CN113621144B - 磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法 - Google Patents

磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法，磁电响应仿生水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液孵育而成；可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液以及细胞孵育而成。该水凝胶具有外部磁场响应无线电刺激的能力，满足组织再生所需要的良好的生物相容性，能够有效地克服传统电刺激带来的问题，实现无线电刺激，且可模拟细胞外微环境，为受伤组织提供生长基质，可以达到促进组织再生的目的。

Description

磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水 凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料和生物医学工程技术领域，涉及组织工程学、固体物理学及仿生生物活性材料制备方法，尤其涉及用于骨组织和神经组织工程的磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法。
背景技术
电刺激作为一种物理刺激手段，在再生医学和组织工程中的应用得到了迅速的发展。近年来，利用电刺激促进损伤神经组织的再生分化的可行性已经得到了证实。适当的电刺激可以促进神经细胞的生长、增殖、和分化。然而，侵入性电刺激往往需要面临两个问题：(Ⅰ)电极/组织界面的接触问题；(Ⅱ)外源电刺激常常因为植入式电极的引入，而引发炎症和胶质增生等情况，这对于神经组织的再生是不利的。因此，找到一种新的方法实现非侵入性远程神经刺激并且克服外源电极造成的损害是至关重要的。
无线电刺激作为一种新兴的手段，既能克服传统电刺激的缺点，同时可以实现非侵入性的、无源的、无限的电刺激。目前无线电刺激的手段主要包括：①利用超声触发压电材料的压电效应，实现机械能转化为电能，从而实现电刺激；②通过磁场触发磁电材料的磁电效应，实现磁能转化为电能；③利用无线能量传输技术，制备小型化、无电池、微创的植入物实现电刺激。无线电刺激在生物医学中的应用显示出巨大的潜力，不仅可以激活神经组织，还可以刺激其它可电兴奋细胞(如心肌细胞、骨骼肌管、成骨细胞)。一般来说，对可兴奋细胞施加电刺激可以实现对组织功能的精细调节，并在许多治疗中发挥重要作用，如心律失常，慢性疼痛，帕金森氏病等疾病。
压电材料为实现无线电刺激提供了一种可能。压电材料能够通过机械转化输出电能，在不使用植入电极和外部电源的情况下，最有可能实现生物安全的电刺激应用。然而，压电效应需在机械运动刺激或者超声作用下触发，限制了在运动障碍患者或部位的应用，而基于超声波刺激产生的压电效应则由于超声波的组织穿透性差及可能产生的空化效应和热效应而对组织产生不良影响，其应用也受到限制。
由压电材料和磁响应材料组成的磁电材料，可通过温和的外磁场产生电刺激，可有效避免上述问题，这种磁电刺激平台受到越来越多研究人员的关注。典型的磁电刺激平台可通过在压电聚合物薄膜中加入磁性颗粒，获得磁刺激作用下的电输出。然而，简单的磁致伸缩相和压电相混合获得磁电材料，存在耦合面积小、共轭性弱、磁电转换效率低等问题。此外，所采用的基质材料生物相容性差，不具有生物活性，且其结构与力学性能与神经组织不匹配，限制了其在各种组织损伤修复中的应用。
综上所述，目前报道的电刺激手段由于存在着组织相容性差、力学性能不匹配、生物活性低等问题，限制了其在组织工程和再生领域的广泛应用。因此，亟需一种可以有效地模拟天然细胞外微环境，并且能够有效地实现无线电刺激的方式，满足细胞在材料中实现三维包裹的同时，对细胞施加有效地电刺激，实现对细胞行为的调控。
发明内容
针对传统电刺激存在着组织相容性差、力学性能不匹配配、生物活性低等技术问题，本发明的目的之一是提供一种磁电响应仿生水凝胶及其制备方法，该水凝胶具有外部磁场响应无线电刺激的能力，满足组织再生所需要的良好的生物相容性，能够有效地克服传统电刺激带来的问题，实现无线电刺激，且可模拟细胞外微环境，为受伤组织提供生长基质，可以达到促进组织再生的目的。
本发明的目的之二是提供一种可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法，该水凝胶通过向前述磁电响应仿生水凝胶中加入细胞，实现细胞三维原位封装，可通过远程磁场刺激产生电效应来无线刺激并调节细胞功能，包括增殖、分化及相应的功能化，具有良好的组织工程应用前景。
为达到上述目的，本发明首先提供一种磁电响应仿生水凝胶，该水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液孵育而成，所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒为表面修饰了BaTiO3壳层的Fe3O4纳米颗粒，所述水凝胶包含1～5％w/v的醛基化透明质酸、1～6％w/v的胶原以及0～2％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量不为0。
本发明提供的磁电响应仿生水凝胶，其基于生物仿生凝胶基质和磁电纳米材料的复合构建出具有外部磁场响应的仿生无线电刺激复合凝胶。该水凝胶采用胶原/透明质酸复合凝胶体系，具有与天然组织相近的组成及良好的生物相容性，其具有胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键以及胶原自组装所形成的双重交联网络，具有良好的生物活性及力学性能，能够有效地与组织适配，满足诱导组织再生的要求。同时，在外加磁场的作用下，Fe3O4@BaTiO3磁电纳米颗粒内部的Fe3O4纳米颗粒受磁场作用，能够产生磁致伸缩效应，以应力/应变的形式传导至壳层压电相BaTiO3，从而产生电信号，从而实现磁触发无线电刺激。
上述磁电响应仿生水凝胶，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量对凝胶内部电信号产生能力具有影响，但是Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒含量过多，纳米材料占据了大量的纤维网络，使得细胞的生存空间减少，细胞的粘附位点减少，从而不利于细胞增殖及分化。进一步地，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量优选为0.2～1％w/v。
本发明还提供了一种上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将醛基化透明质酸溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中形成浓度为2～10％w/v的醛基化透明质酸溶液；将冻干胶原溶解于乙酸中形成胶原溶液，并在-4～0℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，胶原溶液浓度为2～12mg/mL；将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：0.5～3的体积比例混合均匀，并添加并添加0～2％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒后形成反应混合物；将反应混合物于37℃下孵育15～45min后，即得磁电响应仿生水凝胶。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，构建具有外部磁场响应的磁电复合凝胶，首先，将醛基化的透明质酸溶解于磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中形成透明质酸溶液，之后利用乙酸将冻干胶原溶解形成胶原溶液，并在-4～0℃下，将胶原溶液的pH值调至7.5左右。之后，将透明质酸溶液与胶原溶液进行按比例混合均匀。之后将磁电纳米颗粒在透明质酸和胶原混合溶液中均匀分散形成前驱体溶液，置于37℃环境下，保持15～45min，通过胶原在37℃下自组装，以及胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键，此过程中前驱体溶液成胶，从而构建出具有双重交联网络的外部磁场响应的磁电复合仿生水凝胶。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，乙酸的浓度采用本领域常规浓度即可，在本发明的实施例中采用浓度为0.4M的乙酸。调节胶原溶液pH的碱采用本领域常规用碱即可，在本发明中优选浓度为5M的氢氧化钠溶液。进一步地，醛基化透明质酸溶液与胶原溶液优选等体积(即1：1)混合。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒为表面修饰了BaTiO3壳层的Fe3O4纳米颗粒。本发明中，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的制备思路是：首先通过典型的溶剂热法制备出Fe3O4纳米颗粒，再将制备好的Fe3O4纳米颗粒作为核体材料，通过原位反应的方式在其表面生成一层具有压电性的BaTiO3，从而实现磁电纳米颗粒的构建。具体是以钛酸四丁酯作为钛源制备出表面修饰了一层TiO2的Fe3O4纳米颗粒，即Fe3O4@TiO2纳米颗粒，再以氢氧化钡作为钡源，在碱性条件下，Fe3O4表面的TiO2作为Ti的前驱体，能够与Ba2+有效结合，进而原位生成钛酸钡壳层。
所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米颗粒
将六水氯化铁0.675～2.025g、柠檬酸钠0.2～0.4g和醋酸铵1.927～5.781g溶解在乙二醇中，在连续搅拌的条件下，于170℃下反应1～2h至反应溶液颜色变为均匀的黑色；将反应溶液转移到反应容器中，加热至200～250℃并保温10～18h，反应结束后待反应溶液冷却至室温，收集反应产物并洗涤，得到磁性Fe3O4纳米颗粒，将Fe3O4纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4悬浮液，备用；
(2)制备磁电纳米颗粒
(21)制备Fe3O4@TiO2纳米颗粒
将步骤(1)制得的浓度为5～10mg/mL的Fe3O4悬浮液5～10mL与乙醇80～90mL和乙腈10～50mL的混合溶剂均匀混合形成Fe3O4分散液，在搅拌条件下，向Fe3O4分散液中加入钛酸四丁酯0.5～2mL和氨水0.1～1mL并反应1.5～5h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，得到表面修饰了一层TiO2的Fe3O4纳米颗粒，即Fe3O4@TiO2纳米颗粒，将Fe3O4@TiO2纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4@TiO2悬浮液，备用；
(22)制备Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒
将氢氧化钡0.1575～0.63g溶解在去离子水中形成氢氧化钡溶液；将步骤(21)制得的Fe3O4@TiO2悬浮液加入到氢氧化钡溶液中，在搅拌条件下加入氨水1～10mL形成反应混合物，将反应混合物转移到反应容器中，将反应容器加热至180～240℃并保温6～8h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，即得Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，步骤(1)中，首先将六水氯化铁在乙二醇中溶解，之后加入柠檬酸钠，待溶解后，加入醋酸铵构建碱性反应环境，将反应溶液加热至一定温度条件下保温反应1～2h后，反应溶液变黑。此时，将反应溶液加入到反应容器(例如反应釜)中，在200～250℃条件下保温反应10～18h。在此期间，乙二醇和柠檬酸钠在200～250℃温度下能够显示出还原性，能够将Fe3+还原成Fe2+，并在碱性条件下生成具有良好分散性的四氧化三铁。乙二醇的用量可以根据常规用量确定，通常为将六水氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵充分溶解即可，本发明中使用的是70mL。反应最终产物黑色沉淀物可以使用钕磁铁进行收集。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，步骤(2)的目的是以Fe3O4(FO)纳米颗粒作为核，通过原位反应的方式在其表面生成一层具有压电性BaTiO3(BTO)，从而实现磁电纳米颗粒的构建。取步骤(1)制备的Fe3O4分散溶液，分散在乙醇和乙腈的混合溶液中，并加入适量氨水，氨水所含的水分可以有效地实现钛酸四丁酯的水解，使其在Fe3O4表面生成二氧化钛凝胶，获得均匀有效的包覆。制备的Fe3O4@TiO2(FO@TO)纳米颗粒，在氨水创造碱性条件下，Fe3O4表面的TiO2作为Ti的前驱体，能够与Ba2+有效结合，原位生成钛酸钡壳层。乙醇和乙腈的混合溶剂用于提供反应环境，所述乙醇与乙腈的体积比约为3:1。将Fe3O4悬浮液加入到混合溶剂中后进一步超声分散15～60min，以使Fe3O4分散均匀。本发明中，所得最终产物Fe3O4@TiO2分散在20mL乙醇中，形成Fe3O4@TiO2悬浮液，备用。
此外步骤(1)、步骤(21)和步骤(22)中所涉及到洗涤，其目的均是去除反应产物表面所残留的未反应的反应物和反应溶液，因此在达到去除表面残留物的目的基础上，均可以根据相应的产物采用本领域常规洗涤液体和方式进行洗涤即可，如乙醇、去离子水等。在本发明中，步骤(1)和步骤(21)中均可采用乙醇和水依次进行洗涤，步骤(22)中可分别用甲酸、水和乙醇依次进行洗涤。
上述磁电响应仿生水凝胶的制备方法，醛基化透明质酸为具有双醛基团的透明质酸衍生物，通过在透明质酸溶液中加入氧化剂氧化透明质酸，从而使透明质酸中的葡萄糖醛酸的部分环被打开引入双醛基团，氧化剂一般可以采用高锰酸钾、高碘酸钠、双氧水等，比例可以根据常规步骤设定。在本发明中，所述醛基化透明质酸的制备方法，优选包括以下步骤：将透明质酸钠1-4g溶解在去离子水中形成透明质酸钠溶液，向透明质酸钠溶液中滴加0.25～5mL的0.05～5M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌3～10h之后，添加1～5mL乙二醇再继续搅拌0.5～1.5h后使反应终止，将反应产物用水透析并冻干，得到醛基化透明质酸。NaIO4具有氧化性，作为氧化剂，其能够有效地使透明质酸中的葡萄糖醛酸的部分环被打开，从而引入了双醛基团，进而得到醛基化的透明质酸，并通过乙二醇控制反应的结束时间。透明质酸钠的分子量为10～200kDa；本发明中，将透明质酸钠1-4g溶解在去离子水100～400mL中形成透明质酸钠溶液。
本发明进一步提供了一种可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，该水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液以及细胞孵育而成，所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒为表面修饰了BaTiO3壳层的Fe3O4纳米颗粒，所述水凝胶包含1～5％w/v的醛基化透明质酸、1～6％w/v的胶原以及0～2％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量不为0，细胞密度为5×106～1×107个/mL。
上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，是在前述磁电响应仿生水凝胶的基础上原位装载细胞，从而外部磁场作用下实现对细胞的无线电刺激，这对于研究电刺激作用下细胞行为的调控提供了一种新的方式。其中装载的细胞可以为神经细胞、成骨细胞、成纤维细胞等等。该水凝胶能够有效实现细胞微环境的模拟及对细胞的无线电刺激，电刺激能够有效调控细胞行为，包括增殖、分化及相应的功能化，其显示出良好的组织工程应用前景。
上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量对凝胶内部电信号产生能力具有影响，但是Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒含量过多，纳米材料占据了大量的纤维网络，使得细胞的生存空间减少，细胞的粘附位点减少，从而不利于细胞增殖及分化。进一步地，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量优选为0.2～1％w/v。
本发明还提供了一种上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将醛基化透明质酸溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中形成浓度为2～10％w/v的醛基化透明质酸溶液；将冻干胶原溶解于乙酸中形成胶原溶液，并在-4～0℃条件下将胶原溶液pH调节至7～7.5，胶原溶液浓度为2～12mg/ml；将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：0.5～3的体积比例混合均匀，并添加不超过2％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒后形成反应混合物；将反应混合物与细胞混合均匀得到细胞装载的前驱体混合液，其中细胞密度为5×106～1×107个/mL，将前驱体混合液于37℃下孵育15～45min后，即得可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶。
上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，该方法针对组织再生的活性基质设计，建立了一个新型的材料平台——即前述磁电响应仿生水凝胶，通过远程磁场刺激产生电效应来无线刺激并调节细胞功能。通过前述磁电响应仿生水凝胶实现细胞三维原位封装，同时具有外部磁场响应无线电刺激的能力，满足组织再生所需要的良好的生物相容性，因此可以获得具有模拟细胞外微环境特性的无线外部磁场响应电刺激微环境，从而有效介导无线电刺激神经进而调节组织再生功能。
进一步地，本发明对于装载的细胞并没有特殊的限制，可以根据研究需要进行选择，如神经细胞、成骨细胞、成纤维细胞等均可。
上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，乙酸的浓度采用本领域常规浓度即可，在本发明的实施例中采用0.4M乙酸。调节胶原溶液pH的碱采用本领域常规用碱即可，在本发明中优选浓度为5M的氢氧化钠溶液。进一步地，醛基化透明质酸溶液与胶原溶液优选等体积(即1：1)混合。
上述可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的制备方法和醛基化透明质酸的制备方法与前面磁电响应仿生水凝胶的制备方法中给出的相同，这里不再详细描述。
需要说明的是，本发明中所涉及的浓度％w/v是指溶质质量与溶剂体积的比值，其中w的单位为mg，体积单位为mL，本发明中另一种表述方式即为mg/mL。
与现有的技术相比，本发明提供的技术方案具有以下有益效果：
1、本发明提供的磁电响应仿生水凝胶，利用Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒磁电材料作为无线电刺激的媒介，能够有效地避免传统电刺激存在的问题，为实现非侵入性、无线电刺激提供了巨大的可能。同时，对比单纯掺杂的方式构建磁电复合材料，本发明中采用Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，其为核壳结构的磁电纳米颗粒，能够增加界面耦合面积，增强应力传导效率，从而提高磁电效应系数。
2、本发明提供的磁电响应仿生水凝胶，采用胶原/透明质酸复合凝胶体系，具有与天然组织相近的组成及良好的生物相容性。同时，通过调节材料的比例能够有效地模拟体内各项组织的力学性质，达到力学匹配的效果。此体系具有胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键以及胶原自组装形成的双重交联网络，从而达到构建仿生组织的网络结构的目的。
3、本发明提供的磁电响应仿生水凝胶，通过将磁电纳米颗粒复合胶原/透明质酸凝胶，构建具有外部磁场响应的无线电刺激复合凝胶，能够有效地模拟天然生物组织，并且能够实现非侵入性、无线电刺激，这对于研究电刺激作用下细胞行为的调控提供了一种新的方式。且该材料具有良好的生物相容性、无毒、环保、制备工艺简单，具有广泛应用与组织工程中的可能性，为再生医学提供了一种新型的电刺激方式。
4、本发明提供的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，在前述磁电响应仿生水凝胶的基础上，通过向磁电响应仿生水凝胶中原位装载细胞，能够有效实现细胞微环境的模拟及对细胞的无线电刺激，电刺激能够有效调控细胞行为，包括增殖、分化及相应的功能化，具有良好的组织工程应用前景。
5、本发明提供的两种水凝胶的制备方法，其工艺步骤简单，反应过程温和，以具有双醛基团的醛基化透明质酸和胶原为交联剂，通过胶原的自组装以及胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键，实现溶液-胶体之间的转变，将Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒/细胞包裹于凝胶中，制备出具有双重交联网络的外部磁场响应的磁电复合仿生水凝胶，凝胶化时间短，易于工业化生产。
附图说明
图1为本发明磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备过程示意图，其中，图(a)为Fe3O4@BaTiO3(FO@BTO)纳米颗粒制备过程示意图，图(b)为磁电响应仿生水凝胶的制备过程示意图，图(c)为可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备过程示意图。
图2为实施例1制备的Fe3O4(FO)、Fe3O4@TiO2(FO@TO)、Fe3O4@BaTiO3(FO@BTO)纳米颗粒的结构性能表征示意图，其中，图(a)为样品扫描电镜图谱，图(b)为样品透射电镜图谱，图(c)为样品表面元素分布图，图(d)为样品X-射线衍射图谱。
图3为实施例1制备的Fe3O4(FO)、Fe3O4@TiO2(FO@TO)、Fe3O4@BaTiO3(FO@BTO)纳米颗粒的磁电性能表征示意图，其中，图(a)为样品磁性能表征，图(b)为样品磁电性能表征示意图，图(c)-(e)为通过压电力显微镜得到的样品形貌、振幅和相位图，图(f)-(g)为样品相位和振幅曲线。
图4为对比例1制备的透明质酸/胶原水凝胶及实施例1、实施例2和实施例3制备的磁电响应仿生水凝胶的结构及力学表征，其中，图(a)为醛基化透明质酸(AHA)及未被处理的透明质酸(HA)的核磁图谱，图(b)为样品扫描电镜图谱，图(c)为样品压缩模量图谱，图(d)为样品应力松弛图谱，图(e)为样品降解曲线图谱，其中AC0表示水凝胶中FO@BTO浓度为0mg/mL，AC0.2表示水凝胶中FO@BTO浓度为0.2mg/mL，AC0.5表示水凝胶中FO@BTO浓度为0.5mg/mL，AC1表示水凝胶中FO@BTO浓度为1mg/mL。
图5为对比例2制备的装载有细胞的透明质酸/胶原水凝胶以及实施例6、实施例7和实施例8制备的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶分别在培养1、4、7天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱，AC0，AC0.2，AC0.5和AC1表示的含义同上。
图6为实施例7制备的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶分别在有无磁场刺激情况下培养1、4、7天后的F-actin/DAPI染色及培养14天后神经相关蛋白Tubulin-β3，NF和PSD95染色激光共聚焦图谱，图(a)为F-actin/DAPI染色激光共聚焦图谱，图(b)为根据1天、4天和7天的染色结果统计的细胞长度箱线图，图(c)为Tubulin-β3、NF和PSD95染色激光共聚焦图谱，图(d)为根据14天的染色结果统计的荧光强度热图，AC0.5表达含义同上，AC0.5MS表示AC0.5凝胶受到外部磁场作用。
图7为实施例7制备的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶分别在有无磁场刺激情况下培养7天后的L-VGCC/DAPI染色，AC0.5，AC0.5MS表达含义同上。
具体实施方式
以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
本发明所提供的磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，其制备工艺过程如图1所示。
其中，磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶中所含有的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，其制备过程如图(a)所示。首先通过溶剂热反应制备Fe3O4纳米颗粒(FO NPs)，在高温的条件下，乙二醇和柠檬酸钠的还原性能够有效地将六水氯化铁转化为四氧化三铁。然后，采用溶胶凝胶法，在乙醇-氨水-乙腈混合物中，钛酸四丁酯的水解和缩合反应致使FO NPs表面上沉积一层致密的TiO2(TO)。最后，在碱性溶液中，通过水热法，TO相与Ba2+原位反应转化为颗粒状的BaTiO3(BTO)相，从而获得了具有核/壳结构的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒(FO@BTO NPs)。
磁电响应仿生水凝胶其制备过程如图(b)所示。首先将Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒在透明质酸和胶原混合溶液中均匀分散，再通过胶原自组装，以及胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键，将Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒包裹于亚胺键及胶原自组装形成的双重交联网络中，即构建出具有双重交联网络的外部磁场响应的磁电响应仿生水凝胶。
可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶其制备过程如图(c)所示。首先将Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒在透明质酸和胶原混合溶液中均匀分散，再加入细胞混合均匀得到细胞装载的水凝胶前驱体混合液，再通过胶原自组装，以及胶原分子中的氨基与透明质酸分子上的醛基进行酰胺化反应形成亚胺键，将Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒和细胞包裹于亚胺键及胶原自组装形成的双重交联网络中，即构建出具有双重交联网络的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶。
以下实施例中，确定的磁电纳米颗粒浓度具体方法如下：先取1mL洗涤所得磁电纳米颗粒溶液，然后通过常规冻干手段对1mL洗涤所得物质进行冻干处理，得到干燥的磁电纳米颗粒，对其称重即可得到磁电纳米颗粒的重量，进而得到洗涤所得物质中磁电纳米颗粒的浓度。
以下实施例中，施加磁场刺激的方式为：磁场发生器由直径为20cm的亥姆赫兹线圈及脉冲电流发生器组成。将亥姆赫兹线圈通入合适的电流参数后，产生强度13mT的脉冲磁场(60Hz，占空比50％)。将包含细胞的复合凝胶的培养皿置于亥姆赫兹线圈中央空腔，每天施加0.5h刺激。
以下实施例中使用的氨水质量浓度为25％。
实施例1-5
实施例1-5提供的磁电响应仿生水凝胶，其具体步骤如下：
(1)制备磁性纳米颗粒
将六水氯化铁1.350g，柠檬酸钠0.4g和醋酸铵3.854g溶解在乙二醇70mL中，在连续搅拌的条件下，于170℃下反应1h直到反应溶液颜色变为均匀的黑色，然后将反应溶液转移到100mL的聚四氟乙烯高压反应釜中，将高压釜加热至200℃并保持12h，反应结束后待反应溶液冷却至室温后，用钕磁铁收集黑色沉淀物并分别用水和乙醇洗涤3次，得到磁性Fe3O4纳米颗粒，然后将Fe3O4纳米颗粒分散在乙醇20mL中形成10mg/mL的Fe3O4悬浮液，备用。
(2)制备磁电纳米颗粒
(21)制备Fe3O4@TiO2纳米颗粒
将步骤(1)制备的Fe3O4悬浮液5～10mL与乙醇85mL和乙腈30mL混合，超声分散15分钟，然后，在剧烈的机械搅拌下，加入钛酸四丁酯1mL和氨水0.1～1mL，反应1.5～5h后，用磁体收集反应产物并分别用乙醇和水洗涤3次。得到表面修饰了一层TiO2的Fe3O4纳米颗粒，即Fe3O4@TiO2纳米颗粒，最后，将Fe3O4@TiO2纳米颗粒分散在乙醇20mL中形成Fe3O4@TiO2悬浮液，备用。
(22)制备Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒
将氢氧化钡0.315g添加到去离子水20mL中形成氢氧化钡溶液，将Fe3O4@TiO2悬浮液20mL置于超声波中15分钟，之后加入氢氧化钡溶液，在剧烈的机械搅拌下，加入氨水1～10mL形成反应混合物。然后，将反应混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜100mL中。将高压釜加热至180～240℃并保持6～8h。反应结束后，用磁体收集反应产物并分别用1％甲酸、水和乙醇各洗涤3次，即得Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒。
(3)制备醛基化透明质酸
将分子量为10～200kDa的透明质酸钠1g溶解在去离子水100mL中形成透明质酸钠溶液，然后，向形成透明质酸钠溶液中滴加3ml的0.05M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌3～10h，之后，通过添加1mL乙二醇终止反应，剧烈搅拌0.5～1.5h后，将反应产物透析并冻干，得到醛基化透明质酸(AHA)。
(4)构建磁电复合水凝胶
按照2～10％w/v的浓度将AHA溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中形成醛基化透明质酸溶液。然后，将冻干的胶原(Col)溶解于0.4M乙酸中形成胶原溶液，并在-4℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，最终胶原溶液浓度为2～12mg/ml。将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：1的体积比例混合，并添加Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒形成反应混合物，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒在反应混合物中的浓度为0.2～1mg/mL。之后，将反应混合物注入圆柱形聚苯乙烯模具
Figure BDA0003225685970000101
中，在37℃下孵育30分钟，即得磁电响应仿生水凝胶，制备的水凝胶包含1～5％w/v的AHA、1～6％w/v的胶原和0.2～1％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒。
表1给出了实施例1-5磁电响应仿生水凝胶制备方法中部分原料或中间产物用量和工艺参数。
表1实施例1～-5磁电响应仿生水凝胶制备方法中部分原料或中间产物用量和工艺参数
Figure BDA0003225685970000111
对比例1
该对比例制备透明质酸/胶原复合水凝胶，包括以下步骤：
(i)制备醛基化透明质酸
将分子量为70kDa的透明质酸钠1g溶解在去离子水100mL中形成透明质酸钠溶液，然后，向形成透明质酸钠溶液中滴加3ml的0.05M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌6h，之后，通过添加1mL乙二醇终止反应，剧烈搅拌0.5h后，将反应产物透析并冻干，得到醛基化透明质酸(AHA)。
(ii)构建透明质酸/胶原复合水凝胶
按照4％w/v的浓度将AHA溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中形成醛基化透明质酸溶液。然后，将冻干的胶原(Col)溶解于0.4M乙酸中形成胶原溶液，并在-4℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，最终胶原溶液浓度为6mg/ml。将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：1的体积比例混合形成反应混合物，之后，将反应混合物注入圆柱形聚苯乙烯模具
Figure BDA0003225685970000121
中，在37℃下孵育30分钟，即得透明质酸/胶原复合水凝胶，制备的水凝胶包含2％w/v的AHA、3％w/v的胶原。
以下对实施例1-3所制备的纳米颗粒以及水凝胶样品，以及对比例1所得样品进行结构、性能表征分析如下。
为了确定磁电纳米颗粒的成功合成，对实施例1中所获得的纳米颗粒样品进行了系列表征，如图2所示。图2(a)展示了TiO2(FO)、Fe3O4@TiO2(FO@TO)及Fe3O4@BaTiO3(FO@BTO)的形貌变化，可以看出，未涂覆的FO颗粒表面显得粗糙，但随着TO的沉积，颗粒尺寸增大，表面趋于光滑，这说明FO颗粒表面生成了壳层，然后通过水热合成法原位生成出颗粒状纳米颗粒，导致颗粒表面再次出现粗糙结构。同时FO@TO、FO@BTO纳米颗粒TEM结果如图2(b)所示，FO纳米颗粒上涂覆着一层紧密的膜厚度约15nm，经过水热反应后，又转化为由较多的纳米颗粒7-8nm大小组成的粗糙且连续的壳厚度10-12nm。此外，HRTEM图像显示，壳状纳米粒子的晶面间距为0.4nm，与四方相BTO的d001晶格吻合，表明生成的大量BTO颗粒构成了纳米颗粒外部壳层。通过EDX图谱分析纳米颗粒的元素组成，如图2(c)所示，FO@BTO NPs表面存在Ba和Ti，证明该复合纳米粒子是由Ba、Ti、O组成的壳和由FO核复合组成的纳米颗粒。对于磁电纳米颗粒而言，其组成主要是FO和BTO，其结晶度对于材料的性能影响至关重要，尤其是BTO，其表现压电性能的晶体结构主要是四方相，因此通过XRD分析进一步探讨了混合NPs的晶体结构，如图2(d)所示，FO的XRD特征峰谱符合四氧化三铁的立方尖晶石结构。底部的XRD图谱出现了与BTO曲线相似的特征峰，可以归入四方相的BTO钙钛矿结构。以上结果可以得知，本实施例成功合成了核壳结构的FO@BTO纳米颗粒。
进一步地，对实施例1中获得核壳结构的FO@BTO纳米颗粒机型磁性能和磁电性能表征，如图3所示。如图3(a)所示，通过VSM在300K下对FO、FO@TO和FO@BTO NPs的磁化进行了检测，磁滞曲线结果显示三者的剩余磁化强度为0，表明三种纳米颗粒具有超顺磁性行为。如图3(b)所示通过PFM对单个FO@BTO NP的铁电性质和磁电性质进行了表征。图3(c)-(e)显示了单个FO@BTO NP的形貌、振幅和相位，形貌图显示的是单个纳米颗粒，尺寸为200-300nm，与其振幅和相位图像匹配良好。局部压电响应相曲线如图3(f)所示，表现出BTO NPs受到交变电场作用能够产生约180°的相位切换，这表明当施加外部电场时，压电BTO的极化具有可逆性。此外，根据压电响应振幅曲线的斜率计算，FO@BTO的有效压电系数d33约为28pm/V。
此外，通过在施加外部磁场1000Oe的情况下，研究了FO@BTO的磁电性。如图3(g)所示，FO@BTO受磁场刺激的结果与无磁场时(负压-2.59V，正压2.12V)相比，矫顽电压值发生了变化(负压-0.75V，正压1.47V)。结果表明，当FO@BTO被外部磁场刺激时，压电响应相环的中心会发生偏移，这是由磁电效应引起的。此外，作为磁电性能的指标，经计算，FO@BTO的磁电系数为26×104mV cm-1Oe-1。
对对比例1制备的透明质酸/胶原水凝胶及实施例1、实施例2和实施例3制备的磁电响应仿生水凝胶的结构及力学表征，如图4所示。对实施例1中步骤(3)得到的醛基化透明质酸及未被处理的透明质酸进行了核磁分析，如图4a所示，AHA的1H-NMR光谱在4.9ppm和5.0ppm处显示了两个新的峰，这对应于来自醛基和邻近羟基的半乙酰质子，证明了透明质酸成功被高碘酸钠氧化得到醛基化透明质酸。
对对比例1制备的透明质酸/胶原水凝胶及实施例1、实施例2和实施例3制备的磁电复合水凝胶进行SEM表征，由图4(b)可以看出，虽然NPs的浓度高达1％，但网络仍呈现均匀的纤维状结构，FO@BTO NPs均匀地分散在复合水凝胶中。同时，随着纳米颗粒浓度的增加，纳米颗粒逐渐占据网络。然而，当纳米颗粒浓度增加到1％w/v时，FO@BTO NPs占据了大量网络结构，纤维结构变得松散，这种形貌结构存在抑制神经细胞的粘附、增殖和扩散的可能。
对对比例1制备的透明质酸/胶原水凝胶及实施例1、实施例2和实施例3制备的磁电复合水凝胶进行力学表征，压缩模量通过DMA测量，如图4(c)所示，结果显示四组水凝胶具有相似的压缩模量(约0.4kPa)，这表明FO@BTO的引入和不同浓度对所得到的复合水凝胶的压缩模量影响不大。应力松弛曲线图4d表明，复合水凝胶具有粘弹性，半松弛时间τ1/2约为22s。
对对比例1制备的透明质酸/胶原水凝胶及实施例1、实施例2、和实施例3制备的磁电复合水凝胶进行了降解速率表征。如图4(e)所示，FO@BTO/AHA-Col复合水凝胶可被I型胶原酶有效降解，且FO@BTO NPs的浓度并没有使降解产生差异。
实施例6-8
本实施例提供的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，其具体步骤如下：
按照实施例1中步骤(1)-(3)制备磁电纳米颗粒和醛基化透明质酸。
(4)构建装载细胞的磁电复合水凝胶
4％w/v的浓度将AHA溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中形成醛基化透明质酸溶液。然后，将冻干的胶原(Col)溶解于0.4M乙酸中形成胶原溶液，并在-4℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，最终胶原溶液浓度为6mg/ml。将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：1的体积比例混合，并添加Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒形成反应混合物，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒在反应混合物中的浓度为0.2～1mg/mL。将反应混合物与PC12细胞混合均匀得到细胞装载的前驱体混合液，其中PC12细胞密度为1×107个/mL，之后，将前驱体混合液注入圆柱形聚苯乙烯模具
Figure BDA0003225685970000141
中，在37℃下孵育30分钟，即得可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，制备的水凝胶包含2％w/v的AHA、3％w/v的胶原和0.2～1％w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，细胞密度为1×107个/mL。
表2给出了实施例6-8可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶制备方法中部分原料用量。
表2实施例6-8可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶制备方法中部分原料用量
Figure BDA0003225685970000142
对比例2
该对比例制备装载细胞的透明质酸/胶原复合水凝胶，包括以下步骤：
(i)制备醛基化透明质酸
将分子量为70kDa的透明质酸钠1g溶解在去离子水100mL中形成透明质酸钠溶液，然后，向形成透明质酸钠溶液中滴加3ml的0.05M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌6h，之后，通过添加1mL乙二醇终止反应，剧烈搅拌0.5h后，将反应产物透析并冻干，得到醛基化透明质酸(AHA)。
(ii)构建装载细胞的透明质酸/胶原复合水凝胶
按照4％w/v的浓度将AHA溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中形成醛基化透明质酸溶液。然后，将冻干的胶原(Col)溶解于0.4M乙酸中形成胶原溶液，并在-4℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，最终胶原溶液浓度为6mg/ml。将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：1的体积比例混合形成反应混合物，将反应混合物与PC12细胞混合均匀得到细胞装载的前驱体混合液，其中PC12细胞密度为1×107个/mL，之后，将前驱体混合液注入圆柱形聚苯乙烯模具
Figure BDA0003225685970000143
中，在37℃下孵育30分钟，即得装载细胞的透明质酸/胶原复合水凝胶，制备的水凝胶包含2％w/v的AHA、3％w/v的胶原。
以下对实施例6～8所制备水凝胶样品以及对比例1所得水凝胶样品进行培养，并对其性能进行分析如下。
将对比例2制备的细胞装载的水凝胶样品(对应AC0)以及实施例6、实施例7和实施例8制备的细胞装载的水凝胶样品(分别对应AC0.2、AC0.5、AC1)，在1、4、7天后分别对凝胶中的PC12细胞进行FDA/PI染色，利用共聚焦分析细胞的活死情况，如图5所示。由图可以看出，实施例6～8制备的水凝胶样品具有良好的生物活性，PC12细胞能够在凝胶中稳定生长，且实施例7制备磁电复合水凝胶凝胶中的磁电纳米颗粒浓度，对细胞的增殖有着明显的促进作用。这表明本发明制备的磁电复合水凝胶具有优异的生物相容性。
将实施例7制得水凝胶样品置于磁场刺激下，对比有无磁场刺激下PC12细胞分别在1、4、7天后F～actin/DAPI染色差异，通过对染色凝胶材料进行共聚焦显微镜分析，结果显示图6所示。由图(a)和(b)可以看出在磁场的作用下能够有效地促进细胞生产。并通过细胞长度统计可知，实施例7所得水凝胶样品在磁场作用下，对比无磁场刺激的情况，磁电纳米颗粒产生的电信号能够有效的促进细胞的伸长。
将实施例7制得磁电复合凝胶置于磁场刺激下，对比有无磁场刺激下PC12细胞在14天后，神经相关蛋白Tubilin～β3、PSD95、NF染色差异，免疫荧光染色得到的凝胶通过共聚焦显微镜分析，所得结果显示图6(c)和图6(d)所示。实施例7所得水凝胶样品在磁场作用下，磁电纳米颗粒产生的电信号能够有效地传导至细胞，从而刺激细胞表达神经相关蛋白。
研究表明，电刺激细胞能够有效地促进细胞内钙离子相关通道蛋白的表达，特别是L型电压门控钙离子通道L～VGCC，此蛋白的高表达能够有效促进钙离子内流，钙离子作为细胞内的第二信使，其胞内浓度升高能够有效地促进细胞特异性蛋白的表达。鉴于此，将实施例7制备的磁电复合凝胶在有无磁场作用下，分析其在第7天两组凝胶中细胞的L～VGCC蛋白的免疫荧光染色，通过激光共聚焦显微镜所的结果如图7所示，AC0.5MS中细胞的L～VGCC的表达比未受磁场刺激的AC0.5水凝胶组中的更高。
上述分析表明，本发明提供的磁电响应仿生水凝胶及可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶及其制备方法，是一种基于磁电纳米颗粒复合仿生凝胶基质的无线电刺激技术。一方面，通过磁场刺激作用，Fe3O4@BaTiO3磁电纳米颗粒与外部磁场耦合产生电刺激；另一方面，生物仿生3D基质能够为细胞提供生物活性位点，通过3D包裹细胞能够有效地将产生的电信号传导至周围组织。进一步地，本发明提供可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，基于神经细胞与磁电相互作用的机制，其中跨膜L～VGCC和细胞内Ca2+可参与其中，该水凝胶不仅在神经损伤和疾病的临床治疗中具有前景，而且为未来人机交互提供了新的思路，拓展了功能纳米材料在生物科学中的跨学科应用。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种磁电响应仿生水凝胶，其特征在于：该水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液孵育而成，所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒为表面修饰了BaTiO3壳层的Fe3O4纳米颗粒，所述水凝胶包含1~5％w/v的醛基化透明质酸、1~6％w/v的胶原以及0~2%w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量不为0；w/v中w的单位为mg，v的单位为mL。
2.根据权利要求1所述的磁电响应仿生水凝胶，其特征在于：所述水凝胶中，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量为0.2~1%w/v。
3.一种权利要求1或2所述的磁电响应仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将醛基化透明质酸溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中形成浓度为2~10 %w/v的醛基化透明质酸溶液；将冻干胶原溶解于乙酸中形成胶原溶液，并在-4~0℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，胶原溶液浓度为2~12 mg/ml；将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：0.5~3的体积比例混合均匀，并添加0~2%w/v的Fe3O4@BaTiO3 纳米颗粒后形成反应混合物；将反应混合物于37℃下孵育15~45min后，即得磁电响应仿生水凝胶；w/v中w的单位为mg，v的单位为mL。
4.根据权利要求3所述的磁电响应仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：所述Fe3O4@BaTiO3 纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备磁性纳米颗粒
将六水氯化铁0.675~2.025g、柠檬酸钠0.2~0.4g和醋酸铵1.927~5.781g溶解在乙二醇中，在连续搅拌的条件下，于170 ℃下反应1~2 h至反应溶液颜色变为均匀的黑色；将反应溶液转移到反应容器中，加热至200~250℃并保温10~18 h，反应结束后待反应溶液冷却至室温，收集反应产物并洗涤，得到磁性Fe3O4纳米颗粒，将Fe3O4纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4悬浮液，备用；
（2）制备磁电纳米颗粒
（21）制备Fe3O4@TiO2纳米颗粒
将步骤（1）制得的浓度为5~10mg/mL的Fe3O4悬浮液5~10mL与乙醇80~90mL和乙腈10~50mL的混合溶剂均匀混合形成Fe3O4分散液，在搅拌条件下，向Fe3O4分散液中加入钛酸四丁酯0.5~2mL和氨水0.1~1mL并反应1.5~5 h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，得到表面修饰了一层TiO2的Fe3O4纳米颗粒，即Fe3O4@TiO2纳米颗粒，将Fe3O4@TiO2纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4@TiO2悬浮液，备用；
（22）制备Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒
将氢氧化钡0.1575~0.63g溶解在去离子水中形成氢氧化钡溶液；将步骤（21）制得的Fe3O4@TiO2悬浮液加入到氢氧化钡溶液中，在搅拌条件下加入氨水1~10mL形成反应混合物，将反应混合物转移到反应容器中，将反应容器加热至180~240 ℃并保温6~8 h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，即得Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒。
5.根据权利要求3所述的磁电响应仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：所述醛基化透明质酸的制备方法，包括以下步骤：将透明质酸钠1~4g溶解在去离子水中形成透明质酸钠溶液，向透明质酸钠溶液中滴加0.25~5mL的0.05~5M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌3~10h之后，添加1~5mL乙二醇再继续搅拌0.5~1.5 h后使反应终止，将反应产物透析并冻干，得到醛基化透明质酸。
6.一种可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，其特征在于：该水凝胶通过Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒与醛基化透明质酸溶液和胶原溶液的混合溶液以及细胞孵育而成，所述Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒为表面修饰了BaTiO3壳层的Fe3O4纳米颗粒，所述水凝胶包含1~5％w/v的醛基化透明质酸、1~6％w/v的胶原以及0~2%w/v的Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量不为0，细胞密度为5×106~1×107个/mL；w/v中w的单位为mg，v的单位为mL。
7.根据权利要求6所述的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶，其特征在于：所述水凝胶中，Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒的含量为0.2~1%w/v。
8.一种权利要求6或7所述的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将醛基化透明质酸溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中形成浓度为2~10 %w/v的醛基化透明质酸溶液；将冻干胶原溶解于乙酸中形成胶原溶液，并在-4~0℃条件下将胶原溶液pH调节至7.5，胶原溶液浓度为2~12 mg/ml；将醛基化透明质酸溶液与胶原溶液按1：0.5~3的体积比例混合均匀，并添加不超过2%w/v的Fe3O4@BaTiO3 纳米颗粒后形成反应混合物；将反应混合物与细胞混合均匀得到细胞装载的前驱体混合液，其中细胞密度为5×106~1×107个/mL，将前驱体混合液于37℃下孵育15~45min后，即得可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶；w/v中w的单位为mg，v的单位为mL。
9.根据权利要求8所述的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶胶的制备方法，其特征在于：所述Fe3O4@BaTiO3 纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备磁性纳米颗粒
将六水氯化铁0.675~2.025g、柠檬酸钠0.2~0.4g和醋酸铵1.927~5.781g溶解在乙二醇中，在连续搅拌的条件下，于170 ℃下反应1~2 h至反应溶液颜色变为均匀的黑色；将反应溶液转移到反应容器中，加热至200~250℃并保温10~18 h，反应结束后待反应溶液冷却至室温，收集反应产物并洗涤，得到磁性Fe3O4纳米颗粒，将Fe3O4纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4悬浮液，备用；
（2）制备磁电纳米颗粒
（21）制备Fe3O4@TiO2纳米颗粒
将步骤（1）制得的浓度为5~10mg/mL的Fe3O4悬浮液5~10mL与乙醇80~90mL和乙腈10~50mL的混合溶剂均匀混合形成Fe3O4分散液，在搅拌条件下，向Fe3O4分散液中加入钛酸四丁酯0.5~2mL和氨水0.1~1mL并反应1.5~5 h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，得到表面修饰了一层TiO2的Fe3O4纳米颗粒，即Fe3O4@TiO2纳米颗粒，将Fe3O4@TiO2纳米颗粒分散在乙醇中得到Fe3O4@TiO2悬浮液，备用；
（22）制备Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒
将氢氧化钡0.1575~0.63g溶解在去离子水中形成氢氧化钡溶液；将步骤（21）制得的Fe3O4@TiO2悬浮液加入到氢氧化钡溶液中，在搅拌条件下加入氨水1~10mL形成反应混合物，将反应混合物转移到反应容器中，将反应容器加热至180~240 ℃并保温6~8 h，反应结束后，收集反应产物并洗涤，即得Fe3O4@BaTiO3纳米颗粒。
10.根据权利要求8所述的可调细胞电学微环境磁电响应仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：所述醛基化透明质酸的制备方法，包括以下步骤：将透明质酸钠1~4g溶解在去离子水中形成透明质酸钠溶液，向透明质酸钠溶液中滴加0.25~5mL的0.05~5M NaIO4溶液，于室温避光连续搅拌3~10 h之后，添加1~5mL乙二醇再继续搅拌0.5~1.5 h后使反应终止，将反应产物透析并冻干，得到醛基化透明质酸。
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