CN116113690A - 包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物及利用其的细胞外囊泡的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含在细胞凋亡中起到重要作用的源自Noxa蛋白的肽(Peptide)的组合物及其衍生物(derivative)来大量生产细胞外囊泡(Extra‑cellular vesicle，EV)的方法，在利用本发明的细胞外囊泡生产促进用肽及利用其的细胞外囊泡的生产方法的情况下，可以有效且大量均匀地生产细胞外囊泡，并且，可以有效生产不仅担载重组蛋白或质粒脱氧核糖核酸而且还担载不易通过细胞膜的药物的细胞外囊泡。

Description

包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物及利用其的细胞外囊泡的生产方法
【技术领域】
本申请要求于2020年9月9日提交且申请号为第10-2020-0115145号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物及利用其的细胞外囊泡(Extra-cellular vesicle，EV)的生产方法，具体地，涉及包含在细胞凋亡中起到重要作用的源自Noxa蛋白的肽(Peptide)的组合物以及利用包含糖的溶液来有效地大量生产细胞外囊泡的方法。
【背景技术】
细胞外囊泡是指比细胞小的由单位磷脂双分子层包括的囊泡，存在于所有种类的体液中。细胞外囊泡起到在细胞间从传递和接收内容物或信息的作用，近来，因其用作新型药物传递方式的可能性而备受关注。与其他药物传递方式相比，其大体的优点在于，不受个体免疫系统的排斥、不大受细胞膜之类的自然屏障的影响、可以使其具有对特定细胞的选择性等。
根据大小及生成过程，细胞外囊泡分为外泌体(Exosome)、凋亡小体(Apoptoticbody)及微囊泡(Microveslcles,Ectosome)等三种。外泌体的大小为30nm至150nm，源自细胞内的内体(Endosome)。凋亡小体的大小为100nm至5000nm，源自细胞凋亡初期坍塌的细胞骨架。微囊泡的大小为50nm至1000nm，通过特定药物或物理压力导出细胞膜来形成。在细胞外囊泡中，外泌体及微囊泡作为新兴药物传递工具而备受瞩目，尤其在大量进行着利用外泌体的研究。
外泌体由吞噬入细胞内的细胞膜形成。当通过细胞内吞作用(Endocytosis)将细胞膜吞入细胞内时，形成早期内体(Early sorting endosome，ESE)，早期内体可以与内质网(Endoplasmic reticulum，ER)或高尔基体(Trans-golginetwork，TGN)等结合。早期内体在形成后期内体(Late sorting endosome，LSE)后，可以将其他细胞质内的物质纳入内体中，或者将内体内的物质释放到细胞质内来形成包含腔内囊泡(Intraluminal vesicle)的多囊体(Multivesicular bodies，MVB)。多囊体与自噬体(Autophagosome)结合后，通过与溶酶体(Lysosome)结合来分解或者通过与细胞膜的内侧结合来向细胞外放出腔内囊泡。这样放出的腔内囊泡被称为外泌体。用于分离及纯化外泌体的标记物有CD9、CD63、CD81、筏蛋白(flotillin)、HSP70或HSP90等。
外泌体通过来往于细胞与细胞之间来行使多种功能。外泌体与细胞内的多种细胞器进行相互作用，其结果不仅使外泌体内部包含蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等细胞结构物，还包含氨基酸或其他代谢产物。外泌体就是这样通过细胞间的相互作用来在包括生殖、发育、免疫反应或癌症在内的多种疾病的发生等中起到重要的作用。
有关将外泌体用作诊断和治疗目的的方案的研究正在活跃地的进行着。外泌体可以反映细胞内和细胞外存在的所有物质，正在尝试将外泌体用于脑血管疾病或中枢神经系统疾病等的诊断中，尤其在大量进行着将其用于癌症的诊断的研究。近来，积极提出了很多根据外泌体所包含的脱氧核糖核酸、核糖核酸或蛋白质等的分析来诊断癌症的可能性。
并且，外泌体作为新型药物传递工具而备受关注。与脂质体(Liposome)相比，外泌体不仅更易于进入细胞内，而且几乎不受免疫系统的排斥。不仅如此，存在于外泌体的膜表面的大量的配体(Ligand)显出通过受体的细胞特异性传递的可能性。
而且，微囊泡由细胞膜向细胞外侧突出来形成。代表性的有从血小板和红细胞形成的微囊泡，它们是在细胞被激活或施加剪应力(Shear stress)或引起细胞凋亡时形成的。并且，由于微囊泡与其来源的细胞的细胞膜的结构相似，因此可以在几乎不受免疫系统影响的情况下轻易进入细胞内，从而显出细胞特异性传递的可能性。
但是，尽管有如此多的优点，细胞外囊泡的有效且大量均匀的生产仍存在很大的困难。
【发明内容】
【技术问题】
于是，本发明人为了解决上述问题完成了如下方法：在特定条件下向细胞株处理源自在细胞凋亡中起到重要作用的Noxa蛋白的肽及其衍生物(Derivative)来有效且大量均匀地生产细胞外囊泡。
并且，本发明人确认到可以在细胞外囊泡中担载不易通过细胞膜的物质。
因此，本发明的目的在于，提供一种包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物。
本发明的再一目的在于，提供一种细胞外囊泡生产用培养基，包含：源自Noxa蛋白的肽；以及包含糖的溶液。
本发明的还有一目的在于，提供一种利用细胞外囊泡生产用培养基的细胞外囊泡生产方法。
本发明的另一目的在于，提供一种利用细胞外囊泡生产用培养基的细胞外囊泡有效载荷(Payload)装载方法。
【技术方案】
本发明涉及包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物即利用其的细胞外囊泡的生产方法，具体地，涉及包含在细胞凋亡中起到重要作用的源自Noxa蛋白的肽的组合物以及利用包含糖的溶液来有效地大量生产细胞外囊泡的方法。
以下，更为详细地说明本发明。
本发明的一例涉及包含源自Noxa蛋白的肽、其衍生物或它们的组合的细胞外囊泡生产促进用组合物。
在本发明中，Noxa蛋白利用BH3(Bcl-2homology 3)结构域与Mcl1和Bcl2A1结合来抑制，激活BAX和BAK蛋白，使细胞色素C(Cytochrome-c)向细胞质流出来启动半胱天冬酶系统(Caspase system)，从而可以引起细胞程序性死亡。
在本发明中，术语“肽(peptide)”可以表示通过肽键使氨基酸残基相互结合来形成的线型分子。
本发明的术语“衍生物”可以表示在本发明的肽的N-末端、C-末端等通过化学修饰或追加氨基酸来变形的肽，但不限定于此，还可以表示执行与本发明的肽相同或相似的功能的肽。
在本发明的一具体例中，源自Noxa蛋白的肽可以为与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的肽具有约60％以上、70％以上、约80％以上、约90％以上、约95％以上、约98％以上或约99％以上的同源性的肽。
在本发明的又一具体例中，源自Noxa蛋白的肽的衍生物可以为与由SEQ ID NO：2至21中的至少一种氨基酸序列组成的肽具有约60％以上、约70％以上、约80％以上、约90％以上、约95％以上、约98％以上或约99％以上的同源性的肽。
在本发明中，肽可以通过利用多肽固相合成法(Solid phase peptidesynthesis)来化学直接合成的方法、利用自动合成仪来合成的方法、向载体中插入编码肽的碱基序列并表达的方法来制备，但不限定于此。
在本发明中，术语“载体(Vector)”可以表示用于在宿主细胞中表达目标基因的工具。
在本发明中，载体可以包括例如质粒(Plasmid)载体、粘粒(Cosmid)载体及噬菌体(Bacteriophage)载体、腺病毒(Adenovirus)载体、逆转录病毒(Retrovirus)载体及现病毒相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体之类的病毒载体，但不限定于此。
本发明的再一例涉及一种细胞外囊泡生产用培养基，包括：选自由由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽组成的组中的一种以上的肽；以及包含糖的溶液。
在本发明中，溶液中包含的肽的浓度可以为10μM至80μM、10μM至70μM、10μM至60μM、10μM至50μM、10μM至40μM、15μM至80μM、15μM至70μM、15μM至60μM、15μM至50μM、15μM至40μM、20μM至80μM、20μM至70μM、20μM至60μM、20μM至50μM或20μM至40μM，例如，可以为20μM至40mM，但不限定于此。
在本发明中，糖可以为选自由葡萄糖、山梨糖醇及蔗糖组成的组中的一种以上，例如，可以为蔗糖，但不限定于此。
在本发明中，在溶液中包含不是葡萄糖的本发明的其他糖的情况下，溶液中包含的葡萄糖的浓度可以为3mM至70mM、3mM至60mM、3mM至50mM、4mM至70mM、4mM至60mM、4mM至50mM、5mM至70mM、5mM至60mM或5mM至50mM，例如，可以为5mM至50mM，但不限定于此。
在本发明中，在溶液中不包含不是本发明的葡萄糖的其他糖的情况下，溶液中包含的葡萄糖的浓度可以为80mM至300mM、80mM至290mM、80mM至280mM、80mM至270mM、80mM至260mM、80mM至250mM、90mM至300mM、90mM至290mM、90mM至280mM、90mM至270mM、90mM至260mM、90mM至250mM、100mM至300mM、100mM至290mM、100mM至280mM、100mM至270mM、100mM至260mM或100mM至250mM，例如，可以为100mM至250mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的蔗糖的浓度可以为80mM至300mM、80mM至290mM、80mM至280mM、80mM至270mM、80mM至260mM、80mM至250mM、90mM至300mM、90mM至290mM、90mM至280mM、90mM至270mM、90mM至260mM、90mM至250mM、100mM至300mM、100mM至290mM、100mM至280mM、100mM至270mM、100mM至260mM或100mM至250mM，例如，可以为100mM至250mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的山梨糖醇的浓度可以为100mM至350mM、100mM至340mM、100mM至330mM、100mM至320mM、100mM至310mM、100mM至300mM、125mM至350mM、125mM至340mM、125mM至330mM、125mM至320mM、125mM至310mM、125mM至300mM、150mM至350mM、150mM至340mM、150mM至330mM、150mM至320mM、150mM至310mM或150mM至300mM，例如，可以为150mM至300mM，但不限定于此。
在本发明中，培养基可以为选自由固体培养基及液体培养基组成的组中的一种以上，例如，可以为液体培养基，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS，3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)的浓度可以为7mM至13mM、7mM至12mM、7mM至11mM、8mM至13mM、8mM至12mM、8mM至11mM、9mM至13mM、9mM至12mM、9mM至11mM、10mM至13mM、10mM至12mM、10mM至11mM，例如，可以为10mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液的pH可以为5至10、5至9、5至8、6至10、6至9、6至8、7至10、7至9或7至8，例如，可以为7至8。
在本发明中，溶液的pH在细胞外囊泡的生产中至关重要，在pH大于10或小于5的情况下可能无法生产细胞外囊泡。
在本发明中，溶液还可以包含选自由氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、葡萄糖酸钠(Na-gluconate)、葡萄糖酸钾(K-gluconate)、磷酸钠(NaPO4)及磷酸钾(KPO4)组成的组中的一种以上。
在本发明中，溶液中包含的氯化钠的浓度可以为1mM以下，可以为0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的氯化钾的浓度可以为1mM以下，可以为0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的葡萄糖酸钠的浓度可以为1mM以下，可以为0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的葡萄糖酸钾的浓度可以为1mM以下，0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的磷酸钠的浓度可以为1mM以下，可以为0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明中，溶液中包含的磷酸钾的浓度可以为1mM以下，可以为0mM至0.8mM、0mM至0.6mM、0mM至0.4mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.8mM、0.1mM至0.6mM或0.1mM至0.4mM，例如，可以为0.1mM，但不限定于此。
在本发明的一实施例中，溶液可以包含5mM的葡萄糖、10mM的3-(N-吗啉)丙磺酸以及250mM的蔗糖。
在本发明的一实施例中，溶液可以包含255mM的葡萄糖及10mM的3-(N-吗啉)丙磺酸。
在本发明的一实施例中，溶液可以包含5mM的葡萄糖、10mM的3-(N-吗啉)丙磺酸以及250mM的山梨糖醇。
本发明的还有一例涉及一种细胞外囊泡的生产方法包括：
培养基准备步骤，准备包含选自由由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽组成的组中的一种以上的肽以及包含糖的溶液的培养基；以及
混合步骤，混合培养基与细胞株。
在本发明中，细胞株可以为选自由CT26(小鼠结肠肿瘤)、HeLa(人宫颈癌)、HEK293(人肾上皮)、3T3-L1(小鼠前脂肪细胞)及HMSC(人间充质干细胞)组成的组中的一种以上，例如可以为HeLa或HEK293，但不限定于此。
本发明的另一例涉及一种细胞外囊泡有效载荷装载方法，其特征在于，包括：
培养基准备步骤，准备包含选自由由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽组成的组中的一种以上的肽以及包含糖的溶液的培养基；以及
混合步骤，混合培养基、有效载荷及细胞株。
在本发明中，有效载荷可以为选自由蛋白质、脱氧核糖核酸、核糖核酸、质粒脱氧核糖核酸及抗癌物质组成的组中的一种以上，例如，可以为质粒脱氧核糖核酸，但不限定于此。
在本发明中，装载(loading)可以表示在细胞外囊泡中担载有效载荷的行为，但不限定于此。
在本发明中，抗癌物质可以为选自由抗癌蛋白、肿瘤抑制基因及抗癌化合物组成的组中的一种以上，但不限定于此。
在本发明中，抗癌蛋白可以为选自由天冬酰胺酶、肉毒毒素(Botulinum toxin)、破伤风毒素(Tetanus toxin)、志贺氏毒素(Shiga toxin)、白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)、蓖麻毒素(ricin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)、溶细胞素A(cytolysin A，ClyA)、γ-白树毒素(γ-Gelonin)、血管内皮生长因子(VEGF，vscularendothelial growth factor)、促血管生成素1(angiopoietin1，Ang1)、促血管生成素2(Ang2)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β)、转化生长因子(TGF-β)整合素(integrin)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)、纤溶酶原激活物(plasminogenactivator，PA)、蝶素(ephrin)、血小板衍生生长因子(PDGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1、monocyte chemotactic protein-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胎盘生长因子(placentagrowth factor、PIGF)、VHL抑癌基因(von HippelLindau)、腺瘤型结肠息肉抑制基因(Adenomatous polyposis coli)、分化簇95(CD 95，cluster of differentiation 95)、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5，Suppression of tumorigenicity 5)、YPEL3(Yippee like 3)、肿瘤发生抑制蛋白7(Suppression of tumorigenicity 7)及肿瘤发生抑制蛋白14(ST14，Suppression of tumorigenicity 14)组成的组中的一种以上，但不限定于此。
在本发明中，肿瘤抑制基因可以为选自由VHL抑癌基因、腺瘤型结肠息肉抑制基因、分化簇95、肿瘤发生抑制蛋白5、YPEL3、肿瘤发生抑制蛋白7及肿瘤发生抑制蛋白14组成的组中的一种以上，但不限定于此。
在本发明中，抗癌化合物可以为选自由甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine)、硫酸羟脲(hydroxy urea)、巯嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、氮芥(nitrogenmustad)、环孢酰胺(cyclosporamide)、蒽环霉素(anthracycline)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、吡蒽醌(pixantrone)、沙柔比星(sabarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱(vincristine)、紫杉醇(taxol)、康普立停A4(combretastatinA4)、烟曲霉素(Fumagillin)、除莠霉素(herbimycin A)、2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)、OGT 2115、TNP 470、曲尼司特(tranilast)、XRP44X、沙利度胺(thalidomide)、内皮抑素(endostatin)、salmosin、血管抑素(angiostatin)、血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)、载脂蛋白(apolipoprotein)的三环结构域(kringle domain)、奥沙利铂、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、硼替佐米(Bortezomib)及放射性核素(radionuclides)组成的组中的一种以上，但不限定于此。
【发明的效果】
在利用本发明的细胞外囊泡生产促进用肽及利用其的细胞外囊泡的生产方法的情况下，可以有效且大量均匀地生产细胞外囊泡，并且，可以有效生产不仅担载重组蛋白或质粒脱氧核糖核酸而且还担载不易通过细胞膜的药物的细胞外囊泡。
【附图说明】
图1为在使用eMTDΔ4肽与本发明的一实施例的溶液一同处理HeLa细胞株的情况下，通过显微镜观察生成细胞外囊泡并沉淀在培养板底部的情形的照片。
图2a至图2s为在将eMTDΔ4肽与本发明的一实施例的溶液组合来处理HeLa细胞株的情况下，通过显微镜观察生成细胞外囊泡的情形的照片。
图3a至图3c为在使用eMTDΔ4肽与包含葡萄糖、山梨糖醇或蔗糖的溶液一同处理HeLa细胞株的时通过显微镜观察生成细胞外囊泡的情形的照片。
图4为在外泌体标记物HSP90上附着荧光蛋白EGFP并转染到HeLa细胞株后使其形成细胞外囊泡来通过共聚焦显微镜观察的照片。
图5a至图5b为在膜蛋白CD9上附着mEmerald，在CD81上附着mCherry并转染到HeLa细胞株后使用共聚焦显微镜以2秒钟的间隔拍摄细胞外囊泡的形成过程的照片。
图6a至图6c为使用扫描探针显微镜测量HeLa细胞株中生产的细胞外囊泡的大小的照片。
图7为使用Bradford溶液定量在HEK-293细胞株中生产MTD、eMTDΔ4及其衍生物的细胞外囊泡的数量的热图(Heat-map)。
图8a至图8d为使用纳米颗粒追踪分析系统(Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)system)分析在HEK-293细胞株中生产MTD、eMTDΔ4及其衍生物的细胞外囊泡的大小和数量的曲线图。
图9为在细胞外囊泡中装载重组蛋白TRAIL蛋白后进行丙烯酰胺凝胶电泳(acrylamide gel electrophoresis)的结果。
图10为在细胞外囊泡中担载质粒脱氧核糖核酸pUC19和pEGFP-C1后进行琼脂凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)的结果。
图11为示出在细胞外囊泡中担载质粒脱氧核糖核酸后将其分离的过程的示意图。
图12为在对HeLa细胞株处理eMTDΔ4来生产的细胞外囊泡中担载易于通过细胞膜的药物阿霉素后使用共聚焦显微镜确认其结果的照片。
图13为在对HeLa细胞株处理eMTDΔ4来生产的细胞外囊泡中装载不易通过细胞膜的药物碘化丙啶(PI，propidium iodide)后使用共聚焦显微镜确认其结果的照片。
【最佳实施方式】
一种细胞外囊泡生产促进用组合物，包含选自由由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽组成的组中的一种以上的肽。
【具体实施方式】
以下，通过实施例更为详细地说明办发明。但对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。
【制备例1.制备源自Noxa蛋白的肽及其衍生物】
表1的SEQ ID NO：1示出Noxa蛋白的线粒体靶向结构域(mitochondrialtargeting domain，MTD)。源自MTD的肽的合成基本使用以0.25mMol为单位的手动Fmoc合成方法。具体地来说，使用二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)清洗干净树脂(resin)后，向树脂中放入10mL的20％的哌啶/二甲基甲酰胺(piperidine/DMF)溶液。搅拌1分钟后，再放入10mL的20％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液后摇动30分钟。重新使用二甲基甲酰胺清洗干净后，通过茚三酮反应(ninhydrin test)确认没有哌啶剩余(树脂变为蓝色)。
为进行偶联(coupling)准备如下溶液：1mMol的Fmoc-氨基酸(Fmoc-amino acid)、2.1mL的0.45M的HBTU/HOBT(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐、六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲/羟基苯并三唑)((2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate,Hexafluorophosphate BenzotriazoleTetramethyl Uronium/Hydroxybenzotriazole)(1mMol)、348μL的N,N-二异丙基乙胺(DIEA，N,N-Diisopropylethylamine)(2mMol)。
将准备好的溶液放入树脂中后摇动30分钟。从树脂中取出溶液后，使用二甲基甲酰胺洗涤树脂。然后，为了偶联氨基酸，重新放入上述溶液后重复进行偶联步骤来合成源自Noxa蛋白的eMTDΔ4及其衍生物肽。
通过高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，仪器：Waters2690separations module，流速(Flow rate)：1.0mL/min，梯度(gradient)：0％-20％，B 5分钟；20％-50％，B 20分钟；50％-80％，B 5分钟，A；0.1％ TFA water，B；0.1％ TFAacetonitrile；色谱柱(column)：waters C18，5micron，检测波长(Detection)：220nm，纯度(purity)：95％)及质谱仪(HP1100series LC/MSD)分析合成的肽，表1的SEQ ID NO：2至SEQID NO：21示出合成的肽。
【表1】
序列 命名 序列 备注
1 MTD KLLNLISKLF 10aa
2 eMTDΔ4 KLNFRQKLLN LISKLF 16aa
3 TU17 RPARPARGGK LLNLISKLF 19aa
4 R(8):MTD RRRRRRRRKL LNLISKLF 18aa
5 TU103 KLLNLWSLLF GYTIK 15aa
6 TU104 MEWWYLLKLL NLISKLF 17aa
7 TU107 LRSLRDKLLN LISKLF 16aa
8 TU111 GLKSLRKLLN LISKLF 16aa
9 TU114 KWYAKLLNLI SKLF 14aa
10 TU124 KLLNLWSLLK GYTIK 15aa
11 TU128 AEYRKLLNLI SKLF 14aa
12 TU135 AEYSRKLLNL ISKLF 15aa
13 TU146 YWLPLRKLLN LISKLF 16aa
14 TU149 AHFLRKLLNL ISKLF 15aa
15 TU151 AFFLRKLLNL ISKLF 15aa
16 TU155 QFAQYLRNLI SKLF 14aa
17 TU156 KVSIFLKNLI SKLF 14aa
18 TU166 KLNFAEFLRN LISKLF 16aa
19 TU168 KLNFRLGLRS LREKLF 16aa
20 TU171 KLNFRQKLAR LLTKLF 16aa
21 TU172 LNFKWYSLLN LISKLF 16aa
【实施例2.制备细胞外囊泡生产用溶液】
为了生产利用源自Noxa蛋白的线粒体靶向结构域eMTDΔ4及其衍生物肽的细胞外囊泡，制备包含表2所示的组成和含量的实施例1及比较例1至比较例18的溶液。
【表2】
Figure BDA0004113333900000071
Figure BDA0004113333900000081
【实验例1.培养癌细胞株】
【1-1.准备细胞株及试剂】
在测试制备例1的源自Noxa蛋白的肽及其衍生物的细胞外囊泡生产诱导活性之前，培养癌细胞株。
从Gibco公司购入培养所需的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM，Dulbecco'modifiedeagle medium)、RPMI 1640、胎牛血清(FBS，Fatal bovine serum)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA，Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)以及Hank's平衡盐溶液(HBSS，Hank's balanced salt solution)，从Qiagen公司购入转染(transfection)试剂Effectene。从韩国细胞株银行(KCLB)购入HeLa及HEK293细胞株。
【1-2.培养】
将HeLa及HEK293细胞株传代培养(Subculture)三次以上用于实验。HeLa细胞株使用包含10％的胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的杜氏改良伊戈尔培养基，HEK-293细胞株使用包含10％的胎牛血清的RPMI 1640，在5％(v/v)的CO2气体条件、37℃的温度条件下进行培养。
【实验例2.生产细胞外囊泡】
【2-1.生产细胞外囊泡】
在6孔培养板(Well plate)中培养HeLa细胞株后，去除培养液后，对HeLa细胞株处理实施例1的溶液。
对照组(Control)不处理任何肽，比较组(Experiment)中处理SEQ ID NO：2的eMTDΔ4肽(最终浓度：20μM)。经过10分钟后，使用光学显微镜(明视野(Bright field))观察生成细胞外囊泡的结果如图1所示。
如图1所示，对照组的培养板底部很干净，但比较组形成小的细胞外囊泡粒子沉淀在培养板底部。
【2-2.利用多种溶液生产细胞外囊泡】
利用SEQ ID NO：4的R(8)：MTD肽及实施例1、比较例1至比较例18的溶液，根据实验例2-1的实验方法生产细胞外囊泡的结果如图2a至图2s所示。
通过图2a可以确认，生成大量细胞外囊泡粒子，大部分粒子沉淀在培养板底部。
但是，通过图2b至图2s可以确认，没有生成细胞外囊泡粒子，没有观察到沉淀在培养板底部的细胞外囊泡，只观察到细胞死亡时细胞内部发生的颗粒化现象。
【2-3.利用多种糖生产细胞外囊泡】
利用SEQ ID NO：4的R(8)：MTD肽以及表3所示的实施例1至实施例21的溶液，根据实验例2-1的实验方法生产细胞外囊泡的结果如图3a至图3c所示。
【表3】
(mM) 葡萄糖 蔗糖 山梨糖醇 3-(N-吗啉)丙磺酸
实施例1 5 250 - 10
实施例2 255 - - 10
实施例3 5 - 250 10
通过图3a至图3c可以确认，即使使用葡萄糖或山梨糖醇替代蔗糖过量加入溶液中，也很好地生成细胞外囊泡。
【实验例3.确认细胞外囊泡的形态】
为了将外泌体的标记物HSP90蛋白转染到HeLa细胞株，在6孔培养板中过夜培养HeLa细胞株后，使用克隆有Effectene和pEGFP-HSP90的质粒处理细胞株，4小时后更换培养液。
第二天，从HeLa细胞株中去除培养液后，加入实施例1的溶液。对照组不处理肽，比较组中处理SEQ ID NO：2的eMTDΔ4肽(最终浓度：20μM)。使用488nm的氩激光激发(Excitation)HSP90蛋白。10分钟后利用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5Microsystems)观察对照组和比较组，结果如图4所示。
通过图4可以确认，对照组(Control)的细胞形态未受损，HSP90蛋白位于细胞质内。相反，比较组(eMTDΔ4)的细胞形态受损，包含HSP90蛋白的细胞外囊泡沉淀在培养板底部。
这个结果可以判断为通过在形成细胞外囊泡的过程中发生的细胞膜缺损使细胞质的HSP90蛋白被排到细胞外。
【实验例4.确认细胞外囊泡的生成过程】
在12孔培养板中培养HeLa细胞株一夜，为了确认细胞外囊泡的标记物CD9蛋白，处理克隆有Effectene和mEmerald-CD9的质粒，培养4小时后更换培养液。
第二天，从HeLa细胞株中去除培养液后，处理实施例1的溶液。对各HeLa细胞株处理eMTDΔ4肽(最终浓度：20μM)后，使用488波长的激光用于激发mEmerald-CD9。然后，使用共聚焦显微镜以间隔越2秒钟的方式拍摄照片并10分钟，结果如图5a所示。
并且，为了确认细胞外囊泡的标记物CD81蛋白，除使用克隆有mCherry-CD81的质粒替代mEmerald-CD9来处理HeLa细胞株，使用561nm波长的激光激发mCherry-CD81以外，进行与上述用来观察CD9蛋白的方法相同的过程，结果如图5b所示。
通过图5a及图5b所示，CD9及CD81蛋白都足以观察细胞外囊泡的形成，CD9及CD81蛋白释放到细胞外基质。虽然无法具体确认释放的过程，但可以确认细胞外囊泡在生成后数秒内释放到细胞外基质中。
【实验例5.确认细胞外囊泡的大小】
在培养皿(Culture plate)中培养HeLa细胞株后，使用eMTDΔ4肽(最终浓度：20μM)与实施例1的溶液一同处理细胞株，10分钟后，使用4％(v/v)的多聚甲醛(Paraformaldehyde)固定。
然后，利用扫描探针显微镜(Surface Imaging Systems，NANO Station II)进行观察(带有金字塔型尖端的悬臂梁(cantilever with a pyramidal-shaped tip)，146kHz–236kHz的频率(a frequency of 146–236kHz)，21N/m–98N/m的弹簧系数(a springconstant of 21–98N/m)，225nm的波长(a length of225nm)，0.01Ωcm–0.02Ωcm的阻抗(and a resistance of 0.01–0.02Ωcm))，观察的结果如图6a至图6c所示。
通过图6a可以确认，形成多种大小的细胞外囊泡，可以测量其大小。测量细胞外囊泡的大小的结果如图6b及图6c的曲线图所示。
通过图6b及图6c可以确认，测量到细胞外囊泡的大小约为200nm。这样的结果证明本发明的细胞外囊泡具有与现有已知的细胞外囊泡的大小相似的大小。
【实验例6.确认细胞外囊泡的生产量】
以2×105个/mL的浓度在6孔培养板中培养293-HEK细胞株，第二天使用实施例1的溶液及SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种肽处理细胞株。20分钟后去除溶液，以12000rcf离心分离后，利用上清液通过Bradford溶液定量细胞外囊泡的数量，结果如图7及表4所示。
【表4】
Figure BDA0004113333900000101
Figure BDA0004113333900000111
通过图7及表4可以确认，表4所示的肽虽然在生产量上存在差异，但大部分都很好地生产了细胞外囊泡。
并且，可以确认随着肽的最终处理浓度从10μM增至20μM及40μM，细胞外囊泡中包含的蛋白质的量呈增加的倾向。
【实验例6.确认细胞外囊泡的大小及数量】
在10cm的培养皿(culture dish)中以90％融合(confluency)(约2×107cell)的方式培养293-HEK细胞株后，去除培养液后，将eMTDΔ4肽(最终浓度：20μM)溶于5mL的实施例1的溶液中后处理细胞株。20分钟后去除溶液，以12000rcf离心分离后，利用纳米颗粒追踪分析系统(Nanosight LM10，Malvern Instruments公司)测量细胞外囊泡的大小和数量，结果如图8a至图8d及表5所示。
【表5】
Figure BDA0004113333900000112
Figure BDA0004113333900000121
通过图8a至图8d及表5可以确认，在利用eMTDΔ4肽的情况下，细胞外囊泡的大小的平均值(mean)为184.5nm，众数(mode)为126.3nm，标准差(SD)为87.8nm。
在利用MTD肽的情况下，平均值为181.1nm，众数为115.6nm，标准差为75.2nm。
在利用TU17肽的情况下，平均值为229.6nm，众数为150.9nm，标准差为104.3nm。
在利用TU114肽的情况下，平均数为231.1nm，众数为182.3nm，标准差为110.2nm。
因此可以确认，若在特定溶液条件下使用本发明的细胞外囊泡生产促进用肽，则可以有效地大量生产具有不同大小的细胞外囊泡。
【实验例7.生产装载有重组蛋白的细胞外囊泡】
在6孔培养板中以90％融合的方式培养293-HEK细胞株后，去除培养液后，分别以25μM、2μg/ml的浓度将eMTDΔ4肽(最终浓度：25μM)和重组TRAIL蛋白(recombinant TRAIL)溶于实施例1的溶液中后处理细胞株。采取上清液并加入聚乙二醇(PEG)(最终浓度：8％)后以12000rcf离心分离10分钟来沉淀细胞外囊泡，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认TRAIL蛋白，结果如图9及表6所示。
【表6】
Figure BDA0004113333900000122
通过图9及表6可以确认，若在特定溶液条件下利用本发明的细胞外囊泡生产促进用肽，则可以在细胞外囊泡的生产过程中可以有效地在细胞外囊泡中装载从外部加入的重组蛋白。
【实验例8.生产正在由质粒脱氧核糖核酸的细胞外囊泡】
在6孔培养板中以90％融合的方式培养293-HEK细胞株后去除培养液，将eMTDΔ4肽(最终浓度：25μM)和质粒脱氧核糖核酸(3μg/ml的PUC19，6μg/ml的EGFP-C1)溶于实施例1的溶液中后处理细胞株。
采取1.15mL的上清液后再加入0.35mL的Qiagen buffer P3使总体积为1.5mL，使其中的0.75mL通过脱氧核糖核酸微型制备柱(miniprep column)(Qiagen公司)，使用苯酚纯化通过的溶液后使用乙醇使其沉淀。
将30μl的结合于色谱柱(Column)的脱氧核糖核酸与30μl的使用乙醇沉淀的脱氧核糖核酸溶于水后，将10μl的结合于色谱柱的脱氧核糖核酸及10μl的使用乙醇沉淀的脱氧核糖核酸通过琼脂糖凝胶电泳后使用EtBr染色来确认的结果如图10所示。
在图10中可以确认，可以在细胞外囊泡的生产过程中在细胞外囊泡中装载从外部加入的质粒脱氧核糖核酸。
并且，根据图11所示的过程，可以从细胞外囊泡中重新分离出质粒脱氧核糖核酸。
因此，若在特定溶液条件下利用本发明的细胞外囊泡生产促进用肽，则可以有效地在细胞外囊泡中装载质粒脱氧核糖核酸。
【实验例9.生产担载有阿霉素的细胞外囊泡】
阿霉素为易于通过细胞膜的药物，为用于治疗乳腺癌、膀胱癌、卡波西肉瘤、淋巴癌或急性淋巴细胞白血病等癌症的药物。首先，在12孔培养板中培养HeLa细胞株一夜后，使用克隆有Effectene和pEGFP-HSP90的质粒处理细胞株，4小时后更换培养液。次日，从HeLa细胞株中去除培养液来准备细胞株。
对照组不处理肽，而是只处理阿霉素，比较组将eMTDΔ4肽(最终浓度：25μM)和阿霉素(最终浓度：100μM)溶于实施例1溶液中并处理10分钟后利用共聚焦显微镜进行观察，结果如图12所示。
在图12中可以确认，生成的细胞外囊泡中不仅包含外泌体标记物HSP90蛋白，还包含阿霉素。
【实验例10.生产担载有碘化丙啶(PI，propidium iodide)的细胞外囊泡】
碘化丙啶为不以通过细胞膜的药物，为可以用于染色细胞的荧光物质。首先，将HSP90蛋白转染于HeLa细胞株中来准备细胞株。
对照组不处理肽，只处理碘化丙啶，比较组为将eMTDΔ4肽(最终浓度：25μM)与5μg/ml的碘化丙啶一同溶于实施例1溶液中来处理细胞株后，10分钟后使用共聚焦显微镜进行观察，结果如图13所示。
在图13中可以确认，生成的细胞外囊泡中不仅包含外泌体标记物HSP90蛋白，还包含碘化丙啶。
因此，可以在细胞外囊泡中装载蛋白质、脱氧核糖核酸、难以通过细胞膜的多种药物等，从而可以有效将其用作新型的药物传递系统。
【产业上的可利用性】
本发明涉及包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物及利用其的细胞外囊泡的生产方法，具体地，涉及包含在细胞凋亡中起到重要作用的源自Noxa蛋白的肽的组合物以及利用包含糖的溶液来有效地大量生产细胞外囊泡的方法。
                   序列表
<110>    Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University
<120>    包含源自Noxa蛋白的肽的细胞外囊泡生产促进用组合物及利用其的细胞外囊泡的生产方法
<130>    PP210032
<160>    21
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    10
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    MTD
<400>    1
Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10
<210>    2
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    eMTDΔ4
<400>    2
Lys Leu Asn Phe Arg Gln Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    3
<211>    19
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU17
<400>    3
Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg Gly Gly Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser
1               5                   10                  15
Lys Leu Phe
<210>    4
<211>    18
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    R(8):MTD
<400>    4
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Leu Phe
<210>    5
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU103
<400>    5
Lys Leu Leu Asn Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Ile Lys
1               5                   10                  15
<210>    6
<211>    17
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU104
<400>    6
Met Glu Trp Trp Tyr Leu Leu Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
Phe
<210>    7
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU107
<400>    7
Leu Arg Ser Leu Arg Asp Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    8
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU111
<400>    8
Gly Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    9
<211>    14
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU114
<400>    9
Lys Trp Tyr Ala Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10
<210>    10
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU124
<400>    10
Lys Leu Leu Asn Leu Trp Ser Leu Leu Lys Gly Tyr Thr Ile Lys
1               5                   10                  15
<210>    11
<211>    14
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU128
<400>    11
Ala Glu Tyr Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10
<210>    12
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU135
<400>    12
Ala Glu Tyr Ser Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    13
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU146
<400>    13
Tyr Trp Leu Pro Leu Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    14
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU149
<400>    14
Ala His Phe Leu Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    15
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU151
<400>    15
Ala Phe Phe Leu Arg Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    16
<211>    14
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU155
<400>    16
Gln Phe Ala Gln Tyr Leu Arg Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10
<210>    17
<211>    14
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU156
<400>    17
Lys Val Ser Ile Phe Leu Lys Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10
<210>    18
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU166
<400>    18
Lys Leu Asn Phe Ala Glu Phe Leu Arg Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    19
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU168
<400>    19
Lys Leu Asn Phe Arg Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    20
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU171
<400>    20
Lys Leu Asn Phe Arg Gln Lys Leu Ala Arg Leu Leu Thr Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
<210>    21
<211>    16
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    TU172
<400>    21
Leu Asn Phe Lys Trp Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15

Claims (16)

1.细胞外囊泡生产促进用组合物，其包含选自下列的一种以上的肽：由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽。
2.细胞外囊泡生产用培养基，其包含：
选自下列的一种以上的肽：由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽；以及
包含糖的溶液。
3.根据权利要求2所述的培养基，其中所述糖是选自下列的一种以上：葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇。
4.根据权利要求2所述的培养基，其中所述溶液还包含3-(N-吗啉)丙磺酸。
5.根据权利要求2所述的培养基，其中所述溶液还包含选自下列的一种以上：氯化钠、氯化钾、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、磷酸钠及磷酸钾。
6.细胞外囊泡的生产方法，其包括：
培养基准备步骤，准备包含下列物质的培养基：
选自下列的一种以上的肽：由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽；以及
包含糖的溶液；以及
混合步骤，混合培养基与细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述糖是选自下列的一种以上：葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶液还包含3-(N-吗啉)丙磺酸。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶液还包含选自下列的一种以上：氯化钠、氯化钾、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、蔗糖、磷酸钠及磷酸钾。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞株是选自下列的任一种：小鼠结肠肿瘤CT26、人宫颈癌HeLa、人肾上皮HEK293、小鼠前脂肪细胞3T3-L1以及人间充质干细胞HMSC。
11.细胞外囊泡有效载荷装载方法，其包括：
培养基准备步骤，准备包含下列物质的培养基：
选自下列的一种以上的肽：由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：21中的任一种氨基酸序列组成的肽；以及
包含糖的溶液；以及
混合步骤，混合培养基、有效载荷及细胞株。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述有效载荷是选自下列的一种以上：蛋白质、脱氧核糖核酸、核糖核酸、质粒脱氧核糖核酸及抗癌物质。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗癌物质是选自下列的一种以上：抗癌蛋白、肿瘤抑制基因及抗癌化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗癌蛋白是选自下列的一种以上：天冬酰胺酶、肉毒毒素、破伤风毒素、志贺氏毒素、白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、溶细胞素A、γ-白树毒素、血管内皮生长因子、促血管生成素1、促血管生成素2、转化生长因子-β、转化生长因子β整合素、血管内皮钙粘蛋白、纤溶酶原激活物、蝶素、血小板衍生生长因子、单核细胞趋化蛋白-1、成纤维细胞生长因子、胎盘生长因子、VHL抑癌基因、腺瘤型结肠息肉抑制基因、分化簇95、肿瘤发生抑制蛋白5、YPEL3、肿瘤发生抑制蛋白7及肿瘤发生抑制蛋白14。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤抑制基因是选自下列的一种以上：VHL抑癌基因、腺瘤型结肠息肉抑制基因、分化簇95、肿瘤发生抑制蛋白5、YPEL3、肿瘤发生抑制蛋白7及肿瘤发生抑制蛋白14。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗癌化合物是选自下列的一种以上：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、硫酸羟脲、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氮芥、环孢酰胺、蒽环霉素、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、吡蒽醌、沙柔比星、戊柔比星、放线菌素D、长春新碱、紫杉醇、康普立停A4、烟曲霉素、除莠霉素、2-甲氧雌二醇、OGT 2115、TNP 470、曲尼司特、XRP44X、沙利度胺、内皮抑素、salmosin、血管抑素、血纤维蛋白溶酶原、载脂蛋白的三环结构域、奥沙利铂、卡铂、顺铂、硼替佐米及放射性核素。
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WO2019124522A1 (ja) * 2017-12-21 2019-06-27 合同会社みらか中央研究所 細胞外小胞の安定化方法
KR102189574B1 (ko) * 2019-01-28 2020-12-11 조선대학교산학협력단 녹사 단백질 유래 세포사 유도 펩타이드 eMTD

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