CN116144602A - 一种抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。所述杂交瘤细胞株命名为8D7‑A9‑E2和8D7‑A9‑H4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为CCTCC NO：C202141和CCTCC NO：C202142，保藏日期为2021年01月28日。所述杂交瘤细胞分泌的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体与人醛酮还原酶1B10蛋白具有较高的亲和力。以所述单克隆抗体构建的人醛酮还原酶1B10蛋白检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在酶联免疫吸附、时间分辨免疫荧光分析和化学发光检测等多种检测中应用效果较好。

Description

一种抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
肝脏疾病由脂肪肝(肝炎)、肝纤维化、肝硬化和肝癌逐渐演变的过程，目前缺乏一种早期诊断、精准诊断和监测这些肝脏疾病进程的血清标记物；肝脏疾病常导致肝功能异常，监测肝功能的指标包括谷草转氨酶、谷丙转氨酶等，但是，这些标志物在早期诊断和疾病进展等方面仍显不足；肝癌、肺癌和乳腺癌等癌症是威胁人类健康的恶性肿瘤，目前还缺乏有效地针对肝癌、肺癌、乳腺癌早期检测、疗效判断、预后评估或复发监测的有效方法。因此，亟需一种用于特异性高、敏感性高且能用于肝功能、肝脏疾病和人类多种癌症早期筛查、早期诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的新靶标，和一种易操作的、对人体无危害的、具有临床应用价值的检测方法。
AKR1B10蛋白在正常肝脏中低表达，当肝脏受损时AKR1B10蛋白会表达，或者进入血液中的AKR1B10蛋白增多，因此，AKR1B10蛋白可用于肝功能、肝脏疾病(脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化)和肝癌的早期筛查、早期诊断、疗效判断、预后评估和复发监测。
AKR1B10蛋白在肺癌、乳腺癌等其它肿瘤中高表达，促进肿瘤的生长和转移，并与肿瘤的耐药性相关。通过抑制或敲降AKR1B10基因可以抑制肿瘤的生长和转移，并增加肿瘤对化疗药物的敏感性，促进肿瘤放疗抵抗。在肿瘤细胞中表达的AKR1B10蛋白可以通过溶酶体途径分泌到血液中，使肿瘤患者血液中的AKR1B10蛋白水平升高。因此，通过检测血液中AKR1B10蛋白的水平，可以诊断肿瘤的发生/复发，判断抗肿瘤效果。
因此，开发一种基于AKR1B10蛋白的一系列用于肝功能、肝脏疾病(脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等)以及人类肿瘤的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的检测试剂盒具有重要的临床应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10(Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白，开发出一种新的特异性单克隆抗体，并以此开发出一个灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为8D7A9E2和8D7A9H4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为CCTCC NO：C202141和CCTCC NO：C202142，保藏日期为2021年01月28日。
本发明获得两株鼠源性单抗细胞株，即8D7A9E2和8D7A9H4，保藏号分别为CCTCCNO：C202141和CCTCC NO：C202142，于2021年01月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，经检测存活。
第二方面，本发明提供一种抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由第一方面所述的产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
第三方面，本发明提供第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的制备方法，所述单克隆抗体的制备方法包括：培养第一方面所述的产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进行分离纯化，获得所述抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
第四方面，本发明提供第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体在制备用于人肝功能、人肝脏疾病及癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒中的应用。
优选地，所述人肝脏疾病包括肝炎、脂肪肝、肝纤维化或肝硬化。
优选地，所述癌症包括肝癌、肺癌或乳腺癌。
优选地，所述试剂盒包含特异性检测样本中的AKR1B10蛋白水平的试剂。
优选地，所述试剂盒还包含AKR1B10蛋白标准品。
优选地，所述试剂盒检测的样本包括血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、乳汁、肠液、大便、唾液、阴道分泌物或组织样本中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，使用所述试剂盒进行筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测包括：
(a)利用所述特异性检测AKR1B10蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中AKR1B10蛋白的水平；
(b)将(a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
本发明发现，AKR1B10蛋白是一种分泌性的人醛酮还原酶，在健康人胃肠道上皮组织高表达，在肝脏组织中低表达，由于正常人胃肠道上皮和肝脏表达分泌的AKR1B10蛋白均进入肠道排出，因此正常人血液中AKR1B10蛋白浓度很低。
第五方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的酶联免疫吸附检测试剂盒，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体为含有HRP标记的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包括：
包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)板；包被缓冲液：1×PBS，pH7.3±0.1；样品稀释液：1×PBS、1-5％ BSA、0.05-1％ NaN3，pH7.3±0.1；封闭液：1×PBS、3-5％ BSA；洗脱液PBST：1×PBS、0.05-0.06％ Tween-20；用HRP标记的单克隆抗体。
第六方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的时间分辨免疫荧光分析试剂盒，所述时间分辨免疫荧光分析试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体为含有生物素标记的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的时间分辨荧光免疫测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、洗脱液或Streptavidin-Eu中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述时间分辨荧光免疫试剂盒(TRFIA)包括：
包被特异性捕获抗体的时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)板；包被缓冲液：1×PBS，pH7.3±0.1；样品稀释液：1×PBS、1-5％ BSA、0.05-1％ NaN3，pH7.3±0.1；封闭液：1×PBS、3-5％ BSA；洗脱液PBST：1×PBS、0.05-0.06％ Tween-20；含有生物素(Biotin)标记的单克隆抗体；Streptavidin-Eu。
第七方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的化学发光检测试剂盒，所述化学发光检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体为含有化学发光标记物的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、碱性磷酸酶或鲁米诺中任意一种。
优选地，所述化学发光检测试剂盒还包含包被有特异性捕获抗体的法学发光磁微粒、样品稀释液、洗脱液或发光底物中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述化学发光检测试剂盒包括：
包被有特异性捕获抗体的化学发光磁微粒；样品稀释液：1×PBS、1-5％ BSA、0.05-1％ NaN3，pH7.3±0.1；洗脱液PBST：1BSTS、0.05-0.06％ Tween-20；含有化学发光标记物的特异性单克隆抗体；所述的化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、碱性磷酸酶、鲁米诺；发光底物试剂。
第八方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的免疫比浊检测试剂盒，所述免疫比浊检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
优选地，所述免疫比浊检测试剂盒还包含R1试剂、R2试剂、定标液或检测抗体中的任意一种或至少两种的组合，所述R1试剂由磷酸盐缓冲液、聚乙二醇和叠氮钠组成，所述定标液为人AKR1B10抗原溶液，所述检测抗体为用全长AKR1B10抗原免疫山羊或兔获得的多克隆抗体。
优选地，所述R1试剂中含Tris缓冲液20-30mmol/L，聚乙二醇8000 5-15g/L和0.5-1％叠氮钠等，pH为8.2。
优选地，所述R2试剂中含特异性单克隆抗体2-15mg/mL和0.5-1％叠氮钠，pH为7.5。
优选地，所述定标液中人AKR1B10抗原的浓度为0ng/mL、0.0625ng/mL、0.125ng/mL、0.25ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL或32ng/mL。
本发明建立的检测AKR1B10蛋白的酶联免疫吸附法(ELISA)、时间分辨荧光免疫法、化学发光法和免疫比浊法等方法的试剂盒，可适用于肝功能、肝脏疾病以及肝癌、肺癌和乳腺癌早期诊断和人群筛查、疗效判断、复发监测及预后评估等方面，具有快速、客观和准确性高等优点。
肝功能：人体AKR1B10蛋白主要表达在胃肠道上皮细胞和肝细胞，胃肠道上皮细胞和肝细胞表达的AKR1B10蛋白直接或间接通过胆道系统进入消化道，被排除体外；而当肝功能受损时，肝细胞产生的AKR1B10蛋白则会进入血液，导致血清AKR1B10蛋白浓度增加。
肝脏疾病：肝炎严重时，或者脂肪肝(包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪)形成后，或者演变成为肝纤维化或肝硬化后，肝细胞AKR1B10蛋白表达增加，进入也血液增多。
癌症诊断：当肿瘤很小时，病人还没有临床症状，通过检测血清中AKR1B10蛋白的改变，进行肝癌、肺癌和乳腺癌的早期诊断。
指导治疗：检测接受治疗的肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的改变，可判断疗效。
监测复发：定期检测已治疗的肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的改变，若升高则预示癌症复发。
判断预后：肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的水平与肿瘤的大小及转移、复发率和生存率有关，预示治疗效果及病人的预后。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白，开发出一种新的特异性单克隆抗体，本发明所述单克隆抗体的特异性好，与AKR1B10蛋白具有较高的亲和力，与其他无关蛋白无交叉反应。
(2)本发明以所述单克隆抗体开发出一系列灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，在包括酶联免疫吸附、时间分辨免疫荧光分析和化学发光检测等在内的多种检测中应用效果较好包括，可以广泛应用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
附图说明
图1为用AKR1B10抗原株纯化后的AKR1B10单克隆抗体的SDS-PAGE图。泳道M：蛋白分子量标记物；泳道1-8：纯化过程中洗脱的管数；
图2为纯化的鼠源性AKR1B10单克隆抗体的特异性检测结果；
图3A为肝癌组织的免疫组化检测结果；
图3B为肝癌癌旁组织的免疫组化检测结果；
图4A为乳腺癌组织的免疫组化检测结果；
图4B为乳腺癌癌旁组织的免疫组化检测结果；
图5A为人类肺癌组织的免疫组化检测结果；
图5B为人类肺癌癌旁组织的免疫组化检测结果；
图6为检测AKR1B10蛋白的化学发光测定试剂盒的标准曲线；
图7正常人群和乳腺癌患者血清中AKR1B10浓度；
图8正常人群和肺癌患者血清中AKR1B10浓度；
图9正常人群和肝癌患者血清中AKR1B10浓度。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
发明详述
本发明涉及一种针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白(以下简称为AKR1B10)的特异性单克隆抗体。AKR1B10蛋白是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的。所述AKR1B10蛋白质具有316个氨基酸，在人类肝癌、肺癌和乳腺癌组织中明显高表达，在促进肿瘤细胞的生长增值及侵袭转移，以及在肿瘤的发生、发展中起极为重要的作用。
本发明涉及的AKR1B10单克隆抗体是用全长AKR1B10免疫小鼠获得表达单克隆AKR1B10抗体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交获得了杂交瘤细胞产生的。为了证明AKR1B10单克隆抗体特异性，培养转染了空载体的不表达AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/Vector(MCF7/V)，转染AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/AKR1B10(MCF7/A)，表达AKR1B1而不表达AKR1B10的胚胎肾细胞293T，高表达AKR1B10的肺癌细胞A549，提取它们的总蛋白，用免疫印迹法检测抗AKR1B10单克隆抗体具有高特异性，发现与AKR1B1蛋白无交叉反应，但可特异性地与AKR1B10结合。
本发明涉及的抗AKR1B10蛋白单克隆抗体用免疫组织化学方法，能成功检测到AKR1B10蛋白在人类肝癌、肺癌和乳腺癌组织中的表达(参见图3A、3B、4A、4B、5A和5B)。
本发明发现肿瘤细胞可分泌AKR1B10蛋白到外周血液循环中，在罹患肝癌、肺癌和乳腺癌的患者的血清中AKR1B10蛋白增加。因此AKR1B10蛋白可以作为新的肿瘤血清标记物，可用于肝癌、肺癌和乳腺癌的筛查、早期诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。此外，本发明还发现人的正常肠上皮细胞可分泌AKR1B10蛋白到肠液，在肠液及大便中可检测到AKR1B10蛋白。
本发明提供的检测AKR1B10蛋白的试剂盒包括特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，在试剂盒中，所述单克隆抗体包被到磁珠上。
本发明基于新开发的抗AKR1B10蛋白单克隆抗体，利用夹心化学方法检测技术建立了检测血清AKR1B10抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝癌、肺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的人群筛查，并可用于指导治疗、判断预后以及监测复发病人。
本发明提供的检测AKR1B10抗原的夹心化学发光检测试剂盒主要包括有：包被有捕获AKR1B10蛋白的特异性多克隆抗体的免疫磁珠；吖啶结合的鼠单抗AKR1B10抗体。捕获抗体与检测抗体均可与AKR1B10抗原结合。其中所述捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体。
AKR1B10多克隆抗体采用如下方法制备得到：用AKR1B10特异性多肽(ARL-1specific antibodies and uses thereof,U.S.Patent#:US13/017618)抗原免疫山羊获得的多克隆抗体。
所述检测AKR1B10抗原的夹心化学发光检测试剂盒还包括有：样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1％ BSA、0.05％ NaN3，pH7.3±0.1)；标准品(不同浓度AKR1B10纯抗原：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)。
所述捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫鼠所获得的鼠源性单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供一种检测AKR1B10抗原的夹心化学发光检测试剂盒的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：
用山羊抗AKR1B10蛋白多克隆抗体包被免疫磁珠，用试剂稀释液(PBS，pH7.4，1.0％脱脂奶粉，0.05％ NaN3)稀释这些免疫磁珠，配制成磁珠溶液(终浓度0.2mg/mL)，制成试剂盒A腔；用吖啶酯标记鼠抗AKR1B10蛋白单克隆抗体(简称“鼠抗AKR1B10单抗”)，用试剂稀释液(PBS，pH7.4，1.0％脱脂奶粉，0.05％ NaN3)稀释吖啶标记的鼠抗AKR1B10单抗到1:50，配制成试剂盒D腔；用瓶盖密封A腔和D腔，放于4℃冰箱，备用。
使用时，将50μL血清样本或者标准品(0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL AKR1B10纯蛋白稀释品)加入50μL兔抗AKR1B10抗体包被的磁珠(A腔)，孵育15min后进行第一次磁分离清洗；清洗后加入100μL吖啶酯结合的鼠抗AKR1B10单克隆抗体(D腔)，孵育15min后进行第二次磁分离清洗；清洗后试管内加入预激发液及激发液读取相对发光度值。
任选地，所述试剂盒可以包含下述试剂：AKR1B10蛋白标准品、质控品、预激发液、激发液、洗液或说明书等。
以下具体实施方式中使用的试剂购自西格玛奥德里奇中国公司(Sigma-AldrichCo.LLC)、Peirce、ThermoFisher。
实施例1鼠抗AKR1B10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
将全长AKR1B10蛋白(Gene ID:57016)稀释至1mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，皮下多点接种6周龄Balb/c小鼠5只，接种抗原剂量为50μg/只。
3周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原，以后每2周注射1次抗原，重复3次，每次免疫的剂量为25μg/只。
细胞融合前3天，腹腔注射不加佐剂的AKR1B10蛋白进行加强免疫一次。
3天后，从小鼠眼球采血，将血液在37℃放置0.5h，4℃放置1h，3000rpm离心5min，分离后的血清作为阳性血清。
处死小鼠，75％酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，将四肢固定于超净台解剖板上。在无菌的条件下，依次剪开腹部皮肤、腹膜，充分暴露腹腔，在小鼠腹腔左侧用一套无菌的剪刀和镊子取出脾脏，置于含有少量无血清DMEM培养基的无菌玻璃培养皿中的滤网上，剪去脾脏上的筋膜，用玻璃针筒研磨。冲下的脾细胞用无血清DMEM培养基洗涤2次(1500rpm离心5min)，再次悬浮细胞后计数，以无血清DMEM培养基调整细胞浓度为1×107个/mL，获得约10mL细胞悬液，即得免疫脾细胞。
快速取出液氮罐中的Sp2/0骨髓瘤细胞，放入37℃水中，不停摇动冻存管，使其尽快融化，1000rpm离心5min后弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养。
10天后，融合当天取细胞形态均一、边界清晰、生长状态良好的Sp2/0细胞，弃去营养液，用无血清DMEM营养液洗涤后重新悬浮，细胞计数板计数，将细胞稀释为106个/mL，体积为5mL左右，放置在37℃、5％ CO2培养箱中融合备用。
将准备好的Sp2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：10的比例混和，置于50mL离心管内，用无血清DMEM培养基洗涤1次，1000rpm离心10min，用手指轻击离心管底部，使细胞松散。
将离心管置于37℃水浴中，用1mL吸管吸取1mL PEG2000加入离心管，边加边轻轻搅拌，PEG2000平均在1min内加完，加完后轻轻静止1min。缓慢加入1mL无血清DMEM培养基，1min加完，加完后每1s一滴，缓慢加入10mL后定容至45mL。1200rpm离心8min，弃去上清。重悬融合细胞，动作轻柔，防止将刚融合上的细胞吹散，加入100mL HAT培养基(HAT+90％DMEM+10％胎牛血清)开始铺96孔板，一共铺10块，不换液7天后进行检测。
使用间接ELISA方法进行抗AKR1B10抗体检测，筛选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。进一步使用有限稀释法获得分泌针对单一表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本实施例获得两株鼠源性单抗细胞株，即8D7A9E2和8D7A9H4。
实施例2保藏杂交瘤细胞株
本实施例对实施例1中所述的克隆号为8D7A9E2和8D7A9H4的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，
武汉大学，保藏编号分别为CCTCC NO：C202141和CCTCC NO：C202142，保藏日期为2021年01月28日。
实施例3纯化抗AKR1B10蛋白单克隆抗体
本实施例培养克隆号为8D7A9E2和8D7A9H4的杂交瘤细胞株，并使用蛋白G亲和层析方法纯化单克隆抗体。
实验步骤如下所示：
(1)抗体培养液的制备
将杂交瘤细胞进行体外扩增培养，收集培养基。
(2)单克隆抗体的纯化
用AKR1B10抗原纯化柱纯化培养基中的抗AKR1B10抗体。
(3)SDS-PAGE电泳鉴定纯度
SDS-PAGE电泳鉴定纯度并用Nanodrop测定浓度。纯化的鼠源性AKR1B10单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果如图1所示，由图1可知，纯化后的单克隆抗体条带大小正确，纯度>95％。泳道M：蛋白分子量标记物，上样量5μL；泳道1-8：纯化过程中洗脱的管数，上样量5μL。
实施例4检测抗AKR1B10蛋白单克隆抗体的特异性检测
检测步骤如下所示：
(1)培养转染了空载体的不表达AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/Vector(MCF7/V)、转染AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/AKR1B10(MCF7/A)、表达AKR1B1而不表达AKR1B10的胚胎肾细胞293T、高表达AKR1B10的肺癌细胞A549。
(2)提取这些细胞的总蛋白，测定蛋白浓度，每个样本取30μg，调整体积到30μL，加入SDS，95℃10min。
(3)将样本加入SDS-PAGE样品孔中，跑完胶后转膜，用绿春红染色，然后拍照。
(4)用5％脱脂牛奶封面膜，然后加入1:1000AKR1B10单克隆鼠抗，用PBST洗脱3遍后，用HRP标记的抗鼠的二抗孵育膜，显色后拍摄照片，获得图2。
检测结果如图2所示，图2为纯化的鼠源性AKR1B10单克隆抗体的特异性结果。图中，MCF7/V表示转染了空载体的不表达AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/Vector(MCF7/V)；MCF7/A表示转染AKR1B10的乳腺癌细胞MCF7/AKR1B10(MCF7/A)，293T表示表达AKR1B1而不表达AKR1B10的胚胎肾细胞293T，A549表示高表达AKR1B10的肺癌细胞A549。结果表明，抗AKR1B10单克隆抗体具有高特异性，与AKR1B1蛋白无交叉反应。
实施例5检测抗AKR1B10蛋白单克隆抗体与AKR1B10蛋白的结合活性
(1)将用PBS(pH7.3)溶解全长AKR1B10蛋白，浓度10μg/mL，包被ELISA板，然后用3％脱脂奶粉的MPBS溶液室温封闭2h，用PBS洗涤3遍。
(2)在一排试管中，建立从0.1nmo/L、0.25nmo/L、0.5nmo/L、1nmo/L、5nmo/L、10nmo/L、50nmo/L、100nmo/L、500nmo/L、1000nmo/L浓度的AKR1B10抗原PBS溶液，每个试管加入1nmol/L抗体溶液，每个试管总体积为400μL。
(3)试管室温孵育30min后，将100μL反应混合物加入抗原板，每个浓度重复3个平行孔，孵育10min。
(4)用TBST洗涤抗原板3次，加入1:5000的碱性磷酸酶(AP)偶联的鼠单克隆抗体，孵育10min。
(5)用TBST洗涤抗原板3次，AP底物对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)10μL、5min后用多功能酶标仪检测405nm波长的荧光值。
(6)从检测结果可知获得抗体抗原解离常数Kd为5.2nmol/L。
实施例6抗AKR1B10蛋白单克隆抗体用于免疫组织化学检测
检测步骤如下所示：
(1)收集肝癌、乳腺癌、肺癌组织样本.
(2)将组织样本固定、脱水、包埋、切片。
(3)将组织切片封闭，然后用1:200抗AKR1B10单克隆鼠抗孵育，洗脱三次，加入HRP标记的鼠二抗，加入显色剂，在显微镜下观察组织中AKR1B10的表达水平。
用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类肝癌组织中的表达，检测结果如图3A和图3B所示；图3A为肝癌组织的免疫组化检测结果，图3B为肝癌癌旁组织的免疫组化检测结果，结果表明用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体能检测到肝癌组织中的AKR1B10蛋白。
用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类乳腺癌组织中的表达，检测结果如图4A和图4B所示；图4A为乳腺癌组织的免疫组化检测结果，图4B为乳腺癌癌旁组织的免疫组化检测结果，结果表明用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体能检测到乳腺癌组织中AKR1B10蛋白。
用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类肺癌组织中的表达，检测结果如图5A和图5B所示；图5A为人类肺癌组织的免疫组化检测结果，图5B为人类肺癌癌旁组织的免疫组化检测结果，结果表明用抗AKR1B10蛋白单克隆抗体能检测到人类肺癌组织中的AKR1B10蛋白。
实施例7制备检测AKR1B10蛋白的酶联免疫吸附检测试剂盒
以实施例3中所获得的单克隆抗体(即从保藏的8D7A9E2和8D7A9H4细胞株提取纯化AKR1B10单克隆抗体)用作检测抗体，所述检测试剂盒包括：
包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)板；
包被缓冲液：1×PBS，pH7.3±0.1；
样品稀释液：1×PBS、1％ BSA、0.05％ NaN3，pH7.3±0.1；
封闭液：1×PBS、3％ BSA；
洗脱液PBST：1×PBS、0.05％ Tween-20；
用HRP标记的抗AKR1B10蛋白单克隆抗体。
使用所述酶联免疫吸附检测试剂盒对AKR1B10蛋白进行检测，检测步骤如下所示：
(1)将10μg/mL羊抗AKR1B10多抗溶解到包被缓冲液中，每孔200μL加入ELISA板孔中；
(2)用200μL封闭液封闭ELISA板；
(3)加入不同浓度AKR1B10蛋白(0ng/mL、0.0625ng/mL、0.125ng/mL、0.25ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)，室温孵育1h；
(4)去除蛋白溶液，用洗脱液洗涤3次，加入1:2000鼠抗AKR1B10单克隆抗体，孵育30min；
(5)用洗脱液洗涤3次，加入1:5000HRP标记的抗鼠二抗；
(6)用洗脱液洗涤3次，加入底物TMB，孵育15min，然后加入终止液，在450nm测量荧光值。
检测结果如表1所示，该试剂盒的最低检出限为0.25ng/mL，在0.125-32ng/mL之间具有较好的线性关系。
表1
抗原浓度(ng/mL) OD450
0 1866
0.0625 1911
0.125 1932
0.25 1990
0.5 2300
1 2745
2 3458
4 5687
8 7865
16 12543
32 23456
实施例8制备检测AKR1B10蛋白的时间分辨荧光免疫试剂盒(TRFIA)
以实施例3中所获得的单克隆抗体(即从保藏的8D7A9E2和8D7A9H4细胞株提取纯化AKR1B10单克隆抗体)用作检测抗体，所述检测试剂盒包括：
包被缓冲液：1×PBS，pH7.3±0.1；
样品稀释液：1×PBS、1％ BSA、0.05％ NaN3，pH7.3±0.1；
封闭液：1×PBS、3％ BSA；
洗脱液PBST：1×PBS、0.05％ Tween-20；
含有生物素(Biotin)标记的特异性单克隆抗体；
Streptavidin-Eu，铕标记链霉亲和素。
使用所述酶联免疫吸附检测试剂盒对AKR1B10蛋白进行检测，检测步骤如下所示：
(1)将2-10μg/mL羊抗AKR1B10多抗溶解到包被缓冲液中，每孔100-200μL加入高绑定性能的ELISA板孔中；
(2)用200-250μL封闭液封闭ELISA板；
(3)加入不同浓度AKR1B10蛋白(0ng/mL、0.0625ng/mL、0.125ng/mL、0.25ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)，室温孵育1h；
(4)去除蛋白溶液，用洗脱液洗涤3次，加入1:1000的生物素标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体，孵育30min；
(5)用洗脱液洗涤3次，加入1:5000Streptavidin-Eu，孵育15min；
(6)用洗脱液洗涤3次，在340nm激发光下，测量613nm的荧光值。
检测结果如表2所示，该试剂盒的最低检出限为0.125ng/mL，在0.125-32ng/mL之间具有较好的线性关系。
表2
抗原浓度(ng/mL) OD450
0 213
0.0625 220
0.125 223
0.25 452
0.5 821
1 1632
2 3345
4 7365
8 13454
16 23455
32 32346
实施例9制备检测AKR1B10蛋白的化学发光检测试剂盒
实施例3中所获得的单克隆抗体(即从保藏的8D7A9E2和8D7A9H4细胞株提取纯化AKR1B10单克隆抗体)用作检测抗体，并用吖啶酯标记；用野生型全长AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体，将捕获抗体连接到免疫磁珠上，构建一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的化学发光检测试剂盒。
本实施例中抗体纯化试剂盒(Sulfolink@Immobilization Kit for Peptides)购自Thermo Scientific公司(货号44999)；单克隆抗体的吖啶酯标记和多克隆抗体的免疫磁珠偶联均由深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司负责标记与偶联；所用试剂自配：试剂稀释液：pH7.4的PBS溶液，1.0％脱脂奶粉，0.05％ NaN3。
兔抗AKR1B10抗体包被的磁珠(试剂盒的A腔)：用试剂稀释液配制成磁珠终浓度为0.2mg/mL。
吖啶结合的鼠单抗AKR1B10抗体(试剂盒的D腔)：用试剂稀释液稀释吖啶结合的鼠单抗AKR1B10抗体到1:50。
标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)。
将检测AKR1B10蛋白的化学发光检测试剂装到亚辉龙iFlash 3000的试剂窗，将标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)放到仪器样本架上；在仪器检测程序上增加AKR1B10检测项目，启动检测程序，获得标准品的检测值，绘制标准曲线。
化学发光检测试剂盒的检测结果如图6所示，图6为检测AKR1B10蛋白的化学发光测定试剂盒的标准曲线，其中连在磁珠上的捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体；标记发光物的检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫鼠获得的纯化单克隆抗体。用纯化的、不同量AKR1B10蛋白作为待检样品，以确定最低检出限。
结果表明，本实施例获得的捕获抗体和检测抗体的灵敏度和特异性都很强，本实施例中的化学发光检测方法的特异性强，自动化程度高，灵敏度高，可检测到0.5ng/mL的AKR1B10蛋白。
实施例10使用化学发光检测试剂盒检测正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中AKR1B10浓度
血清样本的检测：本实施例将实施例9制备的检测AKR1B10蛋白的化学发光检测试剂装到亚辉龙iFlash 3000的试剂窗，将血清样本和标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL和32ng/mL)放到仪器样本架上；在仪器检测程序上增加AKR1B10检测项目，启动检测程序，获得样本和标准品的检测值；根据标准曲线，计算出血清样本中AKR1B10的浓度，得到血清AKR1B10浓度。
检测结果分析：
选取50例健康人、50例乳腺癌患者、30例肺癌患者和30例原发性肝癌患者进行血清样本检测，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。
化学发光检测试剂盒检测的检测结果如图7、图8和图9所示。图7为正常人群和乳腺癌患者血清中AKR1B10浓度，图8为正常人群和肺癌患者血清中AKR1B10浓度，图9为正常人群和肝癌患者血清中AKR1B10浓度。
t检验结果显示，乳腺癌、肺癌和肝癌患者的平均KR1B10抗原水平要显著高于正常健康人(p<0.001)。健康人血清AKR1B10抗原的浓度平均为150pg/mL，乳腺癌患者血清AKR1B10的浓度为812pg/mL，肺癌患者血清AKR1B10的浓度为1102pg/mL，肝癌患者血清AKR1B10的浓度为1102pg/mL。
综上，本发明开发出一种新的针对AKR1B10蛋白的特异性单克隆抗体，本发明所述单克隆抗体的特异性好，与AKR1B10蛋白具有较高的亲和力，与其他无关蛋白无交叉反应。AKR1B10蛋白作为一种肿瘤血清标记物，具有很强的肝癌、肺癌及乳腺癌特异性，本发明所述抗AKR1B10蛋白单克隆抗体与AKR1B10蛋白具有较高的结合活性，基于此本发明开发了一系列用于检测血清中AKR1B10蛋白的实验方法和化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒可以广泛应用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为8D7A9E2和8D7A9H4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为CCTCCNO：C202141和CCTCC NO：C202142，保藏日期为2021年01月28日。
2.一种抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括：培养权利要求1所述的产生抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进行分离纯化，获得所述抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
4.权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体在制备用于人肝功能、人肝脏疾病及癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述人肝脏疾病包括肝炎、脂肪肝、肝纤维化或肝硬化；
优选地，所述癌症包括肝癌、肺癌或乳腺癌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含特异性检测样本中AKR1B10蛋白水平的试剂；
优选地，所述试剂盒还包含AKR1B10蛋白标准品；
优选地，所述试剂盒检测的样本包括血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、乳汁、肠液、大便、唾液、阴道分泌物或组织样本中任意一种或至少两种的组合。
7.一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的酶联免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包含权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体为含有HRP标记的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体；
优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的时间分辨免疫荧光分析试剂盒，其特征在于，所述时间分辨免疫荧光分析试剂盒包含权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体为含有生物素标记的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体；
优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的时间分辨荧光免疫测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、洗脱液或Streptavidin-Eu中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光检测试剂盒包含权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体为含有化学发光标记物的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、碱性磷酸酶或鲁米诺中任意一种；
优选地，所述化学发光检测试剂盒还包含包被有特异性捕获抗体的法学发光磁微粒、样品稀释液、洗脱液或发光底物中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种检测人醛酮还原酶1B10蛋白的免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述免疫比浊检测试剂盒包含权利要求2所述的抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体。
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