CN116115618A

CN116115618A - 一种治疗肿瘤的药物

Info

Publication number: CN116115618A
Application number: CN202211430054.2A
Authority: CN
Inventors: 范丽雪; 刘喜宝; 柴晓玲; 束云; 杨银平; 李冰; 崔淑香; 王洁; 宗娜
Original assignee: CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology Shijiazhuang Co Ltd
Current assignee: CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology Shijiazhuang Co Ltd
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2023-05-16
Also published as: WO2023083362A1

Abstract

本发明提供了一种如式(I)所示的化合物，其对TRK、ALK、ROS1激酶及其突变体，特别是对TRK激酶及其突变形式显现了优良的抑制活性；对多种TRK突变的细胞(包括TRK突变的耐药细胞)具有较强的抑制作用，体外、体内抑瘤活性均优于现有对照化合物。并且，联合使用本发明化合物与KRAS^G12C抑制剂能协同增强药物对KRAS^G12C突变的肿瘤的抑制作用。本发明化合物用作药物具有很好的应用前景。

Description

一种治疗肿瘤的药物

本申请要求2021年11月15日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202111345327.9，发明名称为“一种治疗肿瘤的药物”在先申请的优先权。该申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗肿瘤的药物。

背景技术

1.KRAS^G12C与肿瘤

RAS是一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，通过在临近细胞膜处与GTP/GDP互相转化的循环中起到分子开关的作用。RAS基因主要有三个亚型(HRAS、NRAS或KRAS)，其中，KRAS是实体瘤中最常见的癌基因之一，包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、白血病(例如急性髓细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病)、宫颈癌、肝癌、卵巢癌和脑癌等肿瘤中均可出现KRAS突变。约90％胰腺癌、50％结直肠癌和25％肺癌均发生KRAS突变，从多种肿瘤整体突变频率看，KRAS突变率在30％左右。

KRAS最易突变的三个氨基酸是甘氨酸12(G12)、甘氨酸13(G13)、谷氨酰胺61(Q61)，G12和G13处于核苷酸结合口袋的周围，其突变将会产生一定的位阻效应，阻止水解所需的构象形成，进而抑制GTP-RAS的水解。KRAS^G12C突变约占12号密码子突变的21％。与野生型相比，KRAS^G12X突变对RAF亲和性普遍较低，其中G12D、G12R和G12V突变对RAF的亲和性低，G12A则略有降低，而G12C突变则表现出与野生型相似的亲和性。因此，KRAS^G12C突变更易激活RAF介导的MEK-ERK信号通路，促进癌细胞生长和增殖。在非小细胞肺癌中，KRAS突变约占25％，其中KRAS^G12C突变占所有非小细胞肺癌的14％。并且与无吸烟史的肺癌患者相比，有吸烟史的肺癌患者KRAS^G12C突变的比例明显增加。ctDNAKRAS突变检测和预后之间的相关性分析显示，KRAS突变与胰腺癌患者的不良预后相关，而G12C在KRAS突变的胰腺癌患者中约占2％。KRAS^G12C自身活化在胰腺癌和结直肠癌中较显著，在结直肠癌中，KRAS突变约占45％，其中KRAS^G12C突变占5％。

AMG510是由安进公司开发的一种具有口服活性的KRAS^G12C抑制剂，于2018年8月27日启动临床1期试验，2021年2月FDA受理其NDA申请。MRTX849是Mirati公司开发的KRAS^G12C抑制剂，于2018年12月启动临床1期试验，目前处于3期临床阶段。但从临床数据上看，由于肿瘤的异质性以及临床患者对KRAS^G12C抑制剂敏感性的差异，AMG510和MRTX849等对KRAS^G12C突变的肿瘤患者作用有限(客观缓解率ORR≤50％)，且对不同肿瘤类型的响应差异较大，单独使用的临床价值受限。

AMG510和MRTX849均开展了多项联用试验，主要联用靶点包括：PD-1、EGFR、SHP2、MEK等。【论文1】The clinical KRAS(G12C)inhibitor AMG510 drives anti-tumourimmunity，Nature.2019Nov；575(7781):217-223.首先通过体外细胞增殖抑制试验，分别检测AMG510与HER、EGFR、SHP2、PI3K、AKT、MEK抑制剂联用对多种KRAS^G12C突变细胞株的抑制活性。结果显示：AMG510与MEK抑制剂联用在多株细胞上均具有显著的协同作用；AMG510与多种其他药物的组合均可协同杀伤NCI-H358肿瘤细胞，但在其他细胞株上作用有限。【论文2】The KRAS^G12CInhibitor MRTX849 Provides Insight toward TherapeuticSusceptibility of KRAS-Mutant Cancers in Mouse Models and Patients,CancerDiscov.2020Jan；10(1):54-71.该篇文献通过RNAseq分析差异基因，随后利用CRISPR/Cas9技术发现mTOR、SHP2、MYC是影响MRTX849的主要信号通路/靶点，因此通过联用这些靶点抑制剂有可能起到协同的效果。随后利用荷瘤鼠体内药效实验进行验证，获得了理想的临床前药效结果。

2.TRK与肿瘤

原肌球蛋白受体激酶(tropomycin receptor kinase,TRK)属于受体酪氨酸激酶，其家族成员包括分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码的TRKA、TRKB和TRKC三个蛋白。近几十年的研究结果表明，TRK激酶与多种肿瘤的发生、转移和恶化有密切的关系，如TRK激酶在非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胆囊癌、甲状腺癌、恶性胶质瘤等中都存在过表达，且这种过表达与肿瘤细胞的增殖迁移有密切的关系。NTRK基因融合及基因突变、TRK蛋白高表达等都可以引起组成性的TRK酪氨酸残基磷酸化，持续激活PI3K、RAS/Raf/ERK和PLC-γ等下游信号通路，引起肿瘤的发生发展。

携带NTRK基因融合或突变的癌症分为两大类：(1)罕见癌症，具有较高NTRK融合突变比例。比如绝大多数婴儿纤维肉瘤都携带NTRK融合突变，但疾病本身极其罕见；(2)常见癌症，如非小细胞肺癌，NTRK融合突变比例较低，预计只有1％左右。

TRK靶点目前仅有两款药物上市，均属于第一代TRK抑制剂。2018年11月，LoxoOncology和拜耳(Bayer)联合开发的Larotrectinib(商品名VITRAKVI，代号LOXO-101，25mg/100mg胶囊，20mg/mL口服液)获批上市，用于携带NTRK基因融合的晚期实体瘤儿童和成人患者。2019年8月，罗氏(Roche)开发的Entrectinib(商品名ROZLYTREK，代号RXDX-101，100mg/200mg胶囊)获批上市，适应症有2个，用于治疗ROS1阳性的非小细胞肺癌，以及具有神经营养性酪氨酸受体激酶(NTRK)基因融合的儿童(12岁以上)和成人患者。根据文献报道，在临床试验研究过程中已发现TRK抑制剂获得性耐药突变，目前，依据患者的耐药突变位点开发的第二代TRK抑制剂LOXO-195和TPX-0005等也已经进入临床研究阶段。

【论文3】Repotrectinib increases KRAS-G12C inhibitor effectiveness viasimultaneous inhibition of SRC,FAK,and JAK2.European Journal of Cancer138S2(2020)S39-S40.指出，由于KRAS^G12C抑制剂可通过反馈再激活或旁路途径产生抗性，因此限制了KRAS^G12C抑制剂的抗肿瘤功效。PI3K/AKT信号通路的自适应上调已被认为是促进癌细胞存活并可能限制KRAS^G12C抑制剂功效的常见耐药机制，SRC/FAK信号可通过激活PI3K/AKT途径来促进肿瘤细胞的生存，因此SRC/FAK靶点抑制剂可作为联用策略之一。另外，致癌的KRAS诱导多种细胞因子和生长因子的分泌，调节肿瘤微环境以促进肿瘤生长，因此通过调节细胞因子分泌途径的JAK2/STAT3通路可能对KRAS耐药产生积极的效果。作者利用KRAS^G12C突变的体内外模型，评估TPX-0005联合AMG510的抗肿瘤活性。结果显示：在AMG510敏感CDX模型(NCI-H358)和耐药PDX模型(LU11693)中，TPX-0005与AMG510联用产生协同作用，并诱导明显的细胞凋亡。在H2122移植瘤模型生存期试验中，联用组小鼠生存期显著延长。TPX-0005由于具有对SRC/FAK/JAK2靶点的抑制作用，与KRAS^G12C抑制剂联用，可通过PI3K/AKT和JAK2/STAT3旁路途经协同增强后者的药理学作用，为二者联用奠定基础。WO2021108682A1也公开了类似的内容，并指出组合使用SRC/FAK/JAK2抑制剂可使KRAS^G12C抑制剂的抗肿瘤活性和反应持续时间最大化。

但TRK抑制剂并不都对SRC/FAK/JAK2靶点具备抑制作用，除了【论文3】提到的TPX-0005，其他TRK抑制剂与KRAS^G12C抑制剂联用是否能协同增效，目前尚不确定。

发明内容

本发明提供一类新型的TRK抑制剂，其能有效抑制TRK激酶，预防和/或治疗通过TRK介导的疾病；并同时提供该TRK抑制剂与KRAS^G12C抑制剂的联合治疗方案，以增加对肿瘤(尤其是KRAS^G12C突变的肿瘤)的疗效。

具体来说：

本发明提供化合物A在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述化合物A的结构如下式(I)所示：

其中，X选自：键、-O-、-S-、-NH-或-CH₂-；

Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄各自独立的选自：-CH-、N或C；

X₂选自：键、-(CH₂)_p-或-NH-，其中，p为1、2、3或4；当X₂为键时苯环直接与环A相连；

表示：键存在或不存在；

R选自：C_5～12的芳基或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基是未被取代的或被至少一个选自R₁的取代基取代；

R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷氧基或-SC_1～6烷基；

R_1a在每次出现时，各自独立地选自：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂或氰基；

R₂选自：H、卤素、羟基、氨基、或取代或未取代的C_1～6烷基，所述取代是指被1、2或3个选自卤素或羟基的取代基所取代；

R₃选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；

环A选自：环烷基、杂环烷基、桥环基、杂桥环基、并环基、杂并环基、螺环基、杂螺环基，其中所述杂环烷基、杂桥环基、杂并环基和杂螺环基中的杂原子独立地选自O、S或N，所述杂原子数选自1、2、3或4个；

R₄位于环A上的任意可取代位置，其独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-(CH₂)_m-OH、-(CH₂)_m-COOH、-(CH₂)_m-CO-NH₂、-CO-(CH₂)_m-NH₂、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；其中，所述氧代基是指相同取代位的两个H被同一个O替代形成双键；m选自1、2、3或4；R_4a选自氢、未取代或取代的C_1～4烷基；R_4b选自H、未取代或取代的C_1～6烷基或未取代或取代的C_3～6环烷基，所述取代的取代基独立地选自-OH、-NH₂、卤素，取代基个数选自1、2或3；

n选自1、2、3或4。

本发明提供化合物A联合KRAS^G12C抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供化合物A在制备改善KRAS^G12C抑制剂治疗肿瘤效果的药物中的用途，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供KRAS^G12C抑制剂在制备改善化合物A治疗肿瘤效果的药物中的用途，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供一种药物，其包括化合物A，化合物A的结构如上式(I)所示。优选地，所述药物用于治疗肿瘤。

本发明提供一种药物，其包括化合物A及KRAS^G12C抑制剂，化合物A的结构如上式(I)所示。优选地，所述药物用于治疗肿瘤。

本发明提供一种药物，其包括化合物A，化合物A的结构如上式(I)所示，所述药物用于改善KRAS^G12C抑制剂治疗肿瘤的效果。

本发明提供一种药物，其包括KRAS^G12C抑制剂，所述药物用于改善化合物A治疗肿瘤的效果，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供一种治疗肿瘤的方法，包括：给予患者或受试者治疗有效量的化合物A，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供一种治疗肿瘤的方法，包括：给予患者或受试者治疗有效量的化合物A及KRAS^G12C抑制剂，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供一种改善KRAS^G12C抑制剂治疗肿瘤的效果的方法，包括：给予患者或受试者治疗有效量的化合物A，化合物A的结构如上式(I)所示。

本发明提供一种改善化合物A治疗肿瘤的效果的方法，包括：给予患者或受试者治疗有效量的KRAS^G12C抑制剂，化合物A的结构如上式(I)所示。

在以上技术方案中：

优选地，所述化合物A，其中，在一个实施方案中，R选自：C_5～9的芳基或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基是未被取代的或被至少一个选自R₁的取代基取代；或者，R选自：C_5～6的芳基或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基是未被取代的或被至少一个选自R₁的取代基取代。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-1)或(I-2)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，

环A和n具有与本发明式(I)化合物中相同定义，X₁选自：-CH-或N。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-A)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X，X₁，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，环A和n具有与本发明式(I-1)或(I-2)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-A-1a)、(I-A-1b)或(I-A-1c)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X，X₁，X₂，环A和n具有与本发明式(I-1)或(I-2)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-B)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X₁，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，环A和n具有本发明式(I-1)或(I-2)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-B-1a)、(I-B-1b)或(I-B-1c)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X₁，X₂，环A和n具有本发明式(I-1)或(I-2)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-C)所示的结构：

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-C-1a)、(I-C-1b)或(I-C-1c)所示的结构：

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物)，其中，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷基或未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基或未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、C_1～3烷基或C_1～3烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、F、Cl、-OH、甲基或甲氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：F、-OH、甲基或甲氧基。

在一个实施方案中，R_1a在每次出现时，各自独立地选自：C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、硝基、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂或氰基；或者，R_1a选自：卤素、-OH、氨基、-NHC_1～3烷基、-N(C_1～3烷基)₂或氰基；或者，R_1a选自：卤素、-OH、氨基或氰基；或者，R_1a选自：F、Cl或-OH。

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物)，其中，R₂选自：H、F、OH或取代或未取代的C_1～6烷基，所述取代是指被1、2或3个选自卤素或羟基的取代基所取代；或者，R₂选自H、F、-OH或C_1～6烷基；或者，R₂选自H、F、-OH或C_1～3烷基；或者，R₂选自H或F。

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物)，其中，X₁选自-CH-或N，R₁选自F或-OCH₃。

在一个实施方案中，X₁选自-CH-，R₁选自F；或者，X₁选自N，R₁选自-OCH₃。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-D)所示的结构：

其中，R₃，R₄，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，环A和n具有本发明式(I)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-D-a)、式(I-D-b)或式(I-D-c)所示的结构：

其中，R₃，R₄，X₂，环A和n具有本发明式(I)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物、式(I-D)化合物、式(I-D-a)化合物、式(I-D-b)化合物、式(I-D-c)化合物)，其中，R₃选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～3烷基或C_1～3烷氧基；或者，R₃选自：H、F、Cl、-OH、甲基或甲氧基；或者，R₃选自：H或F。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-D-1a)、式(I-D-1b)或式(I-D-1c)所示的结构：

其中，R₄，X₂，环A和n具有本发明式(I)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-C-1a-1)所示的结构：

其中，R₄，X₂、环A和n具有本发明式(I)中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-C-1a-2)所示的结构：

其中，R₄，X₂、环A和n具有本发明式(I)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物、式(I-D)化合物、式(I-D-a)化合物、式(I-D-b)化合物、式(I-D-c)化合物、式(I-D-1a)化合物、式(I-D-1b)化合物、式(I-D-1c)化合物、式(I-C-1a-1)化合物、和式(I-C-1a-2)化合物，下同)，其中，环A选自：C_3-6环烷基、4-6元杂环烷基、C_6-8桥环基、6-8元杂桥环基、C_8-10并环基、8-10元杂并环基、C_7-12单螺环基、7-12元杂单螺环基；或者，环A选自：4-6元杂环烷基、6-8元杂桥环基、8-10元杂并环基、7-12元杂单螺环基；其中所述杂环烷基、杂桥环基、杂并环基和杂单螺环基中的杂原子独立地选自O、S或N，所述杂原子个数选自1、2、3或4个；或者，环A选自如下结构：

或者，环A选自如下结构：

或者，环A选自如下结构：

或者，环A选自如下结构：

或者，环A选自如下结构：

在一个实施方案中，所述化合物A(包括式(I)化合物、式(I-1)化合物、式(I-2)化合物、式(I-A)化合物、式(I-A-1a)化合物、式(I-A-1b)化合物、式(I-A-1c)化合物、式(I-B)化合物、式(I-B-1a)化合物、式(I-B-1b)化合物、式(I-B-1c)化合物、式(I-C)化合物、式(I-C-1a)化合物、式(I-C-1b)化合物、式(I-C-1c)化合物、式(I-D)化合物、式(I-D-a)化合物、式(I-D-b)化合物、式(I-D-c)化合物、式(I-D-1a)化合物、式(I-D-1b)化合物、式(I-D-1c)化合物、式(I-C-1a-1)化合物、和式(I-C-1a-2)化合物)，其中，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-COOH、-CONH₂、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、取代或未取代的C_1～6烷基、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、取代或未取代的C_1～3烷基、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-H、-OH、取代或未取代的C_1～3烷基、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；其中，所述氧代基是指相同取代位的两个H被同一个O替代形成双键；R_4a选自氢、未取代或取代的C_1～4烷基；R_4b选自未取代或取代的C_1～6烷基或未取代或取代的C_3～6环烷基，所述取代的取代基独立地选自-OH、-NH₂、或卤素，取代基个数选自1、2或3；或者，所述取代的取代基独立地选自-OH或F，取代基个数选自1、2或3。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-A-1a)所示的结构：

其中，X选自：键、-O-、-S-、-NH-或-CH₂-；

X₁选自：-CH-或N；

X₂选自：键、-(CH₂)_p-或-NH-，其中，p为1、2、3或4；

R₁选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；

R₂选自：H、F、OH或取代或未取代的C_1～6烷基，所述取代是指被1、2或3个选自卤素或羟基的取代基所取代；

R₃选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；

n选自1、2、3或4。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-B-1a)所示的结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，X₁，X₂、环A和n具有本发明式(I-A-1a)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-D-1a)所示的结构：

其中，R₁，R₃，R₄，X₁，X₂、环A和n具有本发明式(I-A-1a)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如式(I-C-1a)所示的结构：

其中，R₄，X₂、环A和n具有本发明式(I-A-1a)化合物中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物A中，环A选自：C_3-6环烷基、4-6元杂环烷基、C_6-8桥环基、6-8元杂桥环基、C_8-10并环基、8-10元杂并环基、C_7-12单螺环基、7-12元杂单螺环基，其中所述杂环烷基、杂桥环基、杂并环基和杂单螺环基中的杂原子独立地选自O、S或N，所述杂原子个数选自1、2或3个。

在一个实施方案中，所述化合物A中，环A选自如下结构：

在一个实施方案中，所述化合物A中，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-COOH、-CONH₂、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b，其中，所述氧代基是指相同取代位的两个H被同一个O替代形成双键；R_4a选自氢、未取代或取代的C_1～4烷基；R_4b选自未取代或取代的C_1～6烷基或未取代或取代的C_3～6环烷基，所述取代的取代基独立地选自-OH、-NH₂、卤素，取代基个数选自1、2或3。

在一个实施方案中，所述化合物A具有如下结构：

在一个实施方案中，所述化合物A具有如下式(4)所示结构：

在以上技术方案中，

优选地，所述KRAS^G12C抑制剂选自AMG-510、MRTX849、JNJ-74699157(ARS-3248)、ARS-1620、MRTX1257、RM-007、ADT-007，优选AMG510和MRTX849，更优选AMG510。所述AMG510和MRTX849的结构分别如下所示：

优选地，所述肿瘤选自KRAS^G12C突变的肿瘤，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、白血病、宫颈癌、肝癌、卵巢癌和脑癌，所述白血病包括急性髓细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病；优选肺癌、胰腺癌、结直肠癌，所述肺癌优选非小细胞肺癌、肺腺癌。

在一些实施方案中，本发明所述的药物进一步包含药学上可接受的辅料或药学上可接受的载体。

本发明所述的药物每个制剂单位中包含化合物A0.1-1000mg，优选1-500mg，示例性的含量为1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mg、400mg、300mg、250mg、200mg、190mg、180mg、170mg、160mg、150mg、140mg、130mg、120mg、110mg、100mg、90mg、80mg、70mg、60mg、50mg、40mg、30mg、20mg、15mg、10mg、5mg、3mg、2mg、1mg以及上述任意两个点值之间的范围值。

本发明所述的药物每个制剂单位中包含0.1-1000mg的KRAS^G12C抑制剂，优选1-1000mg，示例性的含量为1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mg、400mg、300mg、250mg、200mg、190mg、180mg、170mg、160mg、150mg、140mg、130mg、120mg、110mg、100mg、90mg、80mg、70mg、60mg、50mg、40mg、30mg、20mg、15mg、10mg、5mg、3mg、2mg、1mg以及上述任意两个点值之间的范围值。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂为AMG510，所述药物每个制剂单位包含AMG510约1-1000mg，优选1-500mg、1-400mg、1-300mg或1-200mg，例如包含AMG510约960mg、480mg、240mg、120mg。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂为MRTX849，所述药物每个制剂单位包含MRTX849约1-1000mg，优选1-600mg、1-500mg、1-400mg、1-300mg或1-200mg，例如包含MRTX849约600mg、300mg、200mg、150mg、100mg。

所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂可以包含在同一个制剂单位中，也可以分别在不同制剂单位中，以组合产品的形式制成所述药物。所述制剂选自口服制剂、注射制剂、局部给药制剂或外用制剂等。相应地，所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂通过注射、口服、局部或体外施用。所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂可以同时给药，也可以间隔给药或贯序给药。

本发明所述药物以治疗有效量给予患者或受试者以治疗肿瘤。所述治疗有效量可以缓解或消除所述患者或受试者的肿瘤的临床症状、体征、病理改变等。其中，化合物A的治疗有效量为1-1000mg，优选1-800mg、1-600mg、1-500mg、1-400mg、1-350mg、1-360mg、1-300mg、1-250mg、1-240mg、1-200mg、1-180mg、1-150mg，示例性的剂量包括15mg、30mg、60mg、75mg、90mg、120mg、150mg、180mg、200mg、240mg、250mg、300mg、350mg、360mg、400mg、450mg、500mg以及上述任意两个点值之间的范围值。上述治疗有效量可以是单次施用剂量，也可以是每日分2-3次施用的累积剂量。例如，每次15mg、30mg、60mg、90mg、120mg或150mg，每天口服1次或2次。

KRAS^G12C抑制剂的治疗有效量为1-1500mg，例如1500mg、1200mg、1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mg、400mg、300mg、250mg、200mg、190mg、180mg、170mg、160mg、150mg、140mg、130mg、120mg、110mg、100mg、90mg、80mg、70mg、60mg、50mg、40mg、30mg、20mg、15mg、10mg、5mg、3mg、2mg、1mg以及上述任意两个点值之间的范围值；上述治疗有效量可以是单次施用剂量，也可以是每日分2-3次施用的累积剂量。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂为AMG510，其治疗有效量约1-1200mg，优选100-1200mg、200-1200mg、300-1200mg、400-1100mg、500-1100mg、600-1100mg、700-1100mg、800-1000mg或900-1000mg；上述治疗有效量可以是单次施用剂量，也可以是每日分2-3次施用的累积剂量。在一个实施方案中，AMG510的治疗有效量为每次960mg，每天口服施用1次。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂为MRTX849，其治疗有效量为1-1500mg，优选100-1500mg、200-1400mg、300-1300mg、400-1200mg、500-1200mg、600-1200mg、700-1200mg、

800-1200mg、900-1200mg或1000-1200mg；上述治疗有效量可以是单次施用剂量，也可以是每日分2-3次施用的累积剂量。在一个实施方案中，MRTX849的有效治疗量为每次600mg，每天口服施用2次。

以上实施方案代表了本发明的示例性实施方案，但是本发明并不限于以上实施方案。另外，本发明的以上实施方案中的各个技术特征可以相互组合，从而构成一个或多个新的技术方案，这些新的技术方案也落在本发明的范围内，只要这样的新的技术方案在技术上可行即可。

本发明还提供化合物A的制备方法，包括如下步骤：

化合物Im与化合物R₄-OH反应得到式I所示化合物；

其中，R，R₂，R₃，R₄，X，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，

环A和n具有上文中相同定义。

在一个实施方案中，所述化合物Im采用如下方法制备：

化合物In与化合物Ip反应得到化合物Im；

其中，R，R₂，R₃，R₄，X，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，

和环A具有上文中相同定义。

定义

除另有规定外，本发明所指的以下术语具有下述定义。

本发明中部分取代基中“

”处表示连接位点。

术语“烷基”指一价饱和脂肪族烃基团，包含1-20个碳原子的直链或支链基团，优选包含1-10个碳原子(即C_1-10烷基)，进一步优选包含1-8个碳原子(C_1-8烷基)，更优选包含1-6个碳原子(即C_1-6烷基)，例如“C_1-6烷基”指的是该基团为烷基，且碳链上的碳原子数量在1-6之间(具体地为1个、2个、3个、4个、5个或6个)。实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、正庚基、正辛基等。

术语“碳环基”或“碳环”表示含有3-12个碳原子的，单价或多价的饱和或部分不饱和单环、双环或者三环体系，其中单环、双环或三环中不包含芳香环。碳双环基包括桥环基、螺环基、并环基等。桥环基是指任意两个环公用两个直接相连或不直接相连的原子。

术语“环烷基”指的是具有特定碳原子数的单环饱和脂烃基，优选地包含3-12个碳原子(即C_3-12环烷基)，更优选包含3-10个碳原子(C_3-10环烷基)，进一步优选3-6个碳原子(C_3-6环烷基)、4-6个碳原子(C_4-6环烷基)、5-6个碳原子(C_5-6环烷基)。实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、甲基环丙基、2-乙基-环戊基、二甲基环丁基等。

术语“烷氧基”指-O-烷基，所述烷基的定义同上，即包含1-20个碳原子，优选地，包含1-10个碳原子，较佳地1-8个碳原子，更佳地1～6个碳原子(具体地为1个、2个、3个、4个、5个或6个)。代表的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、叔丁氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基等。

术语“卤素”或“卤代”是指F、Cl、Br、I。术语“卤代烷基”是指如上所定义的烷基中一个、两个或多个氢原子或全部氢原子被卤素取代。卤代烷基的代表性例子包括CCl₃、CF₃、CHCl₂、CH₂Cl、CH₂Br、CH₂I、CH₂CF₃、CF₂CF₃等。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环、双环或多环环状烃取代基，为非芳香结构，包含3-20个环原子，其中1个、2个、3个或更多个环原子选自N、O或S，其余环原子为C。优选包含3～12个环原子(C_3-12杂环基)，进一步优选包含3-10个环原子(C_3-10杂环基)，或3～8个环原子(C_3-8杂环基)，或3～6个环原子(C_3-6杂环基)，或4～6个环原子(C_4-6杂环基)，或5～6个环原子(C_5-6杂环基)。杂原子优选1-4个，更优选1～3个(即1个、2个或3个)。单环杂环基的实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吡喃基等。多环杂环基包括杂螺环基、杂并环基、杂稠环基和杂桥环基等的杂环基。

术语“杂环烷基”是指饱和的如上定义的“杂环基”，包含3-20个环原子，其中1个、2个、3个或更多个环原子选自N、O或S，其余环原子为C。优选包含3-12个环原子(C_3-12杂环烷基)，进一步优选包含3-10个环原子(C_3-10杂环烷基)，或3-8个环原子(C_3-8杂环烷基)，或3-7个环原子(C_3-7杂环烷基)，或3-6个环原子(C_3-6杂环烷基)，或4-6个环原子(C_4-6杂环烷基)，或5-6个环原子(C_5-6杂环烷基)。杂原子优选1-4个，更优选1～3个(即1个、2个或3个)。实例包括氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、氧杂环己烷、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二噁烷基、二硫杂环己基、噁唑烷基、噻唑烷基、吡唑烷基、咪唑啉啶等。

术语“芳基”表示含有6-16个碳原子，或6-14个碳原子，或6-12个碳原子，或6-10个碳原子的单环、双环和三环的芳香碳环体系，优选6-10个碳原子，术语“芳基”可以和术语“芳香环”交换使用。芳基基团的实例可以包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基或芘基等。

术语“杂芳基”表示含有5-12元结构，或优选5-10元结构，5-8元结构，更优选5-6元结构的芳香单环或者多环环状系统，其中1个、2个、3个或更多个环原子为杂原子且其余原子为碳，杂原子独立地选自O、N或S，杂原子数量优选为1个、2个或3个。杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、硫代二唑基、三嗪基、酞嗪基、喹啉基、异喹啉基、喋啶基、嘌呤基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并吡啶基、苯并嘧啶基、苯并吡嗪基、苯并咪唑基、苯并酞嗪基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]嘧啶基、咪唑并[1,2-b]哒嗪基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪基、[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶基、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基等。

本发明所述的活性化合物，例如化合物A、AMG510和MRTX849等，解释为包括所述化合物及其互变异构体、立体异构体、光学异构体、溶剂化物、氮氧化物、前药、同位素衍生物或其药学上可接受的盐。所述化合物的互变异构体、立体异构体、光学异构体、溶剂化物、氮氧化物、前药、同位素衍生物或其药学上可接受的盐通过本领域常规技术手段获得，在体内外以与所述化合物基本相同的作用机理，发挥相同或相似的效用。

术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指在合理医学判断范围内适用于与哺乳动物特别是人的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等并与合理的效益/风险比相称的盐。如果所述化合物为碱性，则药学上可接受的盐包含选自无机酸制备的盐，也包括选自有机酸制备的盐。如果所述化合物为酸性的，则药学上可接受的盐包括无机碱和/或有机碱制备的盐。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括构型异构体和构象异构体，其中，构型异构体又包括几何异构体(或顺反异构体)和光学异构体(包含对映异构体和非对映异构体)。

几何异构体可以存在于本化合物中。本发明的化合物可以含有E或Z构型的碳-碳双键或碳-氮双键，其中术语“E”代表碳-碳或碳-氮双键的对侧的更高顺序取代基，术语“Z”代表碳-碳或碳-氮双键的同侧上的更高顺序取代基(利用Cahn-IngoldPrelog优先规则确定)。本发明的化合物还可以以“E”和“Z”异构体的混合物形态存在。将环烷基或杂环烷基周围的取代基称为顺式或反式构型。

光学异构体指的是分子结构完全相同，物理化学性质相近，但旋光性不同的物质。本发明的化合物在R或S构型中可以含有不对称取代的碳原子，其中术语“R”和“S”如IUPAC1974Recommendations for Section E,Fundamental Stereochemistry,Pure Appl.Chem.(1976)45,13-10所定义。具有不对称取代的碳原子的化合物(具有相等数量的R和S构型)在那些碳原子处是外消旋的。具有过量的一种构型(相对于另一个)的原子使该构型存在更高数量，优选过量大约85％-90％，更优选过量大约95％-99％，更加优选过量大于大约99％。相应地，本发明包括外消旋混合物、相对和绝对光学异构体和相对与绝对光学异构体的混合物。

术语“氮氧化物”是指当化合物含有几个胺官能团时，可将1个或大于1个氮原子氧化形成N-氧化物。N-氧化物的特殊实例是叔胺的N-氧化物或含氮杂环氮原子上的N-氧化物。

术语“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。

术语“互变异构体”是指具有不同能量的可通过低能垒互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。

术语“同位素衍生物”是指本发明的化合物可以以同位素示踪的或富集形式存在，含有一个或多个原子，这些原子的原子量或质量数不同于自然界中发现的最大量的原子的原子量或质量数。同位素可以是放射性或非放射性的同位素。原子例如氢、碳、磷、硫、氟、氯和碘的同位素包括但不局限于：²H,³H,¹³C,¹⁴C,¹⁵N,¹⁸O,³²P,³⁵S,¹⁸F,³⁶Cl和¹²⁵I。含有这些和/或其它原子的其它同位素的化合物在本发明范围之内。

在另一个实施方案中，同位素标记的化合物含有氘(²H)、氚(³H)或¹⁴C同位素。本发明的同位素标记的化合物可以利用本领域普通技术人员熟知的一般方法来制备。在这方面，相关的文献包括：Lizondo,J et al,Drugs Fut,21(11),1116(1996)；Brickner,S J etal,J Med Chem,39(3),673(1996)；Mallesham,B et al,Org Lett,5(7),963(2003)。

含有同位素的化合物已经用于药物研究，通过评价非同位素示踪的母体化合物的作用机理和代谢途径，研究化合物的体内代谢结果(Blake et al,J.Pharm.Sci.64,3,367-391(1975))。在安全、有效的治疗药物设计方面，这种代谢研究是重要的，这是因为给予患者的体内活性化合物或因为母体化合物产生的代谢物被证明是毒性的或致癌的(Kushneret al,Can.J.Physiol.Pharmacol.,77,79-88(1999)；Foster et al,Advances in DrugResearch Vol.14,pp.2-36,Academic press,London,1985；Kato et al,J.LabelledComp.Radiopharmaceut.,36(10):927-932(1995))。

另外，含有非放射性活性同位素的药物，例如称为“重药物”的氘代药物，可以用于治疗相关的疾病和病症。存在于上面化合物中的同位素的量提高到其天然丰度以上被称作富集。富集的量的例子包括大约0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，16，21，25，29，33，37，42，46，50，54，58，63，67，71，75，79，84，88，92，96至大约100mol％。

分子结构中任意可能的位点均可被同位素取代，得到同位素衍生物。例如，在分子中任意可能的位点可被氘(²H)取代，得到氘代形式的衍生物。

用稳定同位素示踪的药物，可以改变药物的理化性质，例如pKa和脂质溶解度。如果同位素取代影响参与配体-受体相互作用的区域，那么这些效果和改变可以影响药物分子的药效响应。尽管稳定同位素示踪的分子的一些物理性能不同于未示踪的分子的物理性能，但化学和生物学特性是相同的，一种重要的不同是：由于重同位素的质量增加，涉及重同位素和另一个原子的任何键比轻同位素和该原子之间的相同的键更强。相应地，在代谢或酶催转化的位点结合同位素可以使所述反应潜在地减缓，相对于非同位素化合物，可以改变药物动力学特性或效果。

术语“前药”或“前体药物”是设计的活性药物的衍生物，其可以改善一些确定的、不合需要的物理或生物学性质。物理性能通常是相关的溶解度(过高或不足的脂质或水溶性)或稳定性，而有问题的生物学特性包括代谢太快或生物利用率差，这本身可能与物理化学性质相关。

前体药物通常如下制备：a)形成活性药物的酯、半酯、碳酸脂、硝酸酯、酰胺、异羟肟酸、氨基甲酸酯、亚胺、曼尼希碱、磷酸盐、磷酸酯和烯胺，b)用偶氮、糖苷、肽和醚官能团使药物功能化，c)使用药物的缩醛胺、半缩醛胺、聚合物、盐、复合物、磷酰胺、乙缩醛、半缩醛和缩酮形式。例如，参见Andrejus Korolkovas’s,“Essentials of MedicinalChemistry”,John Wiley-Interscience Pulications,John Wiley and Sons,New York(1988),pp.97-118，本文结合其所有内容作为参考。酯可以利用本领域技术人员已知的一般方法，由含有羟基或羧基的底物来制备。这些化合物的典型反应是用另一个原子替代一个杂原子的取代。酰胺可以用类似的方式、由含有氨基或羧基的底物来制备。酯还可以与胺或氨反应，形成酰胺。制备酰胺的另一种方式是将羧酸和胺一起加热。

术语“药学上可接受的辅料”或“药学上可接受的载体”包含但不限于由美国食品与药物管理局、中国国家药品监督管理局等批准可接受用于人类或家养动物的任一佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

术语“肿瘤”包含良性肿瘤、恶性肿瘤和交界性肿瘤，其中恶性肿瘤又统称为癌。

在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。

术语“患者或受试者”包括人及其它动物。在一个实施方案中，本文所述的方法可用于人类临床医学、兽医和动物试验。因此，“患者或受试者”可以是人，或者在兽医应用的情况下可以是家畜或宠物，或者在动物试验过程中用于实验动物如啮齿动物(例如小鼠、大鼠)、犬、猴等。

术语“KRAS^G12C抑制剂”包括但不限于：本领域已知的选择性抑制KRAS^G12C基因或选择性抑制由KRAS^G12C基因编码的蛋白质(K-ras^G12C蛋白)的任何化合物或试剂，其涉及RAS/MAPK信号通路，其中KRAS基因编码的K-ras蛋白产物具有错义突变G12C。术语KRAS基因、K-ras蛋白和RAS/MAPK信号途径为本领域技术人员所知和理解。所述KRAS^G12C突变基因编码的K-ras蛋白12位的甘氨酸-半胱氨酸突变(即K-ras^G12C蛋白)。作为KRAS^G12C基因的产物的K-ras^G12C蛋白的产生是编码序列突变的结果，例如在编码序列的34位鸟嘌呤对胸腺嘧啶的取代。所述KRAS^G12C抑制剂可以是本领域已知的选择性靶向KRAS^G12C基因的任何试剂，并且包括那些能够选择性地抑制或能够选择性地干扰KRAS^G12C基因(或其相应信使RNA)转录(和/或翻译)到K-ras^G12C蛋白的试剂，例如siRNA、寡核苷酸、核糖核酸等。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂能选择性地抑制或选择性地干扰KRAS^G12C和/或相应信使RNA的转录/翻译，所述KRAS^G12C抑制剂可以是生物制剂，如siRNA、寡核苷酸、核糖核酸等。在一些实施方案中，所述KRAS^G12C抑制剂可选择性地抑制由KRAS^G12C基因编码的K-ras^G12C蛋白，所述KRAS^G12C抑制剂可以是生物制剂，例如抗体(例如，单克隆抗体或mAb)，小分子药物/抑制剂或靶向剂。“KRAS^G12C抑制剂”的例子包括但不限于AMG-510、MRTX849、JNJ-74699157(即ARS-3248)、ARS-1620、MRTX1257、RM-007、ADT-007等。在一些实施方案中，KRAS^G12C抑制剂是在美国专利US20180334454中公开的化合物，在此引入该专利作为KRAS^G12C抑制剂的示例性参考。在一些实施方案中，KRAS^G12C抑制剂是AMG510。在一些实施方案中，KRAS^G12C抑制剂是在美国专利US20190270743和US20190144444中公开的化合物，在此引入上述专利作为KRAS^G12C抑制剂的示例性参考。在一些实施方案中，KRAS^G12C抑制剂是MRTX849。其中，AMG510和MRTX849的结构分别如下所示：

为了提供更简洁的描述，本文中的一些定量数据没有使用术语“约”。应当理解，无论明确使用或不明确使用术语“约”，这里给出的每一个数值都不仅包括实际给出的值(给定值)，并且它还意味着包括基于本领域普通技术人员合理推断的这种给定值的近似值，包括由于实验和/或测量条件而产生的这种给定值的等价物和近似值。所述近似值优选在给定值的基础上±20％、±15％、±10％、±8％、±6％、±5％、±4％、±3％、2％、±1％。

本文提及的所有专利、专利申请和其它公开内容通过引用全部并入本文。如果在本文中提出的定义与在此引入作为参考的专利、专利申请或其它公开中提出的定义相反或不一致，则在本文中提出的定义优于在此引入作为参考的定义。

在本发明中，使用的术语如下所述：

DCM：二氯甲烷；DIPEA：二异丙基乙胺；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；EA：乙酸乙酯；NBS：N-溴代丁二酰亚胺；PE：石油醚；DMSO：二甲基亚砜；TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐；ATP：5'-三磷酸腺苷；DTT：1,4-二硫苏糖醇；MTT：3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一类结构新颖的化合物，体外激酶活性抑制试验显示：本发明化合物对TRK、ALK、ROS1激酶及其突变体，特别是对TRK及其突变形式显现了优良的抑制活性；体外细胞抑制活性试验显示：本发明化合物对多种TRK突变的细胞(包括TRK突变的耐药细胞)具有较强的抑制作用，对6种细胞的IC₅₀在10nM以下，优选化合物的IC₅₀在3nM以下；体内抑瘤试验结果显示：与对照化合物相比，本发明化合物具有更好的体内抗肿瘤效果，耐受性更好，成药可能性较高；体内作用机制研究试验显示：本发明化合物能够抑制肿瘤组织中的TRK，进而有效抑制PLCγ及AKT的磷酸化，抑制肿瘤组织生长；联合使用本发明化合物与KRAS^G12C抑制剂(例如AMG510)能协同增强药物对KRAS^G12C突变的肿瘤(例如非小细胞肺癌、胰腺癌)的抑制作用，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1本发明化合物4对TRKA-G595R突变耐药荷瘤小鼠瘤组织内下游靶蛋白磷酸化的抑制作用时效关系western blot图。

具体实施方式

以下具体实施方式中涉及的原料、反应试剂、催化剂或溶剂，均可通过商业途径购买得到或现有技术常规方法制备得到。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域专业人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法之中。文中所示的较佳实施方法与材料仅做示范之用。

制备例A：6-氯咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-羧酸乙酯的制备

将(E)-3-乙氧基丙烯酸乙酯(5.00g,34.7mmol,1eq)的1,4-二氧六环(50mL)和水(50mL)溶液降温至-10℃，分批加入NBS(6.80g,38.15mmol,1.1eq)，自然升至室温反应2h；加入6-氯-3-氨基哒嗪(4.5g,34.7mmol，1eq)，升温至80℃反应1.5h，降温至室温；减压浓缩，残留物加水(100mL)和EA(100mL)，搅拌，分液，水相用EA(20mL×2)萃取，合并有机相；有机相用H₂O(50mL)、饱和食盐水(50mL)洗涤，减压浓缩除去有机溶剂，残留物用硅胶柱层析进行分离(洗脱剂:正己烷:EA＝5:1～1:1，v/v)，得6-氯咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-羧酸乙酯(5.2g,收率59.75％)，(ES,m/z):225.91[M+H]⁺。

中间体制备例1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A1)

步骤a：将(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(5.0g，27.292mmol)，5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(6.14g，27.292mmol)，正丁醇(70mL)和二异丙胺(6.9g，68.230mmol)的混合溶液在100℃下回流搅拌4h，减压浓缩得到橙色粘稠状固体，加入无水乙醚，搅拌有大量固体析出，抽滤得到(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯粗品(6.224g)。未进行纯化，直接用于下步反应，(ES,m/z):373.02[M+H]⁺。

步骤b：将(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯粗品(6.224g，16.714mmol)溶于无水乙醇(40mL)，75℃搅拌直至混合溶液澄清透明，再加入LiOH(2.805g，66.856mmol)水溶液(40mL)，75℃搅拌3h。冷却至室温后，减压浓缩，除去无水乙醇。缓慢滴加1NHCl水溶液调节pH3～4，有大量白色固体析出，室温搅拌30min后抽滤，滤饼再用少量纯化水洗涤。收集滤饼，晾干后称重，得到(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(5.64g，98％)，(ES,m/z):345.02[M+H]⁺。

中间体制备例2：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A2)

步骤a：将(2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷(5.826g，28.958mmol)，5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(6.534g，28.958mmol)，正丁醇(50mL)和二异丙胺(8.790g，86.874mmol)的混合溶液在100℃下反应4h，减压浓缩得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯粗品。未进行纯化，直接用于下步反应，(ES,m/z):391.05[M+H]⁺。

步骤b：将5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯粗品溶于无水乙醇(50mL)，75℃下搅拌直至体系澄清透明，再加入LiOH(4.86g，115.832mmol)水溶液(50mL)，75℃搅拌反应5h。冷却至室温后，减压浓缩，除去无水乙醇。缓慢滴加1NHCl水溶液调节pH3～4，有大量白色固体析出，室温搅拌30min后抽滤，滤饼再用少量纯化水洗涤。收集滤饼，晾干后称重，得到白色粉末状固体5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(9.9g)。滤液用EA(2×50mL)萃取，合并有机相，用水(2×50mL)及饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。柱层析纯化(PE:EA＝4:1～2:1，v/v)，收集产物点，减压浓缩，得到白色粉末状固体5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(386mg)。共得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸纯品(10.286g，98％)，(ES,m/z):363.04[M+H]⁺。

中间体制备例1a～2a：

参照中间体制备例1和2的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A1a～A2a：

中间体制备例3：5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A3)

步骤a：氮气保护下，0℃条件下，向2,5-二氟苯甲醛(28.4g，0.2mol)的7mol/LNH₃/CH₃OH液(30mL)中滴加三甲基氰硅烷(39.66g，0.4mol)，滴毕后室温过夜搅拌反应；反应液减压浓缩，残留物柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝50:1，V/V)，得到2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙腈(21.92g，65.2％)，(ES,m/z):169[M+H]⁺。

步骤b：将2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙腈(21.92g，130mmol)加入到2mol/L NaOH水溶液(130mL)中，回流条件下反应6h；降温至0℃，用浓盐酸调节pH至3，减压浓缩至干；残留物中加入四氢呋喃(200mL)，搅拌30min，过滤，滤液用无水硫酸钠过夜干燥，过滤，减压浓缩干，得到2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙酸粗品(20.78g)，未纯化直接用于下步反应，(ES,m/z):186.02[M-H]^-。

步骤c：氮气保护下，将2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙酸(20.78g，111mmol)四氢呋喃(600mL)溶液降温至-10～-5℃，分批加入四氢铝锂(10.53g，278mmol)，加完后室温过夜反应；向反应液中加入饱和氯化铵溶液(500mL)淬灭反应，过硅藻土过滤，滤液分层，水相用EA(2×100mL)萃取，合并有机相；有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩；残留物经柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝10:1，V/V)，得到2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙醇(7.177g，两步总收率32％)，(ES,m/z):174.02[M+H]⁺。

步骤d：氮气保护下，0℃条件下，向2-氨基-2-(2,5-二氟苯基)乙醇(7.177g，41.447mmol)、三乙胺(8.388g，82.894mmol)的四氢呋喃(200ml)溶液中加入氯乙酰氯(5.62g，49.736mmol)，保温搅拌反应30min；向反应体系中分批加入60％NaH(4.974g，124.341mmol)，加完后室温反应2h；用饱和氯化铵(100ml)淬灭反应，分液，水相用EA(2×50ml)萃取，合并有机相；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩；残留物经柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝80:1～20:1，V/V)，得到5-(2,5-二氟苯基)吗啉-3-酮(4.532g，51.3％)，(ES,m/z):214.01[M+H]⁺。

步骤e：氮气保护下，0℃条件下，向5-(2,5-二氟苯基)吗啉-3-酮(4.532g，21.271mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中分批加入四氢铝锂(3.229g，85.849mmol)，加完后50℃反应2h；降温至0℃，用饱和氯化铵(90mL)淬灭反应，减压浓缩，水相用EA(3×50mL)萃取，合并有机相；有机相用水(50mL)，盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩；残留物经柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝50:1～25:1，V/V)，得到3-(2,5-二氟苯基)吗啉(3.40g，80.3％)，(ES,m/z):200.03[M+H]⁺。

步骤f：将3-(2,5-二氟苯基)吗啉(3.40g，17.068mmol)，5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(3.851g，17.068mmol)，正丁醇(50mL)和二异丙胺(5.181g，51.204mmol)的混合溶液在100℃下过夜反应；减压浓缩，向残留物中加入EA(100mL)和水(100mL)，搅拌，分液，水相用EA(2×50mL)萃取，合并有机相；有机相用水(100mL)，盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩；残留物经柱层析纯化(正己烷:乙酸乙酯＝50:1～10:1，V/V)，得到5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(6.066g，91.5％)，(ES,m/z):389.05[M+H]⁺。

步骤g：向5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(6.066g，15.623mmol)乙醇(60mL)溶液中加入LiOH(2.622g，62.492mmol)水溶液(60mL)，升温至75℃过夜反应。冷却至室温后，减压浓缩，水相用1N盐酸水溶液调节pH至2～3，用EA(3×60mL)萃取，合并有机相；有机相用水(100mL)及盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝4:1～1:1，v/v)，得到5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(5.324g，94.6％)，(ES,m/z):361.09[M+H]⁺。

中间体制备例4：5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A4)

参照中间体制备例3步骤a-f方法，以5-氟-2-甲氧基-3-吡啶甲醛为原料，制备得到5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯。

向5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(5.00g，12.46mmol)无水乙醇(50mL)溶液中加入LiOH(2.091g，49.827mmol)水溶液(50mL)，75℃过夜反应。冷却至室温后，减压浓缩，水相用1N盐酸水溶液调节pH至2～3，用EA(3×50ml)萃取，合并有机相；有机相用水(50ml)及盐水(50ml)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝4:1～1:1，v/v)，得到5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(4.277g，92％)，(ES,m/z):374.02[M+H]⁺。

中间体制备例5：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A5)

步骤a：将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪(850mg，3.067mmol)加入含(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(880mg，2.556mmol)与TBTU(985mg，3.067mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(991mg，7.668mmol)，室温过夜反应。反应液加入水(50mL)混合搅拌，有固体析出，通过减压抽滤得到滤饼，真空干燥箱干燥，得到(R)-叔丁基4-(4-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(1.450g，94％)，(ES,m/z):604.52[M+H]⁺。

步骤b：向(R)-叔丁基4-(4-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(1.45g，2.402mmol)中加入DCM和CF₃COOH(12mL，3/1，v/v)，室温搅拌2.5h，将反应液减压浓缩，向残留物中加入水(12mL)和EA(6mL)，用氨水调碱(pH＝9)，搅拌有固体析出，通过减压抽滤得到滤饼，用少量水淋洗滤饼，晾干后称重，得到(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(999mg)，(ES,m/z):504.13[M+H]⁺。

中间体制备例5a和6～9：

参照中间体制备例5的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A5a及A6～A9：

中间体制备例10：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A10)

步骤a：将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪(918mg，3.312mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A2，1000mg，2.76mmol)与TBTU(1063mg，3.312mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(1284mg，9.936mmol)，室温过夜反应。反应液加入水(50mL)混合搅拌，有固体析出，通过减压抽滤得到滤饼，真空干燥箱干燥，得到叔丁基4-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基哌嗪-1-羧酸酯(1320mg，77％)。(ES,m/z):622.09[M+H]⁺。

步骤b：向叔丁基4-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基哌嗪-1-羧酸酯(1.320g，2.125mmol)中加入DCM和CF₃COOH(12mL，3/1，v/v)，室温搅拌4h，将反应液减压浓缩，向残留物中加入水(80mL)和EA(10mL)，用氨水调碱(pH＝9)，搅拌有固体析出，通过减压抽滤得到滤饼，用少量水淋洗滤饼，晾干后称重，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(907mg，82％)，(ES,m/z):522.09[M+H]⁺。

中间体制备例10a：

参照中间体制备例10的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A10a：

中间体制备例11：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A11)

步骤a：将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌啶(458mg，1.656mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A2，500mg，1.380mmol)与TBTU(532mg，1.656mmol)的无水DMF(5mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(535mg，4.140mmol)，室温过夜反应18h。反应液加入水(50mL)混合搅拌，有固体析出，通过减压抽滤得到滤饼，真空干燥箱干燥，得到叔丁基4-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基哌啶-1-羧酸酯(627mg，73％)。(ES,m/z):621.15[M+H]⁺。

步骤b：向叔丁基4-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基哌啶-1-羧酸酯(627mg，1.101mmol)中加入DCM和CF₃COOH(8mL，3/1，v/v)，室温搅拌4h，将反应液减压浓缩，向残留物中加入水(80mL)和EA(50mL)，用氨水调碱(pH＝9)，用EA(55mL×2)萃取该水相，并用H₂O(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的萃取相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩残留物，残留物用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用3％(v/v)MeOH-DCM洗掉极性偏小后的杂质后，换用10％(v/v)MeOH-DCM洗脱，收集产物点并浓缩，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(437mg，76％)，(ES,m/z):521.14[M+H]⁺。

中间体制备例11a和12：

参照中间体制备例11的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A11a和A12：

中间体制备例13：5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A13)

步骤a：氮气保护下，将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪(3.812g，13.756mmol)加入含5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(4.127g，11.46mmol)与TBTU(4.417g，13.756mmol)的无水DMF(20mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(4.441g，34.362mmol)，室温过夜反应。反应液加入EA(100ml)和水(100mL)混合搅拌，分液；水相用EA(2×50ml)萃取，合并有机相；有机相用水(2×50mL)及盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝80:1～60:1，v/v)，得到4-(4-(5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺基)苯基叔丁基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3.924g，55.3％)，(ES,m/z):620.49[M+H]⁺。

步骤b：向4-(4-(5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺基)苯基叔丁基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3.924g，6.332mmol)的DCM(30ml)溶液中加入CF₃COOH(10ml)，室温搅拌4h，将反应液减压浓缩，向残留物中加入水(100mL)和EA(100ml)，用氨水调节pH至9，分液，水相用EA(2×50ml)萃取，合并有机相；有机相用水(100mL)、盐水(50mL)洗涤；无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝50:1～10:1,v/v)，得到5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(2.978g，90.5％)，(ES,m/z):520.11[M+H]⁺。

中间体制备例14：

参照中间体制备例13的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A14：

中间体制备例15：5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A15)

步骤a：氮气保护下，将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪(3.813g，13.747mmol)加入含5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(4.277g，11.46mmol)与TBTU(4.414g，13.747mmol)的无水DMF(20mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(4.441g，34.368mmol)，室温过夜反应。反应液加入EA(100ml)和水(100mL)混合搅拌，分液；水相用EA(2×50ml)萃取，合并有机相；有机相用水(2×50mL)及盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝100:1～50:1，v/v)，得到4-(4-(5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.736g，65.3％)，(ES,m/z):633.09[M+H]⁺。

步骤b：向4-(4-(5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.736g，7.485mmol)的DCM(30ml)溶液中加入CF₃COOH(10ml)，室温搅拌4h，将反应液减压浓缩，向残留物中加入水(100mL)和EA(100ml)，用氨水调节pH至9，分液，水相用EA(2×50ml)萃取，合并有机相；有机相用水(100mL)、盐水(50mL)洗涤；无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝50:1～10:1,v/v)，得到5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(3.685g，92.5％)，(ES,m/z):533.10[M+H]⁺。

中间体制备例16：

参照中间体制备例15的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体A16：

中间体制备例17：N1-(氧杂环丁-3-基)苯-1,4-二胺(中间体B1)

步骤a：将3-氧杂环丁胺(124mg，1.701mmol)加入含有对氟硝基苯(200mg，1.417mmol)的DMSO(3mL)溶液中，然后添加DIPEA(366mg，2.834mmol)，在120℃条件下搅拌反应5h，向反应液中加入水(20mL)，搅拌有大量固体析出，减压抽滤，得到滤饼N-(4-硝基苯基)氧杂-3-胺(268mg，97％)，(ES,m/z):195.01[M+H]⁺。

步骤b：将上一步中得到的滤饼N-(4-硝基苯基)氧杂-3-胺(268mg，1.380mmol)和甲醇(15mL)加入反应瓶中，加入10％Pd/C，H₂置换后搅拌4h。抽滤出Pd/C，旋干滤液得到N-1-(氧杂环丁-3-基)苯-1,4-二胺固体产品(110mg)，(ES,m/z):164.92[M+H]⁺。

中间体制备例18～24：

参照中间体制备例17的工艺步骤，采用以下相应的起始原料、对氟硝基苯及制备方法制备中间体B2～B8：

中间体制备例25：(R)-6-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-3-羧酸(中间体C1)

步骤a～c:参照专利CN108794484B实施例1第一至三步骤方法，制备(R)-6-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-3-羧酸，(ES,m/z):346.02[M+H]⁺。

中间体制备例26：6-((2R，4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-3-羧酸(中间体C2)

步骤a～c：参照中间体制备例25的工艺步骤方法，制备得到6-((2R，4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-3-羧酸，(ES,m/z):364.03[M+H]⁺。

中间体制备例27～30：

参照中间体制备例5的工艺步骤，采用以下相应的起始原料及制备方法制备中间体C3～C6：

以下为本发明化合物的实施例。

实施例1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物1)

将羟基乙酸(32mg，0.417mmol)加入含(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A5，70mg，0.139mmol)与BOP(74mg，0.167mmol)的无水DMF(3mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(54mg，0.417mmol)，室温搅拌反应4h。反应液加入水(20mL)混合，用EA(15mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用1％(v/v)MeOH-DCM，后用2％(v/v)MeOH-DCM洗脱，收集产物点并浓缩，得到(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(44mg，56％)，(ES,m/z):562.13[M+H]⁺。

实施例1a、1b和2～3：

参照实施例1的制备工艺路线及操作，采用以下物料和中间体A5、A5a或C3作为起始原料，制备化合物1a、1b和2～3。

实施例4：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物4)

将羟基乙酸(306mg，4.026mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A10，700mg，1.342mmol)与BOP(712mg，1.610mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(520mg，4.026mmol)，室温搅拌反应4h。反应液加入水(80mL)混合，用EA(55mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(80mL)、盐水(80mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用1％(v/v)MeOH-DCM，后用2％(v/v)MeOH-DCM洗脱，收集产物点并浓缩，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(666mg，86％)，(ES,m/z):580.14[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.810(s,1H),8.906-8.723(m,1H),8.283-8.229(m,1H),7.623(s,1H),7.343(s,1H),7.210(s,2H),7.061-6.842(m,4H),5.711-5.495(m,2H),4.631(t,J＝5.4Hz,1H),4.556-4.548(m,1H),4.318-4.225(m,1H),4.150(d,J＝5.4Hz，2H)，3.637(s,2H),3.513(s,2H),3.124-3.106(m,4H),2.957-2.912(m,1H)。

实施例4a～4b、5a、7a～7b和5～9：

按照实施例4的制备工艺路线及操作，采用中间体A10、A10a或C4和以下物料作为起始原料，制备化合物4a～4b、5a、7a～7b和5～9。

实施例10：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(1-(2-羟基乙酰基)哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物10)

将羟基乙酸(438mg，5.763mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A11，1000mg，1.921mmol)与BOP(1274mg，2.882mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(745mg，5.763mmol)，室温过夜搅拌反应。反应液加入水(100mL)混合，用EA(80mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(100mL)、盐水(110mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用1％(v/v)MeOH-DCM，5后用2％(v/v)MeOH-DCM洗脱，收集产物点并浓缩，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(1-(2-羟基乙酰基)哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(820mg，74％)，(ES,m/z)：579.14[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.952(s,1H),9.022-8.753(m,1H),8.355-8.152(m,2H),7.663(s,1H),7.343-7.042(m,6H),5.773-5.552(m,2H),4.529-4.481(m,2H),4.358-4.115(m,3H),3.803-3.779(m,1H),3.640-3.603(m,1H),3.090-3.049(m,1H),2.968-2.957(m,1H),2.792-2.752(m,1H),2.722-2.682(m,1H),2.241-2.212(m,1H),1.808(s,2H),1.608-1.589(m,1H),1.492-1.476(m,1H)。

实施例10a～10b，11a～11b和11～17：

按照实施例10的制备工艺路线及操作，采用中间体A11、A11a或C6和以下物料作为起始原料，制备化合物10a～10b，11a～11b和11～17。

实施例18：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物18)

将羟基乙酸(51mg，0.672mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A12，120mg，0.224mmol)与BOP试剂(149mg，0.336mmol)的无水DMF(12mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(87mg，0.672mmol)，室温搅拌反应4h。反应液加入水(20mL)混合，用EA(10mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用1％(v/v)MeOH-DCM，后增加至2％(v/v)MeOH-DCM，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(4-(2-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(30mg，22％)，(ES,m/z)：594.12[M+H]⁺。

实施例19：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(氧杂环丁-3-基氨基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物19)

将N1-(氧杂环丁-3-基)苯-1,4-二胺(105mg，0.640mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A2，193mg，0.534mmol)与TBTU(205mg，0.640mmol)的无水DMF(5mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(205mg，1.602mmol)，室温过夜搅拌反应14h。反应液加入水(25mL)混合，用EA(15mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残留物，制备液相色谱柱分离(X-BridgeC1819*150mm5um，洗脱体系：5-25％的乙腈水溶液梯度洗脱，0.05％NH₄HCO₃改性)，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(氧杂环丁-3-基氨基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(60mg，22.1％)，(ES,m/z):509.12[M+H]⁺。

实施例19a～19b和20～24：

按照实施例19的制备工艺路线及操作，采用以下中间体作为起始原料，制备化合物19a～19b和20～24：

实施例25：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(6-(2-羟基乙酰基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-3-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物25)

步骤a：将3-(4-氨基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯(442mg，1.528mmol)(中间体B5)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A2，460mg，1.270mmol)与TBTU(491mg，1.528mmol)的无水DMF(5mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(494mg，3.819mmol)，室温过夜搅拌反应14h。反应液加入水(100mL)混合搅拌，有大量固体析出，减压抽滤后干燥，得到叔丁基3-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸酯固体粗品。

步骤b：将上述所得叔丁基3-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸酯固体粗品溶于DCM(25mL)，加入CF₃COOH(5mL)室温搅拌3h。旋干反应液，加入水稀释后氨水调碱，有固体析出，抽滤后晾干，得到N-(4-(3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基-3-基)苯基)-5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺固体产品(450mg)。

步骤c：将羟基乙酸(35mg，0.450mmol)加入含N-(4-(3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基-3-基)苯基)-5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(200mg，0.375mmol)与TBTU(145mg，0.450mmol)的无水DMF(5mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(146mg，1.125mmol)，室温搅拌反应4h。反应液加入水(30mL)混合，用EA(20mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(30mL)、盐水(40mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，先用1％MeOH-DCM，后用2％MeOH-DCM洗脱，收集产物点并浓缩，得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(6-(2-羟基乙酰基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-3-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(180mg，81％)，(ES,m/z):592.02[M+H]⁺。

实施例26：5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(6-(2-羟基乙酰基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物26)

步骤a：将6-(4-氨基苯基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(178mg，0.607mmol)(中间体B8)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(中间体A2，200mg，0.552mmol)与TBTU(217mg，0.607mmol)的无水DMF(5mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(217mg，1.656mmol)，室温过夜搅拌反应14h。反应液加入水(30mL)混合搅拌，有大量固体析出，减压抽滤后干燥，得到叔丁基6-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸酯固体粗品，(ES,m/z):534.12[M+H]⁺。

步骤b：将上述所得叔丁基6-(4-(5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸酯固体粗品溶于DCM(6mL)，加入CF₃COOH(2mL)室温搅拌3h。旋干反应液，加入水稀释后氨水调碱，有固体析出，抽滤后晾干，得到N-(4-(2,6-二氮杂螺并[3.3]庚基-2-基)苯基)-5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺固体产品(218mg)。

步骤c：将羟基乙酸(37mg，0.490mmol)加入含N-(4-(2,6-二氮杂螺并[3.3]庚基-2-基)苯基)-5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(218mg，0.409mmol)与TBTU(157mg，0.490mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(158mg，1.226mmol)，室温搅拌反应4h。反应液加入水(30mL)混合，用EA(20mL×2)萃取该混合物，并用H₂O(30mL)、盐水(40mL)洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩残留物，制备板分离纯化(展开剂：DCM:MeOH＝15:1，v/v)得到5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(6-(2-羟基乙酰基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(51mg，94％)，(ES,m/z):592.12[M+H]⁺。

实施例27：5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物27)

将羟基乙酸(584mg，7.676mmol)加入含5-((2R,4S)-2-(2,5-二氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)-N-(4-(哌啶-4-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A13，997mg，1.919mmol)与BOP(1274mg，2.878mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(744mg，5.756mmol)，室温过夜搅拌反应。反应液加入水(100mL)混合，用EA(80mL×2)萃取，合并有机相；有机相用H₂O(100mL)、盐水(110mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，洗脱剂(DCM:CH₃OH＝100:1～50:1，v/v)，收集产物点并浓缩，得到5-(3-(2,5-二氟苯基)吗啉基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(609.8mg，55％)，(ES,m/z)：578.12[M+H]⁺。

实施例28

按照实施例27的制备工艺路线及操作，采用A14和羟基乙酸作为起始原料，制备化合物28。

实施例29：5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(化合物29)

将羟基乙酸(511mg，6.723mmol)加入含5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉代)-N-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(中间体A15，1.022g，1.92mmol)与BOP(1274mg，2.878mmol)的无水DMF(10mL)溶液中，然后0℃条件下滴加DIPEA(744mg，5.763mmol)，室温过夜搅拌反应。反应液加入水(100mL)混合，用EA(80mL×2)萃取，合并有机相；有机相用H₂O(100mL)、盐水(110mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩残留物，用柱层析硅胶柱进行洗脱，洗脱剂(DCM:CH₃OH＝100:1～50:1，v/v)，收集产物点并浓缩，得到5-(3-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吗啉基)-N-(4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(737mg，65.02％)，(ES,m/z)：591.20[M+H]⁺。

实施例30

按照实施例29的制备工艺路线及操作，采用A16和羟基乙酸作为起始原料，制备化合物30。

实施例31-47

参照中间体制备例1～30及实施例1～30的制备工艺路线、操作，参考CN111936500A中公开的方法，以(2R)-2-(2,5-二氟苯基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷和各中间体为原料，制备化合物31～47。

对照品制备例1-5：

另：参照WO2019029629A1和WO2012034095A1专利文件中制备工艺路线、操作制备化合物D1～D5。

试验例1：化合物对TRK的激酶抑制试验

1.操作步骤：

1.1激酶反应：

在化合物板中依次加入一定浓度梯度的待测化合物、酶溶液(阴性对照孔加入激酶缓冲液(1X kinase buffer(Cisbio,Cat#62EZBFDD)，pH7.5；5mM MgCl₂，1mM DTT))，1000rpm离心30秒。封板，并将板子放在25℃的恒温培养箱中孵育30分钟。制备TK-Sub-biotin(Cisbio，Cat#61TKOBL)以及ATP(Sigma，Cat#R0441)的底物溶液，并将底物混合溶液加入到384孔板中，1000rpm离心30秒。封板，并将板子放在25℃的恒温培养箱中孵育60分钟。

1.2激酶检测：

将TK抗体和XL665稀释、混合并加入assay板中，1000rpm离心30秒。封板，并将板子放在25℃的恒温培养箱中孵育60分钟。将assay板放置在Envision机器上读数。(HTRF 665/615比值：665nm信号值/615nm信号值)

抑制率＝(比值_{阴性对照孔}-比值_化合物孔)/(比值_{阴性对照孔}-比值_{无酶对照孔})×100％

1.3数据分析和曲线拟合

在XLFit excel插件版本5.4.0.8中拟合数据以获得IC₅₀值。

1.4QC参数

参考化合物被包含在每块板中，且其IC₅₀每次都在3倍以内。

2.试验结果：如表1所示

表1本发明化合物及对照化合物对TRK的激酶抑制活性

备注：以上RXDX-101、LOXO-195、LOXO-101均为已公开的化合物，并可市售获得上市产品(药品或化工级产品)。

结果表明：本发明化合物在多种激酶中展现了较高的激酶抑制活性，在TRKA、TRKB、TRKC和TRKC-G696A中活性优于RXDX-101、LOXO-195和LOXO-101或相当，而在多种突变耐药型激酶中(G595R、G667C、G623R)抑制活性显著优于RXDX-101、LOXO-195和LOXO-101。

试验例2：化合物对ALK和ROS1的激酶抑制试验

1.操作步骤：

1.1激酶反应：

化合物用DMSO稀释成一定浓度，并4倍梯度稀释。在384孔板中分别加入一定浓度化合物，酶溶液和DMSO，室温孵育10min；加入荧光素标记肽，ATP(sigma,Cat.No.:A7699-1G,LotNo.:987-65-5)28℃孵育一定时间；加入终止液。读数。

单个浓度对应的抑制率公式：抑制率＝(OD_{阴性对照孔}-OD_化合物孔)/(OD_{阴性对照孔}-OD_{无酶对照孔})×100％

1.2数据分析和曲线拟合

在XLFitexcel插件版本4.3.1中拟合数据以获得IC₅₀值，结果如表2。

表2本发明化合物及对照化合物对ALK和ROS1激酶抑制活性

结果表明：本发明多个化合物在ROS1激酶中表现出较强的抑制活性，显著优于RXDX-101和LOXO-101，优于LOXO-195；对ALK激酶也具有良好的抑制活性，显著优于LOXO-101和LOXO-195。

试验例3：化合物对细胞的体外抑制试验

1.细胞系

6种试验用细胞系来源：康源博创生物技术(北京)有限公司

细胞类型：鼠源B细胞

培养基：RPMI-1640+10％FBS

2.试验方法

收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数。将一定密度的细胞悬液吹打均匀接种于96孔板，每孔100μL，震荡，使其均匀分散至孔内；每孔加入100μl一定浓度梯度的药物溶液，每个药物浓度设置三个复孔；37℃CO₂培养箱培养72小时；加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20μl；37℃作用4小时；平板离心机1000rpm/min离心5min，吸弃培养基180μl后加入150μlDMSO，微孔振荡器震荡混匀，将板底擦拭干净，酶标仪550nm处检测光密度值(OD)。

3.数据分析

抑制率＝(对照孔OD-受试孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)*100％，根据各浓度抑制率，采用SPSS软件计算半数抑制浓度IC₅₀值。

4.试验结果：结果如表3所示：

表3本发明化合物及对照化合物对TRK突变细胞株的抑制活性

注：——为未检测。

表4对照化合物对TRK突变细胞株的抑制活性

结果表明：本发明多个化合物在多种野生型及突变耐药型细胞株中表现出较好的体外细胞活性，显著优于RXDX-101、LOXO-195、LOXO-101及现有技术公开的化合物D1-D5。

试验例4：化合物在体内机制的研究

1.试验方法

1.1模型制备：

取对数生长期的突变耐药细胞Ba/F3LMNA-NTRK1-G595R，收集、重悬至无血清培养基中，使细胞浓度为6×10⁷-10×10⁷个/mL，并向细胞悬液中加入等体积的基质胶(Matrigel)，使细胞的终浓度为3×10⁷-5×10⁷个/mL。于NuNu鼠(北京维通利华，4-6周，雌性)前肢腋下皮下接种0.1mL肿瘤细胞悬液，接种量为3×10⁶-5×10⁶个/只，制备动物模型。

1.2试验分组：

用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的最大瘤径和最小瘤径，计算肿瘤体积：肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a和b分别表示瘤块的最大直径和最小直径。接种后12-15天，选择肿瘤体积200-300mm³的裸鼠，采用随机数字法按肿瘤体积将动物均衡分成7组，每组3只。

1.3给药

根据动物体重进行灌胃给药，给药体积为10ml/kg，化合物4使用“3％DMSO+96％HP-β-CD(0.5g/mL)+1％HCl”配置成所需要的给药浓度。

对照组共三只，给予溶媒后4h取肿瘤组织冻存。其他组均给予本发明化合物4100mg/kg，分别在0.25h、1h、4h、8h、12h和24h取肿瘤组织冻存。

1.4蛋白提取及定量

取一定质量的肿瘤组织加入相应体积的蛋白裂解液(RIPA裂解液(ThermoFisher，货号89900)：蛋白酶抑制剂(cOmplete,Mini,EDTA-free,EASYpack；Roche，货号04693159001)：磷酸酶抑制剂(PhosStop,EASY pack；Roche，货号04906837001)＝8:1:1)，匀浆，冰浴裂解30min。低温高速离心，取上清液进行BCA蛋白定量(依据BCA蛋白定量试剂盒(天根，货号：#PA115-01)操作)。最后将蛋白浓度用裂解液调成统一浓度后，加入上样缓冲液(loading buffer)，100℃煮沸10min。

1.5Western-blot

采用4-20％的10孔预制胶；上样量100ug；140V电泳1-1.5h；300mA湿转1.5h-2h；5％BSA封闭2-3h；一抗4℃孵育过夜(Trk1:5000，p-Trk、PLCγ1、p-PLCγ1、AKT、p-AKT、actin1:1000)；4×5min0.1％TBST洗涤；二抗室温孵育2h(1:5000)，ECL发光，曝光。

2.试验结果：如附图1所示。

由试验结果可知：随着时间延长，图1中TRK、p-TRK、p-PLCγ1和p-AKT均明显降低，证明本发明化合物4可明显降低TRK、p-TRK的蛋白水平，进而有效抑制p-PLCγ1/PLCγ1及p-AKT/AKT的磷酸化，以调控细胞生长与增殖。

试验例5：化合物对NTRK突变耐药肿瘤模型的体内药效实验

试验方法

1.1模型制备

取对数生长期的细胞，收集、重悬至无血清培养基中，使细胞浓度为6×10⁷-10×10⁷个/mL，并向细胞悬液中加入等体积的基质胶(Matrigel)，使细胞的终浓度为3×10⁷-5×10⁷个/mL。于NuNu鼠(北京维通利华，4-6周，雌性)前肢腋下皮下接种0.1mL肿瘤细胞悬液，接种量为3×10⁶-5×10⁶个/只，制备动物模型。

1.2试验分组

用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的最大瘤径和最小瘤径，计算肿瘤体积：肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a和b分别表示瘤块的最大直径和最小直径。接种后7-10天，选择肿瘤体积100-200mm³的裸鼠，采用随机数字法按肿瘤体积将动物均衡分组，每组6只。

1.3观察指标

分组当天开始根据动物体重进行灌胃给药，给药体积为10ml/kg，LOXO-195使用0.5％CMC-Na配置成所需要的给药溶液，化合物4和10分别使用“3％DMSO+96％HP-β-CD(0.5g/mL)+1％HCl”配置成所需要的给药溶液，溶媒对照组给予溶媒“3％DMSO+96％HP-β-CD(0.5g/mL)+1％HCl”。每周两次测量瘤径，计算肿瘤体积。具体指标如下：

动物体重：每天上午给药前对动物进行称重，体重降低大于20％定义为药物有毒性反应(观察至末次给药次日)；

肿瘤体积(Tumor volume，TV)＝V＝1/2×a×b²，其中a和b分别表示瘤块的最大直径和最小直径(观察至末次给药次日)；

相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：给药组RTV，CRTV：对照组RTV)；

肿瘤生长抑制率(TGI)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％。(其中Ti表示某一天某给药组的平均肿瘤体积；T0为此给药组在开始给药时平均肿瘤体积；Vi为某一天(与Ti同一天)溶媒对照组的平均肿瘤体积；V0为溶媒对照组在开始给药时的平均肿瘤体积)；

肿瘤抑制率：实验结束时，脱颈处死动物，剥离瘤块并称重，拍照，计算抑瘤率，肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

试验结果

2.1Ba/F3LMNA-NTRK1-G667C模型

2.1.1药物对荷瘤小鼠体重的影响

各化合物各剂量组体重具有上升趋势，且上升趋势比对照组明显。各化合物各剂量组体重上升明显，可能与化合物有关，也可能由于抑制肿瘤生长，使小鼠状态较好，体重增长明显。测试结果见表5。

2.1.2药物对荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响

数据结果表明：同等给药剂量(100mg/kg)下，与LOXO-195相比，本发明化合物4和化合物10对肿瘤生长的抑制更显著；进一步地，与更高给药剂量的LOXO-195组(200mg/kg)相比，本发明化合物4和化合物10(100mg/kg)亦表现出更好的抑瘤效果。结果见表5。

表5Ba/F3LMNA-NTRK1-G667C模型体内结果

2.2Ba/F3LMNA-NTRK1-G595R模型

2.2.1药物对荷瘤小鼠体重的影响

各化合物各剂量组体重具有上升趋势，且上升趋势比对照组明显。各化合物各剂量组体重上升明显，可能与化合物有关，也可能由于抑制肿瘤生长，使小鼠状态较好，体重增长明显。测试结果见表6。

2.2.2药物对荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响

数据结果表明：与LOXO-195(100mg/kg)相比，在更低的给药剂量(50mg/kg)下，本发明化合物4和化合物10即可实现对肿瘤组织重量的显著抑制，瘤重抑制率＞90％。测试结果见表6。

表6Ba/F3LMNA-NTRK1-G595R模型体内结果

试验例6：化合物联合AMG510对Nu/Nu小鼠人非小细胞肺癌H358移植瘤模型药效试验

1.试验方法

1.1H358小鼠移植瘤模型制备

取对数生长期的细胞，收集、重悬至无血清培养基中，使细胞浓度为2×10⁷个/mL，并向细胞悬液中加入等体积的基质胶(Matrigel)，使细胞的终浓度为1×10⁷个/mL。于NuNu鼠(北京维通利华，4-6周，雌性)前肢腋下皮下接种0.1mL肿瘤细胞悬液，接种量为1×10⁶个/只，制备动物模型。

1.2试验分组

用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的最大瘤径和最小瘤径，计算肿瘤体积：肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a和b分别表示瘤块的最大直径和最小直径。接种后4天，选择肿瘤体积100-200mm³的裸鼠，采用随机数字法按肿瘤体积将动物均衡分成7组，每组6只。

1.3观察指标

分组当天开始根据动物体重进行灌胃给药，给药总体积为10ml/kg，化合物4使用“3％DMSO+96％HP-β-CD(0.5g/mL)+1％HCl”配置成所需要的给药溶液。AMG510使用“99.6％(0.5％MC)+0.4％Tween-80”配置成所需要的给药溶液。溶媒对照组使用溶媒“3％DMSO+96％HP-β-CD(0.5g/mL)+1％HCl”。

每周两次测量瘤径，计算肿瘤体积。具体指标如下：

动物体重：每天给药前对动物进行称重，体重降低大于20％定义为药物有毒性反应(观察至末次给药次日)；

相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：给药组RTV，CRTV:对照组RTV)；

协同因子Q：Burgi修正公式：Q＝E(a+b)/[E(a)+E(b)–E(a)*E(b)]。(E(a+b)：a、b两药联合给药后的瘤体积抑制率；E(a)：a单独给药时的瘤体积抑制率；E(b)：b单独给药时的瘤体积抑制率)

Q<0.85拮抗

0.85≤Q<1.15相加

Q≥1.15协同

2.试验结果

2.1药物对荷瘤小鼠体重的影响

化合物4和AMG510单用和联用组体重均具有上升趋势，化合物4单用和联用组体重上升趋势显著，未见明显药物毒性反应。测试结果见表7。

2.2药物对荷瘤小鼠抑瘤率的影响

结果表明：与溶媒对照组比较，两个联用组均表现出明显的抑瘤效果，具有显著统计学差异。与化合物4 30mg/kg相比，化合物4 30mg/kg与AMG510 3mg/kg联合组表现出显著的统计学差异(P＜0.05)，具有明显协同作用(Q＝1.429)。化合物4 100mg/kg与AMG5106mg/kg联合组与相应的单用组相比均具有显著统计学差异(P＜0.05)，具有明显协同作用(Q＝1.257)。测试结果见表7。

表7H358模型体内药效结果

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05；与化合物4 30mg/kg比较，#P<0.05；与化合物4100mg/kg比较，▲P<0.05；与AMG510 6mg/kg比较，●P<0.05。

试验例7：化合物联合AMG510对Nu/Nu小鼠人胰腺癌MIAPaCa2移植瘤模型药效试验

1.试验方法

1.1MIA PaCa2模型制备

取对数生长期的细胞，收集、重悬至无血清培养基中，使细胞浓度为1×10⁸个/mL。于NuNu鼠(北京维通利华，4-6周，雌性)前肢腋下皮下接种0.1mL肿瘤细胞悬液，接种量为1×10⁷个/只，制备动物模型。

1.2试验分组

用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的最大瘤径和最小瘤径，计算肿瘤体积：肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a和b分别表示瘤块的最大直径和最小直径。接种后7天，选择肿瘤体积100-200mm³的裸鼠，采用随机数字法按肿瘤体积将动物均衡分成4组，每组6只。

1.3观察指标

每周两次测量瘤径，计算肿瘤体积。具体指标如下：

Q<0.85拮抗

0.85≤Q<1.15相加

Q≥1.15协同

2.试验结果

2.1药物对荷瘤小鼠体重的影响

化合物4和AMG510单用和联用组体重均具有上升趋势，化合物4单用和联用组体重上升趋势显著，未见明显药物毒性反应。测试结果见表8。

2.2药物对荷瘤小鼠抑瘤率的影响

结果表明：与溶剂对照组比较，联用组表现出明显的抑瘤效果，具有显著统计学差异(P＜0.01)；经计算，联用组相对于单用组具有明显协同作用(Q＝1.86)。测试结果见表8。

表8MIA PaCa2模型体内药效结果

注：与溶媒对照组比较*P<0.05,**P<0.01；与AMG51010mg/kg比较，##P＜0.01；与化合物430mg/kg比较，▲▲▲P＜0.001。

Claims

1.化合物A在制备与KRAS^G12C抑制剂联合用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述化合物A的结构如下式(I)所示：

其中，X选自：键、-O-、-S-、-NH-或-CH₂-；

Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄独立的选自：-CH-、N或C；

X₂选自：键、-(CH₂)_p-或-NH-，其中，p为1、2、3或4；

表示：键存在或不存在；

R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷氧基、或-SC_1～6烷基；

R_1a在每次出现时，各自独立地选自：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂、或氰基；

R₃选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；

n选自1、2、3或4。

2.化合物A联合KRAS^G12C抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述化合物A的结构如权利要求1中式(I)所示。

3.化合物A在制备改善KRAS^G12C抑制剂治疗肿瘤效果的药物中的用途，所述化合物A的结构如权利要求1中式(I)所示。

4.KRAS^G12C抑制剂在制备改善化合物A治疗肿瘤效果的药物中的用途，所述化合物A的结构如权利要求1中式(I)所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述R选自：C_5～9的芳基或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基是未被取代的或被至少一个选自R₁的取代基取代；或者，所述R选自：C_5～6的芳基或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基是未被取代的或被至少一个选自R₁的取代基取代。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物具有如式(I-1)或(I-2)所示的结构：

优选地，所述化合物具有如式(I-A)所示的结构：

进一步优选地，所述化合物具有如式(I-A-1a)、(I-A-1b)或(I-A-1c)所示的结构：

,

或者，优选地，所述化合物具有如式(I-B)所示的结构：

进一步优选地，所述化合物具有如式(I-B-1a)、(I-B-1b)或(I-B-1c)所示的结构：

其中，X₁选自：-CH-或N；

R₁，R₂，R₃，R₄，X，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，

环A和n具有权利要求1所述的定义。

7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷基、或未被取代或被至少一个R_1a取代的C_3～6环烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、氰基、未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷基或未被取代或被至少一个R_1a取代的C_1～6烷氧基；或者，R₁在每次出现时，各自独立地选自：氢、卤素、-OH、氨基、C_1～6烷基或C_1～6烷氧基；

和/或，所述R_1a在每次出现时，各自独立地选自：C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、硝基、卤素、-OH、氨基、-NHC_1～6烷基、-N(C_1～6烷基)₂或氰基；或者，R_1a在每次出现时，各自独立地选自：卤素、-OH、氨基、-NHC_1～3烷基、-N(C_1～3烷基)₂或氰基；

和/或，所述R₂选自：H、F、OH或取代或未取代的C_1～6烷基，所述取代是指被1、2或3个选自卤素或羟基的取代基所取代；或者，R₂选自H、F、-OH或C_1～6烷基。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物具有如式(I-D)所示的结构：

优选地，所述化合物具有如式(I-D-a)、(I-D-b)或(I-D-c)所示的结构：

其中，R₃，R₄，X₂，Y，Y₁，Y₂，Y₃，Y₄，环A和n具有权利要求1所述的定义。

9.如权利要求1-8任一项所述的用途，其特征在于，所述R₃选自：H、卤素、-OH、氨基、C_1～3烷基或C_1～3烷氧基；或者，R₃选自：H、F、Cl、-OH、甲基或甲氧基；

和/或，所述环A选自：C_3-6环烷基、4-6元杂环烷基、C_6-8桥环基、6-8元杂桥环基、C_8-10并环基、8-10元杂并环基、C_7-12单螺环基、7-12元杂单螺环基；或者，环A选自：4-6元杂环烷基、6-8元杂桥环基、8-10元杂并环基、7-12元杂单螺环基；其中所述杂环烷基、杂桥环基、杂并环基和杂单螺环基中的杂原子独立地选自O、S或N，所述杂原子个数选自1、2、3或4个；或者，环A选自如下结构：

和/或，所述R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-COOH、-CONH₂、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；或者，R₄独立的选自：-H、-OH、卤素、-CN、氧代基、取代或未取代的C_1～6烷基、-CO-CR_4aR_4b-OH或-CO-R_4b；其中，所述氧代基是指相同取代位的两个H被同一个O替代形成双键；R_4a选自氢、未取代或取代的C_1～4烷基；R_4b选自未取代或取代的C_1～6烷基或未取代或取代的C_3～6环烷基，所述取代的取代基独立地选自-OH、-NH₂、卤素，取代基个数选自1、2或3。

10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其特征在于，所述化合物具有如下结构：

优选地，所述化合物A的结构如下式(4)所示：

11.如权利要求1-10任一项所述的用途，其特征在于：所述KRAS^G12C抑制剂选自AMG-510、MRTX849、JNJ-74699157(ARS-3248)、ARS-1620、MRTX1257、RM-007、ADT-007，优选AMG510和MRTX849，更优选AMG510；AMG510和MRTX849的结构分别如下所示：

12.如权利要求1-11任一项所述的用途，其特征在于：所述肿瘤选自KRAS^G12C突变的肿瘤，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、白血病、宫颈癌、肝癌、卵巢癌和脑癌，所述白血病包括急性髓细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病；优选肺癌、胰腺癌、结直肠癌，所述肺癌优选非小细胞肺癌、肺腺癌。

13.如权利要求1-12任一项所述的用途，其特征在于：所述药物中进一步包含药学上可接受的辅料或药学上可接受的载体。

14.如权利要求1-13任一项所述的用途，其特征在于：所述的药物每个制剂单位中包含化合物A 0.1-1000mg，优选1-500mg；

和/或，所述的药物每个制剂单位中包含KRAS^G12C抑制剂0.1-1000mg，优选1-1000mg；

和/或，所述KRAS^G12C抑制剂为AMG510，所述药物每个制剂单位包含AMG5101-1000mg，优选1-500mg、1-400mg、1-300mg或1-200mg；

和/或，所述KRAS^G12C抑制剂为MRTX849，所述药物每个制剂单位包含MRTX849约1-1000mg，优选1-600mg、1-500mg、1-400mg、1-300mg或1-200mg。

15.如权利要求1-14任一项所述的用途，其特征在于：所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂可以包含在同一个制剂单位中，也可以分别在不同制剂中，以组合产品的形式制成所述药物；所述制剂选自口服制剂、注射制剂、局部给药制剂或外用制剂等；相应地，所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂通过注射、口服、局部或体外施用；所述化合物A及KRAS^G12C抑制剂可以同时给药，也可以间隔给药或贯序给药。

16.一种药物，其特征在于：含有化合物A和KRAS^G12C抑制剂，所述化合物A的结构如权利要求1中的式(I)所示。