CN1161454C - 单角德斯霉新菌株和含它的杂草防治组合物 - Google Patents

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Abstract

在26℃-35℃温度范围内，具有可行的除稗(Echinochloa spp.)的杂草防治活性，并且对主要作物，包括水稻不显示致病性的单角德斯霉新菌株细胞被用作除草剂组分。

Description

单角德斯霉新菌株和含它的杂草防治组合物
                         技术领域
本发明涉及在26℃-35℃温度范围内具有抗稗的除草剂活性的单角德斯霉(Drechslera monoceras)菌株以及包含其作为活性成分的杂草防治组合物。
                         背景技术
由合成农用化学品导致的环境污染已成为一个现代环境社会问题。因此，利用天然微生物的新的除草剂正被试验作为一种新类型的将不污染环境的农用化学品。例如，DeVine(有效成分：疫霉(Phytophthora palmivola)作为抑制藤本植物，萝摩科杂草的杂草防治组合物在美国可购买到，Collego(有效成分：制盘孢菌(Colletotrichum Gloeosporioides)，Biomal(有效成分，刺盘孢菌中的malvae种)和Luboa II(有效成分：刺盘孢菌中的cuscutae种)作为北有节山豆，一种豆科杂草的杂草防治剂分别在美国，加拿大和中国可购买到。
在日本目前没有利用活细胞的除草剂被注册为农用化学品。然而，正在研究霉菌除草剂对稻田和草地中的杂草的作用(亚洲水稻田和水草的综合管理。FFTC丛书系列号45，1994)。尤其是，正在进行用于稗的霉疫除草剂的细致研究，稗是稻种植中一种令人讨厌的杂草，并且在日本专利公开号1991/219883(KoKai3-219883)，日本专利公开号1994/329513(KoKai 6-329513)和有关作为植物病原体的德斯霉属的一个株菌对防治稗属杂草有效的其它文献中均有报道。然而，这些研究还没有达到实际运用阶段。
在世界，尤其是日本的水稻种植区稗被已知为杂草，在那里它们被长期认为是令人讨厌的杂草。根据Yabuno(Zasso Kenkyu(杂草研究)，卷2，1975)，在世界范围内，已知六种野生型稗，即Echinochloaoryzicola，E.colona，E.pyramidalis，E.Stagnina，E.haplcolada和E.crus-galli。后面的种类被进一步分为三个变种，即E.crus-galli var formosensis，E.crus-galli var crus-galli和E.crus-galli var.pratycola。已知为水稻种植中令人讨厌的杂草的稗被认为是由不同种类或亚种的稗之间的植物的天然杂交而产生的那些。防治稗的霉菌除草剂必须具有抗稗属所有种类和亚种植物的除草活性，但必须对主要作物，包括水稻不具有致病性。而且，稗属的杂草在10℃开始萌发，在15℃-35℃的宽的温度范围内迅速生长。因此，防治稗的霉菌除草剂应优选在约低至15℃到约高至35℃的宽的温度内具有选择性的抗稗属杂草的除草活性。
从稗属植物分离的毛霉目真菌的菌株单角德斯霉(Drechslera monoceras)IFO-9619和IFO-9800保藏在Osaka的发酵学院中。然而，如下面所解释的，这些菌株不具有抗已知在水稻种植中为令人讨厌的杂草的稗的除草活性。
具有抗稗的除草活性的单角德斯霉菌株，例如MH-9011(FERM BP-3416)在日本专利公开号1992-226905中被描述。然而，如下面所解释的，这些菌株在正常温度即在约25℃下具有抗稗的除草活性，但在高于约30℃时几乎没有活性。
事实是除了稗外许多种类生长在水稻田和作物地中，并且这些杂草在水稻种植中也必须加以防治。目前常用的办法是以混合物或多种除草剂的混合物的组合物形式施用对不同杂草起作用的数种除草剂。结果，大大增加了合成农药。使用大量合成农药的施用不仅产生了关于对水，土嚷等的污染的关注，而正产生诱导化学抗性的杂草和昆虫害虫或具有抗药性的病原体的恶性循环。因此，迫切需要开发新的对人类和动物安全但不污染环境的农用学品。同时，需要有力的措施来降低合成农用化学品的使用。
                            发明内容
本发明试图解决的问题是减少常规杂草防治方法的缺点，其中仅通过提供对人和动物无害，并且不产生环境污染的霉菌除草剂来使用合成农药。因此，本发明的一个目的是提供在所述杂草迅速生长的温度范围内，对水稻种植中的稗的困扰具有选择性除草活性的德斯霉的新菌株，并且提供含有所述菌株的活细胞作为有效成分的杂草防治组分物。
本发明的另一个目的是提供一种杂草防治方法，该方法通过使用所述细胞和组合物中存在的化学除草剂降低合成农用化学品的使用，从而减少它们对环境的影响。
为了解决上述问题，本发明让人在现存于自然界的各种植物病原体中寻找并分离出在所述杂草迅速生长的温度范围内具有抗稗的可行除草活性，但在大多数作物，包括水稻中不具有致病的单角德斯霉的新菌株，从而完成了本发明。
因此，本发明包括在26℃-35℃的温度范围内具有选择性的除稗(Echincochloa spp.)的除草活性的单角德斯霉菌株，以及包含所述单角德斯霉细胞作为有效成分的杂草防治组合物。
根据本发明的单角德斯霉菌株在26℃-35℃的温度范围，以及正常温度下具有除所有种类的稗杂草(Echinochloa spp.)的除草剂活性，并且显示出可行的杂草防治效果。另一方面，它们对包括水稻的主要作物不具致病性，并且它们显示出在化学除草剂中被认为难以达到的高的选择性。
而且，混合施用本发明的单角德斯霉菌株细胞加上化学除草剂或两种的混合组分物可减少防治稗所必需的化学品的量，从而有助于减少目前的环境污染的现象和增加的化学抗性杂草的亲生。
根据本发明的单角德斯霉菌株为通过使用稗属杂草和水稻作物(选择对经济作物，如水稻没有致病性)的选择性除草活性试验从数以万计生活来自然界的不同微生物中选择出来的植物病原体。这些菌株在30℃以上以及25℃左右的正常温度，即在26℃-35℃的温度范围内显示出除稗的可行的除草活性。
要防治的稗为分类为稗属，例如E.Oryzicola，E.Crus-galli var.formosensis和E.crus-galli var crus-galli的杂草。根据本发明的单角德斯霉的这些菌株对主要作物，如水稻，大麦、黑麦、小麦和燕麦以及青草，如果园青草，印度麦草和黑麦草没有致病性。
本发明的菌株特征在于所述菌株在26℃-35℃温度范围内，具有除稗的除草活性，并且具有与存在于染色体上1.5kbp与1.6kbp之间位置的具有SEQ ID NO1序列的DNA杂交的两个核苷酸序列。
根据本发明的单角德斯霉的代表性菌株的实例包括MH-1901(FERM BP-6091)和MH-2001(FERM BP-6092)这些菌根据用于专利过程目的的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约，于1996，10月30日以上面的保藏号保藏在NationalInstifute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Scienceand Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，1-3Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki Prefecture，Japan。
根据本发明的单角德斯霉菌株可被以培养的活细胞，细胞培养物滤液或细胞和滤液的混合物的形式用于杂草防治组合物中。而且，菌丝或分生孢子或含有菌丝和分生孢子的菌丝体可以活细胞形式使用。
属于德斯霉属的霉菌可通过如日本专利公开1995/79784(公开7-79784)公开的已建立的方法大规模生产，并且从而能作为杂草防治组合物用于工业用途。
本发明还提供了一种除稗草的杂草防治组合物，其包含本发明的单角德斯霉菌株的细胞作为有效成分以及载体或稀释剂。使用纯形式的所述细胞可获得使用根据本发明的单角德斯霉细胞的杂草防治组合物。然而，通常优选通过将具有持久性的活细胞，例如分生孢子与无活性的载体混合获得它们的制剂形式，例如颗粒剂、粉剂、可湿粉剂、可流动剂、乳剂、液体剂等。
对于载体没有特殊的限制，只要它们无生物活性，可使用通常用于农业和园艺制剂的固体或液体载体。固体载体的实例包括矿物，例如粘土，滑石，高岭土，蒙脱石，白碳，沸石，硅石和硅藻土，植物材料，例如玉米粉，豆粉或淀粉和聚合物，例如聚乙烯醇和多烷基化合物。液体载体的实例包括各种有机溶剂，例如癸烷和十二烷，植物油，矿物油和水。
按照需要可使用辅助剂，表面活性剂，粘合剂和稳定剂，例如抗氧化剂和PH控制剂。
用于根据本发明的杂草防治组合物的单角德斯霉细胞的适宜数量随制剂的形式和施用的方法而变化。通常，大田施用的数量为1×106-1×1012，优选为1×108-1×1010个分生孢子/公亩。
充分的杂草防治效果还可进一步通过将根据本发明的单角德斯霉的杂草防治组合物与少量的化学除草剂混合而增加，其中在其他情况下该少量的化学除草剂如果以这样少的量单独被使用时，则是不够，即有效地降低了化学除草剂的量。因此，所述细胞不仅对作物产量作出了贡献，而且通过降低化学除草剂的使用减少了环境污染。
如本发明的单角德斯霉细胞的杂草防治组合物与用于稗的合成农药一起混合使用，例如二苯基醚除草剂，酰胺除草剂和氨基甲酸酯除草剂，则获得了增加两种组合物除草活性的协同效果。而且，通过将它与用于所述杂草的化学除草剂混合，例如二嗪除草剂，磺酰脲除草剂和三嗪除草剂，可将本发明的杂草防治组合物的功效扩展到宽叶杂草。在这种情况下，还降低了单角德斯霉细胞的剂量。
这种协同作用的可能的机理是由根据本发明的单角德斯霉造成的感染损伤了植物组织。从而促使了化学除草剂的高吸收和运输。类似地，化学除草剂也损伤了植物组织，从而促使了单角德斯霉的感染和生长，从而增强了两种组合物的除草活性。
化学除草剂的实例包括2，4-D，MCPB，Phenothiol，萘丙胺、敌稗，efhobenzanide，buromobutide，苯噻草胺，丁草胺，异丙甲草胺，丙草胺，theynlchlor，ntt氟草胺，杀草丹，草达灭，哌草丹，禾草畏，稗草畏，特草特，磺草灵，敌草隆，linuron，杀草隆，Cumyluron，苄嘧黄隆，吡嘧黄隆，醚黄隆，imazosulfuron，azimsulfron，cyclosulfamuron，抑草磷，哌草磷，莎稗磷，氟乐灵，二甲戊苯灵，灭藻酯，quinchlorac，敌草腈，磺苯腈，稀禾定，Sulcotrione，befoenox，三氟羧草醚，吡氟禾草灵，喹禾灵，cyhalofop-butyl，吠草黄，环庚草醚，哒草伏，isoxaflutole，灭草松，除草定，吡唑特，苄草唑，吡单酮，灭草烟，灭草喹，cafenstrole，pentoxazone，pyriminobac-methyl，bispyribac-sodium，西玛津，莠去津，西草净，扑草净，二甲丙乙净。
根据本发明的单角德斯霉细胞的杂草防治组合物可通过两种单独施用来与已知的化学除草剂一起混合使用，但在化学除草剂对所述细胞的分生孢子的萌发或网状菌丝体扩展没有抑制活性的情况下，例如苯噻草胺和萘丙胺，可以混合的组合物形式使用。根据本发明的杂草防治组合物中的单角德斯霉的数目随制剂形式而变化。然而，在固体制剂，如颗粒剂和可湿粉剂时该数目通常变化范围为1×106-108，优选1×106-1×107/g。
                          附图说明
图1显示PCR产物的电泳图。
                         具体实施方式
通过下面的实施例将详细说明根据本发明的单角德斯霉和含有它作为有效成分的杂草防治组合物。然而，应该理解本发明不变这些实施例的限制。
实施例1：本发明的单角德斯霉的分离
收集自然染病的稗，并从叶子的叶片和鞘的病态组织中分离病原体。具体地说，切下中心带有损害的1平方cm的组织部分，将切下部分在70％的乙醇水溶液中浸泡1-2秒，接着在有效氯浓度为约2％的次氯酸钠水溶液中浸泡10分钟以将切下部分的表面灭菌。用无菌水将由已灭菌的病态组织部分洗涤三次，放在补充有抗生素的琼脂培养基上，并接着在保温箱中静止保温。在光学显微镜下挑取生长的网状菌丝体的顶部并转移至营养培养基中以进行纯培养。
试验实施例1：选择性除草活性的检验和分离的霉菌的鉴定
(1)选择性除草活性的检验
在无菌条件在试管中培养不同种类的稗属杂草和水稻作物以制备试验料。特别地，按上面描述的相同方式灭菌稗属杂草，即E.oryzicola，E.crus-galli var.formosensis和E.crus-galli var.crus-galli的种子和水稻作物，即NipponbareKoshihikari和Sasanishiki的种子，装有无菌蒸馏水的用于这些作物的试管中播种并让其生长。
另一方面，25℃下，将完全分离的霉菌在装有马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(Difco)的平板上培养1周，接着使用软木钻孔器切下得到的菌落的外缘以获得用于接种的Mecerial盘。
将mecerial盘接种到稗属杂草或水稻作物已生长在其中的试管中，并接着在温箱中保温使植物生长。接种二周后，试验真菌对稗属杂草和水稻作物的作用被计算为4个等级，即-(没有作用)，+，++和+++(枯萎)。结果示表表1-1和表1-2中。
表1-1根据本发明的霉菌对稗属杂草的除草活性
    菌株   E.oryzicola  E.crus-galli var.formosensis  E.crus-galli var.crus-galli
  IFO-9619*     -     -     -
  IFO-9800*     -     -     -
  MH-9011*     +     ++     ++
  MH-1901     +++     +++     +++
  MH-2001     +++     +++     +++
    没有     -     -     -
*已知菌株
表1-2根据本发明的霉菌对水稻作物的致病性
    菌株   Nipponbare   Koshihikari   Sasanishiki
    IFO-9619*    -    -    -
    IFO-9800*    -    -    -
    MH-9011*    -    -    -
    MH-1901    -    -    -
    MH-2001    -    -    -
    没有    -    -    -
*已知菌株
(2)霉菌的鉴定
鉴定了对稗属杂草具有明显除草活性并对水稻作物没有作用的霉菌。MH-1901和MH-2001在麦芽琼脂培养基(Difco)上显示出灰黑色菌落和不规则生长。分生孢子具有测量为87.5-127.5μm×15-17.5μm的明显光滑和轻微弯曲的形状，大部分具有5-7个，最大约9个隔膜。分生孢子是直的。根据Ellis分类，从这些特征来看，将霉菌MH-1901和MH-2001鉴定如德斯霉(Ellis，M.B.1971：Demariaceus Hyphomycetes.Commonwealth MycologicalInstitute，Kew，England和Eilis，M.B.1976：More DemariaceusHyphomycetes.commonwealth Mycological Institute，Kew，England)。如上面所描述的，这些新的菌株，MH-1901和MH-2001以保藏号FERM BP-6091和FERMBP-6092分别保藏在National Institute of Bioscience and Human-TechnologyAgency of Inductrial Science and Technology。
试验实施例2：根据本发明的单角德斯霉菌株与已知菌株的区别
根据本发明的单角德斯霉MH-1901和MH-2001菌株和单角德斯霉MH-9011的已知菌株(根据用于专利过程的微生物的保藏国际承认的却达佩斯条约，以保藏号FERM BP-3416保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Indutrial Science and Technology)与使用通过RAPD方法(任意扩增多晶型DNA，Williams，J.G.K等(1990)由任意引物扩增的DNA多晶型可用作基团标记物，核酸研究，Vol.18)获得的PCR产物的电泳图谱进行了比较。
根据常规方法从MH-1901，MH-2001和MH-9011提取和纯化DNA。将纯化的DNA和商业可购得的PCR试剂(Takara shuzo Co.Ltd)以如表2的比例混合以制备PCR反应溶液。
表2PCR反应溶液的组成
PCR缓冲液(×10)                                1.5μl
25mM氯化镁                                     0.3μl
2.5mM dNTP                                     0.6μl
Taq聚合酶                                      0.06μl
0.1μM引物                                     0.6μl
DNA(1ng/μl)                                   0.5μl
灭菌水                                         11.34μl
RAPD的OPE-1(5’-CCCAAGGTCC-3’(SEQ ID NO：1)，Operon Technology的产物)被用作引物。使用DNA热循环(基因扩增PCR系统9600，Perkin Elmer公司的产品)进行PCR反应，开始为94℃，2分钟，一个循环，接着按下面进行45个循环：94℃下，10秒，40℃下，1分钟，72℃以下，1分钟，接着72℃下进行10分钟。
将由PCR反应获得的DNA在1.5％琼脂糖凝脉上进行水下电泳(50V，50分钟)，将凝胶放在溴化乙锭水溶液(0.5um/ml)中浸泡20分钟染色，接着在紫外照射下，检测PCR产物的带型。结果示于图1中。
PCR产物的电泳图谱的比较表明根据本发明的MH-1901和MH-2001明显不同于MH-9011。
试验实施例3：不同温度下根据本发明的单角德斯霉的除草活性
将根据本发明的单角德斯霉MH-1901和MH-2001的细胞和已知菌株MH-9011分别接种在麦片琼脂培养基(Difco)，并在25℃下静止培养2周。将在表面菌落形成的分生孢子悬浮于0.02％Triton X-100(Rohm和Haas Co.)水溶液中以制成含有单角德斯霉细胞(1×105分生孢子/ml)作为有效成分的杂草防治组合物。
另一方面，将1/10000公亩的盆装满水稻土壤，以50粒种子/每盆稗种，接着让作物长至一叶龄。将种有作物的盆装水至约5cm的深度。向这些盆滴加1ml上述各种杂草防治组合物。将盆放置在温度设置为10，20，25，30℃和40℃的的气候控制室中来培植稗(光照：10,000勒克司，光照/黑暗：12/12小时)。用杂草防治组合物处理二周后，计数存活植物和枯萎植物的数量以计算防治稗的比例。将试验重复三次。平均防治比例示于表3中。
表3：不同温度下，根据本发明的单角德斯霉的除草活性
温度(℃)    10      20     25     26     28     30     35    40
MH-9011*    -**     76     98     90     70     4      2     -***
MH-1901     -**     100    100    100    100    100    70    -***
MH-2001     -**     100    100    100    100    100    70    -***
没有接种    -**     0      0      0      0      0      0     -***
*：已知菌株
**：由于低温稗没有生长
***：由于高温大多数稗枯萎。
制剂实施例1：可湿性粉剂
将含有单角德斯霉MH-1901分生孢子(1×109)和90g为硅藻上的TOALITE(Toa Kasei Co.，Ltd)的悬浮液充分混和，室温下在空气中充分干燥混合物，并将干燥物捣碎。将产生的捣碎的物质与作为表面活性剂的NewKalgen(Takemotooil & Fat Co.，Ltd)混合并捏和，将混合物过筛以获得本发明的单角德斯霉的可湿性粉剂。
制剂实施例2：粉剂
将含有单角德斯霉MH-2001分生孢子(1×109)和90gTOALITE(Toa KaseiCo.，Ltd)的悬浮液充分混和，接着在室温下，在空气中充分干燥混合物，将干燥物捣碎，接着过筛以获得本发明的单角德斯霉的粉剂。
制剂实施例3：颗粒剂
将含有单角德斯霉MH-1901的分生孢子(1×109)，88gTOALITE和为羧甲基纤维素钠的2g Collogen(Daiichi Kogyo Seiyaku Co.，Ltd)的悬浮液充分混和，接着使用小型挤出成粒机将混合物成粒。将成粒物过筛，接着在空气中干燥以获得本发明的单角德斯霉颗粒剂。
制剂实施例4：混有化学除草剂的颗粒剂
将10％(重量计)的捣碎得很细的EMUON的颗粒(含有18.1％CNP作为有效成份；Sankyo的产品)和78g沸石(Sanyo-KoKusaku Pulp Co.，Ltd)充分混和，接着加入含单角德斯霉分生孢子(1×108)的悬浮液以润湿所得到的混合物。加入2gCellogen(Daiichi Kogyo Seiyaku Co.，Ltd)，充分混合混合物，接着使用小挤压成粒机。过成粒物过筛，空气干燥以获得混合有CNP的本发明的单角德斯霉的颗粒剂。
试验实施例4：根据本发明的单角德斯霉与稗的化学除草剂混合施用试验
将1/1000公亩数量的盆装满水稻土壤，以约100粒稗种子/盆播种，接着让植物生长到一叶龄。将盆装水至约5cm高度。将植物用根据制剂实施例1制备的可湿粉剂与除稗的化学除草，即HINOCHLOA颗粒剂(有效成分：苯噻草胺)处理。将盆放置在温度设置为30℃的气候控制室(光照：10,000勒克司，光照/黑暗12/12小时)以培植稗。处理1个月后，计数存活的植物的数目以使用下式计算防制稗的比例。将试验重复三次。平均防治比例示于表4。
防治比例(％)二[(未处理组中存活植物的数目一处理组中存活植物的数目)/末处理组中存活植物的数目]×100。
表4：根据本发明的单角德斯霉与化学除草剂混合施用对稗的除草效果(平均防治比例，％)
分生孢子                 HINOCHLOA颗粒剂(mg)
的数目        300       100      30       10      0
1×106       100       100      100      100     100
3×105       100       100      100      100     77
1×105       100       100      100      78      51
3×104       100       100      77       53      24
0             100       74       52       22      -
试验实施例5：根据本发明的单角德斯霉与宽叶杂草的化学除草剂混合的施 用试验
将1/1000公亩数量的盆装满水稻土壤，以约100粒稗种子/盆和约100粒宽叶杂草的种子/盆播种，即单子叶和窄叶水大蕉，接着让植物生长直至稗达到1叶龄。将盆装水至约5cm深度。将植物用根据制剂实施例1制备的可湿粉剂与300mgSIRIUS颗粒剂(有效成分：吡嘧黄嘧)处理。让植物生长于温度设置为30℃的气候控制室中(光照：10,000勒克司，光照/黑暗：12/12小时)，处理1个月后，计数存活植物的数目，用试验实施例4的公式计算防治稗的比例。将试验重复三次。平均防治比例示于表5中。当用300mgSIRIUS颗粒剂处理时，对单子叶和窄叶大蕉的防治比例均为100％。
表5根据本发明的单角德斯霉与宽叶植物的化学除草剂混合施用的除草效果。
分生孢子的数目    SIRIUS          颗粒剂(mg)
                  300             0
1×106           100             100
1×105           100             76
1×105           100             52
1×104           77              24
0                 13              -

Claims (6)

1.一种单角德斯霉(Drechslera monoceras)菌株，其在35℃具有选择性的除稗草的除草活性，其中单角德斯霉为MH-1901，其保藏号为FERM BP-6091，或MH-2001，其保藏号为FERM BP-6092。
2.根据权利要求1所述的单角德斯霉菌株，其中通过PCR反应获得的一个PCR产物为1.5kbp-1.6kbp，在所述PCR反应中，所述德斯霉的DNA被用作模板，具有SEQ ID NO：1碱基序列的DNA被用作引物。
3.根据权利要求1或2所述的单角德斯霉菌株的分生孢子。
4.一种除稗草的杂草防治组合物，包含权利要求1的单角德斯霉菌株的细胞作为有效成分以及载体或稀释剂。
5.根据权利要求4的杂草防治组合物，其中通过PCR反应获得的一个PCR产物为1.5kbp-1.6kbp，在所述PCR反应中，所述单角德斯霉的DNA被用作模板，具有SEQ ID NO：1的碱基序列的DNA被用作引物。
6.根据权利要求4或5的杂草防治组合物，其还包含一种或多种化学除草剂，所述化学除草剂为一种或多种除草剂，其选自二苯基醚除草剂，酰胺除草剂，氨基甲酸酯除草剂，二嗪除草剂，磺酰脲除草剂和三嗪除草剂。
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