CN116103207B - 一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌jybb-163及菌剂、制备方法和应用 - Google Patents

一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌jybb-163及菌剂、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌JYBB‑163及其菌剂、制备方法和应用。两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JYBB‑163于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18091。JYBB‑163菌剂可以明显提升经高温处理睾丸的小鼠和衰老大鼠的睾酮水平和睾丸系数、改善其精液质量，可用于辅助治疗男性不育、改善男性精液质量和生育功能。

Description

一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌JYBB-163 及菌剂、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌JYBB-163及菌剂、制备方法和应用。
背景技术
生育问题一直是生命科学领域的重要研究问题，近年来，男女不育症的发生率不断升高，其中男性不育约占40％～50％，男性不育症的主要病因包括生殖内分泌激素水平异常、精液质睾丸附睾发育异常、自身免疫、精子获能障碍及感染等，主要表现为少精、弱精及精子畸形等精液质量异常症状。研究发现，睾酮水平是影响精液质量的因素之一，睾酮是支持男性生殖系统生长发育的基本激素，低水平睾酮不利于附睾等附属性腺的生长，从而影响精子的成熟；而且睾酮水平直接影响精子的生长发育，低水平睾酮会诱发生精细胞凋亡，使精子数量减少，直接损伤精子DNA；同时低水平睾酮会降低男性性欲，引起勃起功能障碍，从而降低患者性生活满意程度，间接影响患者的精液质量。
目前，改善男性精液质量和生育能力的方法包括饮食运动、药物治疗。控制饮食和加强运动锻炼，成本很低，但是难以坚持。药物治疗见效快，但是效果不持久且副作用较大。研究发现，通过调节肠道菌群变化可以间接促进生殖障碍问题的解决。但是目前肠道菌群移植的技术还不成熟，治疗效果不稳定，未有重复性好的益生菌治疗手段的相关报道。
发明内容
针对现有技术中益生菌治疗男性生殖障碍效果不稳定的技术问题，本发明提供一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌JYBB-163及菌剂和应用。
第一方面，本发明提供一改善男性精液质量和生育能力的种两歧双歧杆菌JYBB-163，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JYBB-163于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18091。
第二方面，本发明提供一种上述两歧双歧杆菌JYBB-163的菌剂。
第三方面，本发明提供一种上述菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)取保藏的两歧双歧杆菌JYBB-163在MRS平板培养基上活化，将活化后的两歧双歧杆菌JYBB-163接种于MRS液体培养基中，培养24h获得菌液；
(2)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量分数为15％的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0～2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(3)将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂。
进一步的，步骤(1)中，接种量为1％。
进一步的，步骤(1)中，MRS液体培养基的制备方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合，调pH为6.8，搅拌均匀后，灭菌即可。
进一步的，灭菌的条件为在121℃、0.1MPa，灭菌时间为20min。
进一步的，步骤(1)中，培养温度为37℃。
第四方面，本发明提供上述两歧双歧杆菌JYBB-163在制备改善男性精液质量和生育能力产品方面的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明分离得到一株两歧双歧杆菌JYBB-163，将其制成菌剂，经试验验证，JYBB-163菌剂可以明显提升经高温处理睾丸的小鼠的睾酮水平和睾丸系数，提高其精子总数、精子移动率，降低其精子畸形率；同时JYBB-163菌剂可以明显提升衰老大鼠的睾酮水平和睾丸系数，提高衰老大鼠的质膜完整性、线粒体功能正常比例和DNA完整性。因此，两歧双歧杆菌JYBB-163菌剂有助于改善男性精液质量和生育功能，可用于辅助治疗男性不育。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1菌株分离与鉴定
1、菌株筛选及纯化
(1)取样：取伊利州牧民家里自然发酵的葡萄酒1mL，备用；
(2)制备稀释液：将步骤(1)的葡萄酒置于无菌三角瓶中，加入灭菌后的生理盐水振荡摇匀，制成不同浓度梯度的稀释液，稀释倍数分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；
(3)制备MRS平板培养基：
蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用；
(4)培养：将步骤(2)的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
(5)按照以下菌落特征挑选菌落：
直径1-2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起。
(6)分离纯化：根据步骤(5)的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板的培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将步骤(6)分离纯化后单菌落送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程(上海)股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
该菌株基因序列为：
CTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCTCCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGTTCCACATGATCGCATGTGATTGTGGGAAAGATTCTATCGGCGTGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTTGGGAGCAAGCCTTCGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGCTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGACGCTGGATGTGGGGCACGTTCCACGTGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGACGCCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGGGTCGGGGGAAGGTGGGTTTAGTCCCGCAACCAGGGCCACCCTCGCCCCGTGTTGGCCGCACGTTATGGTGGGAACTCACGGGGAACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGGGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCGGGGCTTCCCCCATGCTACAATGGCCGGTACAGCAGGATGCGACCTGGCGACATGGAGCGAATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGGAGCCTGCAACCCGGCTCCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAGAGTGTACAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAGGTGAGGCTCGTGATTGGGACTCAGTCA
鉴定结果为：该菌株为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，其分类单元为：Bacteria；Actinobacteria；Bifidobacteriales；Bifidobacteriaceae；Bifidobacterium。
将鉴定后的菌株命名为两歧双歧杆菌JYBB-163，于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.18091。
实施例2制备两歧双歧杆菌JYBB-163菌剂
(1)制备培养基，MRS液体培养基包括蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可；
(2)取实施例1中保藏的两歧双歧杆菌JYBB-163在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照1％的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；
(3)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量分数为15％的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.5×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(4)将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂；低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为100亿/g。
实施例3两歧双歧杆菌JYBB-163通过模拟胃肠消化液实验
(1)模拟胃液制备与操作
模拟胃液按照如下方法配制：用9.5％盐酸加蒸馏水稀释至pH值为1.5，每100mL加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
称取12份实施例2制得的两歧双歧杆菌JYBB-163菌剂，每份重量为1g，转移至预热的装有9mL模拟胃液的试管中，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。
(2)模拟肠液制备与操作
模拟肠液按照如下方法配制：将6.8g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中，加入3g胆盐和10g胰蛋白酶，用浓度为4g/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.8，用蒸馏水定容至1L后，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
称取12份实施例2制得的两歧双歧杆菌JYBB-163菌剂，每份重量为1g，转移至装有9mL模拟肠液的试管中，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。
(3)称取12份实施例2制得的两歧双歧杆菌JYBB-163菌剂，每份重量为1g，转移至装有9mL生理盐水的试管中，作为对照菌株溶液，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。
以对上述胃液或肠液处理的溶液及对照菌株溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，计算公式如下：
结果如表1所示。
表1体外模拟胃肠环境下JYBB-163存活率
处理时间 模拟胃液存活率 模拟肠液存活率
0h 100％ 100％
1h 93％ 97％
2h 87％ 94％
3h 84％ 93％
4h 81％ 93％
如表1所示，可以看出两歧双歧杆菌JYBB-163在体外模拟胃肠环境下的存活率非常高，在胃液中4h，存活率依然在80％以上；在肠液中4h，存活率达到90％以上，为后续菌种定殖肠道、发挥功能奠定基础。
实施例4JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的睾酮水平的影响
将7周龄昆明小鼠随机分为3组，即对照组、模型组(高温处理)、JYBB-163组，每组10只。将模型组和JYBB-163组小鼠四肢绑于立式支架，待睾丸降入阴囊，使阴囊浸没于45℃温水中恒温水浴30min，构建小鼠生殖系统损伤模型。然后三组小鼠正常饲喂14天，期间JYBB-163组给小鼠灌胃0.2mL浓度为107cfu/mL的JYBB-163菌液(JYBB-163菌液由实制备实施例2的菌剂用生理盐水稀释而成)，每天1次，对照组和模型组灌注同样体积的生理盐水。各组连续灌胃14天，于第15天用3％戊巴比妥钠麻醉小鼠，对小鼠进行称重。股动脉放血法处死小鼠，收集血液，1000r/min离心10min，吸取上清液。使用睾酮免疫试剂盒(购自美国Rapidbio公司)，根据说明书检测血清中睾酮含量，结果如表2所示。
表2小鼠血清中睾酮含量
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
睾酮水平(nmol/L) 11.33±0.94 3.21±0.65## 10.94±1.11**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表2可以看出，模型组小鼠在高温处理后与正常对照组相比，睾酮含量显著下降(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，睾酮含量显著增高(p＜0.01)，且与正常对照组并无明显差异。因此，两歧双歧杆菌JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的睾酮水平有明显的提升作用。
实施例5JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的睾丸系数的影响
在实施例4的小鼠处死后，迅速取双侧睾丸组织，去除脂肪，用滤纸吸干血液，电子分析天平称量双侧睾丸的重量，再参照实施例4中的小鼠体重，计算睾丸系数，结果如表3所示。
表3小鼠睾丸系数
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
睾丸系数(％) 5.93±0.27 3.54±0.18## 6.04±0.25**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表3可以看出，模型组小鼠在高温处理后与正常对照组相比，睾丸系数显著下降(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，睾丸系数显著增高(p＜0.01)，且与正常对照组并无明显差异。因此，两歧双歧杆菌JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的睾丸系数有明显的提升作用。
实施例6JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的精液质量的影响
将实施例4中的小鼠处死后，使用75％乙醇消毒腹部，打开腹腔，室温下取附睾尾部，用预热的37℃生理盐水漂洗2次，剪3刀，置于盛有1mL生理盐水冻存管中，37℃水浴箱中孵育30min，使精子游出，制成悬液进行精子总数、运动率和畸形率的测定。
(1)精子总数测定
将精子悬液滴在血球计数板置于显微镜下观察，按红细胞计数法测定精子数量：在高倍镜下记录中央大方格中的5个中方格中的精子数目，遵循上下左右只取一边的原则记录视野内的精子数量。为了避免误差过大，选取的方格中所记录的精子数量最大值和最小值之间差率不得超过±10％。将5个中方格计数的精子数相加，每毫升精液所含精子数＝5个中方格的精子总数×5×10×103，结果如表4所示。
(2)精子移动率的测定
将精子悬液滴入血球计数板置于高倍镜下观察，随机记录100个精子中活动精子数量，并参照既定的标准对精子活动进行定级：等级I，精子可快速延直线向前运动；等级II，精子行动迟缓，延直线或非直线前进；等级III，精子仍有活力，但不移动；等级IV，精子无活力，不移动。记录数据后，代入下列公式计算每只小鼠的精子移动率，每组取平均值，结果如表4所示。
其中，SI为等级I的精子数量，SII为等级II的精子数量，SIII为等级III的精子数量，SIV为等级IV的精子数量。
(3)精子畸形率测定
取10μL制备好的新鲜精子悬液涂片，待其自然干燥后用甲醛溶液将精子涂片固定过夜，并于次日取出后用2％伊红染色90min，随后用流水缓慢轻轻冲洗涂片，室温自然干燥后进行镜检。精子畸形形态根据文献可分为6种，分别为：无钩、大头、双头、香蕉形、卷尾、双尾等非正常形态。针对每只小鼠的精液样品共记录500个完整精子及其中的畸形数目，然后计算畸形率，计数时排除掉精子形态不全且模糊、重叠精子以及机械剪切碎片等非正常形态，，每组取平均值，结果如表4所示。
表4小鼠精液质量指标
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
精子总数(×107个/mL) 4.32±0.28 1.81±0.24## 4.41±0.21**
精子移动率(％) 54.2±3.1 11.4±2.0## 56.9±3.9**
精子畸形率(％) 27.26±1.64 59.24±3.18## 24.98±1.82**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表4可以看出，模型组小鼠在高温处理后与正常对照组相比，精子总数和精子移动率均显著下降(p＜0.01)，精子畸形率显著上升(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，精子总数和精子移动率均显著上升(p＜0.01)，精子畸形率显著下降(p＜0.01)，且各项指标与正常对照组并无明显差异，说明两歧双歧杆菌JYBB-163对经高温处理睾丸后的小鼠的精液质量有明显的改善作用。
实施例7JYBB-163对衰老大鼠的睾酮水平的影响
选用清洁级健康雄性Wistar大鼠作为实验对象，分为三组，对照组、模型组、JYBB-163组，每组10只。对照组在12月龄进行取材；模型组在16月龄时每天定点进行灌胃0.2mL生理盐水，60天后进行取材；JYBB-163组在16月龄时每天定点灌胃0.2mL浓度为108CFU/mL的JYBB-163菌液，60天后进行取材。
实验结束后，用6％水合氯醛麻醉(0.5mL/100g)，立即称取大鼠体量。用毛细吸管插入内眦眶后静脉丛取血2mL，1000r/min离心10min，吸取上清液，使用睾酮免疫试剂盒(购自美国Rapidbio公司)，根据说明书进行检测血清中睾酮含量，结果如表5所示。
表5大鼠血清中睾酮含量
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
睾酮含量(nmol/L) 5.17±1.31 0.74±0.25## 3.57±0.96**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表5可以看出，模型组衰老大鼠与对照组青年大鼠相比，睾酮含量显著下降(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，睾酮含量显著增高(p＜0.01)，说明两歧双歧杆菌JYBB-163对衰老大鼠的睾酮水平有明显的提升作用。
实施例8JYBB-163对衰老大鼠的睾丸系数的影响
对实施例7中处死的大鼠，迅速取双侧睾丸组织，去除脂肪，用滤纸吸干血液，电子分析天平称量双侧睾丸的重量，再参照实施例7中的大鼠体重，计算睾丸系数，公式如下：
表6大鼠睾丸系数
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
睾丸系数(％) 9.26±1.17 3.74±0.38## 7.28±0.65**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表6可以看出，模型组的衰老大鼠与对照组青年大鼠相比，睾丸系数显著下降(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，睾丸系数显著增高(p＜0.01)，说明两歧双歧杆菌JYBB-163对衰老大鼠的睾丸系数有明显的提升作用。
实施例9JYBB-163对衰老大鼠的精液质量的影响
将实施例7中的大鼠处死后，75％乙醇消毒腹部，打开腹腔,室温下取附睾尾部，用37℃预热的生理盐水漂洗2次，剪3刀，置于盛有1mL生理盐水冻存管中,37℃水浴箱中孵育30min，使精子游出，制成悬液检测精液质量。
(1)精子质膜完整性观察结果
采用乙酰乙酸盐+碘化丙啶染色法观察质膜完整性，其中乙酰乙酸盐(FDA)购自中国北京泛博生物化学有限公司，型号为P22020，1mg FDA溶解于1mL丙酮中，避光保存；碘化丙啶(PI)购自Sigma公司，型号为P8080，用0.1M PBS溶液配成浓度为400μg/mL PI溶液，4℃避光保存。取出新收集的精子悬液0.5mL，常温下使用高速离心机(Eppendorf 5415D，德国)1000r/min离心2min，去除上清液，用0.1M PBS溶液洗涤2次，调整精子浓度至5×106个/mL，加入FDA染液使其终浓度至20μg/mL，37℃避光染色3min，然后加入PI染液其终浓度至5μg/mL，染色3min，涂片后用荧光显微镜(OLYMPUS E53，日本)计数100个精子中头部发绿色荧光的精子数。头部发绿色荧光的表明质膜完整，发红色荧光的为质膜破损。
按照下列公式计算每只大鼠的精子质膜完整性，每组取平均值，结果如表7所示。
(2)精子线粒体功能检测结果
采用罗丹明123(Rh123)染色，在荧光显微镜下，发强绿色荧光的精子线粒体功能正常，而精子发弱绿荧光或荧光出现分节现象，说明其线粒体功能减弱。涂片后用荧光显微镜(OLYMPUS E53，日本)计数100个精子中头部发强绿色荧光的精子数。按照下列公式计算每只大鼠的精子线粒体功能正常比例，每组取平均值，结果如表7所示。
(3)精子DNA完整性观察结果
采用精子DNA吖啶橙荧光检测试剂盒检测精子DNA完整性，头部发绿色荧光的为DNA正常精子，发红色或黄色荧光的为DNA异常精子，计数100个精子中头部发强绿色荧光的精子百分数，即为精子DNA完整性，每组取平均值，结果如表7所示。
表7大鼠精液质量指标
组别 对照组 模型组 JYBB-163组
质膜完整性 58.7±2.3 32.1±1.7## 47.6±1.9**
线粒体功能正常比例(％) 48.7±2.1 27.1±1.3## 41.6±1.7**
精子DNA完整性 58.2±2.4 29.8±1.8## 49.9±2.1**
注：##表示与对照组对比，p＜0.01；**表示与模型组对比，p＜0.01。
由表7可以看出，模型组衰老大鼠与对照组青年大鼠相比，精子质膜完整性、线粒体功能正常比例和DNA完整性均显著下降(p＜0.01)；JYBB-163组与模型组相比，精子质膜完整性、线粒体功能正常比例和DNA完整性均显著上升(p＜0.01)，说明两歧双歧杆菌JYBB-163对大鼠的精液质量有明显的改善作用。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种改善男性精液质量和生育能力的两歧双歧杆菌JYBB-163，其特征在于，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JYBB-163于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18091。
2.一种如权利要求1所述两歧双歧杆菌JYBB-163的菌剂。
3.一种如权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)取保藏的两歧双歧杆菌JYBB-163在MRS平板培养基上活化，将活化后的两歧双歧杆菌JYBB-163接种于MRS液体培养基中，培养24h获得菌液；
(2)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量分数为15％的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0～2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(3)将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，接种量为1％。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，MRS液体培养基的制备方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合，调pH为6.8，搅拌均匀后，灭菌即可。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，灭菌的条件为在121℃、0.1MPa，灭菌时间为20min。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，培养温度为37℃。
8.如权利要求1所述两歧双歧杆菌JYBB-163在制备改善男性精液质量和生育能力的产品方面的应用。
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