CN116120589A - 羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种羧基化的聚酰胺胺‑无定形磷酸钙胶束及其制备方法、用途，制备方法包括以下步骤：S1.将聚乙二醇溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，得胶束前体溶液；S2.在胶束前体溶液中加入聚山梨酯，搅拌后振荡分散胶束，得胶束溶液；S3.胶束溶液离心，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺‑无定形磷酸钙胶束。并公开了羧基化的聚酰胺胺‑无定形磷酸钙胶束在诱导胶原纤维仿生矿化方面的应用。采用本发明的羧基化的聚酰胺胺‑无定形磷酸钙胶束有助于钙、磷诱导胶原纤维内部矿化。
Description
技术领域
本发明涉及胶原原纤维仿生矿化技术领域，尤其是羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束及其制备方法、用途。
背景技术
从原子和分子尺度开始构建仿生矿化材料，是生物矿化策略的关键特征之一。该技术导致形成纳米结构的构建块，进而组织成复杂的层次结构，这意味着生物大分子的组装和发展中的矿物之间的相互作用构成了任何生物矿化过程的基石。大分子在生物矿化中发挥着许多重要功能过程，包括对形成的矿物相、矿物颗粒的形状及其组织的控制。
根据体外研究，无定形磷酸钙(ACP)通常是在中性pH值和轻度过饱和条件下形成的第一个沉积物，其转变为热力学上更稳定的羟基磷灰石。ACP被证明作为碳酸羟基磷灰石前体相，并在与软骨骨化相关的囊泡中被发现。意味着使用瞬态亚稳态矿物相是许多生物矿化过程的关键策略。近年来，许多体外矿化研究都集中在添加一些仿生DMP1的有机或无机添加剂来稳定ACP的尺寸，通过有效阻断ACP在水溶液中向磷灰石的转化从而使其合成有潜力的仿生矿化材料。然而，在体内牙本质形成过程中，形成的生物矿物质是通过精确的细胞介导机制合成的，即胶原纤维的矿化由成牙本质细胞和成骨细胞所分泌的胶原纤维和基质小泡所介导，通常含有磷脂双分子层，钙磷矿物以及介导钙磷离子沉积的酶等。
据介绍，聚酰胺胺（PAMAM)是一种具有树枝状结构、内部空腔、末端有大量反应基团的高分子聚合物，可以进入胶原原纤维并与特定位点结合，具有稳定和减缓转化的能力。因此在之前的研究报告成功合成了PAMAM-COOH/ACP纳米复合体，且验证其具有诱导人脱矿牙本质胶原纤维内矿化的能力。然而，该PAMAM-COOH/ACP纳米复合体容易团聚，且在经过一年避光干燥保存后，呈现出结晶增大的形态，无法进入胶原纤维，因此，对纳米复合体进行进一步研究，使其更贴近生物形成内矿化的机理，是十分有必要的。
发明内容
本发明提供了一种羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束及其制备方法、用途，将羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙封装形成胶束，有助于钙、磷诱导胶原纤维矿化且长期维持磷酸钙的无定形状态利于应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束，由聚乙二醇和聚山梨酯构建的胶束来封装羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒制成。
本发明还提供了羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束的制备方法，包括以下步骤：
S1.将聚乙二醇溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，浓度为28~32mg/mL，反应40-90min，得胶束前体溶液；
S2.在胶束前体溶液中加入聚山梨酯，聚山梨酯和胶束前体溶液的比例为2.0~2.3g:10mL，搅拌2.5~5h，然后振荡分散胶束，得胶束溶液；
S3.胶束溶液离心，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束。
优选的，含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液的制备方法包括以下步骤：
（1）将可溶性钙盐和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于水中，搅拌至完全溶解，制备得含羧基化的聚酰胺-胺的钙溶液，并调节pH至5.9~6.1，作为制备复合体的钙液；
（2）将可溶性磷酸盐溶于水中，制备得磷酸盐溶液，作为制备复合体的磷液；
（3）将钙液和磷液混合，钙离子和磷酸根离子的摩尔比为2~1:1，搅拌反应20-60min，反应完成后即得含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液。
更优选的，所述可溶性钙盐为氯化钙；所述可溶性磷酸盐为磷酸氢二钠。
更优选的，所述步骤（3）中，钙液和磷液的体积比为1:1，钙离子和磷酸根离子的摩尔比为4~5:3。
更优选的，所述步骤（1）中，羧基化的聚酰胺-胺与钙离子的摩尔比为13~20:1。
更优选的，所述钙液中钙离子的浓度为10mM，所述磷液中磷酸根离子的浓度为6mM。
优选的，所述聚乙二醇为PEG-6000，所述聚山梨酯为聚山梨酯80。
优选的，步骤S2中，振荡为超声波振荡；步骤S3中，离心在4℃下进行。
本发明还提供了以上所述的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束或以上所述的制备方法制备获得的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束在诱导胶原纤维仿生矿化方面的应用。
以上所述的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束及其制备方法，采用聚乙二醇和聚山梨酯构建的胶束来封装羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒，本发明具有以下优点：
（1）采用聚乙二醇和聚山梨酯构建的胶束来封装羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒，形成的PAMAM-COOH/ACP胶束分散性好，有利于提高诱导人脱矿牙本质胶原纤维内矿化的能力。
（2）本发明的PAMAM-COOH/ACP胶束在一年后仍保持无定形磷酸钙形态，从而更加有助于长期保存及将来的临床应用，且经过验证后，该胶束通过异丙醇诱导纳米颗粒释放后，可以成功诱导牛跟腱I型胶原纤维及人脱矿牙本质胶原纤维矿化，为仿生矿化胶原纤维问题的解决提供新的思路和实验依据，也为修复牙体组织乃至骨组织提供理论支持和解决途径。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为原理示意图；
图2为ACP 颗粒的TEM、SAED透射电镜图：A为加PAMAM-COOH时，ACP 搅拌1min为散在钙磷团簇，B为加PAMAM-COOH时，其将ACP包裹成约25nm的无定形纳米球粒，C为未加PAMAM-COOH时，ACP 搅拌1min为晶体，D未加PAMAM-COOH时，ACP搅拌30min为晶体；
图3为实施例1、实施例4和对比例3步骤（3）制备中，搅拌不同时间制得的PAMAM-COOH/ACPTEM透射电镜图，A、B、C、D分别是标尺为200nm下的1min、30min、60min、120min透射电镜图；E、F、G、H分别是标尺为100nm下的1min、30min、60min、120min透射电镜图；
图4为图3测得的粒径对比图，平均粒径分别为3.15nm，25.15nm，133.3nm，434.4nm。
图5为实施例1制得的PAMAM-COOH/ACP（实施例1中步骤（1）、（2）、（3）合成的含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液经固液分离、洗涤、冷冻干燥后制得的）傅里叶红外检测图；
图6为实施例1制得的PAMAM-COOH/ACP胶束的透射电镜与能谱分析结果；A、B分别是标尺为200nm、100nm下的透射电镜图，C、D分别是Ca、P元素的能谱分析图；
图7为PAMAM-COOH/ACP胶束包封与释放情况；其中A图显示实施例1制得的PAMAM-COOH/ACP胶束成功包封后粒径平均为300nm左右；B图对比去离子水胶束（对比例1），PAMAM-COOH/ACP胶束呈现出磷酸根的特征峰；C图显示了钙磷的包封率分别为40%及22%，D图显示添加浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6g/mL的异丙醇时，释放的纳米颗粒电位分别为-2.38、-3.89、-1.355、-0.762；
图8为各合成纳米材料的稳定情况（TEM透射电镜图），A为标尺100nm下对比例2的PAMMA-COOH/ACP纳米复合体的形态为无定形纳米颗粒，B为标尺为500nm下避光干燥保存一年后，呈现出结晶团聚的状态。C是标尺100nm下实施例1合成的PAMAM-COOH/ACP（实施例1中步骤（1）、（2）、（3）合成的含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒），D是标尺为500nm下为避光干燥保存一年后仍保持无定形纳米颗粒形态，E为标尺100nm下实施例1合成的PAMAM-COOH/ACP 胶束，F为标尺为500nm下避光干燥保存一年后仍保持包封良好形态，G为标尺100nm下对比例1的去离子水胶束呈现空泡形态，无纳米颗粒包裹其中，H为标尺为500nm下避光干燥保存一年后仍显示无颗粒包裹的空泡；
图9为实施例1的PAMAM-COOH/ACP 胶束和ACP颗粒诱导胶原纤维矿化的TEM及能谱图，A为ACP 颗粒无法进入胶原纤维内诱导矿化的TEM图，B、C图为ACP颗粒无法进入胶原纤维内诱导矿化的P、Ca元素的能谱分析图，D为PAMAM-COOH/ACP 胶束经浓度为0.2g/mL异丙醇调控后可进入胶原纤维内诱导矿化的TEM图，E、F图为PAMAM-COOH/ACP 胶束经浓度为0.2g/mL的异丙醇调控后可进入胶原纤维内诱导矿化的P、Ca元素的能谱分析图；图10为PAMAM-COOH/ACP 胶束经浓度为0.2g/mL的的异丙醇调控后诱导完全脱矿人牙本质胶原纤维矿化的SEM图,A-C是标尺为10um下的正常牙本质、完全脱矿的牙本质、经过异丙醇0.2mg/mL调控后胶束矿化完全脱矿牙本质14d后的扫描电镜图，D-F是标尺为2um下的正常牙本质、完全脱矿的牙本质、经过异丙醇0.2mg/mL调控后胶束矿化完全脱矿牙本质14d后的扫描电镜图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例1
羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束的制备方法包括以下步骤：
S1.将PEG-6000溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，浓度为30mg/mL，反应60min，得胶束前体溶液；
S2.在胶束前体溶液中缓慢加入聚山梨酯80，聚山梨酯80和胶束前体溶液的比例为2.5g:12mL，在25℃下搅拌3h，然后在25℃下超声波振荡20min分散胶束，得胶束溶液；
S3.胶束溶液在4℃以下离心1h，转速为100000rcf，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束。
其中：含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液的制备方法为：
（1）将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水，将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水搅拌至完全溶解，制备得含羧基化的聚酰胺-胺的氯化钙溶液，氯化钙的浓度为10mM，羧基化的聚酰胺-胺的浓度为0.625mM，并用NaOH调节pH至6.0，作为制备复合体的钙液；
（2）将磷酸氢二钠溶于去离子水，制备得6mM的磷酸氢二钠溶液，作为制备复合体的磷液；
（3）将钙液和磷液按体积比1:1混合，磁力搅拌器搅拌室温下反应30分钟，将反应液离心1.5h（100000rcf，4℃），去除上清液中的游离离子，得含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液。
实施例2
羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束的制备方法包括以下步骤：
S1.将PEG-6000溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，浓度为28mg/mL，反应50min，得胶束前体溶液；
S2.在胶束前体溶液中缓慢加入聚山梨酯80，聚山梨酯80和胶束前体溶液的比例为2.3g:10mL，在25℃下搅拌3h，然后在25℃下超声波振荡20min分散胶束，得胶束溶液；
S3.胶束溶液在4℃以下离心1h，转速为100000rcf，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束。
其中：含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液的制备方法为：
（1）将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水，将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水搅拌至完全溶解，制备得含羧基化的聚酰胺-胺的氯化钙溶液，氯化钙的浓度为10mM，羧基化的聚酰胺-胺的浓度与钙离子的浓度的摩尔比为13:1，并用NaOH调节pH至5.9，作为制备复合体的钙液；
（2）将磷酸氢二钠溶于去离子水，制备得7mM的磷酸氢二钠溶液，作为磷液；
（3）将钙液和磷液按体积比1:1混合，磁力搅拌器搅拌室温下反应20分钟，将反应液离心5分钟（10000rcf，4℃），去除上清液中的游离离子，得含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液。
实施例3
羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束的制备方法包括以下步骤：
S1.将PEG-6000溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，浓度为32mg/mL，反应90min，得胶束前体溶液；
S2.在胶束前体溶液中缓慢加入聚山梨酯80，聚山梨酯80和胶束前体溶液的比例为2g:10mL，在25℃下搅拌5h，然后在25℃下超声波振荡25min分散胶束，得胶束溶液；
S3.胶束溶液在4℃以下离心1.1h，转速为100000rcf，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束。
其中：含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液的制备方法为：
（1）将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水，将氯化钙和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于去离子水搅拌至完全溶解，制备得含羧基化的聚酰胺-胺的氯化钙溶液，氯化钙的浓度为10mM，羧基化的聚酰胺-胺的浓度与钙离子的浓度的摩尔比为18:1，并用NaOH调节pH至6.1，作为制备复合体的钙液；
（2）将磷酸氢二钠溶于去离子水，制备得5mM的磷酸氢二钠溶液，作为制备纳米颗粒的磷液；
（3）将钙液和磷液按体积比1:1混合，磁力搅拌器搅拌室温下反应35分钟，将反应液离心5分钟（10000rpm，4℃），去除上清液中的游离离子，得含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液。
实施例4
实施例4与实施例1基本相同，但步骤（3）中搅拌反应的时间为60min。
对比例1：去离子水胶束
将去离子水与PEG-6000和聚山梨酯80混合，PEG-6000在水中的浓度为30mg/ml，然后加入聚山梨酯80，聚山梨酯80和PEG-6000溶液的比例为2.5g:12mL， 25℃下搅拌3h，然后在25℃下超声波振荡20min分散胶束，得胶束溶液；胶束溶液在4℃以下离心1h，转速为100000rcf，获得去离子水胶束。
如图8所示，I为去离子胶束呈现内部中空的形态，无纳米颗粒包裹其中，J为去离子水在避光干燥保存一年后仍显示无颗粒包裹的空泡，而本发明制备的胶束如C、D所示，在一年前后均呈现良好的包裹性能，且维持无定形形态。
对比例2：CN 112999094A中实施例1的诱导胶原纤维仿生内矿化的纳米复合体材料。
对比例3
对比例3与实施例1基本相同，但步骤（3）中搅拌反应的时间为1min、120min。
进入胶原纤维内诱导矿化模拟试验：
（1）由异丙醇介导钙离子和磷酸根离子的释放：
将浓度为0.2g/mL的异丙醇分别添加到10mLpH6.5的实施例1制得的PAMAM-COOH/ACP胶束（异丙醇：胶束为0.2g/mL）中，破坏胶束的结构，释放出PAMAM-COOH/ACP纳米颗粒作为矿化介质；然后，将混合溶液涡旋混合10min，在4℃下超速离心1小时。（添加0.1、0.4、0.6g/mL的异丙醇参照上述步骤。）
（2）自组装胶原蛋白的制备：
将牛跟腱 I 型胶原蛋白（中国生工生物工程有限公司）溶于 0.02 M 盐酸（中国生工生物工程有限公司），搅拌过夜，制备胶原蛋白/乙酸 (5 mg/ml) 原液，加入 2 uL/mL酚红（中国生工生物工程有限公司）作为指示剂，取65ul原液滴于培养皿中，放置 400 目透射电子显微镜镍网（中国中镜科仪有限公司）于液滴上，然后用氨蒸气中和胶原溶液，通过pH 指示剂的颜色变化指示，胶原溶液被中和后在37°C 下孵育 24 小时而凝胶化。然后用0.03 M 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)/0.06 M N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)溶液 (中国源叶工程有限公司) 交联4 小时制得胶原蛋白涂层网格，然后用去离子水对网格清洗3 次，并在空气晾干以备接下来的矿化实验。
（3）异丙醇 (IPA) 介导的 PAMAM-COOH/ACP 胶束对胶原纤维的纤维内矿化：
胶原蛋白涂层网格在 100% 湿度的室内倒置于200ul 矿化培养基，并在 3 天内每 24 小时更换一次新鲜的矿化培养基。随后用去离子水清洗网格 3 次并在空气中干燥。通过 TEM 和 Element Mapping 对胶原纤维的再矿化和胶原纤维内部形成的矿物质的晶体特性进行了观察和分析，即如图9所示。
按上述（1）、（2）和（3）的步骤，将实施例1制得的PAMAM-COOH/ACP胶束替换为ACP颗粒（图2中未用PAMAM-COOH矿化的ACP），做对比试验。
本材料在基于生物基质小泡体内诱导内矿化的机制的基础上，创新地通过模拟生物体内矿化机制，构建非离子型囊泡模型，再现出生物体牙本质内ACP矿化转变至HAP的生理过程，利用异丙醇模拟体内磷脂裂解酶调控模型内部钙磷物质释放出矿物纳米颗粒从而内矿化胶原纤维。是为更贴近生物机理的可控的矿化的胶原支架材料，为人工合成新材料提供理论依据和设计思路，为仿生矿化胶原纤维问题的解决提供新的思路和实验依据，也为修复牙体组织乃至骨组织提供理论支持和解决途径。
试验结果分析：
如图2所示，通过 TEM、SAED透射电镜图可见A为加PAMAM-COOH时，ACP 搅拌1min为散在钙磷团簇， B为加PAMAM-COOH时，其将ACP包裹成约25nm的无定形纳米球形颗粒，C为未加PAMAM-COOH时，ACP 搅拌1min为晶体，D未加PAMAM-COOH时，ACP搅拌30min为晶体。如图3和图4所示，为实施例1和对比例3步骤（3）制备中，搅拌不同时间制得的PAMAM-COOH/ACP的TEM透射电镜图，A、B、C、D分别是标尺为200nm下的1min、30min、60min、120min透射电镜图；E、F、G、H分别是标尺为100nm下的1min、30min、60min、120min透射电镜图；平均粒径分别为3.15nm，25.15nm，133.3nm，434.4nm，搅拌30min和60min，PAMAM-COOH/ACP 纳米颗粒的形态是均匀的球形；如图5所示，由傅里叶红外图可见，在波长为1650cm-1附近，可见羰基（-C=O）结构特征峰和在波长为1560cm-1附近，可见酰胺键（-NH-CO-）结构特征峰，提示PAMAM-COOH的存在；在波长为1040cm-1附近可见ACP特有的磷酸基团（PO4 3-）特征峰，提示ACP的存在；上述结果证明了 PAMAM-COOH/ACP 纳米粒子是 PAMAM-COOH 和 ACP 的组合。PAMAM-COOH/ACP 纳米粒子的 TEM 图像结构清晰，分布均匀，呈圆形，这些粒子由较小尺寸的 CaP 预成核簇聚集在一起，包覆有 PAMAM- COOH 以较高的放大倍数显示，符合矿化前体的基本特征，如图3C和3G所示，每个 PAMAM-COOH/ACP 纳米颗粒包含更小的颗粒，结果证实 PAMAM-COOH/ACP 纳米颗粒处于无定形相。
如图6，PAMAM-COOH/ACP胶束的透射电镜与能谱分析结果可见，ACP成功包封于胶束内部。如图7可见，PAMAM-COOH/ACP胶束包封与释放情况；其中A图显示了PAMAM-COOH/ACP胶束成功包封后粒径平均为300nm左右；B图对比去离子水胶束，PAMAM-COOH/ACP胶束呈现出磷酸根的特征峰，进一步证明了磷酸钙的存在；C图显示了钙、磷的包封率分别为40%及22%，表明两种矿物的包封率都较高。D图显示添加浓度0.1、0.2、0.4、0.6g/mL的异丙醇时，释放的纳米颗粒电位分别为-2.38、-3.89、-1.355、-0.762，PAMAM-COOH/ACP 胶束的近中性zeta 电位可能是由于聚山梨酯 80 的涂层，已知其在各种 pH 值下呈电中性。Zeta 电位结果表明，沉淀释放体系中离子的电位先升高后降低，随着 IPA 浓度的逐渐升高，在异丙醇浓度0.2g/mL时达到最低，约为-3.8，表明存在胶束被破坏得最彻底。
图8为各合成纳米材料的稳定情况，A为对比例2的PAMMA-COOH/ACP纳米复合体的形态为无定形纳米颗粒，呈现为较大的团聚形态，B为避光干燥保存一年后，原PAMAM-COOH/ACP纳米复合体呈现出结晶团聚的状态，形成HAP，尺寸增大，无法进入胶原纤维，C是实施例1合成的PAMAM-COOH/ACP（实施例1中步骤（1）、（2）、（3）合成的含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液），D是为避光干燥保存一年后仍保持无定形纳米颗粒形态，E为PAMAM-COOH/ACP胶束，F为避光干燥保存一年后仍保持包封良好形态，可以观察到 PAMAM-COOH/ACP 胶束在 PAMAMCOOH/ACP 纳米颗粒周围有清晰的均匀涂层，分散性好，且维持无定形形态；G为对比例1的去离子水胶束呈现空泡形态，无颗粒包裹其中，H为避光干燥保存一年后仍显示无颗粒包裹的空泡。 图9为PAMAM-COOH/ACP 胶束诱导胶原纤维矿化的TEM及能谱图，A、B、C图为ACP 颗粒无法进入胶原纤维内诱导矿化，E、D、F图为PAMAM-COOH/ACP 胶束经浓度0.2g/mL的异丙醇调控后可进入胶原纤维内诱导矿化。利用 PAMAM-COOH/ACP 胶束释放的游离纳米粒子诱导自组装胶原蛋白模拟体内骨组织矿化过程，当矿化3 天时，拍摄的 TEM 图像表明原纤维的周期性变得完全模糊，无定形纳米颗粒失去了形状，由矿化胶原的 Element Mapping 表征， Ca、 P 和 N 的空间分布重叠且分布一致，表明磷灰石均匀沉积在整个胶原原纤维中。图10为PAMAM-COOH/ACP 胶束经浓度0.2g/mL的异丙醇调控后诱导完全脱矿人牙本质胶原纤维矿化的SEM图。当矿化14天后，经过异丙醇0.2g/mL调控后胶束矿化完全脱矿牙本质对比完全脱矿的牙本质，在牙本质表面生成了近似正常牙本质的矿物质。结合上述分析，本发明的PAMAM-COOH/ACP胶束不仅分散性更好，并仍可在一年后仍保持无定形磷酸钙形态，从而更加有助于长期保存及将来的临床应用，且经过验证后，该胶束通过异丙醇诱导纳米颗粒释放后，可以成功诱导牛跟腱I型胶原纤维及人脱矿牙本质胶原纤维矿化，为仿生矿化胶原纤维问题的解决提供新的思路和实验依据，也为修复牙体组织乃至骨组织提供理论支持和解决途径。
Claims (10)
1.羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束，其特征在于，
由聚乙二醇和聚山梨酯构建的胶束来封装羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒制成。
2.权利要求1所述的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.将聚乙二醇溶解在含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液中，浓度为28~32mg/mL，反应30-90min，得胶束前体溶液；
S2.在胶束前体溶液中加入聚山梨酯，聚山梨酯和胶束前体溶液的比例为2.0~2.3g:10mL，搅拌2.5~5h，然后振荡分散胶束，得胶束溶液；
S3.胶束溶液离心，除去含有游离钙和磷酸根离子的上清液，得羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液的制备方法包括以下步骤：
（1）将可溶性钙盐和羧基化的聚酰胺-胺依次溶于水中，搅拌至完全溶解，制备得含羧基化的聚酰胺-胺的钙溶液，并调节pH至5.9~6.1，作为制备复合体的钙液；
（2）将可溶性磷酸盐溶于水中，制备得磷酸盐溶液，作为制备复合体的磷液；
（3）将钙液和磷液混合，钙离子和磷酸根离子的摩尔比为2~1:1，搅拌反应20-60min，反应完成后即得含有羧基化的聚酰胺胺和无定形磷酸钙纳米颗粒的溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述可溶性钙盐为氯化钙；所述可溶性磷酸盐为磷酸氢二钠。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤（3）中，钙液和磷液的体积比为1:1，钙离子和磷酸根离子的摩尔比为4~5:3。
6.根据权利要求3所述的诱导胶原纤维仿生内矿化的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
所述步骤（1）中，羧基化的聚酰胺-胺与钙离子的摩尔比为13~20:1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述钙液中钙离子的浓度为10mM，所述磷液中磷酸根离子的浓度为6mM。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述聚乙二醇为PEG-6000，所述聚山梨酯为聚山梨酯80。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤S2中，振荡为超声波振荡；步骤S3中，离心在4℃下进行。
10.权利要求1所述的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束或权利要求2~9任一项所述的制备方法制备获得的羧基化的聚酰胺胺-无定形磷酸钙胶束在诱导胶原纤维仿生矿化方面的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 沈敏娟: "PEG/Polysorbate胶束负载无定形磷酸钙体外仿生模拟基质小泡诱导胶原纤维内外矿化", 《中国优秀硕士学位论文电子期刊网 医药卫生科技辑》, no. 2, 15 February 2020 (2020-02-15), pages 074 - 166 * |
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