程体细胞是ES样细胞，并且因此可根据分化ES细胞的已知方法诱导分化以获得期望的细胞类型。例如，可通过在分化培养基中并在提供细胞分化的条件下培养iPSC来诱导此类细胞分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞等。导致胚胎干细胞分化的培养基和方法以及合适的培养条件是本领域已知的。
在一些具体实施方案中，iPSC被诱导分化成造血干细胞，例如，如Palacios等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92：7530-37(1995)中所述，该文献教导了通过使干细胞经历诱导程序从胚胎细胞系产生造血干细胞，该诱导程序包括最初在缺乏视黄酸的悬浮培养基中培养此类细胞的聚集体，接着在含有视黄酸的相同培养基中培养，接着将细胞聚集体转移到提供细胞附着的基质上。
在其他具体实施方案中，根据如Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-52(1994)所述的方法诱导iPSC分化，该文献引用了大量公开了用于体外分化胚胎干细胞以产生各种分化的细胞类型包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等的方法的文章。
在其他具体实施方案中，根据Bain等人，Dev.Biol.，168：342-357(1995)诱导iPSC分化，该文献教导了胚胎干细胞的体外分化以产生具有神经元特性的神经细胞。
这些参考文献是所报道的从胚胎或干细胞样细胞获得分化的细胞的方法的示例。这些参考文献并且特别是其中关于分化胚胎干细胞的方法的公开内容全文以引用方式并入本文。
因此，使用已知的方法和培养基，本领域技术人员可培养受试者的胚胎或干细胞样细胞以获得期望的分化的细胞类型，例如神经细胞、肌细胞、造血细胞等。此外，使用诱导型Bcl-2或Bcl-x1可能有助于增强特定细胞谱系的体外发育。在体内，Bcl-2防止在淋巴和神经发育期间发生的许多但不是所有形式的凋亡性细胞死亡。Bcl-2表达如何用于在供体细胞转染后抑制相关细胞谱系的凋亡的彻底讨论公开于美国专利5,646,008中，该专利以引用方式并入本文。
本文提供的iPSC可用于获得任何期望的分化的细胞类型。此类分化的人细胞的治疗用途是无可比拟的。例如，人造血干细胞可用于需要骨髓移植的医学治疗。这些方法用于治疗许多疾病，例如晚期癌症诸如卵巢癌和白血病，以及损害免疫系统的疾病。造血干细胞可例如通过将癌症或AIDS患者的成年体细胞(例如，上皮细胞或淋巴细胞)与去核卵母细胞(例如，牛卵母细胞)融合，获得如上所述的胚胎或干细胞样细胞，并在有利于分化的条件下培养这些细胞直到获得造血干细胞来获得。此类造血细胞可用于治疗包括癌症和AIDS的疾病。
本发明的方法还可用于治疗、预防或稳定神经疾病，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或ALS、溶酶体贮积病、多发性硬化症或脊髓损伤。例如，体细胞可获自需要治疗的个体，并重编程以获得多能性，并培养以获得可用于替换或辅助患病或受损组织的正常功能的神经外胚层细胞。
为了治疗或预防内分泌病症，可将产生激素诸如生长因子、甲状腺激素、促甲状腺激素、甲状旁腺激素、类固醇、血清素、肾上腺素或去甲肾上腺素的重编程细胞施用于哺乳动物。另外，可施用重编程的上皮细胞以修复对体腔或器官诸如肺、肠、外分泌腺或泌尿生殖道的内层的损伤。还设想可将iPSC施用于哺乳动物以治疗器官诸如膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道或子宫中的细胞损伤或缺陷。
本公开的最大优点是它提供了适于移植的等基因或同基因人细胞的基本上无限的供应。因此，它将避免与当前移植方法有关的重大问题，即由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而可能发生的移植组织排斥。通常，通过施用抗排斥药物诸如环孢霉素来预防或减少排斥。然而，此类药物具有显著的不良副作用，例如免疫抑制、致癌特性以及非常昂贵。本发明应消除或至少大大减少对抗排斥药物诸如环孢霉素、imulan、FK-506、糖皮质素和雷帕霉素以及它们的衍生物的需要。
iPSC还可与基质组合以在体外或体内形成组织或器官，其可用于修复或替换受体哺乳动物中的组织或器官。例如，iPSC可在基质的存在下体外培养以产生泌尿生殖系统的组织或器官，诸如膀胱、阴蒂、海绵体、肾、睾丸、输尿管、输尿管瓣膜或尿道，然后可将其移植到哺乳动物中(Atala，Curr.Opin.Urol.9(6)：517-526，1999)。在另一移植应用中，通过在适当基质的存在下培养重编程的细胞在体外形成合成血管，然后将血管移植到哺乳动物中用于治疗或预防心血管或循环病症。为了产生供体软骨或骨组织，在允许软骨或骨形成的条件下，在基质存在下体外培养iPSC诸如软骨细胞或骨细胞，然后将含有供体组织的基质施用于哺乳动物。另选地，可将细胞和基质的混合物施用于哺乳动物以在体内形成期望的组织。优选地，细胞附着于基质的表面或被基质包封。可用于形成供体组织或器官的基质的示例包括胶原基质、碳纤维、聚乙烯醇海绵、丙烯酰胺海绵、纤维蛋白-凝血酶凝胶、基于透明质酸的聚合物和含有聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸或它们的组合的合成聚合物基质(参见例如美国专利4,846,835、4,642,120、5,786,217和5,041,138)。
根据本公开所产生的iPSC可用于产生遗传工程化或转基因分化的细胞。本质上，这将通过引入期望的一个或多个基因，或去除根据本发明所产生的iPSC的一个或多个内源基因的全部或部分，并使这些细胞分化成期望的细胞类型来实现。实现此类修饰的优选方法是通过同源重组，因为此类技术可用于在干细胞样细胞基因组的一个或多个特定位点处插入、缺失或修饰一个或多个基因。
该方法可用于替换缺陷基因，例如缺陷免疫系统基因、囊性纤维化基因，或用于引入导致治疗上有益的蛋白质诸如生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等表达的基因。例如，可将编码脑衍生生长因子的基因引入人胚胎或干细胞样细胞中，将细胞分化成神经细胞，并将细胞移植到帕金森氏病患者中以延缓在此类疾病期间神经细胞的损失。可使用这些方法拯救的突变的示例包括囊性纤维化基因中的突变；与Dunningan病相关的突变，诸如核纤层蛋白A基因中的R482W、R482Q和R584H突变；以及与Emery Deyfuss肌营养不良的常染色体显性形式相关的突变，诸如核纤层蛋白A基因中的R249Q、R453W和Q6STOP突变。在Q6STOP突变中，Gln6的密码子突变为终止密码子。
以前，用BDNF转染的细胞类型从原代细胞变化到无限增殖化细胞系，或是神经或是非神经(成肌细胞和成纤维细胞)衍生的细胞。例如，使用逆转录病毒载体用BDNF基因转染星形细胞，并将细胞移植到帕金森氏病大鼠模型中(Yoshimoto等人，Brain Research，691：25-36，(1995))。这种离体治疗在移植后32天将大鼠中的帕金森病样症状减少了高达45％。而且，酪氨酸羟化酶基因已被置于星形细胞中，具有类似的结果(Lundberg等人，Develop.Neurol.，139：39-53(1996)和其中引用的参考文献)。
然而，此类离体系统存在问题。特别地，目前使用的逆转录病毒载体在体内被下调，并且转基因仅被瞬时表达(由Mulligan，Science，260：926-932(1993)综述)。此外，这些研究使用原代细胞，星形细胞，其具有有限的寿命并且复制缓慢。此类特性不利地影响转染速率并阻碍稳定转染细胞的选择。此外，几乎不可能繁殖用于同源重组技术的大批量基因定向原代细胞。
相反，与逆转录病毒系统相关的困难应通过使用本公开的iPSC(其为ES样细胞)来消除。使用已知的方法将期望的基因/突变引入ES细胞，可对iPSC进行遗传工程化，并将所得的工程化细胞分化成期望的细胞类型，例如造血细胞、神经细胞、胰腺细胞、软骨细胞等。可引入iPSC的基因包括例如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质衍生的神经营养生长因子、胰岛素样生长因子(I和II)、神经营养蛋白3、神经营养蛋白-4/5、睫状神经营养因子、AFT-1、细胞因子基因(白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(α和β)等)，编码治疗性酶、胶原、人血清白蛋白等的基因。
此外，如果需要，还可使用本领域现在已知的负选择系统之一来从患者中去除治疗性细胞。例如，用胸苷激酶(TK)基因转染的供体细胞将导致产生含有TK基因的胚胎细胞。这些细胞的分化将导致分离也表达TK基因的感兴趣的治疗性细胞。此类细胞可在施用更昔洛韦后的任何时间从患者中选择性地消除。此类负选择系统描述于美国专利5,698,446中并以引用方式并入本文。
可治疗或预防的疾病、障碍或病症的示例包括神经、内分泌、结构、骨骼、血管、泌尿、消化、外皮、血液、免疫、自身免疫、炎症、内分泌、肾、膀胱、心血管、癌症、循环、消化、造血和肌肉疾病、障碍和病症。此外，重编程的细胞可用于重建应用，诸如用于修复或替换组织或器官。
关于本公开的治疗方法，向哺乳动物施用iPSC不旨在限于特定的施用模式、剂量或给药频率；本公开设想了所有施用模式，包括肌内、静脉内、关节内、病灶内、皮下或足以提供足以预防或治疗疾病的剂量的任何其他途径。iPSC可以单剂量或多剂量施用于哺乳动物。当施用多剂量时，剂量可彼此分开例如一周、一个月、一年或十年。还可在施用细胞之前、期间或之后施用一种或多种生长因子、激素、白介素、细胞因子或其他细胞，以进一步使它们偏向特定的细胞类型。
本公开的iPSC可用作体外分化模型，特别是用于研究参与早期发育调节的基因。使用iPSC的分化的细胞组织和器官可用于药物研究。
此外，可将根据本公开所产生的iPSC引入动物例如SCID小鼠、牛、猪，例如在肾囊下或肌内，并用于在其中产生畸胎瘤。此类畸胎瘤可用于衍生不同的组织类型。此外，由X-种核移植产生的内细胞团可与提供3-维组织形成的生物可降解的、生物相容的聚合物基质一起引入。在组织形成后，聚合物降解，理想地仅留下供体组织，例如心脏、胰腺、神经、肺、肝。在一些情况下，包括促进血管生成的生长因子和蛋白质可能是有利的。另选地，用适当的培养基和条件、生长因子和可生物降解的聚合物基质，可完全在体外完全实现组织的形成。
在某些更具体的实施方案中，本文提供了治疗对其有需要的受试者的方法，其包括：(a)从受试者获得细胞的分离群体；(b)根据本文所述的产生iPSC的方法将细胞的分离群体中的γδT细胞重编程以产生iPSC；以及(c)任选地在将iPSC分化成一种或多种期望的细胞类型之后，向该受试者施用所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物。
在某些实施方案中，所产生的iPSC将iPSC分化成一种或多种期望的细胞类型并施用于受试者。
例如，在一些实施方案中，鉴于其显著的多谱系分化和自我更新潜力，iPSC可分化成T细胞以提供几乎无限的再生T细胞来源，从而解决了限制T细胞抗肿瘤功效即T细胞耗竭的重要问题(Schietinger，A.&Greenberg，P.D.，Trends Immunol.，2015，35(2)：51-60)。T细胞通过经由T细胞受体(TCR)与抗原结合而发挥效应子功能。然而，有时TCR结合不产生效应子活性，特别是在慢性感染条件下，从而导致T细胞耗竭(Karagiannis，P.等人，Seminarsin Immunology，2015，28(1)：35-44)。在这种情况下，过继细胞疗法(ACT)可用作补偿机制，其涉及分离自患者肿瘤微环境的T细胞的离体扩增或自体T细胞受体的遗传修饰以引发免疫应答(同前)。通过将耗竭的T细胞重编程为iPSC而使其再生代表了一种用于T细胞耗竭的有效解决方案，因为TCR重排保留了某些特异性抗原的基因座(同前)。
在一些实施方案中，本文提供了包含已从根据本文提供的方法产生的iPSC分化的分离群体或亚群的功能增强的衍生免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，iPSC包含一种或多种可保留在iPSC衍生的免疫细胞中的靶向遗传编辑，其中遗传工程化iPSC及其衍生细胞适用于基于细胞的过继疗法。在一个实施方案中，遗传工程化免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的前T或T细胞。在一个实施方案中，遗传工程化免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的前NK或NK细胞。在一个实施方案中，遗传工程化免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的免疫调节细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，iPSC衍生的遗传工程化免疫细胞被进一步离体调节以提高治疗潜力。
在某些实施方案中，将所产生的iPSC施用于受试者而不进一步分化。
在某些实施方案中，该受试者是人。
在某些实施方案中，该受试者患有造血系统的过度增生性障碍或癌症。在一些实施方案中，该受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，造血系统的过度增殖性障碍是真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化伴骨髓化生或慢性骨髓性白血病。
在某些实施方案中，本文所述的所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物可用于治疗癌症。可治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。在一些实施方案中，癌症可以是非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以是实体瘤。在一些实施方案中，癌症的类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。在一些实施方案中，还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
在一些实施方案中，本文所述的所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物用于治疗血液癌症。血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的示例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性髓样白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、幼年型骨髓单核细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、原因不明的髓样化生、家族性噬红血球性淋巴组织细胞增生症、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
在一些实施方案中，该受试者患有骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性非成淋巴细胞性白血病或前白血病。
在一些实施方案中，本文所述的所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物用于治疗实体瘤。实体瘤是通常不合囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的示例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在一些实施方案中，该受试者患有乳腺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、肉瘤或慢性肉芽肿疾病。
在一些实施方案中，本文提供了包含如本文提供的iPSC的细胞和一种或多种附加剂的组合疗法。
还提供了在疗法中使用的本文所述的iPSC或包含本文所述的iPSC的药物组合物。还提供了在治疗需要此类治疗的受试者的造血系统的过度增殖性障碍或癌症的方法中使用的本文所述的iPSC或包含本文所述的iPSC的药物组合物。
5.7.用于鉴定重编程或有助于重编程体细胞的剂的方法
在另一方面，本文提供了用于鉴定单独或与一种或多种其他剂组合将体细胞(例如T细胞)重编程为低分化状态的剂的方法。本公开还提供了根据本文提供的方法鉴定的剂。
在一个实施方案中，该方法包括使体细胞与包含IL-15、唑来膦酸和/或IL-2的活化培养物接触；使体细胞与候选剂接触，然后确定候选剂的存在是否导致相对于如果细胞未与候选剂接触将发生的重编程增强的重编程(例如，重编程速度和/或效率增加)。
在一些实施方案中，本文提供了用于鉴定单独或与一种或多种剂组合将体细胞(例如T细胞)重编程为低分化状态的剂的方法，其包括(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)使细胞的分离群体与候选剂接触；(d)用编码一种或多种重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；(e)在适于将哺乳动物体细胞重编程为低分化状态的条件下培养所转导的γδT细胞，以及(f)确定这些体细胞中的至少一些体细胞是否重编程为低分化状态。在一些实施方案中，该低分化状态是多潜能状态。在一些实施方案中，该低分化状态是多能状态。在某些实施方案中，该活化培养物还包含一种或多种附加剂或化合物，例如以提高活化或诱导的效率。在一个实施方案中，该活化培养物还包含白介素-2(IL-2)。
在一些实施方案中，IL-15、唑来膦酸和/或IL-2与候选剂一起存在于细胞培养基中，而在其他实施方案中，IL-15、唑来膦酸和/或IL-2与候选剂不一起存在(例如，细胞依次暴露于剂)。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-20天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-17天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-15天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-13天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-11天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-9天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-7天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-5天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持1-3天。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持12-72小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持12-60小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持12-48小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持12-36小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持12-24小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持8-16小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持4-8小时。在某些实施方案中，细胞在培养物中维持2-4小时。细胞可在培养物中维持例如至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天等，在此期间它们与IL-15、唑来膦酸和/或IL-2和候选剂接触全部或部分时间。在一些实施方案中，如果在所述时间段之后重编程细胞或主要包含重编程细胞的集落的数量是细胞未与剂接触时的至少2、5或10倍，则该剂被鉴定为重编程细胞的剂。
候选剂可以是任何分子或超分子复合物，例如肽、小的有机或无机分子、多糖、多核苷酸等，其将被测试用于重编程或促进或增强重编程细胞的能力。如本领域技术人员所理解的，候选剂可从多种来源获得，包括合成或天然化合物的文库。在一些实施方案中，候选剂是合成化合物。许多技术可用于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成。在一些实施方案中，候选调节剂作为天然化合物的混合物以细菌、真菌、植物和动物提取物、发酵液、条件培养基等的形式提供，其是可获得的或容易产生的。
在一些实施方案中，筛选化合物文库。文库通常是可呈现或展示的化合物的集合，使得可在筛选测定中鉴定化合物。在一些实施方案中，文库中的化合物容纳在单独的孔(例如微量滴定板的孔)、容器、管等中，以促进方便地转移到单独的孔或容器用于接触细胞、进行无细胞测定等。文库可由具有共同结构特征的分子组成，该共同结构特征在附接到主结构的基团的数目或类型上不同或可为完全随机的。文库包括但不限于例如噬菌体展示文库、肽文库、多核糖体文库、适体文库、合成小分子文库、天然化合物文库和化学文库。制备分子文库的方法是本领域公知的，许多文库可从商业或非商业来源获得。感兴趣的文库包括合成的有机组合文库。文库诸如合成小分子文库和化学文库可包括化学分子的结构多样性集合。小分子包括通常具有多个碳-碳键的有机分子。文库可包含被一个或多个官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。在一些实施方案中，小分子具有5至50个碳原子，例如在7至30个碳之间。在一些实施方案中，化合物是大环化合物。感兴趣的文库还包括肽文库、随机寡核苷酸文库等。可合成类肽和非肽合成部分的文库。可进一步合成这样的文库，其含有与其天然存在的对应物相比较少受酶降解的非肽合成部分。也可生成小分子组合文库。小分子有机化合物的组合文库可包含紧密相关的类似物的集合，这些类似物在一个或多个多样性方面彼此不同并且通过使用多步方法的有机技术合成。组合文库可包括大量的小有机化合物。如本文所用，″化合物阵列″是化合物的集合，其可通过它们在笛卡尔坐标中的空间地址来鉴定并且排列成使得每个化合物具有共同的分子核心和一个或多个可变结构多样性元件。此类化合物阵列中的化合物在单独的反应容器中平行产生，其中每个化合物通过其空间地址来鉴定和跟踪。在一些实施方案中，筛选含有两种或更多种化合物、提取物或从天然来源获得的其他制备物(其可包含数十种或更多种化合物)和/或无机化合物等的混合物。
在一个实施方案中，本发明的方法用于筛选″批准的药物″。″批准的药物″是已被FDA或另一国家的类似政府机构批准用于人类以用于任何目的的任何化合物(该术语包括生物分子诸如蛋白质和核酸)。这可以是筛选的特别有用的一类化合物，因为它代表一组被认为是安全的并且至少在FDA批准的药物的情况下是用于至少一种目的的治疗剂的化合物。因此，很可能这些药物至少对于其他目的是安全的。
可被筛选的文库的代表性示例包括可从ChemBridge Corporation，16981 ViaTazon，San Diego，Calif.92127获得的DIVERSetTM。DIVERSet含有10,000与50,000个之间的类药物的手工合成小分子。对化合物进行预选择以形成″通用″文库，该文库用最小数量的化合物覆盖了最大药效团多样性，并且适于高通量或较低通量筛选。关于附加文库的描述，参见例如Tan等人，Am.Chem Soc.120，8565-8566，1998；Floyd C D，Leblanc C，WhittakerM，Prog Med Chem 36：91-168，1999。许多文库是可商购获得的，例如来自AnalytiCon USAInc.，P.O.Box 5926，Kingwood，Tex.77325；3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.，665Stockton Drive，Suite 104，Exton，Pa.19341-1151；Tripos，Inc.，1699Hanley Rd.，St.Louis，Mo.，63144-2913等。例如，基于奎尼酸和莽草酸、羟脯氨酸、山道宁(santonine)、二脱水-D-葡萄糖醇、羟基派可林酸、穿心莲内酯、基于哌嗪-2-羧酸的文库、胞嘧啶等的文库是可商购获得的。
在一些实施方案中，候选剂是来自由细胞(例如多能细胞)制备的cDNA表达文库的cDNA。此类细胞可以是胚胎干细胞、卵母细胞、卵裂球、畸胎癌、胚胎生殖细胞、内细胞团细胞等。
应当理解，待测试的候选重编程剂通常是不存在于标准培养基中的重编程剂，或者如果存在，则以比用于本发明时更低的量存在。还应当理解，有用的重编程剂或其他形式的重编程处理不需要能够重编程所有类型的体细胞，也不需要能够重编程给定细胞类型的所有体细胞。非限制性地，使用这样的候选剂，其导致群体中的重编程细胞富集2、5、10、50、100或更多倍(即，群体中重编程细胞的分数是以相同方式处理但不与候选剂接触的细胞的起始群体中存在的2、5、10、50或100倍)。
在一些实施方案中，本文提供的筛选方法用于鉴定在将细胞重编程为多能状态中替代Klf4的剂或剂组合。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在将细胞重编程为多能状态中替代Sox2的剂。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在将细胞重编程为多能状态中替代Oct3/4的剂。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在将细胞重编程为多能状态中替代c-Myc的剂。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在将细胞重编程为多能状态中替代Lin28的剂。在一些实施方案中，使用人细胞实施该方法。在一些实施方案中，使用小鼠细胞实施该方法。在一些实施方案中，使用非人灵长类细胞实施该方法。
在另一方面，本文提供了用于鉴定活化体细胞(例如，T细胞)中内源多能性基因表达的基因的方法。
在一些实施方案中，该方法包括(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种候选重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为低分化状态的条件下培养所转导的γδT细胞，以及(e)确定这些体细胞中的至少一些体细胞是否重编程为低分化状态。在一些实施方案中，该低分化状态是多潜能状态。在一些实施方案中，该低分化状态是多能状态。
在一些更具体的实施方案中，该方法包括(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种候选重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；以及(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞，以及(e)确定这些体细胞中的至少一些体细胞是否重编程为多能状态。
在某些实施方案中，该活化培养物还包含一种或多种附加剂或化合物，例如以提高活化或诱导的效率。在一个实施方案中，该活化培养物还包含白介素-2(IL-2)。
因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种候选重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为低分化状态的条件下培养所转导的γδT细胞；以及(e)确定这些体细胞中的至少一些体细胞是否重编程为低分化状态。
在一些更具体的实施方案中，本文提供的方法包括：(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中该活化培养物包含IL-15、唑来膦酸和IL-2；(b)在该活化培养物中培养该细胞的分离群体，以富集和/或活化该细胞的分离群体中的γδT细胞；(c)用编码一种或多种候选重编程因子的一种或多种病毒载体转导γδT细胞；(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞；以及(e)确定这些体细胞中的至少一些体细胞是否重编程为多能状态。
在其他实施方案中，该方法包括例如在IL-15、唑来膦酸和/或IL-2的存在下培养如本文提供的体细胞，然后用由ES细胞或卵母细胞制备的cDNA文库转染本公开的体细胞，选择表达第一选择性标记的细胞，以及评估第一内源多能性基因在表达第一选择性标记的转染细胞中的表达。第一内源多能性基因的表达表明cDNA编码活化内源多能性基因在体细胞中表达的基因。
本发明的方法适用于鉴定活化体细胞中至少两种内源多能性基因表达的基因。该方法中使用的体细胞还包含与第二选择性标记连接的第二内源多能性基因。可修改该方法以选择表达两种选择性标记的转染细胞，其中评估第一内源多能性基因和第二内源多能性基因的表达。第一内源多能性基因和第二内源多能性基因的表达表明cDNA编码活化体细胞中至少两种多能性基因表达的基因。
本发明的方法还适用于鉴定活化体细胞中至少三种内源多能性基因表达的基因。该方法中使用的体细胞还包含与第三选择性标记连接的第三内源多能性基因。修改该方法以选择表达所有三种选择性标记的转染细胞，其中评估所有三种内源多能性基因的表达。所有三种内源多能性基因的表达表明cDNA编码活化体细胞中至少三种多能性基因表达的基因。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用小鼠遗传学、发育生物学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术描述于文献中。参见例如，Current Protocols in CellBiology，由Bonifacino、Dasso、Lippincott-Schwartz、Harford和Yamada编辑，John Wileyand Sons，Inc.，New York，1999；Manipulating the Mouse Embryos，A LaboratoryManual，第3版，Hogan等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，2003；Gene Targeting：A Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，1993；以及Gene Targeting Protocols，Human Press，Totowa，N.J.，2000。本文引用的所有专利、专利申请和参考文献均全文以引用方式并入。
6.实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
在一组实施方案(A组实施方案)中，提供了：
A1.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中所述活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；
(b)在所述活化培养物中培养所述细胞的分离群体，以富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞；
(c)用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导所述γδT细胞；以及
(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
A2.根据实施方案A1所述的方法，其中所述活化培养物还包含IL-2。
A3.根据实施方案A1或A2所述的方法，其中所述病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
A4.根据实施方案A1-A3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从受试者获得所述细胞的分离群体。
A5.根据实施方案A1-A4中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。
A6.根据实施方案A1-A5中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是终末分化的细胞。
A7.根据实施方案A1-A6中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是哺乳动物细胞。
A8.根据实施方案A7中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是人细胞。
A9.根据实施方案A1-A8中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养1-20天、1-17天、1-15天、1-13天、1-11天、1-9天、1-7天、1-5天、1-3天、12-72小时、12-60小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、8-16小时、4-8小时或2-4小时。
A10.根据实施方案A9所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
A11.根据实施方案A10所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多3天。
A12.根据实施方案A10所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养3天。
A13.根据实施方案A1-A12中任一项所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含5％-100％的γδT细胞、5％-95％的γδT细胞、5％-90％的γδT细胞、5％-85％的γδT细胞、5％-80％的γδT细胞、5％-75％的γδT细胞、5％-70％的γδT细胞、5％-65％的γδT细胞、5％-60％的γδT细胞、5％-55％的γδT细胞、5％-50％的γδT细胞、5％-45％的γδT细胞、5％-40％的γδT细胞、5％-35％的γδT细胞、5％-30％的γδT细胞、5％-25％的γδT细胞、5％-20％的γδT细胞或5％-15％的γδT细胞。
A14.根据实施方案A13所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。
A15.根据实施方案A14所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞。
A16.根据实施方案A1-A15中任一项所述的方法，还包括在步骤(b)之后富集所述细胞的分离群体中的所述γδT细胞。
A17.根据实施方案A16所述的方法，其中所述γδT细胞通过细胞-细胞团块富集来富集。
A18.根据实施方案A1-A17中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9+γδT细胞。
A19.根据实施方案A1-A17中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
A20.根据实施方案A1-A19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组。
A21.根据实施方案A1-A20中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
A22.根据实施方案A21所述的方法，其中在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
A23.根据实施方案A21或A22所述的方法，其中所述饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
A24.根据实施方案A1-A23中任一项所述的方法，还包括分离和/或纯化所产生的iPSC。
A25.根据实施方案A24所述的方法，还包括向受试者施用所分离的iPSC。
A26.根据实施方案A1-A24中任一项所述的方法，还包括将所述iPSC离体分化为期望细胞类型的细胞。
A27.根据实施方案A26所述的方法，还包括向受试者施用所述分化的细胞。
A28.根据实施方案A1-A27中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
A29.根据实施方案A1-A28中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC衍生自γδT细胞。
A30.根据实施方案A1-A28中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC具有TRG和TRD基因座的重排基因；并且其中任选地所产生的iPSC具有Vγ9和Vδ2基因排列。
A31.根据实施方案A1-A28中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不衍生自αβT细胞。
A32.根据实施方案A1-A28中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不从TCRA和TCRB基因座产生聚合酶链式反应(PCR)产物。
A33.根据实施方案A1-A32中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC是基因组稳定的，没有染色体丢失。
A34.根据实施方案A33所述的方法，其中通过核型分析确定所产生的iPSC的基因组稳定性。
A35.根据实施方案A1-A34中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC在过继后能够在无饲养培养基中生长。
A36.一种诱导性多能干细胞(iPSC)，所述诱导性多能干细胞根据实施方案A1-A35中任一项所述的方法产生。
A37.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案A36所述的iPSC和药学上可接受的赋形剂。
A38.一种分化的细胞，所述分化的细胞根据实施方案A26所述的方法产生。
A39.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案A38所述的分化的细胞和药学上可接受的赋形剂。
在另一组实施方案(B组实施方案)中，提供了：
B1.一种治疗对其有需要的受试者的方法，所述方法包括：
(i)从受试者获得包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞群；
(ii)将所产生的iPSC的细胞群中的γδT细胞重编程；以及
(iii)任选地在将所述iPSC分化成一种或多种期望类型的细胞之后，向所述受试者施用所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物，
其中步骤(ii)包括：
(a)使所述细胞群与活化培养物接触；其中所述活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；
(b)在所述活化培养物中培养所述细胞群以富集和/或活化所述细胞群中的γδT细胞；
(c)用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导所述γδT细胞；以及
(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
B2.根据实施方案B1所述的方法，其中所述活化培养物还包含IL-2。
B3.根据实施方案B1或B2所述的方法，其中所述病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
B4.根据实施方案B1-B3中任一项所述的方法，其中所述细胞群在所述活化培养物中培养1-20天、1-17天、1-15天、1-13天、1-11天、1-9天、1-7天、1-5天、1-3天、12-72小时、12-60小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、8-16小时、4-8小时或2-4小时。
B5.根据实施方案B4所述的方法，其中所述细胞群在所述活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
B6.根据实施方案B5所述的方法，其中所述细胞群在所述活化培养物中培养至多3天。
B7.根据实施方案B5所述的方法，其中所述细胞群在所述活化培养物中培养3天。
B8.根据实施方案B1-B7中任一项所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞群包含5％-100％的γδT细胞、5％-95％的γδT细胞、5％-90％的γδT细胞、5％-85％的γδT细胞、5％-80％的γδT细胞、5％-75％的γδT细胞、5％-70％的γδT细胞、5％-65％的γδT细胞、5％-60％的γδT细胞、5％-55％的γδT细胞、5％-50％的γδT细胞、5％-45％的γδT细胞、5％-40％的γδT细胞、5％-35％的γδT细胞、5％-30％的γδT细胞、5％-25％的γδT细胞、5％-20％的γδT细胞或5％-15％的γδT细胞。
B9.根据实施方案B8所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞群包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。
B10.根据实施方案B9所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞群包含少于35％的γδT细胞。
B11.根据实施方案B1-B10中任一项所述的方法，还包括在步骤(b)之后富集所述细胞群中的所述γδT细胞。
B12.根据实施方案B11所述的方法，其中所述γδT细胞通过细胞-细胞团块富集来富集。
B13.根据实施方案B1-B12中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9+γδT细胞。
B14.根据实施方案B1-B12中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
B15.根据实施方案B1-B14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组。
B16.根据实施方案B1-B15中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
B17.根据实施方案B16所述的方法，其中在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
B18.根据实施方案B16或B17所述的方法，其中所述饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
B19.根据实施方案B1-B18中任一项所述的方法，还包括分离和/或纯化所产生的iPSC。
B20.根据实施方案B1-B19中任一项所述的方法，还包括将所述iPSC离体分化为期望细胞类型的细胞。
B21.根据实施方案B1-B20中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
B22.根据实施方案B1-B20中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC衍生自γδT细胞。
B23.根据实施方案B1-B20中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC具有TRG和TRD基因座的重排基因；并且其中任选地所产生的iPSC具有Vγ9和Vδ2基因排列。
B24.根据实施方案B1-B20中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不衍生自αβT细胞。
B25.根据实施方案B1-B20中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不从TCRA和TCRB基因座产生聚合酶链式反应(PCR)产物。
B26.根据实施方案B1-B25中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC是基因组稳定的，没有染色体丢失。
B27.根据实施方案B26所述的方法，其中通过核型分析确定所产生的iPSC的基因组稳定性。
B28.根据实施方案B1-B27中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC在过继后能够在无饲养培养基中生长。
B29.根据实施方案B1-B28中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
B30.根据实施方案B1-B29中任一项所述的方法，其中所述受试者患有造血系统的过度增殖性障碍或癌症。
在另一组实施方案(C组实施方案)中，提供了：
C1.一种诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中所述iPSC的分离群体包含多能细胞，其中所述多能细胞表达一种或多种重编程因子，并且/或者其中所述多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列。
C2.根据实施方案C1所述的iPSC的分离群体，其中所述重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组。
C3.根据实施方案C1或C2所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
C4.根据实施方案C1-C3中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体衍生自γδT细胞。
C5.根据实施方案C1-C3中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体具有TRG和TRD基因座的重排基因；并且其中任选地所述iPSC的分离群体具有Vγ9和Vδ2基因排列。
C6.根据实施方案C1-C3中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体不衍生自αβT细胞。
C7.根据实施方案C1-C3中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物。
C8.根据实施方案C1-C7中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失。
C9.根据实施方案C8所述的iPSC的分离群体，其中通过核型分析确定所述iPSC的分离群体的基因组稳定性。
C10.根据实施方案C1-C9中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
在又一组实施方案(D组实施方案)中，提供了：
D1.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)执行富集和/或活化细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤；以及
(b)执行将所述γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤。
D2.根据实施方案D1所述的方法，其中所述执行富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤包括使所述细胞的分离群体与活化培养物接触；其中所述活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；以及在所述活化培养物中培养所述细胞的分离群体以富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞。
D3.根据实施方案D2所述的方法，其中所述活化培养物还包含IL-2。
D4.根据实施方案D1-D3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括执行从受试者获得所述细胞的分离群体的功能的步骤。
D5.根据实施方案D1-D4中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。
D6.根据实施方案D1-D5中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是终末分化的细胞。
D7.根据实施方案D1-D6中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是哺乳动物细胞。
D8.根据实施方案D7所述的方法，其中所述细胞的分离群体是人细胞。
D9.根据实施方案D2-D8中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养1-20天、1-17天、1-15天、1-13天、1-11天、1-9天、1-7天、1-5天、1-3天、12-72小时、12-60小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、8-16小时、4-8小时或2-4小时。
D10.根据实施方案D9所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
D11.根据实施方案D10所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多3天。
D12.根据实施方案D10所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养3天。
D13.根据实施方案D2-D12中任一项所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含5％-100％的γδT细胞、5％-95％的γδT细胞、5％-90％的γδT细胞、5％-85％的γδT细胞、5％-80％的γδT细胞、5％-75％的γδT细胞、5％-70％的γδT细胞、5％-65％的γδT细胞、5％-60％的γδT细胞、5％-55％的γδT细胞、5％-50％的γδT细胞、5％-45％的γδT细胞、5％-40％的γδT细胞、5％-35％的γδT细胞、5％-30％的γδT细胞、5％-25％的γδT细胞、5％-20％的γδT细胞或5％-15％的γδT细胞。
D14.根据实施方案D13所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。
D15.根据实施方案D14所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞。
D16.根据实施方案D1-D15中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分被活化为Vγ9+γδT细胞。
D17.根据实施方案D1-D15中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
D18.根据实施方案D1-D17中任一项所述的方法，其中所述执行将所述γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤包括用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导所述γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
D19.根据实施方案D18所述的方法，其中所述病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
D20.根据实施方案D18或D19所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组。
D21.根据实施方案D18-D20中任一项所述的方法，其中在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
D22.根据实施方案D21所述的方法，其中在单层饲养层存在下培养所转导的γδT细胞。
D23.根据实施方案D21或D22所述的方法，其中所述饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在又一组实施方案(E组实施方案)中，提供了：
E1.一种根据一种方法产生的诱导性多能干细胞(iPSC)，所述方法包括：
(a)执行富集和/或活化细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤；以及
(b)执行将所述γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤。
E2.根据实施方案E1所述的iPSC，其中所述执行富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤包括使所述细胞的分离群体与活化培养物接触；其中所述活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；以及在所述活化培养物中培养所述细胞的分离群体以富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞。
E3.根据实施方案E2所述的iPSC，其中所述活化培养物还包含IL-2。
E4.根据实施方案E1-E3中任一项所述的iPSC，其中所述方法还包括执行从受试者获得所述细胞的分离群体的功能的步骤。
E5.根据实施方案E1-E4中任一项所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。
E6.根据实施方案E1-E5中任一项所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体是终末分化的细胞。
E7.根据实施方案E1-E6中任一项所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体是哺乳动物细胞。
E8.根据实施方案E7中任一项所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体是人细胞。
E9.根据实施方案E2-E8中任一项所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养1-20天、1-17天、1-15天、1-13天、1-11天、1-9天、1-7天、1-5天、1-3天、12-72小时、12-60小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、8-16小时、4-8小时或2-4小时。
E10.根据实施方案E9所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
E11.根据实施方案E10所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多3天。
E12.根据实施方案E10所述的iPSC，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养3天。
E13.根据实施方案E2-E12中任一项所述的iPSC，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含5％-100％的γδT细胞、5％-95％的γδT细胞、5％-90％的γδT细胞、5％-85％的γδT细胞、5％-80％的γδT细胞、5％-75％的γδT细胞、5％-70％的γδT细胞、5％-65％的γδT细胞、5％-60％的γδT细胞、5％-55％的γδT细胞、5％-50％的γδT细胞、5％-45％的γδT细胞、5％-40％的γδT细胞、5％-35％的γδT细胞、5％-30％的γδT细胞、5％-25％的γδT细胞、5％-20％的γδT细胞或5％-15％的γδT细胞。
E14.根据实施方案E13所述的iPSC，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。
E15.根据实施方案E14所述的iPSC，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞。
E16.根据实施方案E1-E15中任一项所述的iPSC，其中所述γδT细胞的至少一部分被活化为Vγ9+γδT细胞。
E17.根据实施方案E1-E15中任一项所述的iPSC，其中所述γδT细胞的至少一部分被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
E18.根据实施方案E1-E17中任一项所述的iPSC，其中所述执行将所述γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤包括用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导所述γδT细胞；以及在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
E19.根据实施方案E18所述的iPSC，其中所述病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
E20.根据实施方案E18或E19所述的iPSC，其中所述一种或多种重编程因子选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组。
E21.根据实施方案E18-E20中任一项所述的iPSC，其中在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
E22.根据实施方案E21所述的iPSC，其中在单层饲养层存在下培养所转导的γδT细胞。
E23.根据实施方案E21或E22所述的iPSC，其中所述饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
E24.一种诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，所述iPSC的分离群体包含多能细胞，其中所述多能细胞包含用于表达一种或多种重编程因子的工具，并且/或者其中所述多能细胞包含用于编码TRG和TRD基因重排的工具。
E25.根据实施方案E24所述的iPSC的分离群体，其中所述重编程因子选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28组成的组。
E26.根据实施方案E24或E25所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
E27.根据实施方案E24-E26中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体衍生自γδT细胞。
E28.根据实施方案E24-E27中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体具有TRG和TRD基因座的重排基因；并且其中任选地所述iPSC的分离群体具有Vγ9和Vδ2基因排列。
E29.根据实施方案E24-E28中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体不衍生自αβT细胞。
E30.根据实施方案E24-E29中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体不从TCRA和TCRB基因座产生PCR产物。
E31.根据实施方案E24-E30中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体是基因组稳定的，没有染色体丢失。
E32.根据实施方案E31所述的iPSC的分离群体，其中通过核型分析确定所述iPSC的分离群体的基因组稳定性。
E33.根据实施方案E24-E32中任一项所述的iPSC的分离群体，其中所述iPSC的分离群体在过继后能够在无饲养培养基中生长和维持。
7.实施例
以下是对在研究中使用的各种方法和材料的描述。它们被提出以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为其发明的范围，也不旨在表示执行以下实验并且是可以执行的所有实验。应当理解，不一定要执行以现在时态书写的示例性描述，而是可执行这些描述以生成与本发明的教导相关联的数据等。已努力确保关于所使用的数字(例如量、百分比等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
7.1.实施例1：来自PBMC培养物的γδT细胞的选择性活化和富集
为了生成γδT细胞衍生的iPSC，将来自健康个体的全PBMC与唑来膦酸一水合物(Zol)、白介素-2和白介素-15(Zol+IL-2+IL-15)一起培养不同的时间段(3天、8天和13天)。为了找出从Zol刺激的PBMC衍生iPSC的理想时间点，从第3天、第8天或第13天PBMC培养物富集细胞-细胞团块(图1，顶行)。从Zol刺激PBMC后的第3天，可观察到含有活化细胞的细胞-细胞团块或胚细胞。
由于Zol在活化和/或扩增Vγ9+γδT细胞中的选择性性质，假设细胞-细胞团块或胚细胞主要由Vγ9+γδT细胞构成。流式细胞术分析显示，在培养期的第3天、第8天和第13天，细胞-细胞团块分别由全PBMC中约35％、91％和93％的γδT细胞组成(图1，顶行)。在γδT细胞中，TCRVγ9+细胞分别在培养期的第3天、第8天和第13天构成γδT细胞的约35％、96％和98％(图1，底行)。然而，所有健康供体对Zol介导的刺激的响应并不相似。因此，筛选和鉴定对Zol介导的刺激快速响应的供体将有助于找到重编程的最佳供体。
7.1.1.来自全PBMC的Vγ9+γδT细胞的选择性活化
在第-3天、第-8天和第-13天，将一小瓶冷冻的PBMC快速解冻，并添加到在50mLfalcon管中的49mL温热的完全RPMI培养基中，以稀释冷冻培养基。完全RPMI培养基包含RPMI(目录号61870-036，Gibco)、10％FBS(目录号10099-141，Gibco)和1x Pen/Strep(目录号15070-063，Gibco)。将PBMC以1500rpm离心5分钟。通过将细胞重悬于35mL完全RPMI培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)中洗涤细胞一次。将细胞沉淀重悬于完全RPMI培养基中并对细胞进行计数。另选地，通过密度梯度离心从全血样品中分离PBMC，并通过使用血细胞计数器对细胞计数。在完全RPMI培养基中将细胞密度调节至1.0×106个细胞/mL。
同时，向制备的γδT细胞培养基(RPMI-10％；补充有10％FBS和1x Pen/Strep的RPMI)补充重组人IL-2(rhIL-2)(目录号202-IL，R&D Systems)至终浓度1000IU/mL，补充重组人rhIL-15(目录号247-ILB-025，R&D Systems)至终浓度10ng/mL，并补充唑来膦酸至终浓度5μM。用制备的γδT细胞培养基将细胞密度调节至1×106个细胞/mL。将10×106个细胞接种在T-75烧瓶中的10mL培养基中。
(1)对于第-3天Zol活化的PBMC，在第-3天和第0天之间进行细胞富集而不使用任何附加的培养基。
(2)对于第-8天Zol活化的PBMC，在第-5天将含有2x浓度的IL-2(200IU)和IL-15(20ng/mL)的10mL培养基加满以使IL-2和IL-15的终浓度分别达到100IU和10ng/mL。在显微镜下观察细胞胚细胞形成。另外在第-3天，将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。在培养的第-3天，将细胞沉淀重悬于40mL含有100IU IL-2和10ng/mL IL-15的培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)中。
(3)对于第-13天Zol活化的PBMC，在第-11天将含有2x浓度的IL-2(200IU)和IL-15(20ng/mL)的10mL培养基加满。在显微镜下观察细胞胚细胞形成。另外在第-7天，将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。在培养的第-7天，将细胞沉淀重悬于40mL含有100IU IL-2和10ng/mL IL-15的培养基(RPMI+i0％FBS+1x Pen/Strep)中。另外在第-5天，将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。在培养的第-5天，将细胞沉淀重悬于40mL含有100IU IL-2和10ng/mL IL-15的培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)中。另外在第-3天，将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。在培养的第-3天，将细胞沉淀重悬于40mL含有100IU IL-2和10ng/mLIL-15的培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)中。
7.1.2.γδT细胞富集
通过细胞-细胞团块富集间接富集活化的γδT细胞。在第0天，将含有Zol培养的PBMC(分别持续3天、8天和13天)的T-75cm2细胞培养瓶倾斜45度角，并且使用10mL无菌移液管吸出上清液培养基而不干扰沉降的细胞。剩余的沉降群体主要由活化细胞的团块组成。全PBMC中的Vγ9+γδT细胞被Zol选择性活化。活化的细胞形成细胞-细胞团块或胚细胞。这些细胞团块与单细胞相比具有更高的沉降速率，而上清液培养基主要由单细胞组成。
使用EasySepTM人γδT细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)根据制造商的说明书进行纯γδT细胞群的富集。
第3天或第8天收获Zol培养的PBMC并在室温下以1500rpm离心5分钟。将从第3天或第8天Zol刺激的PBMC富集的γδT细胞用于SeV载体转导。
通过将细胞重悬于普通RPMI(无FBS，或1x Pen/Strep)培养基中洗涤细胞一次，并以1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于1mL EasySepTM缓冲液(目录号20144，STEMCELLTechnologies)中，并通过血细胞计数器对细胞计数。
在5mL聚苯乙烯圆底管中，在1mL EasySep缓冲液中将沉降的细胞团块的细胞密度调节至50×106个细胞。将50μL生物素酰化的混合物添加到重悬的细胞中，混合并在室温下温育15分钟。在温育期结束之前，将EasySep磁性颗粒涡旋30秒以使它们均匀分散。温育期后，将50μL EasySep磁性颗粒添加到1mL重悬的细胞中，混合并在室温下温育10分钟。
温育期后，添加1.5mL EasySepTM缓冲液以充满含有细胞的管，通过上下轻轻混合细胞使细胞重悬。将管置于磁架上并在室温下温育5分钟。
在温育期结束时，通过将包含管的磁体翻转一个连续的运动来收集包含富集的细胞悬浮液的培养基。在多管方案中，当管在磁架上时，通过使用1mL移液手从管中收集上清液，而不干扰结合的磁性颗粒。
将37μl涡旋的磁性颗粒添加到富集的细胞悬浮液中，然后将其混合并在室温下温育5分钟。将含有细胞悬浮液的管置于磁架上并在室温下温育5分钟。通过将包含管的磁体翻转一个连续的运动，将细胞悬浮液转移到新的15mL管中，收集富集的细胞。然后用10mL完全RPMI培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)加满管。
将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟，并通过添加10mL完全RPMI培养基再洗涤一次。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟，重悬于1mL完全RPMI培养基中并通过血细胞计数器计数。通过用针对TCR γδ、TCRαβ和TCR Vγ9的mAb对细胞进行染色，在流式细胞仪上检查富集的γδT细胞的纯度。
7.2.实施例2：来自PBMC培养物的人γδT细胞衍生的iPSC的生成
用编码OCT3/4、SOX2、KLF4和c-Myc重编程因子的仙台病毒(SeV)载体转导细胞-细胞团块(或胚细胞)。SeV载体转导的细胞在有丝分裂灭活的MEF饲养层、T细胞耗尽的自体PBMC和/或无饲养条件下增殖，如下文第7.2.1节至第7.2.5节所述。
在SeV转导后约第20天开始观察到集落，并在第26天左右达到最大数量。令人惊讶的是，只有被Zol+IL-2+IL-15刺激3天的PBMC培养物在SeV转导20天后产生了相当数量的集落。相反，用Zol+IL-2+IL-15刺激8天或13天的PBMC培养物在SeV转导后没有产生相当数量的集落。
这种令人惊奇的观察结果表明，与高富集细胞(8天或13天)相比，低富集细胞(3天)非常易于重编程。
如图2A和图2B所示，MEF饲养层上不同克隆(克隆A-C)的未分化iPSC集落被鉴定为具有平滑且紧密边缘的圆形集落，并且紧密边界内的致密细胞没有异养中心。克隆A-C来自相同的供体。
相反，在层粘蛋白-511包被板上生长(无饲养培养)或与有丝分裂灭活T细胞耗尽的自体PBMC共培养(基于饲养的培养)的SeV转导的PBMC的实验组(富集3天、8天或13天)都没有产生任何集落。来自在MEF饲养层上生长的第8天PBMC培养物的富集γδT细胞也不产生任何集落。
此外，检测mRNA或附加体介导的重编程作为仙台病毒(SeV)介导的重编程的替代方案。由于Zol活化的PBMC对重复的电穿孔介导的mRNA转染无抗性，因此不能进一步进行对mRNA介导的重编程的研究。附加体介导的重编程产生非常少的集落。因此，观察到SeV介导的重编程是重编程Zol活化的γδT细胞的最有效方法。
7.2.1.用细胞外基质包被细胞培养板
明胶包被
将2mL 0.1％明胶溶液(目录号ES-006-B，Merck)添加到6孔细胞培养板的孔中，并在室温下温育两小时或在37℃下温育一小时。
在温育期结束时，使用基于真空的抽吸器小心地抽吸明胶溶液，使得孔的表面区域不与抽吸器接触。将细胞(例如，小鼠胚胎成纤维细胞)无任何延迟地添加到孔中。
iMatrix-511包被
用无菌DPBS(目录号14190-136，Gibco)稀释储备浓度为0.5mg/mL的iMatrix-511(目录号892011，Nippi/Matrixome)溶液。用稀释的iMatrix-511以0.5μg/cm2的浓度包被培养皿。对于6孔板的一个孔(9.6cm2/孔)，将9.6μL iMatrix-511(4.8μg)添加到1.99mL无菌DPBS中，并在4℃下温育过夜，在37℃下温育1小时或在室温下温育3小时。
温育期后，小心地从孔中吸出稀释的iMatrix-511，使得孔的表面区域不与吸出器接触，并且孔不被风干。
立即向孔中添加所需的培养基，以便不使板干燥。需要沿壁将培养基滴加到孔中。在抽吸和细胞接种之间不需要冲洗。立即将细胞以期望密度铺板。将板放回培养箱中。
玻连蛋白包被
将一瓶储备浓度为0.5mg/mL的玻连蛋白(目录号A14700，Gibco)在室温下解冻。在聚丙烯管中制备60μL玻连蛋白等分试样。立即使用这些等分试样或在-80℃下冷冻。
为了包被6孔板的孔，从-80℃储存中取出两个60μL玻连蛋白等分试样并在室温下解冻。每6孔板需要两个60μL等分试样。
在室温下将120μL解冻的玻连蛋白添加到含有12mL无菌DPBS但不含钙或镁的15mL锥形管中，并通过上下吸取稀释的玻连蛋白轻轻地重悬。这导致玻连蛋白的工作浓度为5μg/mL(即1∶100稀释)
将2mL稀释的玻连蛋白溶液添加到6孔板的每个孔中。当用于以2mL/孔包被6孔板(10cm2/孔)时，玻连蛋白的终浓度将为0.5μg/cm2。将包被的板在37℃下温育3小时(或根据玻连蛋白制造商在室温下温育1小时)。
可使用包被的板或将其用实验室膜包裹在2-8℃下储存长达一周。但不能干燥包被的板。在使用前，将包被的板预热至室温至少1小时。
吸出玻连蛋白溶液并弃去。去除玻连蛋白后不必冲洗包被的板。细胞可以直接传代到玻连蛋白包被的板上。
7.2.2.有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞培养物的制备
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)复苏
MEF(CF-1)(目录号SCRC-1040，ATCC)细胞系作为冷冻小瓶购自ATCC。将MEF细胞的冷冻小瓶在37℃水浴中快速解冻。将解冻的内容物以滴加方式添加到含有40mL 37℃预热的MEF培养基的50mL falcon管中，该培养基包含DMEM(目录号11965-092，Gibco)、15％FBS和1％Pen/Strep。将MEF细胞在室温下以1500rpm离心5分钟，弃去上清液。将细胞用30mLMEF培养基(DMEM+15％FBS+1％Pen/Strep)洗涤一次并在室温下以1500rpm离心5分钟。然后使用台盼蓝(目录号TCL046，Himedia)在血细胞计数器上对细胞计数。
MEF接种和培养
将MEF以20-25mL MEF培养基(DMEM+15％FBS+1％Pen/Strep)中0.8×106个细胞的密度接种在T-75cm2烧瓶中。另选地，将MEF以40mL MEF培养基中1×106个细胞的密度接种在T-150烧瓶中。将MEF在37℃下在含有7.5％-10％CO2的潮湿培养箱中温育。为了使MEF在7.5％-10％CO2下生长，培养基应含有3.7g/L碳酸氢钠。当细胞培养物达到60％-70％汇合时，对细胞进行传代培养(如下所述)。
MEF传代培养
去除MEF培养基并丢弃。然后用20mL(对于T-75烧瓶)或40mL(对于T-175烧瓶)无菌DPBS冲洗细胞层。添加4mL(对于T-75烧瓶)或10mL(对于T-175烧瓶)预热的胰蛋白酶-EDTA(目录号25200-056，Gibco)并将混合物温育2-5分钟。如在显微镜下观察到的，MEF从烧瓶上脱离，并分离形成单细胞悬浮液。通过向烧瓶中添加两倍量的完全MEF培养基(DMEM+15％FBS+1％Pen/Strep)中和胰蛋白酶。
将所有细胞转移到离心管中并在室温下以1500rpm离心5分钟。弃去上清液后，向细胞沉淀中添加10mL完全生长培养基。用10mL移液管轻轻悬浮细胞以产生单细胞悬浮液。根据传代培养的需要，向单细胞悬液中添加附加的MEF培养基。
对于传代培养，根据需要，以1∶2或1∶3的比例分离MEF细胞。将细胞在烧瓶中在含有7.5％-10％CO2的37℃潮湿培养箱中温育。如果MEF被用作iPSC的饲养层，则不推荐在第6次传代(P6)后使用它们。
MEF冷冻
将MEF细胞以5百万/冷冻瓶的细胞密度在1ml冷冻培养基(补充有附加的40％FBS和10％(v/v)DMSO的完全MEF培养基(目录号D2650，Sigma))中冷冻。
将冷冻瓶在-80℃下在阶梯式冷却器中储存过夜，并且在第二天转移到液氮中。
MEF细胞的有丝分裂灭活
将一小瓶冷冻的MEF(传代数<5)在37℃水浴中快速解冻，并滴加到50mL falcon管中的49mL预热的完全MEF培养基(DMEM+15％FBS+1x Pen Strep)中。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。将一百万个MEF接种在T-150cm2烧瓶中的40mL MEF培养基(DMEM+15％FBS+1％Pen/Strep)中，并在37℃下在含有7.5％CO2的潮湿培养箱中温育。为了使MEF在7.5％CO2下生长，DMEM培养基应含有3.7g/L碳酸氢钠。在培养的第2天，用新鲜的MEF培养基替换培养基。培养3-3.5天后，MEF细胞达到亚汇合期(约70％汇合)。
在双蒸H2O(dd H2O)中以1mg/mL的浓度制备丝裂霉素-C主储备液。添加丝裂霉素-C至10μg(10μl)/毫升MEF培养基(DMEM+15％FBS+1x Pen/Strep)的最终工作浓度。对于含有对数期第3次传代MEF的T-150cm2烧瓶，将400μL丝裂霉素-C(1mg/mL储备浓度)添加到40mLMEF培养基(DMEM+15％FBS+1x Pen/Strep)中。将混合物在烧瓶中在37℃下在含有7.5％CO2的潮湿培养箱中温育2小时。温育期后，吸出含有丝裂霉素-C的培养基。用40mL普通DMEM培养基反复洗涤细胞十(10)次。需要剧烈洗涤以去除任何残留的丝裂霉素-C，因为残留丝裂霉素-c的存在将阻止任何共培养细胞的增殖。作为最后一次洗涤，用40mL DPBS洗涤细胞一次。
将10mL 1x胰蛋白酶-EDTA添加到含有MEF细胞的洗涤过的T-150cm2烧瓶中。在37℃下在含有7.5％CO2的潮湿培养箱中培养3-5分钟。温育期后，通过添加20mL完全MEF培养基(DMEM+15％FBS+Pen/Strep)中和胰蛋白酶。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟。洗涤后，将丝裂霉素-C处理的MEF直接使用或冷冻用于下游应用。
7.2.3.仙台病毒(SeV)载体介导的γδT细胞重编程
第0天：仙台病毒感染
使用台盼蓝对细胞进行计数。将五十万个细胞-细胞团块富集的PBMC或γδT细胞移液到低粘附24孔板的孔中。低粘附板对于防止任何细胞(包括PBMC)在SeV感染期间或之后彼此附着是至关重要的。
仅从在用Zol+IL-2+IL-15培养的PBMC培养物的第8天和第13天收获的PBMC富集纯γδT细胞群，而没有任何αβT细胞或其他细胞的污染。
将CytotuneTM2.0管(目录号A16517，Thermo Fischer Scientific)从-80℃取出并在37℃水浴中一个接一个地快速解冻5至10秒。一旦解冻，就将这些管置于冰上。
将计算体积的含有仙台病毒颗粒的KOS、hc-Myc和hKlf4添加到0.3mL完全RPMI培养基(RPMI+10％FBS)中的细胞中，感染复数(MOI，基于对每批CyotuneTM2.0试剂盒特异性的滴度计算)分别为5、5和3。用100IU IL-2和10ng/mL IL-15补充完全培养基。将聚凝胺(目录号TR-1003-G，Millipore)以4μg/mL的浓度添加到含有病毒的细胞悬浮液中。
第1天：替换培养基和培养细胞
从培养板中取出细胞和培养基并转移到15mL falcon管中。用1mL完全RPMI培养基(RPMI+10％FBS+1x Pen/Strep)轻轻冲洗板中的孔以确保收获大部分细胞。用100IU IL-2和10ng/mL IL-15补充完全培养基。
通过在室温下以200×g旋转细胞10分钟，从细胞悬浮液中去除CytotuneTM2.0仙台病毒。吸出培养基，并将细胞沉淀重悬于低粘附24孔板中的0.5mL完全RPMI培养基中。
将细胞在37℃下在5％CO2的潮湿培养箱中在完全RPMI培养基(RPMI+10％FBS+1％Pen/Strep)中培养2天。
第3天：转移转导的细胞-饲养层(MEF)条件
使用丝裂霉素-C(目录号M4287，Millipore)使饲养层有丝分裂停滞。用丝裂霉素-C处理MEF的详细方案描述于第7.2.2节。将有丝分裂停滞的MEF铺板在6孔板的明胶包被的孔上。建议在将转导的细胞接种到有丝分裂停滞的MEF上前一天或两天对其进行铺板。通过在37℃、5％CO2下在7天的时间段内测量有丝分裂停滞的MEF的培养基消耗来检查丝裂霉素-C停滞的MEF的细胞周期。应经常检查丝裂霉素-C是否真的阻滞MEF的细胞周期
对SeV转导的细胞-细胞团块富集的PBMC或γδT细胞进行计数并以不同的细胞密度(在6孔板中10,000至100,000个细胞/孔)接种到6孔板中的2mL完全RPMI培养基中的MEF单层上。用100IU IL-2和10ng/mL IL-15补充完全培养基。
第3天：转移转导的细胞-无饲养条件(在iMatrix-511包被的板上)
在SeV转导的细胞-细胞团块富集的PBMC或γδT细胞接种当天，用层粘蛋白511-E8片段包被6孔板(用iMatrix-511包被板的详细方案描述于第7.2.1节)。
将SeV转导的PBMC或γδT细胞以各种细胞密度(在6孔板中10,000至100,000个细胞/孔)接种到2mL完全RPMI培养基中的层粘蛋白511-E8片段包被的孔上。
第5、7、9和11天：培养基更换
取出一半用过的完全RPMI培养基(1mL)而不干扰细胞，并用1mL含有100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(目录号AMS-480-100，Amsbio)的新鲜StemFit Basic2.0(目录号SFB500，AJINOMOTO)补充孔。bFGF的最终工作浓度是50ng/mL。
在第7、9和11天用新鲜培养基补充培养基的同时，以2x浓度即100ng/mL添加bFGF。
第13、15、17、19和21天：培养基的完全补充
去除1.5mL旧培养基，并用2mL含有50ng/mL StemFit Basic 2.0培养基补充孔。每天观察集落，并用标记笔标记发育中的集落并跟踪。
7.2.4.集落拾取和繁殖
一旦集落突出，即约第23天左右，就准备人工集落拾取。从培养箱中取出含有iPSC集落的6孔板，并在显微镜下观察细胞。
用标记笔标记未分化的集落。拍摄这些集落的一张或两张照片用于参考目的。一旦完成集落的鉴定，就将板放到层流罩中。
使用真空泵从孔中抽吸用过的培养基。对于基于饲养的培养，将800μL用无菌DPBS以1∶1稀释度预稀释的TrypLE(目录号12563-029，Gibco)解离试剂添加到6孔板的孔中。将板在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中温育4分钟。
对于无饲养培养，将800μL用无菌DPBS以1∶1稀释度预稀释的TrypLE解离试剂添加到6孔板中的孔中。将板在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中温育1分钟。
在温育期结束时，将板从培养箱中取出并轻轻倾斜。用1mL移液管抽吸出孔中存在的全部TrypLE试剂。将2mL含有10μM ROCK抑制剂(目录号SCM075，Merck Millipore)和bFGF的StemFit Basic2.0培养基添加到孔中。
对于无饲养培养，将2mL含有10μM ROCK抑制剂(无任何bFGF)的mTeSR培养基(目录号85850，STEMCELL Technologies)添加到孔中。
将含有StemFit Basic2.0(基于饲养的培养)或mTeSR(无饲养)培养基的板放入倒置显微镜(OLYMPUS，型号CKX53SF，S.no 8M44621)中进行集落挑选。同时，倒置显微镜在层流罩内移动。重要的是确保显微镜在移动到层流罩中之前是清洁和卫生的。调节显微镜在预标记集落上的焦点，使用安装在200μL移液器上的具有细长口的凝胶上样吸头来回刮擦该集落。通过刮擦将集落分成小的正方形块。
可用少量刮擦收集集落以防止来自相邻集落的污染，或者可用200μL吸头收集全集落并转移到96孔板的孔中，该孔含有200μL的含ROCK抑制剂和bFGF的StemFit Basic2.0培养基用于基于饲养的培养或者含ROCK抑制剂而无bFGF的mTeSR培养基用于无饲养培养。
使用200μL移液器收集刮下的块，并立即转移到含有10μM ROCK抑制剂和100ng/mLbFGF的StemFit Basic2.0培养基中的经照射的MEF单层接种板上(基于饲养的培养)，或转移到含有10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基中的层粘蛋白-511/玻连蛋白包被的板上(无饲养培养)，仅在第0天持续24小时并且其后无ROCK抑制剂。
经照射的MEF作为冷冻小瓶(目录号SCRC-1040.1，ATCC)从ATCC获得并如ATCC所述解冻。对解冻的细胞进行计数并以0.5百万个细胞/孔的密度接种在明胶包被的板上的6孔板中的MEF培养基中(该密度可根据不同条件而变化)，一天后将iPSC集落转移到它们上。与丝裂霉素-C处理的MEF单层不同，经照射的MEF单层仅持续5-7天。
挑取集落的整个程序需要快速进行。集落长时间暴露于外部环境可能导致集落中细胞的不适当附着和/或分化。
将板按8字形图案并在37℃下转移到含有5％CO2的潮湿培养箱中。在接下来的48小时中无任何干扰地培养集落。在细胞培养的48小时期间，每24小时使用2mL新鲜培养基替换6孔板的一个孔中用过的培养基，直到下一次传代。
传代间隔取决于iPSC集落的生长，供体与供体之间的差异可能是不同的。通常，每次传代花费3至5天。观察到大量的分化的细胞，直到前四次传代结束。从第5次传代开始及以后，观察到未分化的集落。
对于新的传代循环可重复上述过程。每天观察板。
7.2.5.iPSC集落冷冻和解冻
iPSC集落冷冻
将板从培养箱中取出并在倒置显微镜下观察细胞。用标记笔标记未分化的集落(具有平滑且紧密边缘的集落，并且紧密边界内的致密细胞没有异养中心)。拍摄这些集落的一张或两张照片用于参考目的。一旦完成集落的鉴定，就将板放到层流罩中。
使用真空泵从孔中抽吸用过的培养基。对于基于饲养的培养，将800μL用无菌DPBS以1∶1稀释度预稀释的TrypLE解离试剂添加到6孔板中的孔中。将板在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中温育2-4分钟(对于基于饲养的培养)或1分钟(对于无饲养培养)。
在温育期结束时，将板从培养箱中取出并轻轻倾斜。用真空泵抽吸出孔中存在的全部TrypLE试剂。用普通培养基洗涤孔。向孔中添加2mL的StemFit Basic2.0培养基(对于基于饲养的培养)或mTeSR培养基(对于无饲养培养)。
将板置于显微镜下挑取集落。使用安装在200μL移液器上的具有细长口的凝胶上样吸头选择性地移出所有分化的集落。用2mL的StemFit Basic2.0培养基(对于基于饲养的培养)或mTeSR培养基(对于无饲养培养)洗涤板，然后用真空泵抽吸出培养基。再重复一次洗涤步骤。在这两次洗涤后，从板上去除大部分移出的分化集落。
对于基于饲养的培养，将未分化的集落挑取到Eppendorf管中，如7.2.4节所述。对于无饲养培养，使用刮刀从孔中刮下剩余的未分化集落并收集在1.5mL Eppendorf管中。
将细胞在室温下以100×g离心30秒。使用1mL移液器弃去上清液。将细胞沉淀轻轻地重悬于1mL冷冻培养基(ES-FBS+10％DMSO)中，或另选地，含10％DMSO的Knock out血清替代物(KnockOutTMSR，目录号10828028，Thermo Fisher Scientific)作为冷冻培养基。
将小瓶储存在阶梯式冷却器中并置于-80℃过夜，并在第二天转移到液氮中储存。
iPSC集落解冻
将一小瓶冷冻的iPSC(来自基于饲养或无饲养的培养)在37℃水浴中快速解冻。将小瓶的内容物逐滴添加到含有25mL StemFit Basic 2.0培养基(对于基于饲养的培养)或含有10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基(对于无饲养培养)的50mL锥形管中。重要的是确保逐滴添加细胞，因为细胞突然添加到培养基中将引起渗透压休克。
将细胞在室温下以1200rpm离心5分钟。弃去上清液，并将细胞轻轻地重悬于2mL含有10μM ROCK抑制剂和100ng/mL bFGF的StemFit Basic 2.0培养基(对于基于饲养的培养)或含有10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基(无饲养培养)中。培养基中的ROCK抑制剂将有助于防止iPSC在解冻时自发分化并提高其存活率。
将重悬的iPSC块接种到6孔板中，将该板用经照射的MEF预接种(如第7.2.4节所述)或用玻连蛋白预包被(如第7.2.1节所述)，分别用于基于饲养和无饲养的培养。
将板在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中温育24小时。培养24小时后，用不合ROCK抑制剂但含bFGF的新鲜培养基替换含有ROCK抑制剂的培养基，尽管即使在整个培养过程中继续使用ROCK抑制剂也没有观察到显著差异。
对于6孔板的一个孔，每24小时用2mL新鲜培养基替换用过的培养基直至下一次传代。
传代间隔取决于iPSC集落的恢复和生长。集落的生长随供体而变化。然而，集落的恢复取决于iPSC集落冷冻和解冻的好坏程度。通常，每次传代平均花费3-5天。
受损的集落可能需要更长的时间(7-10天)来恢复。每24小时需要用新鲜培养基替换培养基，直到iPSC完全恢复。
恢复的集落最初产生大量分化的细胞(直到第4次传代或第5次传代)。从第5次传代开始及以后，可观察到明显的未分化集落。
7.3.实施例3：γδT细胞衍生的iPSC中TRG和TRD基因重排的表征
检查衍生自3天Zol活化的PBMC的iPSC集落在TRG和TRD基因座处的重排。第一步，如第7.3.1节所述，分离来自所有五个iPSC集落和22Rv1细胞系的基因组DNA。根据如第7.3.2节所述的程序，用来自IdentiCloneTMT细胞受体γ基因重排测定试剂盒(目录号1-207-0101，Invivoscribe)的引物(针对TRG基因座)进行基因组PCR以评估TRG基因座处的基因重排。
如第7.3.2节中详述的，在从基因组PCR获得的扩增子进行毛细管电泳后，在所有克隆中观察到约191bp和192bp的期望大小的扩增子，这证实了TRG基因座处的特异性Vγ9基因重排(图3)。然而，图3还示出了克隆A、B和C中约180和182bp大小的附加扩增子，表明在这些克隆中具有其他Vγ基因重排的可能性。
鉴于T细胞受体γ基因重排测定没有产生确证结果和与ABI检测系统相关的伪影的可能性(如第7.3.2节中详述)，使用公开的对TRG基因座的可变区(Vγ9)和连接区(JP1/JP2，JP)以及TRD基因座的可变区(Vγ2)和连接区(Jδ1和Jδ3)特异性的引物进行基因组PCR。用于TRG和TRD基因重排的基因组PCR分析的公开的引物序列提供于下表2中。
表2.TCR基因序列
Figure BDA0004113264850000751
在进行的基因组PCT分析中，来自克隆A、B和C的iPSC集落均显示TRG和TRD基因的重排。基因重排被鉴定为代表Vγ9-JP和Vδ2-Jδ1或Jδ3重组的单条带，表明这些集落携带重排的Vγ9Vδ2-TCR基因。对于所有三个克隆，TRG基因的重排被检测为代表Vγ9-JP的单一条带。对于克隆A，TCRδ基因重排被检测为Vδ2-Jδ1。对于克隆B和C，检测到Vδ2-Jδ3重组，这表明这些克隆携带Vγ9和Vδ2基因重排(图4)。在所有三个克隆中观察到GAPDH扩增作为管家对照基因。
从22Rvl细胞系分离的基因组DNA没有观察到扩增，这再次证实了本研究中使用的基因组引物的特异性性质(图4)。此外，图4还显示当用针对TCRα和TCRβ的引物扩增时，没有观察到克隆A、B和C的基因组DNA的扩增，证实这些集落不是来自αβT细胞。此外，扩增子的测序和针对全人基因组的序列的BLAST证实了在所有克隆中在TRG和TRD基因座处成功的Vγ9和Vδ2基因排列(克隆B为图5，克隆A、C、D和E为图6A-图6D)。扩增子仅对克隆A、B和C在1％琼脂糖凝胶上电泳，而所有五个克隆用特异性引物进行基因组PCR并测序(图5和图6A-图6D)。
7.3.1.基因组DNA分离
使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒(目录号G1N70-1Kt，Sigma)分离来自iPSC集落和22Rv1细胞的基因组DNA，如以下方案中详细描述的。
如7.2.4节所述挑取未分化的iPSC集落。将细胞在室温下以200×g沉淀30秒。使用1mL移液器小心地移出培养基，直到管中没有剩余培养基。将细胞在液氮中快速冷冻并储存在-80℃以备将来使用。
将细胞沉淀在冰上缓慢解冻10-20分钟，并完全重悬于200μL重悬溶液中。添加20μL RNA酶A溶液并将混合物在室温下温育2分钟。向样品中添加20μL蛋白酶K溶液，接着添加200μL裂解液C(B8803)。将混合物充分涡旋约15秒并在70℃下温育10分钟。均匀的混合物对于有效裂解是必需的。
将500μL柱制备溶液添加到每个预组装的GenEluteTMMiniprep结合柱中，该溶液使DNA与膜的结合最大化，从而导致更一致的产率。将该柱在台式Eppendorf离心机上以12,000×g离心1分钟。弃去流通液体。
将200μL乙醇(95％-100％)添加到裂解物混合物中；通过将混合物颠倒5-10秒彻底混合。均匀溶液是必需的。
使用宽孔移液管吸头将管的全部内容物转移到处理过的结合柱中以减少转移期间DNA的剪切。将该柱以≥6500×g离心1分钟。弃去含有流通液体的收集管。将结合柱置于新的2mL收集管中。
在第一次使用之前，根据制造商的说明书用乙醇稀释洗涤溶液浓缩物。将500μL洗涤溶液添加到结合柱中，以≥6,500×g离心1分钟。弃去含有流通液体的收集管。将结合柱置于新的2mL收集管中。
将另外500μL洗涤溶液添加到结合柱中，将其以最大速度(12,000-16,000×g)离心3分钟以干燥结合柱。在洗脱DNA之前，结合柱必须不含乙醇。如果观察到残余乙醇，则以最大速度将柱再离心一分钟。弃去含有流通液体的收集管。将结合柱置于新的2mL收集管中。
将200μL洗脱液直接移液到结合柱的中心，将其以≥6,500×g离心1分钟以洗脱DNA。为了提高洗脱效率，在添加洗脱液后将结合柱在室温下温育5分钟，然后离心。
7.3.2.T细胞受体γ基因重排测定2.0
IdentiCloneTMT细胞受体γ基因重排测定2.0PCR测定采用靶向T细胞受体γ链基因内保守遗传区域的多个共有DNA引物。从给定克隆中分离基因组DNA，接着使用IdentiCloneTMT细胞受体γ基因重排测定2.0试剂盒扩增该区域。该试剂盒由含有靶向Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10和Vγ11以及Jγ1/Jγ2、JγP和JγP1/JγP2区域的引物(与6-FAM荧光染料缀合)的单一主混合物组成。然后通过毛细管电泳进行分级分离，并通过GeneMapper软件(Eurofins)进行分析。PCR扩增子具有159-207个碱基对的预期大小范围。
使用从iPSC集落分离的基因组DNA，在以下PCR条件下进行PCR。首先，施加95℃的温度3分钟。接下来，应用以下循环二十五(25)次：95℃持续30秒，65℃持续30秒，72℃持续45秒。最后，将温度在72℃保持5分钟，然后将混合物保持在25℃直至取出。PCR混合物(30μL)由以下成分组成：15μL2x Pwo Master(目录号03789403001，Roche)、100ng DNA模板，0.5μL的两种引物中的每一种(100μM)和水以补足至30μL。
最初，只有来自克隆B的基因组DNA用于PCR，作为确保系统工作的测试。将PCR样品提交给称为Eurofins(Bengaluru，India)的公司用于根据试剂盒制造商的方案进行分析和处理。样品的详细信息汇总于下表3中。
表3.对测试样品B的T细胞受体γ基因重排PCR
Figure BDA0004113264850000771
Figure BDA0004113264850000781
经结果分析，基于特定大小的DNA片段的峰的存在，确定测试样品B(克隆B)对Vγ9Vδ2基因的重排呈阳性。
其余的基因组DNA样品用于进行PCR，正如对克隆B所做的，并再次提交给Eurofins进行分析。样品的详细信息汇总于下表4中。
表4.对测试样品A、C、D、E的T细胞受体γ基因重排PCR
样品编号 样品含量
样品1 测试样品A+TRG 6-FAM主混合物
样品2 测试样品C+TRG 6-FAM主混合物
样品3 测试样品D+TRG 6-FAM主混合物
样品4 测试样品E+TRG 6-FAM主混合物
样品5 测试样品A+样本对照DNA梯度主混合物
样品6 测试样品C+样本对照DNA梯度主混合物
样品7 测试样品D+样本对照DNA梯度主混合物
样品8 测试样品E+样本对照DNA梯度主混合物
样品9 试剂盒阳性对照+TRG 6-FAM主混合物
样品10 试剂盒阳性对照+样本对照DNA梯度主混合物
样品11 试剂盒阴性对照+TRG 6-FAM主混合物
样品12 水+TRG 6-FAM主混合物
样品13 水+样本对照DNA梯度主混合物
经分析，一些测试样品(克隆)显示对Vγ9Vδ2重排呈阳性，这仅作为初步结果。进行测序以确认这些克隆。对于测序，使用两对引物分别进行PCR以扩增γ和δ区域。引物的序列汇总于下表5中。
表5.用于测序的PCR引物
Figure BDA0004113264850000791
在Eurofin(Bengaluru，India)处根据试剂盒制造商的说明书进行样品处理和分析。用6-FAM标记PCR产物。在连接之前根据方案添加尺寸标准物(ROX或LIZ)和高纯甲酰胺。
对于ABI荧光检测，经常观察到在前峰，并且由于ABI平台使用的检测方法而为伪影。在前峰有时是偏斜的，并且具有在右侧朝向真实峰倾斜的底部。这在样本对照尺寸梯度主混合物中尤其明显，其中96bp峰在84bp处具有在前峰。
在新的微量离心管中，通过将混合物充分涡旋，将适当量(对于ROX尺寸标准物为10μL，并且对于LIZ尺寸标准物为9.5μL)的PCR反应产物与高纯甲酰胺和ROX或LIZ尺寸标准物混合。
在新的96孔PCR板中，将10μl高纯甲酰胺与ROX或LIZ大小标准品添加到用于每个PCR的各个孔中。
将1μL每种PCR反应产物转移到含有高纯甲酰胺和ROX或LIZ大小标准品的孔中。每孔仅添加一个样品并通过上下吸移混合。然后盖上或覆盖PCR板。
将样品在95℃下热变性2分钟，然后在冰上急速冷却5分钟。
为样品制备样品单和注射列表。根据其用户手册，在ABI 3100/3130毛细管电泳仪上运行样品。数据自动显示为尺寸和颜色特异性峰。
7.3.3.基因组PCR
进行基因组PCR以评估TRG和TRD基因座处的重排。从iPSC克隆分离的基因组DNA(如上所述)用作模板。
在1％琼脂糖凝胶电泳上鉴定扩增子。在第二系列实验中，从琼脂糖凝胶上的主要条带中提取DNA，并克隆到Topo载体中，并在3730xl DNA分析仪(目录号3730XL，ThermoFisher Scientific)上测序。使用BLAST程序(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi)针对人全基因组分析扩增子序列的序列同源性。
7.4.实施例4：γδT细胞衍生的iPSC中SeV转基因存在的评估
在确认所有五个克隆中TRG和TRD基因座处的重排后，通过如下所述的RT-PCR检查所有克隆中仙台病毒转基因(SeV Tg)的存在。在第10次传代左右，几乎所有的集落都是SeV载体阴性的。该观察结果与高传代集落将不合SeV转基因的事实一致。RT-PCR引物序列汇总于下表6中。
表6.所用RT-PCR引物序列列表
Figure BDA0004113264850000801
7.4.1.RT-PCR
为了评估多能基因(Oct3/4、Nanog、Sox2、Lin28)的表达，并验证所有五个iPSC克隆中仙台病毒转基因(SeV Tg)的存在或不存在，使用上表6中所列的引物进行RT-PCR。根据制造商的说明书，使用RNeasy Plus微型试剂盒(目录号74134，Qiagen)从iPSC集落和全PBMC中分离总RNA。在nanodrop上定量分离的RNA。使用Primescript第1链cDNA合成试剂盒(目录号6110B，Takara)根据制造商的说明书进行eDNA合成。
将所得eDNA用作模板，使用上表6中所列的引物进行RT-PCR。在RT-PCR结束时，扩增子在1％琼脂糖凝胶电泳上电泳以显现在一端具有DNA梯度的条带。从全PBMC制备的eDNA用作模板阴性对照，而针对TCRα和TCRβ的引物用作阴性引物对照。
7.5.实施例5：γδT细胞衍生的iPSC中多能标志物的评估
γδT细胞衍生的iPSC集落的多能标志物通过如上文第7.4.1节(图7A)中所述的RTPCR、通过如第7.5.1节(图7B)中所述的免疫组织化学以及通过如第7.5.2节(图7C)中所述的流式细胞术进行评价。RT-PCR结果显示这些集落表达编码多能转录因子Oct3/4、Nanog、Sox2和Lin28的mRA。使用全PBMC作为阴性对照，以显示引物对多能标志物具有特异性(RT-PCR引物列表和序列在表6中给出)。
进一步支持这些结果，免疫组织化学数据证实了在所有五个iPSC集落中存在主转录因子(Nanog、Oct3/4，Sox2)(参见图7B)。根据图7B，Nanog和Oct3/4的表达在所有克隆中是一致的。然而，Sox2在所有五个克隆中表达不同(从20％-40％变化)。此外，如图7C所示，来自iPSC克隆的单一悬浮液的流式细胞术数据显示它们表达高水平的表面SSEA-4和TRA1-60以及核内Oct-3，再次证实了IHC观察结果。有趣的是，与IHC数据一致，流式细胞仪分析也显示Sox2在所有五个克隆中的不同表达水平(图7C)。
7.5.1.免疫组织化学(IHC)
将iPSC接种到盖玻片上
将盖玻片切成期望大小并置于24孔板的孔中。然后通过将盖玻片浸入1mL含有玻连蛋白的PBS中，用玻连蛋白包被盖玻片。将iPSC从饲养条件改为无饲养条件。因此，玻连蛋白用于包被盖玻片。
将24孔板在37℃下温育2小时。温育期后，吸出含有玻连蛋白的PBS，用DPBS洗涤孔一次。在含有10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基中，将iPSC块立即铺在玻连蛋白包被的盖玻片上。
将24孔板在37℃的含有5％CO2的潮湿培养箱中温育。培养24小时后，用不合ROCK抑制剂的新鲜mTeSR培养基替换含有ROCK抑制剂的培养基。在此阶段，集落开始附着在盖玻片上。即使在整个培养过程中继续使用ROCK抑制剂，也没有观察到显著差异。
用新鲜培养基补充培养基再继续培养2天或直至集落生长至期望大小。
核内染色
在IHC染色当天，从含有接种有iPSC集落的盖玻片的24孔板中抽吸出培养基，将其用0.5mL DPBS洗涤两次。
通过将接种有iPSC的盖玻片在200μL 4.2％PFA中在室温下精确温育2分钟来固定它们。温育期后，从含有iPSC集落接种的盖玻片的孔中吸出PFA。用400μL 1x BD Perm洗涤缓冲液(目录号51-2091KZ，BD Biosciences)洗涤含有固定细胞的盖玻片两次。
通过将含有固定细胞的盖玻片在400μL封闭缓冲液(10％驴血清和0.35％TritonX-100)中在室温下温育1小时进行封闭。温育期后，用400μL 1x BD Perm洗涤缓冲液洗涤细胞一次。
然后通过将细胞在400μL 1x固定/透化溶液中在4℃下在冰箱中温育一小时来使细胞透化。固定/透化溶液来自eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组。一份固定/透化浓缩物用3份固定/透化稀释剂稀释。由于Nanog、Oct3/4和Sox2是转录因子，因此使用前述试剂用核内透化检测它们。使用1x BD Per洗涤液代替来自eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组的透化缓冲液，因为前者中存在温和去污剂。
用400μL 1x BD Per洗涤缓冲液洗涤细胞两次。将透化的细胞在400μL洗涤缓冲液中染色，该缓冲液含有针对人Nanog(目录号AF1997，R&D Systems)、Oct3/4(目录号130-117-821，Miltenyi Biotec，用于荧光染料缀合的抗体，和目录号AF1759，用于未缀合的抗体)和Sox2(目录号130-121-129，Miltenyi Biotec)的未缀合或荧光染料缀合的一抗。
将细胞在室温下在黑暗中温育一小时。温育期后，吸出含有抗体的洗涤缓冲液，并用400μL洗涤缓冲液洗涤孔两次。如果用未缀合的一抗探测细胞，则使用荧光染料标记的二抗检测信号。山羊抗人Oct3/4、Nanog抗体是未缀合的，而抗Sox2是异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的。
然后将细胞在400μL含有二抗的洗涤缓冲液中在室温下在黑暗中染色一小时。
在IHC研究中，使用抗山羊IgG NorthenLightsTM荧光557缀合抗体(目录号NL001，R&D Systems)作为二抗。它们耐光漂白，因此对于多重IHC研究是理想的。
温育期后，将含有被探测细胞的盖玻片在400μL 1x BD Perm洗涤缓冲液中洗涤两次。使用细镊子从24孔板回收含有固定且染色的细胞的盖玻片。
通过将盖玻片的一个角压靠在纸巾上，从盖玻片上排出任何残留的洗涤缓冲液。需要确保盖玻片上没有洗涤缓冲液液滴。
将一滴含有DAPI的VECATSHIELD抗荧光淬灭封片液(目录号H-1200，VectorLaboratories))添加到含有固定和染色细胞的盖玻片上。用镊子将盖玻片的角夹住，并以单一动作翻转并将其安装在显微镜载玻片上。使安装有盖玻片的载玻片在室温下在黑暗中静置30分钟。使用纸巾去除过量渗出的封片液。用指甲油密封盖玻片的边缘。
将载玻片在荧光显微镜(Carl-Zeiss Vert.A1 AXIO)上成像。成像后，将密封的载玻片储存在-20℃的冰箱中。如果需要再次对它们成像，则将载玻片在室温下在黑暗中解冻一小时。擦去由于冷凝形成的水滴并且可进行成像。
分析
在荧光显微镜上拍摄免疫组织化学(IHC)图像。保存图像中的各个通道并作为TIFF格式文件导出。将TIFF文件导出到包含Image J软件的不同计算机上。使用Image J软件生成重叠图像。简而言之，将TIFF图像转换为8位格式，并在适当的R、G和B通道中选择要重叠的图像。生成RGB颜色的合成图像，并将该图像保存为TIFF/JPEG格式文件。
7.5.2.流式细胞术
对于流式细胞术介导的多能标志物表征，最初将iPSC集落解离成单个细胞。将细胞在V形底96孔板中以1800rpm在室温下离心5分钟。吸出上清液，将细胞沉淀重悬于200μL含有5μL Live/Dead可固定紫色死细胞株(目录号L34955，Thermo Fisher Scientifc)和抗Fc抗体的DPBS中。
将细胞在4℃下温育30分钟。温育期后，将细胞在室温下以1800rpm离心5分钟并用200μL FACS缓冲液洗涤一次。
用于表面染色
将细胞在100μL含有针对SSEA-4(目录号330418，BioLegend)、Tra 1-60(目录号A25617，Thermo Fisher Scientific)的荧光染料缀合抗体的FACS缓冲液(DPBS+2％FBS)中在4℃下表面染色30分钟。温育期后，离心细胞并吸出含mAb的FACS缓冲液(DPBS+2％FBS)。将细胞用200μL FACS缓冲液轻轻洗涤两次。
然后通过在冰箱中在4℃下将细胞重悬100μL BD Cytofix(目录号554655，BDBiosciences)中30分钟来固定细胞。温育期后，将细胞在室温下以1800rpm离心5分钟并重悬于150μL FACS缓冲液中。
流式细胞术数据在固定的同一天或后一天从细胞获得。
用于细胞内染色
通过将细胞与200μL固定/透化溶液在4℃下温育30分钟来使细胞透化。固定/透化溶液来自eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组。一份固定/透化浓缩物用3份固定/透化稀释剂稀释。
温育期后，吸出固定/透化溶液。用200μL 1x BD Perm洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
然后用100μL含有针对Oct3/4和Sox2的荧光染料缀合抗体的洗涤缓冲液在细胞内探测细胞，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。
温育期后，向染色的细胞中添加100μL洗涤缓冲液至总体积为200μL。将细胞在室温下以1800rpm离心5分钟。弃去上清液，并用200μL洗涤缓冲液洗涤细胞一次。然后将细胞重悬于150μL FACS缓冲液(DPBS+2％FBS)中。流式细胞术数据在固定的同一天或后一天从细胞获得。
分析
对于表面表型分布实验，最初基于FSC-H(前向散射-高度)对SSC-H(侧向散射-高度)分选细胞。活细胞被门控而其他细胞被清除。接着，通过在FSC-A(前向散射-面积)对FSC-H(前向散射-高度)参数上门控细胞，从活细胞中去除双联体。对活细胞进行多能标志物门控，如SSEA-4和Tra1-60的表面表达以及Oct3和Sox2的细胞内表达。对于每种标志物，使用荧光减一(FMO)对照来定义特异性门控。
7.6.实施例6：iPSC克隆的基因组稳定性的评估
为了检查这些iPSC集落的基因组稳定性，如下所述，在克隆A、B和C的第19次传代以及克隆D和E的第9次传代对此类iPSC集落进行核型分析。如图8A-图8D所示，通过G-带技术，克隆B、C、D和E的核型分析具有正常的染色体带型，证实集落是正常的，没有任何异常的模式。未获得克隆A的核型分析数据。
进行核型分析以评估iPSC集落的基因组稳定性。如上所述，分别从第19次传代和第9次传代的集落A、B和C以及D和E中挑取未分化的iPSC集落。从集落中分离单细胞，添加到StemFit Basic02培养基中并送至Humain Health(Bengaluru，India)进行核型分析。
7.7.实施例7：γδT细胞衍生的iPSC过继至无饲养培养条件
如上实施例2所述，在任何T细胞重编程实验期间都没有观察到无饲养条件下的iPSC集落。在验证Vγ9和Vδ2基因重排和多能标志物的集落后，通过测试基质和培养基的各种组合，将iPSC集落(对于克隆A、B和C传代次数为14，对于克隆D和E传代次数为4)过继至无饲养条件。令人惊讶地，在过继后，发现所有集落在玻连蛋白与mTeSRTM培养基的组合中在无饲养条件下维持和繁殖(参见图9)。
根据前述内容，应当理解，尽管本文已出于说明的目的描述了具体实施方案，但可在不偏离本文提供的精神和范围的情况下进行各种修改。以上提及的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。
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atgcatgctc gagcggccgc cagtgtgatg gatatctgca gaattcgccc tttgtaatga 60
taagctttgt tccgggacca aataccttga tttttttgcc caactccagc acctcccaca 120
aggcacagta gtaggtagct atgtcctgtt tctctacatt gtgaatggtg agagtggatg 180
tagacgtttc aggtatccta tccacctcaa atttgcctga cggaatgccg gattcctttc 240
tgacagtgcc gtcatatgaa atggacacca ggaactgtat gacttcacca ggtctctctc 300
gataccaata tacagatgtt gcagaaattg ttattccaga caccacacat tccaggcggg 360
ctgtttttga cagcgtttta gtactggaaa tttgaggttg ctctaggtga cctgcaaggg 420
cgaattccag cacactggcg gccgttacta gtggatccga gctcggtacc aagcttgatg 480
catagcttga gta 493
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<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆A Vγ9扩增子序列
<400> 2
tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actccagcac 60
ctcccacaag gcacagtagt aggtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgcctgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actcccgcac 60
ctcccacaag gcacagtagt aggtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgcctgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 4
<211> 399
<212> DNA
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<220>
<223> 克隆A Vδ2扩增子序列
<400> 4
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gaattctccc ttataccgag aaaaggacat ctatggccct ggttacaaag acaatttcca 180
aggtgacatt gatattgccc agaacctggc tgtacttaag atacttgcac catcagagag 240
agatgaaggg tcttactact gtgcctgtga caccgtgggg gaacaaaccg ataaactcat 300
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cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggcccaat 399
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<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 用于比对的克隆A Vδ2扩增子序列
<400> 5
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gttacaaaga caatttccaa ggtgacattg 60
atattgccca gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accgtggggg aacaaaccga taaactcatc tttggaaaag 180
gaacccgttg tgactgtgga acaag 205
<210> 6
<211> 208
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vδ2序列
<400> 6
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa ggtgacattg 60
atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accgtggggg ataccgacac cgataaactc atctttggaa 180
aaggaacccg tgtgactgtg gaaccaag 208
<210> 7
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆B Vγ9扩增子序列
<400> 7
gcaacatctg tatattggta tcgagagaga cctggtgaag tcatacagtt cctggtgtcc 60
atttcatatg acggcactgt cagaaaggaa tccggcattc cgtcaggcaa atttgaggtg 120
gataggatac ctgaaacgtc tacatccact ctcaccattc acaatgtaga gaaacaggac 180
atagctacct actactgtgc cttgtgggag acacaagagt tgggcaaaaa aatcaaggta 240
tttggtcccg gaacaaag 258
<210> 8
<211> 258
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vγ9序列
<400> 8
gcaacatctg tatattggta tcgagagaga cctggtgaag tcatacagtt cctggtgtcc 60
atttcatatg acggcactgt cagaaaggaa tccggcattc cgtcaggcaa atttgaggtg 120
gataggatac ctgaaacgtc tacatccact ctcaccattc acaatgtaga gaaacaggac 180
atagctacct actactgtgc cttgtgggag aaccaagagt tgggcaaaaa aatcaaggta 240
tttggtcccg gaacaaag 258
<210> 9
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆B Vδ2扩增子序列
<400> 9
gcccttatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc aaagacaatt tccaaggtga 60
cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt gcaccatcag agagagatga 120
agggtcttac tactgtgcct gtgacaccgt aaatggggga tacgcggtca ccgataaact 180
catctttgga aaaggaaccc gtgtgactgt ggaacaaggg c 221
<210> 10
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆B Vδ2扩增子序列
<400> 10
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa ggtgacattg 60
atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accgtaaatg ggggatacgc ggtcaccgat aaactcatct 180
ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac aag 213
<210> 11
<211> 217
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vδ2序列
<400> 11
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaagg caatttccaa ggtgacattg 60
atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accgtagtac tgggggatac gctcgacacc gataaactca 180
tctttggaaa aggaacccgt gtgactgtgg aaccaag 217
<210> 12
<211> 820
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆C Vγ9扩增子序列
<400> 12
ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 60
ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga 120
attgggccct ctagatgcat gctcgagcgg ccgccagtgt gatggatatc tgcagaattc 180
aggcctgaat tcgccctttg taatgataag ctttgttccg ggaccaaata ccttgatttt 240
tttgcccaac tcttgtgtct cccacaaggc acagtastas gtagctatgt cctgtttctc 300
tacattgtga atggtgagag tggatgtaga cgtttcaggt atcctatcca cctcaaattt 360
gcctgacgga atgccggatt cctttctgac agtgccgtca tatgaaatgg acaccaggaa 420
ctgtatgact tcaccaggtc tctctcgata ccaatataca gatgttgcag aaattgttat 480
tccagacacc acacattcca ggcgggctgt ttttgacagc gttttagtac tggaaatttg 540
aggttgctct aggtgacctg caagggcgaa ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg 600
atccgagctc ggtaccaagc ttgatgcata gcttgagtat tctatagtgt cacctaaata 660
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 720
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 780
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 820
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆C Vγ9扩增子序列
<400> 13
tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actcttgtgt 60
ctcccacaag gcacagtast asgtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgcctgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 14
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vγ9序列
<400> 14
tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actcttggtt 60
ctcccacaag gcacagtagt aggtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgcctgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 15
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆D Vγ9扩增子序列
<400> 15
atagggcgaa ttgggccctc tagatgcatg ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct 60
gcagaattcg cccttgcagg tcacctagag caacctcaaa tttccagtac taaaacgctg 120
tcaaaaacag cccgcctgga atgtgtggtg tctggaataa caatttctgc aacatctgta 180
tattggtatc gagagagacc tggtgaagtc atacagttcc tggtgtccat ttcatatgac 240
ggcactgtca gaaaggaatc cggcattccg tcaggcaaat ttgaggtgga taggatacct 300
gaaacgtcta catccactct caccattcac aatgtagaga aacaggacat agctacctac 360
tactgtgcct tgtgggagtc acaagagttg ggcaaaaaaa tcaaggtatt tggtcccgga 420
acaaagctta tcattacaaa gggcgaattc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc 480
cgagctcggt accaagcttg atgcatagct tgagtattct atag 524
<210> 16
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆D Vγ9扩增子序列
<400> 16
gcaggtcacc tagagcaacc tcaaatttcc agtactaaaa cgctgtcaaa aacagcccgc 60
ctggaatgtg tggtgtctgg aataacaatt tctgcaacat ctgtatattg gtatcgagag 120
agacctggtg aagtcataca gttcctggtg tccatttcat atgacggcac tgtcagaaag 180
gaatccggca ttccgtcagg caaatttgag gtggatagga tacctgaaac gtctacatcc 240
actctcacca ttcacaatgt agagaaacag gacatagcta cctactactg tgccttgtgg 300
gagtcacaag agttgggcaa aaaaatcaag gtatttggtc ccggaacaaa gcttatcatt 360
aca 363
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vγ9序列
<400> 17
gcaggtcacc tagagcaacc tcaaatttcc agtactaaaa cgctgtcaaa aacagcccgc 60
ctggaatgtg tggtgtctgg aataacaatt tctgcaacat ctgtatattg gtatcgagag 120
agacctggtg aagtcataca gttcctggtg tccatttcat atgacggcac tgtcagaaag 180
gaatccggca ttccgtcagg caaatttgag gtggatagga tacctgaaac gtctacatcc 240
actctcacca ttcacaatgt agagaaacag gacatagcta cctactactg tgccttgtgg 300
gagatccaag agttgggcaa aaaaatcaag gtatttggtc ccggaacaaa gcttatcatt 360
aca 363
<210> 18
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆D Vδ2扩增子序列
<400> 18
ttgggccctc tagatgcatg ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattcg 60
cccttatacc gagaaaagga catctatggc cctggtttca aagacaattt ccaaggtgac 120
attgatattg caaagaacct ggctgtactt aagatacttg caccatcaga gagagatgaa 180
gggtcttact actgtgcctg tgacacctta cttcctgggg gaccgtacac cgataaactc 240
atctttggaa aaggaacccg tgtgactgtg gaacaagggc gaattccagc acactggcgg 300
ccgttactag tggatccgag ctcggtacca agcttgatgc atagcttgag tattctatag 360
<210> 19
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆D Vδ2扩增子序列
<400> 19
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa ggtgacattg 60
atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accttacttc ctgggggacc gtacaccgat aaactcatct 180
ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac aag 213
<210> 20
<211> 217
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vγ2序列
<400> 20
tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa ggtgacattg 60
atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga gatgaagggt 120
cttactactg tgcctgtgac accttgcgta ctgggggacg actgtacacc gataaactca 180
tctttggaaa aggaacccgt gtgactgtgg aaccaag 217
<210> 21
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆E Vγ9扩增子序列
<400> 21
ggcgaattgg gccctctaga tgcatgctcg agcggccgcc agtgtgatgg atatctgcag 60
aattcgccct ttgtaatgat aagctttgtt ccgggaccaa ataccttgat ttttttgccc 120
aactcttgta gctcccacaa ggcacagtag taggtagcta tgtcctgttt ctctacattg 180
tgaatggtga gagtggatgt agacgtttca ggtatcctat ccacctcaaa tttgccwgac 240
ggaatgccgg attcctttct gacagtgccg tcatatgaaa tggacaccag gaactgtatg 300
acttcaccag gtctctctcg ataccaatat acagatgttg cagaaattgt tattccagac 360
accacacatt ccaggcgggc tgtttttgac agcgttttag tactggaaat ttgaggttgc 420
tctaggtgac ctgcaagggc gaattcaggc ctgaattcca gcacactggc ggccgttact 480
agtggatccg agctcggtac caagcttgat gcatagcttg agtattctat agtgtcacct 540
aaatagcttg gcgtaaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 600
caaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 660
<210> 22
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆E Vγ9扩增子序列
<400> 22
tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actcttgtag 60
ctcccacaag gcacagtagt aggtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgccwgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 23
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 用于比对的人Vγ9序列
<400> 23
tgtaatgata agctttgttc cgggaccaaa taccttgatt tttttgccca actcttggat 60
ctcccacaag gcacagtagt aggtagctat gtcctgtttc tctacattgt gaatggtgag 120
agtggatgta gacgtttcag gtatcctatc cacctcaaat ttgcctgacg gaatgccgga 180
ttcctttctg acagtgccgt catatgaaat ggacaccagg aactgtatga cttcaccagg 240
tctctctcga taccaatata cagatgttgc agaaattgtt attccagaca ccacacattc 300
caggcgggct gtttttgaca gcgttttagt actggaaatt tgaggttgct ctaggtgacc 360
tgc 363
<210> 24
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆E Vδ2扩增子序列
<400> 24
tgggccctct agatgcatgc tcgagcggcc gccagtgtga tggatatctg cagaattcag 60
gcctgaattc gcccttgttc cacagtcaca cgggttcctt ttccaaagat gagtttatcg 120
gtgtacttct acccccagta gagtagcagg cacagtatta agacccttca tctctctctg 180
atggtgcaag tatcttaagt acagccaggt tctttgcaat atcaatgtca ccttggaaat 240
tgtctttgaa accagggcca tagatgtcct tttctcgg 278
<210> 25
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于比对的克隆E Vδ2扩增子序列
<400> 25
cttgttccac agtcacacgg gttccttttc caaagatgag tttatcggtg tacttctacc 60
cccagtagag tagcaggcac agtattaaga cccttcatct ctctctgatg gtgcaagtat 120
cttaagtaca gccaggttct ttgcaatatc aatgtcacct tggaaattgt ctttgaaacc 180
agggccatag atgtcctttt ctcgg 205
<210> 26
<211> 207
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人Vδ2扩增子序列
<400> 26
cttggttcca cagtcacacg ggttcctttt ccaaagatga gtttatcggt gttcccttta 60
tcccccagta tgtcacaggc acagtagtaa gacccttcat ctctctctga tggtgcaagt 120
atcttaagta cagccaggtt ctttgcaata tcaatgtcac cttggaaatt gtctttgaaa 180
ccagggccat agatgtcctt ttctcgg 207
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vγ9正义引物
<400> 27
cggcactgtc agaaaggaat c 21
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vδ2正义引物
<400> 28
ataccgagaa aaggacatct atg 23
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JP1/JP2反义引物
<400> 29
gaagttacta tgagcttagt ccctt 25
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JP反义引物
<400> 30
aagctttgtt ccgggaccaa atac 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J1/J2反义引物
<400> 31
tacctgtgac aacaagtgtt gttc 24
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> J δ1反义引物
<400> 32
gttccacagt cacacgggtt c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jδ3反义引物
<400> 33
ctcacggggc tccacgaaga g 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRGV9for
<400> 34
gcaggtcacc tagagcaacc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRGJPrev
<400> 35
tgtaatgata agctttgttc 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRV δ 2_Fwd P10
<400> 36
ataccgagaa aaggacatct atg 23
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRJ δ 1_Rev P10
<400> 37
gttccacagt cacacgggtt c 21
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OCT3/4正向 (F)
<400> 38
gacaggggga ggggaggagc tagg 24
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OCT3/4反向 (R)
<400> 39
cttccctcca accagttgcc ccaaac 26
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NANOG正向 (F)
<400> 40
cagccccgat tcttccacca gtccc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NANOG反向 (R)
<400> 41
cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX2正向 (F)
<400> 42
gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX2反向 (R)
<400> 43
ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN28正向 (F)
<400> 44
tgcaccagag taagctgcac 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN28反向 (R)
<400> 45
ctccttttga tctgcgcttc 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-V γ9正向 (V γ9)
<400> 46
cggcactgtc agaaaggaat c 21
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-V γ9反向 (C Gamma)
<400> 47
ggcaccgtta accagctaaa 20
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-V δ2正向 (V δ2)
<400> 48
ataccgagaa aaggacatct atg 23
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-V δ2反向 (C Delta)
<400> 49
gacaaaaacg gatggtttgg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向 (F)
<400> 50
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向 (R)
<400> 51
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeV-Tg正向 (F)
<400> 52
ggatcactag gtgatatcga gc 22
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeV-Tg反向 (R)
<400> 53
accagacaag agtttaagag atatgtatc 29

Claims (44)

1.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)使细胞的分离群体与活化培养物接触；其中所述活化培养物包含IL-15和唑来膦酸；
(b)在所述活化培养物中培养所述细胞的分离群体，以富集和/或活化所述细胞的分离群体中的γδT细胞；
(c)用编码一种或多种重编程因子的病毒载体转导所述γδT细胞；以及
(d)在适于将哺乳动物体细胞重编程为多能状态的条件下培养所转导的γδT细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活化培养物还包含IL-2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒载体是仙台病毒(SeV)载体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从受试者获得所述细胞的分离群体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是外周血单核细胞(PBMC)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是终末分化的细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体是哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞的分离群体是人细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天或至多1天。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养至多3天。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞的分离群体在所述活化培养物中培养3天。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％或少于30％的γδT细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在所述活化培养物中培养后，所述细胞的分离群体包含少于35％的γδT细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)之后富集所述细胞的分离群体中的所述γδT细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述γδT细胞通过细胞-细胞团块富集来富集。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9+γδT细胞。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞的至少一部分在步骤(b)中被活化为Vγ9δ2+γδT细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和c-Myc组成的组。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，在一个或多个饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(d)中，在单层饲养层的存在下培养所转导的γδT细胞。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述饲养层包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包括分离和/或纯化所产生的iPSC。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括向受试者施用所分离的iPSC。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述iPSC离体分化为期望细胞类型的细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括向受试者施用所述分化的细胞。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC对仙台病毒(SeV)载体呈阴性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC衍生自γδT细胞。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC具有TRG和TRD基因座的重排基因；并且其中任选地所产生的iPSC具有Vγ9和Vδ2基因排列。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不衍生自αβT细胞。
30.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC不从TCRA和TCRB基因座产生聚合酶链式反应(PCR)产物。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC是基因组稳定的，没有染色体丢失。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过核型分析确定所产生的iPSC的基因组稳定性。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所产生的iPSC在过继后能够在无饲养层培养基中生长。
34.一种诱导性多能干细胞(iPSC)，所述诱导性多能干细胞根据权利要求1-33中任一项所述的方法产生。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求34所述的iPSC和药学上可接受的赋形剂。
36.一种分化的细胞，所述分化的细胞根据权利要求24所述的方法产生。
37.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求36所述的分化的细胞和药学上可接受的赋形剂。
38.一种治疗对其有需要的受试者的方法，所述方法包括：
(i)从受试者获得包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞群；
(ii)根据权利要求1-33中任一项所述的方法将所述细胞群中的γδT细胞重编程以产生iPSC；以及
(iii)任选地在将所述iPSC分化成一种或多种期望类型的细胞之后，向所述受试者施用所产生的iPSC或包含所产生的iPSC的药物组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者是人。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述受试者患有造血系统的过度增殖性障碍或癌症。
41.一种诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，其中所述iPSC的分离群体包含多能细胞，其中所述多能细胞表达一种或多种重编程因子，并且/或者其中所述多能细胞包含编码TRG和TRD基因重排的核苷酸序列，并且其中任选地所述iPSC具有Vγ9和Vδ2基因排列。
42.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)执行富集和/或活化细胞的分离群体中的γδT细胞的功能的步骤；以及
(b)执行将所述γδT细胞重编程为多能状态的功能的步骤。
43.一种诱导性多能干细胞(iPSC)，所述诱导性多能干细胞根据权利要求42所述的方法产生。
44.一种诱导性多能干细胞(iPSC)的分离群体，所述iPSC的分离群体包含多能细胞，其中所述多能细胞包含用于表达一种或多种重编程因子的工具，并且/或者其中所述多能细胞包含用于编码TRG和TRD基因重排的工具。
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