CN116083480A - 一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 - Google Patents
一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116083480A CN116083480A CN202310137747.0A CN202310137747A CN116083480A CN 116083480 A CN116083480 A CN 116083480A CN 202310137747 A CN202310137747 A CN 202310137747A CN 116083480 A CN116083480 A CN 116083480A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gmmtb1
- soybean
- gene
- overexpression
- over
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 71
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 71
- CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N isoflavone Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC(OC)=C1C1=COC2=C(C=CC(C)(C)O3)C3=C(OC)C=C2C1=O CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 235000008696 isoflavones Nutrition 0.000 title claims abstract description 47
- GOMNOOKGLZYEJT-UHFFFAOYSA-N isoflavone Chemical compound C=1OC2=CC=CC=C2C(=O)C=1C1=CC=CC=C1 GOMNOOKGLZYEJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 150000002515 isoflavone derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N propylbenzene Chemical compound CCCC1=CC=CC=C1 ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 4
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 4
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 4
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 4
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 4
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 108010036937 Trans-cinnamate 4-monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 1
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012877 elongation medium Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000003687 soy isoflavones Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 210000001113 umbilicus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1、构建GmMTB1基因的过表达载体；步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。该方法证明了将过表达GmMTB1基因转入大豆中，可以获得高异黄酮含量的大豆品系，为高异黄酮含量的大豆品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法。
背景技术
大豆(Glycine max)是世界上最重要的经济作物之一，为人类提供了丰富的植物油、蛋白及其他营养物质。近年来，随着越来越多的饮食与健康、流行病学等调查结果的公布，大豆异黄酮一类豆科植物所特有的次生代谢物，具有抗氧化、抗菌、改善雌激素水平等多方面作用，并已应用于肿瘤、血管系统疾病、免疫调节等疾病的治疗，应用前景广阔。由于种质资源和诱变材料中与大豆异黄酮含量相关的遗传变异有限，很难通过常规育种的方法获得高异黄酮含量的大豆材料，使得高异黄酮大豆品种的培育具有很大困难，研究进展缓慢。
大豆异黄酮是一类次生代谢产物，由苯丙烷类/黄酮类代谢途径的一个分支所合成。苯丙氨酸代谢通路在过去的几十年里已经得到了充分研究，由苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4一羟基化酶(C4H)和香豆酸辅酶A连接酶(4CL)起始，伴随一系列酶促反应转化生成。苯丙氨酸代谢通路中，催化酶基因的表达受转录因子的调控，bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子在真核生物中广泛存在，是植物转录因子的第二大家族。bHLH作为转录激活因子或转录抑制因子，参与异黄酮生物合成，在苯丙烷类/黄酮类代谢途径中起着至关重要的作用，它们单独或与其他的转录因子协同作用激活代谢途径中多个关键酶基因的表达，进而调控整个代谢过程。研究发现，拟南芥bHLH-MYC类转录因子通过增强抗坏血酸氧化还原循环和黄酮类生物合成，正向调节JA介导的对棉铃虫等害虫的抗性和对氧化应激的耐受性；紫苏的一对等位基因MYC-rp和MYC-gp的分别异源过表达至烟草和番茄中，导致烟草花的营养组织和番茄花中花青素含量增加；草莓中FaMYB9、FAbHLH3和FATTG1结合形成的复合体在苯丙烷类/黄酮类代谢途径中激活了花青素还原酶；苹果MdbHLH3和MdbHLH33与MYB转录因子互作，参与调控苹果果实花色苷合成，在低温下，MdbHLH3因磷酸化而增加与结构基因启动子的结合，促进了花色苷的合成。这些研究结果表明，bHLH转录因子对苯丙烷类代谢途径的调控机制有重要作用。在育种中，可通过调节bHLH转录因子的表达，调控大豆中异黄酮的积累，进而培育优异材料。
由于种质资源和诱变材料中与大豆异黄酮含量相关的遗传变异有限，很难通过常规育种的方法获得高异黄酮含量的大豆材料，使得高异黄酮大豆品种的培育具有很大困难，研究进展缓慢。迄今为止，利用大豆GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆材料未见报道。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、构建GmMTB1基因的过表达载体；
步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；
步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。
进一步的技术方案，所述GmMTB1基因获取的具体步骤包括：
利用大豆吉林32籽粒不同时期的数字表达谱，筛选到一个与胚的发育协同表达的bHLH转录因子，并以大豆吉林32叶片cDNA为模版，克隆得到GmMTB1基因。
进一步的技术方案，在所述步骤1中，构建过表达载体的具体步骤包括：
以pCHF-3300载体为基础，用BamH I和Pst I两个酶进行双酶切；再根据GmMTB1的CDS序列设计带有限制性内切酶BamH I和Pst I的引物序列，经过PCR克隆得到含有酶切位点的GmMTB1序列，将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，PCR鉴定，最终获得GmMTB1基因的过表达载体
进一步的技术方案，所述引物序列为：
GmMTB1-3300-F：5’-CGCGGATCCATGAAGATTGAGGTGGGG-3’，
GmMTB1-3300-R：5’-AAAACTGCAGTCATAATGTCTTTATGGT-3’。
进一步的技术方案，所述受体大豆为大豆威廉姆斯82。
本发明实施例提供的一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，克隆了一个调控苯丙烷代谢通路的关键转录因子GmMTB1，构建pCHF3300-GmMTB1过表达载体，通过农杆菌介导法，将pCHF3300-GmMTB1过表达载体转入受体大豆威廉姆斯82(W82)中。测定T3、T4代转基因大豆株系和对照植株成熟籽粒中异黄酮含量，在T3、T4代过表达株系中，GmMTB1基因的表达量显著高于对照植株。且在T3、T4代过表达株系成熟籽粒中，异黄酮总含量均显著高于对照植株。证明了过表达GmMTB1基因并转入大豆中，可以获得高异黄酮含量的大豆品系，为高异黄酮含量的大豆品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为GmMTB1的PCR扩增结果图；
图2为pCHF3300-GmMTB1重组质粒PCR扩增结果图；
图3为过表达GmMTB1基因大豆的大豆子叶节遗传转化流程图；
图4为部分转基因植株bar试纸条检测图；
图5为T3、T4转基因株系中20D、35D、50D胚中GmMTB1基因的实时荧光定量PCR检测结果图；
图6为T3代过表达株系和对照植株成熟籽粒中的异黄酮各组份含量及总含量图；
图7为T4代过表达株系和对照植株成熟籽粒中的异黄酮各组份含量及总含量图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，所述GmMTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述方法包括以下步骤：
步骤1、构建GmMTB1基因的过表达载体；
步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；
步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。
所述GmMTB1基因的克隆包括以下步骤：
以40mg大豆吉林32三出复叶为样品，用RNAiso Reagent(购自TaKaRa)提取大豆品种吉林32叶片总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照ReverseTranscriptase M-MLV(RNase H-)的说明书进行。
根据NCBI中GmMTB1(登录号：XP_003528790.1)的CDS序列，设计引物序列：
GmMTB1–F：5'ATGAAGATTGAGGTGGGGT 3'，
GmMTB1–R：5'TCATAATGTCTTTATGGTGCTGGA 3'；
以大豆吉林32叶片cDNA为模版，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增：25μl体系，内含10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP mix 2μl，10μM的引物1和引物2各1μl，cDNA 1μl，Taq DNA Polymerase(购自TIAN GEN，2.5u/μl)0.5μl，去离子水17μl。
反应条件：预变性94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃110sec，共计35个循环；后延伸72℃8min，最终得到GmMTB1的CDS全长的PCR产物(见图1)。
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，回收的片段与中间载体pMD18-T(购自TaKaRa公司)连接。连接液转入大肠杆菌(DH5α)感受态，后在含有氨苄霉素的LB固体培养基上筛选培养，挑取单克隆并进行菌液PCR检测，将阳性单克隆菌液进行测序。将测序正确的菌液保菌和提质粒(pMD18-T-GmMTB1)备用。
作为本发明的一种优选实施例，GmMTB1基因过表达载体的构建具体包括以下步骤：
根据GmMTB1的CDS序列设计带有限制性内切酶BamH I和Pst I的引物序列，经过PCR克隆得到含有酶切位点的GmMTB1序列。
引物序列为：
GmMTB1-3300-F：5’-CGCGGATCCATGAAGATTGAGGTGGGG-3’，
GmMTB1-3300-R：5’-AAAACTGCAGTCATAATGTCTTTATGGT-3’；
pCHF 3300载体用BamH I和Pst I两个酶进行双酶切。将扩增产物与带有酶切位点的产物用无缝克隆试剂盒连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的LB固体培养基上筛选培养，挑取单克隆并进行菌液PCR检测(见图2)，将阳性单克隆菌液送测序，最终表明GmMTB1基因过表达载体的构建成功。将得到的pCHF3300-GmMTB1质粒转入农杆菌感受态EHA105中，用于后续的菌液制备。
作为本发明的一种优选实施例，pCHF3300-GmMTB1过表达载体在受体大豆中的遗传转化具体包括以下步骤：
步骤2.1、农杆菌介导的子叶节侵染法：
步骤2.1.1、种子灭菌：
取表皮光滑、颗粒饱满、无病斑的威廉姆斯82成熟种子于培养皿中，置于通风橱的干燥器内，用96ml的次氯酸钠和4ml的浓盐酸，氯气灭菌16-20h。
步骤2.1.2、种子发芽：
将灭菌后的种子，种脐朝下，接种于发芽培养基上，黑暗培养16h(图3中A)。
步骤2.1.3、菌液制备：
在带有利福平(25mg/l)和壮观霉素(25mg/l)的固体YEP培养基上划线活化带有目标基因的EHA105农杆菌株。28℃倒置培养2-3天后，挑取单克隆接种在含有利福平25mg/l和壮观霉素(25mg/l)的3ml液体培养基中，28℃、220rpm过夜振荡培养，然后将菌液转移至50ml新鲜的上述YEP液体培养基中28℃、220rpm过夜振荡培养，5000rpm离心10min，用液体LCCM培养基重悬菌液至OD600＝0.65。
步骤2.1.4、侵染与共培养：
取没有污染，生长良好的豆子，用镊子小心剥去种皮，切掉胚根和大部分下胚轴以及一对真叶，在胚芽顶尖划一刀。将切好的豆子放在培侵染液中，摇床轻摇，侵染2h以上。侵染结束后，倒净菌液，将子叶内面朝下平放在表面附有灭菌纸的固体共培养培养基中，黑暗培养4天(图3中B)。
步骤2.1.5、芽诱导：
从SCCM上取出外植体，放到恢复培养基上，24℃，光照培养(8/16)14天；14天后将外植体取出，插入筛选培养基中，24℃，光照培养14天(图3中C、D)。
步骤2.1.6、芽伸长：
选取部分生长良好的外植体，除去大芽和死芽，转入芽伸长培养基中，24℃光照培养(18/6)，每两周继代一次(图3中E)。
步骤2.1.7、生根：
当芽伸长的再生芽达到2-3cm时可进行生根处理，转入生根诱导培养基，培养至长出足够的根，移入土壤：蛭石(1:1)的花盆中培养(图3中F)。
步骤2.2、转化植株后代检测：
针对T0代得到的转基因植株加代，最终在T3、T4代获得稳定的转基因株系31-1、31-3和31-6。每一代植株都经过bar试纸条检测，具体操作如下：取新鲜叶片，研磨成匀浆，稍离心，取叶片匀浆液于一新的无菌1.5ml离心管中，拿出试纸条(LibertyLink strip)插入匀浆中进行检测，大概5分钟后观察，显示两条带为转基因植株，只有一条指示带的为野生型非转基因植株。图4为部分bar试纸条检测结果。
作为本发明的一种优选实施例，所述方法还包括转基因植株的目标基因转录水平分析：
提取T3代、T4代大豆品种威廉姆斯82(W82)和转基因株系31-1、31-3、31-6的20D、35D、50D的胚进行总RNA的提取并反转录成cDNA，方法同前述的GmMTB1基因的克隆。
利用Real Time PCR对目标基因在各株系中的表达水平进行了检测，按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(购自全式金)说明书，应用Agilent TechnologiesStratagene Mx305P扩增仪进行。其中，以大豆β-tubulin为内参基因，引物序列为：
tubulin-F:5’-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3’；
tubulin-R:5’-AGTGGCATCCTGGTACTGCA-3’。
GmMTB1的引物为：
F：5’-AGCGGTTCTATGCATTGCGA-3’；
R：5’-CATTGGCCTCCAATTCTGGTC-3’。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件为：
结果显示，在T3和T4代GmMTB1基因在过表达株系中的表达量均显著或极显著高于对照植株(图5)。说明目标基因GmMTB1的转录水平在T3、T4代均实现了一定的提高，表明本发明中的GmMTB1基因在获得的转基因大豆株系中稳定遗传。
作为本发明的一种优选实施例，所述方法还包括GmMTB1基因过表达对大豆成熟籽粒中的异黄酮合成含量的影响，具体包括以下步骤：
步骤1、大豆成熟籽粒中异黄酮的提取：
将大豆籽粒用研磨器磨成豆粉，过60目筛，精准称取0.1g豆粉,放入防爆玻璃管中，分别加入10ml 80％甲醇提取液，80℃水浴14h，12000rpm离心15min，将上清液用0.45μm滤膜过滤，得到最终的预处理液，4℃下保存。
步骤2、利用日本津岛高效液相色谱仪(LC-20A)进行异黄酮含量的测定：
高效液相色谱条件为：
高效液相色谱仪中的色谱系统包括：DGU-20A3脱气机，2个LC-20AT溶剂阵列检测器，紫外检测器SPD-20AV紫外检测器，CTO-10AS柱温箱，CBM-20A系统控制器，LC-Solution工作站，7725手动进样器；色谱柱为Phenomenex C18(150mm×4.6mm，5.0μm)；流动相为甲醇：水＝5：95(v/v)；流速：1mL·min-1，检测波长：254nm；柱温：40℃，进样量：10μL，分析时间：每份样品35～45min。
所有样品平行测定3次，求其峰面积的平均值，根据保留时间定性，根据峰面积定量，根据标准品的标准曲线计算样品中各异黄酮成分的含量。
上述结果表明，在T3、T4代过表达株系中，GmMTB1基因的表达量显著高于对照植株，在T3、T4代过表达株系成熟籽粒中，异黄酮总含量均显著高于对照植株；T3代对照植株的异黄酮总含量为3920.20μg/g，转基因株系31-1异黄酮总含量达到5697.09μg/g，较对照植株提高了31.1％，转基因株系31-3异黄酮总含量达到5055.59μg/g，较对照植株提高了22.4％，转基因株系31-6异黄酮总含量达到5799.31μg/g，较对照植株提高了32.4％；T4代对照植株的异黄酮总含量为4311.45μg/g，转基因株系31-1异黄酮总含量为5155.65μg/g，较对照植株提高了16.3％，转基因株系31-3异黄酮总含量为6317.32μg/g，较对照植株提高了31.7％，转基因株系31-6异黄酮总含量为6875.82μg/g，较对照植株提高了37.2％。(图6)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、构建GmMTB1基因的过表达载体；
步骤2、将过表达载体通过农杆菌介导的子叶节侵染法转化至受体大豆；
步骤3、筛选受体大豆的大豆籽粒中的高异黄酮转基因大豆株系。
2.根据权利要求1所述的基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述GmMTB1基因获取的具体步骤包括：
利用大豆吉林32籽粒不同时期的数字表达谱，筛选到一个与胚的发育协同表达的bHLH转录因子，并以大豆吉林32叶片cDNA为模版，克隆得到GmMTB1基因。
3.根据权利要求1所述的基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，在所述步骤1中，构建过表达载体的具体步骤包括：
以pCHF-3300载体为基础，用BamH I和Pst I两个酶进行双酶切；再根据GmMTB1的CDS序列设计带有限制性内切酶BamH I和Pst I的引物序列，经过PCR克隆得到含有酶切位点的GmMTB1序列，将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，PCR鉴定，最终获得GmMTB1基因的过表达载体。
4.根据权利要求3所述的基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述引物序列为：
GmMTB1-3300-F：5’-CGCGGATCCATGAAGATTGAGGTGGGG-3’，
GmMTB1-3300-R：5’-AAAACTGCAGTCATAATGTCTTTATGGT-3’。
5.根据权利要求1所述的基于过表达
GmMTB1
基因创制高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，所述受体大豆为大豆威廉姆斯82。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310137747.0A CN116083480B (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310137747.0A CN116083480B (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116083480A true CN116083480A (zh) | 2023-05-09 |
| CN116083480B CN116083480B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=86202480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310137747.0A Active CN116083480B (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116083480B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106047889A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-10-26 | 吉林大学 | 大豆myb转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用 |
| CN111690662A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-09-22 | 吉林大学 | 大豆bHLH转录因子GmPIF1基因在促进异黄酮合成中的应用 |
| CN113846180A (zh) * | 2021-11-10 | 2021-12-28 | 云南省烟草农业科学研究院 | 用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记nicas1及其试剂盒与应用 |
-
2023
- 2023-02-20 CN CN202310137747.0A patent/CN116083480B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106047889A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-10-26 | 吉林大学 | 大豆myb转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用 |
| CN111690662A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-09-22 | 吉林大学 | 大豆bHLH转录因子GmPIF1基因在促进异黄酮合成中的应用 |
| CN113846180A (zh) * | 2021-11-10 | 2021-12-28 | 云南省烟草农业科学研究院 | 用于鉴别烟草尼古丁含量高低的分子标记nicas1及其试剂盒与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZONG-YOU LV等: "Phytohormones Jasmonic Acid, Salicylic Acid, Gibberellins, and Abscisic Acid are Key Mediators of Plant Secondary Metabolites", 《WORLD JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE》, vol. 7, no. 3, 31 July 2022 (2022-07-31) * |
| 王天亮: "大豆bHLH类转录因子GmbHLH3和GmPIF1的功能分析", 《中国博士学位论文全文数据库》, no. 03, 15 March 2021 (2021-03-15) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116083480B (zh) | 2024-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5323831B2 (ja) | 草高調節遺伝子およびその使用 | |
| CN111690662B (zh) | 大豆bHLH转录因子GmPIF1基因在促进异黄酮合成中的应用 | |
| CN110628808B (zh) | 拟南芥AtTCP5基因及其在调控株高上的应用 | |
| CN111187789B (zh) | 一种水稻myb转录因子及其重组表达载体的应用 | |
| CN108164590B (zh) | OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用 | |
| WO2010124530A1 (en) | Use of histone deacetylase gene oshdt1 in enhancing rice heterosis | |
| CN110643618A (zh) | 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN102533811A (zh) | 枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力 | |
| CN116083480B (zh) | 一种基于过表达GmMTB1基因创制高异黄酮转基因大豆的方法 | |
| CN108165557B (zh) | 小麦TaZCCT2基因在调控植物开花时间中的应用 | |
| JPWO2007086282A1 (ja) | ストレス応答性遺伝子が導入された形質転換植物 | |
| CN113337522B (zh) | 棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN108218967B (zh) | 水稻抽穗期相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| KR102265780B1 (ko) | 식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도 | |
| CN116064568A (zh) | 紫花苜蓿MsASG166基因及在提高植物耐旱中的用途 | |
| CN109971765B (zh) | 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用 | |
| CN113461794A (zh) | 一种调控种子萌发的试剂盒、方法及其应用 | |
| KR101120036B1 (ko) | 광, 온도, 상처 및 캅사이신에 의해 발현이 조절되는 프로모터 | |
| CN114656537B (zh) | Grmzm2g071330蛋白及其应用 | |
| CN114836436B (zh) | 大豆基因GmRGS1与葡糖糖共同促进豆科植物根瘤产生中的应用 | |
| CN112877337B (zh) | 油菜BnaA09WRKY6基因在促进十字花科植物抽薹和开花中的应用 | |
| CN113637686B (zh) | 马铃薯StABL1基因在调控马铃薯熟性中的应用 | |
| CN113373158B (zh) | 芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用 | |
| CN112375766B (zh) | 一种水稻抗氧化能力相关基因brhis1及其应用 | |
| CN110194791B (zh) | Spl3蛋白在调控植物花序或果柄发育中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |