JP2023536184A - Ｎｏｘａタンパク質に由来するペプチドを含む細胞外小胞産生促進用組成物、及びこれを用いた細胞外小胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アポトーシスに重要な役割を担うＮｏｘａタンパク質に由来するペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）とその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を用いて多量の細胞外小胞（Ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）を生産する方法に関する。本発明の細胞外小胞産生促進用ペプチド及びこれを用いた細胞外小胞の生産方法を用いると、細胞外小胞を効率的で均一かつ大量生産でき、組換えタンパク質又はプラスミドＤＮＡだけでなく、細胞膜を通過しにくい薬物を担持した細胞外小胞を生産することができる。
Description
本特許出願は、２０２０年９月９日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１１５１４５号に対して優先権を主張し、当該特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。
本発明は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドを含む細胞外小胞産生促進用組成物、及びこれを用いた細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）の生産方法に関する。具体的には、アポトーシスに重要な役割を担うＮｏｘａタンパク質に由来するペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組成物、及び糖を含む溶液を用いて細胞外小胞を効率的に大量生産する方法に関する。
細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）は、細胞よりも小さい単位のリン脂質二重層で包まれた袋のことを指し、あらゆる種類の体液に存在する。これは、細胞間に内容物又は情報を交換する役割を担い、近年では、新しいドラッグデリバリーシステムとして利用可能であるという点から注目されている。他のドラッグデリバリーシステムに比し、個々の免疫系の抵抗が少ないこと、細胞膜等の天然のバリアに大きく影響されないこと、特定の細胞への選択性があることなど、他のドラッグデリバリーシステムに比して大きな利点を有している。
細胞外小胞は、その大きさ及び生成過程によって、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）、アポトーシス小体（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）、及びマイクロベシクル（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｌｃｌｅｓ，Ｅｃｔｏｓｏｍｅ）の３つに分類される。当該エクソソームの大きさは３０～１５０ｎｍであり、細胞内エンドソーム（Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に由来する。当該アポトーシス小体の大きさは、１００～５０００ｎｍであり、アポトーシスの初期段階で破壊される細胞骨格に由来する。マイクロベシクルの大きさは、５０～１０００ｎｍであり、特定薬物や物理的ストレスによって細胞膜が突出することで形成される。細胞外小胞のうちエクソソーム及びマイクロベシクルは、新しいドラッグデリバリーシステムとして注目されており、特にエクソソームを用いた研究が多く行われている。
エクソソームは、細胞内に陷入した細胞膜から形成される。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞膜が細胞の内側に陷入すると、初期エンドソーム（Ｅａｒｌｙ ｓｏｒｔｉｎｇ ｅｎｄｏｓｏｍｅ，ＥＳＥ）が形成される。当該初期エンドソームは、小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）やゴルジ体（Ｔｒａｎｓ－ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ，ＴＧＮ）などと結合し得る。当該初期エンドソームは、後期エンドソーム（Ｌａｔｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｅｎｄｏｓｏｍｅ，ＬＳＥ）を形成した後、他の細胞質内の物質をエンドソームに取り込むか、エンドソーム内の物質を細胞質内に放出しながら、腔内小胞（Ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む多胞体（Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ，ＭＶＢ）を形成する。当該多胞体はオートファゴソーム（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）と結合した後、リソソーム（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ）と結合して分解されるか、細胞膜の内側に結合して腔内小胞を細胞外に放出する。このように放出された腔内小胞をエクソソームと称する。当該エクソソームを分離及び精製するための指標としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、フロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＨＳＰ７０、又はＨＳＰ９０などがある。
エクソソームは、細胞間を移動することで様々な機能を果たす。当該エクソソームは、細胞内の様々な細胞小器官と相互作用し、その結果として、内部にタンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の細胞成分を含む他、アミノ酸等の代謝産物を含むこともある。そのため、当該エクソソームは細胞間の相互作用によって、生殖、発生、免疫反応、又は癌を含む様々な疾病の発生などにおいて重要な役割を担う。
エクソソームの診断及び治療への利用が、活発に研究されている。当該エクソソームは、細胞内外に存在するあらゆる物質を反映することができ、当該エクソソームを用いて脳血管疾患、中枢神経疾患等を診断する試みがなされており、特に、癌の診断に対する研究が多く行われている。エクソソームに含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質などの解析による癌診断の可能性は、近年非常に活発に提示されている。
また、エクソソームは、新しいドラッグデリバリーシステムとして注目されている。当該エクソソームは、リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に比べて容易に細胞内に入るだけでなく、免疫系の抵抗をほとんど受けない。さらに、当該エクソソームの膜表面には、豊富なリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）が存在するため、受容体を介した細胞特異的な情報伝達の可能性を示している。
そして、マイクロベシクルは、細胞膜が細胞の外側に突出することで形成される。代表的なものとしては、血小板と、赤血球から形成されるマイクロベシクルとがあるが、これらは、細胞が活性化したとき、せん断応力（Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）が加わったとき、又はアポトーシスが生じたときに形成される。当該マイクロベシクルは、由来した細胞の細胞膜と類似の構成を有するので、免疫系からの影響をほとんど受けずに、容易に細胞内に入ることができ、細胞特異的な情報伝達の可能性を示している。
ただし、このような利点があるにもかかわらず、細胞外小胞を効率的かつ均一に大量生産することは困難であるという問題点がある。
そこで、本発明者らは、上記のような問題点を解決するために、アポトーシスにおいて重要な役割を担うＮｏｘａタンパク質に由来するペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）と、その誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）とを特定条件下で細胞株に処理することで、多量の細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）を効率的かつ均一に大量生産する方法を完成した。
また、本発明者らは、細胞膜を通過しにくい物質を、細胞外小胞に担持させることができることを確認した。
そこで、本発明の目的は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドを含む細胞外小胞産生促進用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチド；及び、糖を含む溶液；を含む細胞外小胞産生用培地を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、細胞外小胞産生用培地を用いた細胞外小胞の生産方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、細胞外小胞産生用培地を用いた細胞外小胞搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）のローディング方法を提供することである。
本発明は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドを含む細胞外小胞産生促進用組成物、及びこれを用いた細胞外小胞（Ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）の生産方法に関する。具体的には、アポトーシスに重要な役割を担うＮｏｘａタンパク質に由来するペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組成物、及び糖を含む溶液を用いて細胞外小胞を効率的に大量生産する方法に関する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一例は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチド、その誘導体、又はそれらの組み合わせを含む細胞外小胞産生促進用組成物に関する。
本発明において、Ｎｏｘａタンパク質は、Ｂｃｌ－２ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３（ＢＨ３）ドメインを介して、Ｍｃｌ１及びＢｃｌ２Ａ１に結合し阻害することによって、ＢＡＸ及びＢＡＫタンパク質を活性化させ、またシトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ－ｃ）が細胞質に放出されることにより、カスパーゼシステム（Ｃａｓｐａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）が活性化してアポトーシスが誘導されると考えられている。
本発明における用語“ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）”とは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。
本発明における用語“誘導体”とは、本発明のペプチドのＮ末端、Ｃ末端などが化学的に修飾された、又はアミノ酸が追加されて変形されたペプチドを意味するが、これに限定されず、本発明のペプチドと同一又は類似の機能を果たすペプチドを意味する。
本発明に係る一具体例において、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドに対して約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の相同性を有するペプチドであってもよい。
本発明に係る一具体例において、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドの誘導体は、配列番号２～２１のいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対して約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の相同性を有するペプチドであってもよい。
本発明においてペプチドは、ペプチド固相合成（Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いて化学的に直接合成する方法、自動合成装置を用いて合成する方法、又は、ペプチドをコードする塩基配列をベクターに挿入し発現させる方法等で製造されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における用語“ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）”とは、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。
本発明におけるベクターは、例えば、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）ベクター、コスミド（Ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、及びバクテリオファージ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）ベクターと、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクター、及びアデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）ベクターのようなウイルスベクターを含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の他の一例は、配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド；及び、糖を含む溶液；を含む細胞外小胞産生用培地に関する。
本発明における溶液に含まれるペプチドの濃度は、１０～８０μＭ、１０～７０μＭ、１０～６０μＭ、１０～５０μＭ、１０～４０μＭ、１５～８０μＭ、１５～７０μＭ、１５～６０μＭ、１５～５０μＭ、１５～４０μＭ、２０～８０μＭ、２０～７０μＭ、２０～６０μＭ、２０～５０μＭ又は２０～４０μＭであってもよく、例えば、２０～４０μＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における糖は、グルコース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選ばれる１種以上であってもよく、例えば、スクロースであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における溶液に含まれるグルコースの濃度は、溶液が本発明のグルコース以外の糖を含む場合に、３～７０ｍＭ、３～６０ｍＭ、３～５０ｍＭ、４～７０ｍＭ、４～６０ｍＭ、４～５０ｍＭ、５～７０ｍＭ、５～６０ｍＭ、又は５～５０ｍＭであってもよく、例えば、５～５０ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるグルコースの濃度は、溶液が本発明のグルコース以外の糖を含まない場合に、８０～３００ｍＭ、８０～２９０ｍＭ、８０～２８０ｍＭ、８０～２７０ｍＭ、８０～２６０ｍＭ、８０～２５０ｍＭ、９０～３００ｍＭ、９０～２９０ｍＭ、９０～２８０ｍＭ、９０～２７０ｍＭ、９０～２６０ｍＭ、９０～２５０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、１００～２９０ｍＭ、１００～２８０ｍＭ、１００～２７０ｍＭ、１００～２６０ｍＭ、又は１００～２５０ｍＭであってもよく、例えば、１００ｍＭ～２５０ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるスクロースの濃度は、８０～３００ｍＭ、８０～２９０ｍＭ、８０～２８０ｍＭ、８０～２７０ｍＭ、８０～２６０ｍＭ、８０～２５０ｍＭ、９０～３００ｍＭ、９０～２９０ｍＭ、９０～２８０ｍＭ、９０～２７０ｍＭ、９０～２６０ｍＭ、９０～２５０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、１００～２９０ｍＭ、１００～２８０ｍＭ、１００～２７０ｍＭ、１００～２６０ｍＭ、又は１００～２５０ｍＭであってもよく、例えば、１００ｍＭ～２５０ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるソルビトールの濃度は、１００～３５０ｍＭ、１００～３４０ｍＭ、１００～３３０ｍＭ、１００～３２０ｍＭ、１００～３１０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、１２５～３５０ｍＭ、１２５～３４０ｍＭ、１２５～３３０ｍＭ、１２５～３２０ｍＭ、１２５～３１０ｍＭ、１２５～３００ｍＭ、１５０～３５０ｍＭ、１５０～３４０ｍＭ、１５０～３３０ｍＭ、１５０～３２０ｍＭ、１５０～３１０ｍＭ、又は１５０～３００ｍＭであってもよく、例えば、１５０ｍＭ～３００ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における培地は、固形培地及び液体培地からなる群から選ばれる１種以上であってもよく、例えば、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における溶液に含まれるＭＯＰＳ［３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］の濃度は、７～１３ｍＭ、７～１２ｍＭ、７～１１ｍＭ、８～１３ｍＭ、８～１２ｍＭ、８～１１ｍＭ、９～１３ｍＭ、９～１２ｍＭ、９～１１ｍＭ、１０～１３ｍＭ、１０～１２ｍＭ、１０～１１ｍＭであってもよく、例えば、１０ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液のｐＨは、５～１０、５～９、５～８、６～１０、６～９、６～８、７～１０、７～９、又は７～８であってもよく、例えば、７～８であってもよい。
本発明における溶液のｐＨは、細胞外小胞を生産する上で重要であり、ｐＨが１０を超える、又はｐＨが５未満である場合には、細胞外小胞が産生されないことがある。
本発明における溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルコン酸ナトリウム（Ｎａ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、グルコン酸カリウム（Ｋ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）、及びリン酸カリウム（ＫＰＯ４）からなる群から選ばれる１種以上をさらに含むものであってもよい。
本発明における溶液に含まれる塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれる塩化カリウム（ＫＣｌ）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるグルコン酸ナトリウム（Ｎａ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるグルコン酸カリウム（Ｋ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明における溶液に含まれるリン酸カリウム（ＫＰＯ４）の濃度は、１ｍＭ以下であってもよく、０～０．８ｍＭ、０～０．６ｍＭ、０～０．４ｍＭ、０．１～１ｍＭ、０．１～０．８ｍＭ、０．１～０．６ｍＭ、又は０．１～０．４ｍＭであってもよく、例えば、０．１ｍＭであってもよいが、これに限定されない。
本発明の一実施例において、溶液は、グルコース５ｍＭ、ＭＯＰＳ１０ｍＭ、及びスクロース２５０ｍＭを含むものであってもよい。
本発明の一実施例において、溶液は、グルコース２５５ｍＭ、及びＭＯＰＳ１０ｍＭを含むものであってもよい。
本発明の一実施例において、溶液は、グルコース５ｍＭ、ＭＯＰＳ１０ｍＭ、及びソルビトール２５０ｍＭを含むものであってもよい。
本発明のさらに他の一例は、次の段階を含む細胞外小胞の生産方法に関する：
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地と細胞株とを混合する混合段階。
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地と細胞株とを混合する混合段階。
本発明において、細胞株は、ＣＴ２６（マウス結腸癌）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＨＥＫ２９３（ヒト腎臓上皮）、３Ｔ３－Ｌ１（マウス脂肪細胞）、及びＨＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）からなる群から選ばれる１種であってもよく、例えば、ＨｅＬａ、又はＨＥＫ２９３であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の一例は、次の段階を含む細胞外小胞搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）のローディング方法に関する：
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地、搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）、及び細胞株を混合する混合段階。
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地、搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）、及び細胞株を混合する混合段階。
本発明において、搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び抗癌物質からなる群から選ばれる１種以上であってもよく、例えば、プラスミドＤＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）は、細胞外小胞に搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）を担持させることを意味するが、これに限定されない。
本発明において、抗癌物質は、抗癌タンパク質、腫瘍抑制遺伝子、及び抗癌剤からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、抗癌タンパク質は、アスパラギナーゼ、ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、破傷風毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）、志賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）、ジフテリア毒素（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ，ＤＴ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、シュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ，ＰＥ）、サイトリシンＡ（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ，ＣｌｙＡ）、γ－ゲロニン（γ－Ｇｅｌｏｎｉｎ）、血管内皮増殖因子（ｖｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ １，Ａｎｇ１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）、形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＴＧＦ－βインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、プラスミノーゲン活性剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１，ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＰＩＧＦ）、ＶＨＬ（ｖｏｎ ＨｉｐｐｅｌＬｉｎｄａｕ）、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）、ＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）、ＳＴ５（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ５）、ＹＰＥＬ３（Ｙｉｐｐｅｅ ｌｉｋｅ ３）、ＳＴ７（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ７）、及びＳＴ１４（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４）からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、腫瘍抑制遺伝子は、ＶＨＬ（ｖｏｎ ＨｉｐｐｅｌＬｉｎｄａｕ）、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）、ＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）、ＳＴ５（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ５）、ＹＰＥＬ３（Ｙｉｐｐｅｅ ｌｉｋｅ ３）、ＳＴ７（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ７）、及びＳＴ１４（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４）からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、抗癌剤は、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、アラビノシルシトシン（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙ ｕｒｅａ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロスポラミド（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ）、アントラシクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピキサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、コンブレタスタチンＡ４（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ４）、フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）、ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ）、２－メトキシエストラジオール（２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ＯＧＴ ２１１５、ＴＮＰ ４７０、トラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ）、ＸＲＰ４４Ｘ、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、プラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、アポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、オキサロプラチン、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、及び放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の細胞外小胞産生促進用ペプチド、及びこれを用いた細胞外小胞の生産方法によれば、細胞外小胞を効率的かつ均一に大量生産でき、また組換えタンパク質又はプラスミドＤＮＡだけでなく、細胞膜を通過しにくい薬物を担持した細胞外小胞を効率的に生産することができる。
以下、本発明は、例示的な実施形態を参照してより詳細に説明される。これらの例示的な実施形態は、本開示をより詳細に説明する目的のためにのみ提供され、したがって、本開示の目的によれば、これらの例が本開示の範囲を制限するように解釈されないことは、当業者にとって明らかであろう。
製造例１．Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチド及びその誘導体の製造
Ｎｏｘａタンパク質のミトコンドリア標的ドメイン（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＭＴＤ）を、表１の配列番号１に示した。ＭＴＤ由来のペプチドの合成は、基本的に、０．２５ｍｍｏｌ単位の手動Ｆｍｏｃ合成法を用いた。具体的には、樹脂とジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）とを用いて洗浄した後、２０％ピぺリジン／ジメチルホルムアミド（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ）溶液を１０ｍＬ添加した。１分間撹拌した後、再度ジメチルホルムアミドで洗浄し、ニンヒドリン試験（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｔｅｓｔ）によりピペリジンが残存していないことを確認した（樹脂が青色に変化）。
Ｎｏｘａタンパク質のミトコンドリア標的ドメイン（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＭＴＤ）を、表１の配列番号１に示した。ＭＴＤ由来のペプチドの合成は、基本的に、０．２５ｍｍｏｌ単位の手動Ｆｍｏｃ合成法を用いた。具体的には、樹脂とジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）とを用いて洗浄した後、２０％ピぺリジン／ジメチルホルムアミド（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ）溶液を１０ｍＬ添加した。１分間撹拌した後、再度ジメチルホルムアミドで洗浄し、ニンヒドリン試験（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｔｅｓｔ）によりピペリジンが残存していないことを確認した（樹脂が青色に変化）。
カップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を行うために、次の溶液を準備した：１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ－アミノ酸（Ｆｍｏｃ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、２．１ｍｌの０．４５Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ［（２－（１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ Ｕｒｏｎｉｕｍ／Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ］（１ｍｍｏｌ）、３４８μＬのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（２ｍｍｏｌ）。
樹脂に、調製した溶液を加えて３０分間振盪した。当該樹脂から溶液を除いた後、ジメチルホルムアミドで樹脂を洗浄した。その後、アミノ酸のカップリングのため、再び溶液を加え、カップリング工程を繰り返し、Ｎｏｘａタンパク質由来のｅＭＴＤΔ４及びその誘導体ペプチドを合成した。
このようにして合成されたペプチドを高速液体クロマトグラフィー（機器：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０分離モジュール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、勾配：０－２０％ Ｂ、５分；２０－５０％ Ｂ、２０分；５０－８０％ Ｂ、５分、Ａ； ０．１％ ＴＦＡ水溶液， Ｂ； ０．１％ ＴＦＡアセトニトリル、カラム：ｗａｔｅｒｓ Ｃ１８，５ミクロン、検出：２２０ｎｍ、純度：９５％）、及び質量分析装置（ＨＰ １１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ）で解析した。合成したペプチドを表１の配列番号２～２１として示した。
実施例２．細胞外小胞産生用溶液の製造
Ｎｏｘａタンパク質のミトコンドリア標的ドメインに由来するｅＭＴＤΔ４とその誘導体ペプチドを用いた細胞外小胞の生産のために、下記表２に示す組成及び含有量を含む実施例１及び比較例１～１８の溶液を製造した。
Ｎｏｘａタンパク質のミトコンドリア標的ドメインに由来するｅＭＴＤΔ４とその誘導体ペプチドを用いた細胞外小胞の生産のために、下記表２に示す組成及び含有量を含む実施例１及び比較例１～１８の溶液を製造した。
実験例１．癌細胞株の培養
１－１．細胞株及び試薬の準備
製造例１のＮｏｘａタンパク質由来ペプチド及びその誘導体の細胞外小胞産生誘導活性を試験するに先立って癌細胞株を培養した。
１－１．細胞株及び試薬の準備
製造例１のＮｏｘａタンパク質由来ペプチド及びその誘導体の細胞外小胞産生誘導活性を試験するに先立って癌細胞株を培養した。
培養に必要なＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ １６４０、ＦＢＳ（Ｆａｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、及びＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｇｉｂｃｏ社から購入し、形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬であるエフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）は、Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞株は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ）から購入した。
１－２．培養
ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞株を３回以上継代培養（Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）して実験に用いた。ＨｅＬａ細胞株は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭを、ＨＥＫ－２９３細胞株は、１０％のウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ １６４０を使用し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞株を３回以上継代培養（Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）して実験に用いた。ＨｅＬａ細胞株は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭを、ＨＥＫ－２９３細胞株は、１０％のウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ １６４０を使用し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
実験例２．細胞外小胞の生産
２－１．細胞外小胞の生産
ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に培養し、培養液を除去した後、実施例１の溶液をＨｅＬａ細胞株に処理した。
２－１．細胞外小胞の生産
ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に培養し、培養液を除去した後、実施例１の溶液をＨｅＬａ細胞株に処理した。
対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には、ペプチドを処理せず、実験群（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）には、配列番号２のｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μＭ）を処理した。１０分経過後に光学顕微鏡（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）を用いて、細胞外小胞が産生されることを観察した結果を図１に示した。
図１から確認できるように、対照群プレートの底はきれいであったが、実験群には、小さい細胞外小胞粒子が形成されてプレートの底に沈んでいた。
２－２．様々な溶液を用いた細胞外小胞の生産
配列番号４のＲ（８）：ＭＴＤペプチド及び実施例１及び比較例１～１８の溶液を用いて、実験例２－１の実験方法によって細胞外小胞を生産した結果を図２Ａ～図２Ｓに示した。
配列番号４のＲ（８）：ＭＴＤペプチド及び実施例１及び比較例１～１８の溶液を用いて、実験例２－１の実験方法によって細胞外小胞を生産した結果を図２Ａ～図２Ｓに示した。
図２Ａから確認できるように、細胞外小胞が多数生成されており、大部分の粒子はプレートの底に沈んでいた。
しかし、図２Ｂ～図２Ｓから確認できるように、細胞外小胞は生成されないため、プレートの底に沈殿した細胞外小胞は観察できず、細胞内のアポトーシス時に発生する粒子の形成のみが観察された。
しかし、図２Ｂ～図２Ｓから確認できるように、細胞外小胞は生成されないため、プレートの底に沈殿した細胞外小胞は観察できず、細胞内のアポトーシス時に発生する粒子の形成のみが観察された。
２－３．様々な糖を用いた細胞外小胞の生産
配列番号４のＲ（８）：ＭＴＤペプチド及び表３に示した実施例１～実施例３の溶液を用いて、実験例２－１の実験方法によって細胞外小胞を生産した結果を図３Ａ～図３Ｃに示した。
配列番号４のＲ（８）：ＭＴＤペプチド及び表３に示した実施例１～実施例３の溶液を用いて、実験例２－１の実験方法によって細胞外小胞を生産した結果を図３Ａ～図３Ｃに示した。
図３Ａ～図３Ｃから確認できるように、スクロースの代わりに、グルコースやソルビトールを過剰に添加しても、細胞外小胞は良好に形成された。
実験例３．細胞外小胞の形状の確認
エクソソームの指標であるＨＳＰ９０タンパク質をＨｅＬａ細胞株に形質転換（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させるために、ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートに一晩培養した後、エフェクテンとｐＥＧＦＰ－ＨＳＰ９０とがクローニングされたプラスミドを細胞株に処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。
エクソソームの指標であるＨＳＰ９０タンパク質をＨｅＬａ細胞株に形質転換（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させるために、ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートに一晩培養した後、エフェクテンとｐＥＧＦＰ－ＨＳＰ９０とがクローニングされたプラスミドを細胞株に処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。
翌日、ＨｅＬａ細胞株から培養液を除去し、実施例１溶液を添加した。対照群にはペプチドを処理せず、実験群には配列番号２のｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μＭ）を処理した。ＨＳＰ９０タンパク質は、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを用いて励起（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）させた。１０分間後に共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて対照群と実験群とを観察し、その結果を図４に示した。
図４から確認できるように、対照群では、細胞形態は壊れておらず、ＨＳＰ９０タンパク質は細胞質内に位置していた。しかし、実験群（ｅＭＴＤΔ４）では、細胞形態が損なわれ、ＨＳＰ９０タンパク質を含む細胞外小胞がプレートの底に沈殿していることが確認された。
その理由は、細胞質側のＨＳＰ９０タンパク質が、細胞外小胞の生成時に生じた細胞膜の欠損を介して細胞外に放出されたためと判断された。
その理由は、細胞質側のＨＳＰ９０タンパク質が、細胞外小胞の生成時に生じた細胞膜の欠損を介して細胞外に放出されたためと判断された。
実験例４．細胞外小胞の生成過程の確認
ＨｅＬａ細胞株を１２ウェルプレートに一晩培養し、細胞外小胞の指標であるＣＤ９タンパク質を確認するために、エフェクテンとｍＥｍｅｒａｌｄ－ＣＤ９とがクローニングされたプラスミドを処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。
ＨｅＬａ細胞株を１２ウェルプレートに一晩培養し、細胞外小胞の指標であるＣＤ９タンパク質を確認するために、エフェクテンとｍＥｍｅｒａｌｄ－ＣＤ９とがクローニングされたプラスミドを処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。
翌日、ＨｅＬａ細胞株から培養液を除去し、実施例１溶液を処理した。それぞれのＨｅＬａ細胞株にｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μＭ）を処理した後、ｍＥｍｅｒａｌｄ－ＣＤ９を励起させるために４８８ｎｍ波長のレーザーを利用した。その後、共焦点顕微鏡を用いて約２秒間隔で写真を撮りながら１０分間観察し、その結果を図５Ａに示した。
また、細胞外小胞の指標であるＣＤ８１タンパク質を確認するために、ｍＥｍｅｒａｌｄ－ＣＤ９の代わりに、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ８１がクローニングされたプラスミドをＨｅＬａ細胞株に処理すること、及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ８１を５６１ｎｍ波長のレーザーを用いて励起させること以外は、前記ＣＤ９タンパク質を観察するための方法と同じ過程を行い、その結果を図５Ｂに示した。
図５Ａ及び図５Ｂで確認できるように、ＣＤ９タンパク質及びＣＤ８１タンパク質のいずれも、細胞外小胞の形成を観察するために十分であり、ＣＤ９タンパク質及びＣＤ８１タンパク質は、細胞外マトリックスに放出された。また、放出手順は具体的に特定することはできないが、産生後数秒で細胞外小胞が細胞外マトリックスに放出されることが確認できた。
実験例５．細胞外小胞の大きさの確認
ＨｅＬａ細胞株を培養プレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）に培養し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μＭ）を実施例１溶液と共に細胞株に処理し、１０分間後に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した。
ＨｅＬａ細胞株を培養プレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）に培養し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μＭ）を実施例１溶液と共に細胞株に処理し、１０分間後に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した。
その後、原子顕微鏡（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＡＮＯ Ｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ）を用いて観察し（ピラミッド状先端、１４６～２３６ｋＨｚの周波数、２１～９８Ｎ／ｍのばね定数、２２５ｎｍの長さ、及び０．０１～０．０２Ωｃｍの抵抗を有するカンチレバー）、観察した結果を図６Ａ～図６Ｃに示した。
図６Ａから確認できるように、様々な大きさの細胞外小胞が生成され、その大きさを測定することができた。細胞外小胞の大きさを測定した結果を、図６Ｂ及び図６Ｃのグラフに示した。
図６Ｂ及び図６Ｃから確認できるように、細胞外小胞の大きさは約２００ｎｍ程度と測定された。このような結果は、本発明における細胞外小胞が、従来知られている細胞外小胞の大きさと同等の大きさを有していることを証明する。
図６Ｂ及び図６Ｃから確認できるように、細胞外小胞の大きさは約２００ｎｍ程度と測定された。このような結果は、本発明における細胞外小胞が、従来知られている細胞外小胞の大きさと同等の大きさを有していることを証明する。
実験例６．細胞外小胞の産生量の確認
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに２×１０５個／ｍＬずつ培養し、翌日、実施例１溶液及び配列番号１～２１のいずれか一つのペプチドを細胞株に処理した。２０分間後に溶液を除去し、１２０００ｒｃｆで遠心分離した後、上清を回収し、ブラッドフォード溶液を用いて細胞外小胞を定量し、その結果を図７及び表４に示した。
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに２×１０５個／ｍＬずつ培養し、翌日、実施例１溶液及び配列番号１～２１のいずれか一つのペプチドを細胞株に処理した。２０分間後に溶液を除去し、１２０００ｒｃｆで遠心分離した後、上清を回収し、ブラッドフォード溶液を用いて細胞外小胞を定量し、その結果を図７及び表４に示した。
図７及び表４から確認できるように、表４に示したペプチドは、産生量に差はあるものの、ほとんどが良好に細胞外小胞を産生していることがわかる。
また、ペプチド処理における最終濃度が１０μＭから２０μＭ、及び４０μＭへと増加するに連れて、細胞外小胞に含まれるタンパク質量が増加する傾向があることを確認することができた。
また、ペプチド処理における最終濃度が１０μＭから２０μＭ、及び４０μＭへと増加するに連れて、細胞外小胞に含まれるタンパク質量が増加する傾向があることを確認することができた。
実験例６．細胞外小胞の大きさ及び数量の確認
２９３－ＨＥＫ細胞株を１０ｃｍ培養皿に９０％コンフルエンシー（約２×１０７ｃｅｌｌ）で培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μｍ）を実施例１の溶液５ｍｌに溶かして細胞株に処理した。２０分間後に溶液を除去し、１２０００ｒｃｆで遠心分離した後、ＮＴＡ（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ）システム（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて細胞外小胞の大きさと数量を測定し、その結果を図８Ａ～図８Ｄ及び表５に示した。
２９３－ＨＥＫ細胞株を１０ｃｍ培養皿に９０％コンフルエンシー（約２×１０７ｃｅｌｌ）で培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２０μｍ）を実施例１の溶液５ｍｌに溶かして細胞株に処理した。２０分間後に溶液を除去し、１２０００ｒｃｆで遠心分離した後、ＮＴＡ（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ）システム（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて細胞外小胞の大きさと数量を測定し、その結果を図８Ａ～図８Ｄ及び表５に示した。
図８Ａ～図８Ｄ及び表５から確認できるように、細胞外小胞の大きさは、ｅＭＴＤΔ４ペプチドを用いると、平均（ｍｅａｎ）１８４．５ｎｍ、最頻値（ｍｏｄｅ）１２６．３ｎｍ、及び標準偏差（ＳＤ）８７．８ｎｍを示した。
ＭＴＤペプチドを用いると、平均１８１．１ｎｍ、最頻値１１５．６ｎｍ、及び標準偏差７５．２ｎｍを示した。
ＴＵ１７ペプチドを用いると、平均２２９．６ｎｍ、最頻値１５０．９ｎｍ、及び標準偏差１０４．３ｎｍを示した。
ＴＵ１１４ペプチドを用いると、平均２３１．１ｎｍ、最頻値１８２．３ｎｍ、及び標準偏差１１０．２ｎｍを示した。
ＭＴＤペプチドを用いると、平均１８１．１ｎｍ、最頻値１１５．６ｎｍ、及び標準偏差７５．２ｎｍを示した。
ＴＵ１７ペプチドを用いると、平均２２９．６ｎｍ、最頻値１５０．９ｎｍ、及び標準偏差１０４．３ｎｍを示した。
ＴＵ１１４ペプチドを用いると、平均２３１．１ｎｍ、最頻値１８２．３ｎｍ、及び標準偏差１１０．２ｎｍを示した。
したがって、本発明の細胞外小胞産生促進用ペプチドを特定溶液条件下で用いると、様々な大きさを有する細胞外小胞を効率的に大量生産可能であることが確認できた。
実験例７．組換えタンパク質を担持した細胞外小胞の生産
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに９０％コンフルエンシーで培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）と組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＴＲＡＩＬとを、それぞれ２５μＭ、２μｇ／ｍｌの濃度で実施例１の溶液に溶かして細胞株に処理した。上清を採取し、ＰＥＧ（最終濃度：８％）を添加した後、１２０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して細胞外小胞を沈殿させ、これをＳＤＳ－アクリルアミドゲルにかけてＴＲＡＩＬタンパク質を確認し、その結果を図９及び表６に示した。
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに９０％コンフルエンシーで培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）と組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＴＲＡＩＬとを、それぞれ２５μＭ、２μｇ／ｍｌの濃度で実施例１の溶液に溶かして細胞株に処理した。上清を採取し、ＰＥＧ（最終濃度：８％）を添加した後、１２０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して細胞外小胞を沈殿させ、これをＳＤＳ－アクリルアミドゲルにかけてＴＲＡＩＬタンパク質を確認し、その結果を図９及び表６に示した。
図９及び表６から確認できるように、本発明の細胞外小胞産生促進用ペプチドを特定溶液条件下で用いると、細胞外小胞生成過程において、外部で添加した組換えタンパク質を細胞外小胞に効率的に担持させることができた。
実験例８．プラスミドＤＮＡを担持した細胞外小胞の生産
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに９０％コンフルエンシーで培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）とプラスミドＤＮＡ（ＰＵＣ１９ ３μｇ／ｍｌ、ＥＧＦＰ－Ｃ１ ６μｇ／ｍｌ）とを実施例１の溶液に溶かして細胞株に処理した。
２９３－ＨＥＫ細胞株を６ウェルプレートに９０％コンフルエンシーで培養した後、培養液を除去し、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）とプラスミドＤＮＡ（ＰＵＣ１９ ３μｇ／ｍｌ、ＥＧＦＰ－Ｃ１ ６μｇ／ｍｌ）とを実施例１の溶液に溶かして細胞株に処理した。
上清１．１５ｍｌを採取し、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液Ｐ３ ０．３５ｍｌを追加して全量を１．５ｍｌにし、そのうち０．７５ｍｌをＤＮＡミニプレップカラム（ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｃｏｌｕｍｎ）（Ｑｉａｇｅｎ）に通過させ、通過した溶液はフェノールで精製し、エタノールを用いて沈殿させた。
カラムに結合したＤＮＡ ３０μｌとエタノールで沈殿させたＤＮＡ ３０μｌとを水に溶かした後、カラムに結合したＤＮＡ １０μｌ及びエタノールで沈殿させたＤＮＡ １０μｌをアガロースゲル電気泳動し、ＥｔＢｒで染色して確認した結果を図１０に示した。
図１０から確認できるように、細胞外小胞生成過程において、外部で添加したプラスミドＤＮＡを細胞外小胞に担持させることができた。
また、図１１に示す過程によって、細胞外小胞からプラスミドＤＮＡを再び分離することができる。
したがって、本発明の細胞外小胞産生促進用ペプチドを特定溶液条件下で用いると、細胞外小胞にプラスミドＤＮＡを効率的に担持させることができる。
実験例９．ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を担持した細胞外小胞の生産
ドキソルビシンは、細胞膜をよく通過する薬物であり、乳癌、膀胱癌、カポジ肉腫、リンパ腫又は急性リンパ性白血病など癌治療に使われる薬物である。まず、ＨｅＬａ細胞株を１２ウェルプレートに一晩培養した後、エフェクテンを、ｐＥＧＦＰ－ＨＳＰ９０がクローニングされたプラスミドを処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。翌日、ＨｅＬａ細胞株から培養液を除去し、細胞株を準備した。
ドキソルビシンは、細胞膜をよく通過する薬物であり、乳癌、膀胱癌、カポジ肉腫、リンパ腫又は急性リンパ性白血病など癌治療に使われる薬物である。まず、ＨｅＬａ細胞株を１２ウェルプレートに一晩培養した後、エフェクテンを、ｐＥＧＦＰ－ＨＳＰ９０がクローニングされたプラスミドを処理し、４時間後に培養液を入れ換えた。翌日、ＨｅＬａ細胞株から培養液を除去し、細胞株を準備した。
対照群にはペプチドを処理せず、ドキソルビシンのみを処理し、実験群には、ｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）とドキソルビシン（最終濃度：１００μＭ）とを実施例１溶液に溶かして処理した後、１０分間後に共焦点顕微鏡を用いて観察し、その結果を図１２に示した。
図１２から確認できるように、産生された細胞外小胞は、エクソソーム指標であるＨＳＰ９０タンパク質の他にドキソルビシンも含んでいた。
実験例１０．ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を担持した細胞外小胞の生産
ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）は、細胞膜を通過しにくい薬物であり、細胞の染色に使用可能な蛍光物質である。まず、ＨＳＰ９０タンパク質をＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションさせ、細胞株を準備した。
ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）は、細胞膜を通過しにくい薬物であり、細胞の染色に使用可能な蛍光物質である。まず、ＨＳＰ９０タンパク質をＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションさせ、細胞株を準備した。
対照群にはペプチドを処理せず、ＰＩのみを処理し、実験群にはｅＭＴＤΔ４ペプチド（最終濃度：２５μＭ）を５μｇ／ｍｌ ＰＩと共に実施例１溶液に溶かして細胞株に処理した後、１０分間後に共焦点顕微鏡を用いて観察し、その結果を図１３に示した。
図１３から確認できるように、生成された細胞外小胞は、エクソソーム指標であるＨＳＰ９０タンパク質の他にＰＩも含んでいた。
したがって、タンパク質、ＤＮＡ、細胞膜を通過できない様々な薬物などを細胞外小胞に担持させることができ、これは新しいドラッグデリバリーシステムとして有用に使用可能であろう。
本発明は、Ｎｏｘａタンパク質由来ペプチドを含む細胞外小胞産生促進用組成物及びこれを用いた細胞外小胞（Ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）の生産方法に関する。具体的には、アポトーシスに重要な役割を担うＮｏｘａタンパク質に由来するペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組成物、及び糖を含む溶液を用いて細胞外小胞を効率的に大量生産する方法に関する。
Claims (16)
- 配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチドを含むことを特徴とする細胞外小胞産生促進用組成物。
- 配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド；及び
糖を含む溶液；
を含むことを特徴とする細胞外小胞産生用培地。 - 前記糖は、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、及びソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の細胞外小胞産生用培地。
- 前記溶液は、ＭＯＰＳ［３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］をさらに含む、請求項２に記載の細胞外小胞産生用培地。
- 前記溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルコン酸ナトリウム（Ｎａ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、グルコン酸カリウム（Ｋ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）、及びリン酸カリウム（ＫＰＯ４）からなる群から選ばれる１種以上をさらに含む、請求項２に記載の細胞外小胞産生用培地。
- 次の段階を含む細胞外小胞の生産方法：
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地と細胞株とを混合する混合段階。 - 前記糖は、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、及びソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項６に記載の細胞外小胞の生産方法。
- 前記溶液は、ＭＯＰＳ［３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］をさらに含む、請求項６に記載の細胞外小胞の生産方法。
- 前記溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルコン酸ナトリウム（Ｎａ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、グルコン酸カリウム（Ｋ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）、及びリン酸カリウム（ＫＰＯ４）からなる群から選ばれる１種以上をさらに含む、請求項６に記載の細胞外小胞の生産方法。
- 前記細胞株は、ＣＴ２６（マウス結腸癌）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＨＥＫ２９３（ヒト腎臓上皮）、３Ｔ３－Ｌ１（マウス脂肪細胞）、及びＨＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）からなる群から選ばれるいずれか１つである、請求項６に記載の細胞外小胞の生産方法。
- 次の段階を含む細胞外小胞搭載物（Ｐａｙｌｏａｄ）ローディング方法：
配列番号１～配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド群から選ばれる少なくとも１種以上のペプチド、及び糖を含む溶液を含む培地を準備する培地準備段階；及び
培地、搭載物、及び細胞株を混合する混合段階。 - 前記搭載物は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び抗癌物質からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１１に記載の細胞外小胞搭載物ローディング方法。
- 前記抗癌物質は、抗癌タンパク質、腫瘍抑制遺伝子、及び抗癌剤からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１２に記載の細胞外小胞搭載物ローディング方法。
- 前記抗癌タンパク質は、アスパラギナーゼ、ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、破傷風毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）、志賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）、ジフテリア毒素（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ，ＤＴ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、シュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ，ＰＥ）、サイトリシンＡ（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ，ＣｌｙＡ）、γ－ゲロニン（γ－Ｇｅｌｏｎｉｎ）、血管内皮増殖因子（ｖｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ １，Ａｎｇ１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）、形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＴＧＦ－βインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、プラスミノーゲン活性剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１，ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＰＩＧＦ）、ＶＨＬ（ｖｏｎ ＨｉｐｐｅｌＬｉｎｄａｕ）、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）、ＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）、ＳＴ５（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ５）、ＹＰＥＬ３（Ｙｉｐｐｅｅ ｌｉｋｅ ３）、ＳＴ７（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ７）、及びＳＴ１４（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１３に記載の細胞外小胞搭載物ローディング方法。
- 前記腫瘍抑制遺伝子は、ＶＨＬ（ｖｏｎ ＨｉｐｐｅｌＬｉｎｄａｕ）、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）、ＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）、ＳＴ５（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ５）、ＹＰＥＬ３（Ｙｉｐｐｅｅ ｌｉｋｅ ３）、ＳＴ７（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ７）、及びＳＴ１４（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１３に記載の細胞外小胞搭載物ローディング方法。
- 前記抗癌剤は、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、アラビノシルシトシン（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙ ｕｒｅａ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロスポラミド（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ）、アントラシクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピキサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、コンブレタスタチンＡ４（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ４）、フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）、ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ）、２－メトキシエストラジオール（２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ＯＧＴ ２１１５、ＴＮＰ ４７０、トラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ）、ＸＲＰ４４Ｘ、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、プラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、アポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、オキサロプラチン、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、及び放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１３に記載の細胞外小胞搭載物ローディング方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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