CN116082240A - 一种琥珀酸脱氢酶抑制剂及其合成方法与应用 - Google Patents

一种琥珀酸脱氢酶抑制剂及其合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂化合物，其结构式如下式(Ⅰ)所示，本发明还公开了化合物的合成方法以及在植物真菌病害防治中的应用，属于农药化学领域。该化合物是在吡唑酰胺类杀菌剂的基础上通过在疏水性结构中引入单氟烯烃基团改进而来，通过抑菌试验证实提高了吡唑酰胺类杀菌剂的生物活性。
Figure DDA0004072867050000011

Description

一种琥珀酸脱氢酶抑制剂及其合成方法与应用
技术领域
本发明属于农药化学领域，具体涉及一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂，本发明还涉及新型琥珀酸脱氢酶抑制剂合成方法以及在植物真菌病害防治中的应用。
背景技术
随着人口的日益增加，人们对粮食的需求也日益提升；但是真菌病害严重影响了粮食产量，据估算，真菌病害已让5大粮食作物的产量在全球范围内每年减少1.25亿吨。其中，单是真菌类病害对水稻、小麦和玉米的危害，就给全球农业带来每年600亿美元的经济损失，而预防植物真菌病害的有效方法主要有生物防治、化学农药的施用和提高作物的抗性。然而化学农药的施用因其具有便捷性、时效性而被广泛使用。但是大量使用化学农药会造成农药残留、影响人体健康以及产生农药抗性。这需要研究人员不断开发高效、环境友好、与当前主要商品药剂无交互抗性的农药品种，以满足植物保护、服务于农业生产的需要。
琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)也被称为线粒体呼吸链复合体Ⅱ，是参与三羧酸循环的重要组成部分，与线粒体电子传递链相连，催化从琥珀酸(succinate)氧化到延胡索酸(fumarate)和从泛醌(ubiquinone)还原到泛醇(ubiquinol)的偶联反应，它由黄素蛋白(Fp,SdhA)、铁硫蛋白(Ip,SdhB)和另外2种嵌膜蛋白(SdhC和SdhD)4个亚单位一同组成。黄素蛋白和铁硫蛋白组成琥珀酸脱氢酶的外周膜(membrane-peripheral)结构域，具有琥珀酸脱氢酶活性，可将琥珀酸氧化成延胡索酸。2种嵌膜蛋白组成的膜锚着点结构域，其主要功能是将黄素蛋白、铁硫蛋白固定在内膜上，同时具有泛醌还原酶活性。SDHIs类杀菌剂就是通过覆盖泛醌的位点，阻断电子从琥珀酸向泛醌的传递，影响病原菌的呼吸链电子传递系统，阻碍其能量的代谢，进而抑制病原菌的生长、导致其死亡，最终达到防治植物病害的目的。
早在1969年SDHI类杀菌剂萎锈灵上市，其发现早于20世纪70年代开发的三唑类杀菌剂，更早于90年代的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，但直到2009年，琥珀酸脱氢酶抑制剂才独成体系，国际杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)在这一年根据其独特的杀菌机理单独归类，截止目前，已有24种琥珀酸脱氢酶抑制剂商业化，例如，巴斯夫公司于2003年开发的啶酰菌胺(Boscalid)、2011年开发的氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)，先正达2010年开发的吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、2011年开发的氟唑环菌胺(Sedaxane)、2013年开发的苯并烯氟菌唑(Benzovindiflupyr)、2016年开发的氟唑菌酰羟胺(Pydiflumetofen)，这些化合物因其具有较强的效果而备受欢迎，琥珀酸脱氢酶抑制剂成为继三氮唑和基丙烯酸酯的第三大类杀菌剂，如今琥珀酸脱氢酶已经成为了不可忽视的重要杀菌剂靶标，可以预见的是，未来开发低毒、结构新颖、广谱高效的SDHIs杀菌剂将成为杀菌剂的主导。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型琥珀酸脱氢酶抑制剂及其制备方法及应用，该抑制剂是在吡唑酰胺类杀菌剂的基础上通过在疏水性结构中引入单氟烯烃改进而来，单氟烯烃基团的引入提高了吡唑酰胺类杀菌剂的生物活性。
本发明的技术方案如下：
一种琥珀酸脱氢酶抑制剂，其结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0004072867030000021
式(Ⅰ)中，R1为二氟甲基或三氟甲基；
R2为H或苯环上的常规取代基，所述常规取代基包括卤素、烷基、烷氧基、卤素取代的烷基(如三氟甲基)，单取代或者多取代；
优选地，R1为二氟甲基；R2为3、4、5-三氟。
本发明可采用以下路线合成上述化合物：
Figure BDA0004072867030000031
在合成步骤a中，将原料I溶于无水二氯甲烷中，加入N,N-二甲基甲酰胺作催化剂，然后滴加草酰氯室温反应2-3小时，用饱和的氢氧化钠溶液吸收尾气，反应完毕用二氯甲烷萃取，有机相浓缩干燥，得到中间体II。
在合成步骤b中，以二氯甲烷为反应溶剂，在N2氛围保护下，将2-碘苯胺与中间体II反应，待反应完毕后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取，有机相浓缩干燥后用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到中间体III。
在合成步骤c中，在N2氛围保护下，加入三苯基膦、二氟氯乙酸钠、N，N-二甲基甲酰胺、原料IV，升温至100℃反应，待反应完毕后，用石油醚萃取，合并有机相并浓缩干燥，柱层析后得到中间体V。
在合成步骤d中，以四氢呋喃为反应溶剂，(Cy3P)2CuCl为催化剂，将中间体V、乙酸钠、联硼酸频那醇酯进行反应，待反应完全后，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机相并浓缩干燥得中间体VI。
合成步骤e中，以四氢呋喃为反应溶剂，四三苯基膦钯为催化剂，将中间体VI和中间体III进行反应，待反应完全后，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机相浓缩干燥，柱层析后得目标产物VII。
在上述合成路线中，R1、R2均与本发明式(I)中对应基团定义相同。
选取农业上8种重要的植物病原真菌：赤霉菌(Fusarium graminearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis)、桃褐腐(Monilinia fructicola)、玉米小斑(Cochliobolusheterostrophus)、纹枯菌(Rhizoctonia solani)、茶树链格孢病菌(Altermariaalternata)作为供式菌种，用含药培养基测试了所合成的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂对这些真菌的离体抑制率，结果表明所合成的化合物具有较强的生物活性。
与现有技术相比，本发明具有一下优点：
(1)杀菌活性强。本发明合成了一系列化合物并验证了这些化合物的抑菌活性，结果发现这些化合物对纹枯菌的抑制率均高于商品化的吡唑酰胺类杀菌剂，且EC50普遍低于商品化的吡唑酰胺类杀菌剂，本发明是在吡唑酰胺类杀菌剂的基础上通过在疏水性结构中引入单氟烯烃改进而来，通过抑菌试验证实了结构改进提高了杀菌剂的生物活性。
(2)广谱性好。本发明合成的化合物对多种植物真菌具有抑制作用，其中对玉米小斑病菌、桃褐腐病菌、链格孢病菌的抑制率显著高于商品化吡唑酰胺类杀菌剂。
(3)结构简单易于制备。合成本发明的琥珀酸脱氢酶抑制剂仅需5－6步，原料易得，工艺可控，产物得率高。
附图说明
图1为本发明化合物的设计构思及结合能预测结果。
图2为本发明化合物与琥珀酸脱氢酶的分子对接结果。
图3为本发明化合物对油菜叶片真菌病害的活体保护作用。
图4为本发明化合物对番茄真菌病害的活体保护作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实验中如无特殊说明，使用的相关试剂均来源于商业渠道，所用的实验方法均为本领域常规实验方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。
本发明所合成的化合物是在吡唑酰胺类杀菌剂的基础上改进而来，设计构思如下：
氟元素具有独特的理化性质，使得含氟取代基长期以来都是新农药创制过程中不可忽略的重要部分，通常，氟原子在农药分子中具有以下的特性：
1、模拟效应：氟原子与氢原子的范德华半径相近且体积小，使得生物体对其难以辨别，于是把它当做氢化物摄入体内，即出现模拟效应。
2、电子效应：由于氟原子的电负性远大于氢原子，在化合物中引入强吸电子的含氟基团(如-F、-CF3、-CF2Cl、-CF2H等)时，可以使该化合物的酸性倍增，药效增强。
3、阻碍效应：碳氟键的键能远大于碳氢键，使得含碳氟键的化合物分子稳定性较好。因而氟类农药一般具有良好的热稳定性和光稳定性，且在生物体内不易被分解，药效持久，使病虫草害的生长受到抑制。
4、渗透效应：氟原子外层电子排列较为密实，不易受到外界影响，使其展现出较好的排斥性和离散性，以及其具有疏水性和脂溶性，使得含氟化合物在生物体内具有良好的渗透性。
近年来，单氟烯烃在药物化学中得到了广泛关注。这主要是由于单氟烯烃骨架在电荷分布与偶极距性质上与酰胺结构非常相近,具有以下两个优点：(1)单氟烯烃不会像酰胺键那样容易在水解酶的作用下发生水解断裂；(2)单氟烯烃结构单元刚性大，不会像酰胺那样容易发生构象变化。因此单氟烯烃结构单元作为仿酰胺结构，常被用于仿肽类蛋白酶抑制剂类药物中。
参见图1，我们引用商品化的琥珀酸脱氢酶抑制的经典结构，以吡唑酰胺为骨架，在琥珀酸脱氢酶抑制剂的疏水部分(联苯)引入氟烯烃，在分子结合靶向农药开发中，结合能是一个参数，表达的是小分子和蛋白质的结合放出的能量，放的能量越多，表示和蛋白质结合的越紧密，作用效果可能就越好。经过结合能的计算后，我们发现其结合能由-8.2kcal/mol降低到-9.2kcal/mol(使用到的软件ChemDraw、AutoDockTool)，因此该骨架可能具有更好的生物活性。参见图2，进一步的，我们通过目标分子骨架与琥珀酸脱氢酶的分子对接，可以看出引入的烯烃上的氟元素会与琥珀酸脱氢酶上的蛋白质残基存在相互作用，绿色表示目标小分子，蓝色表示琥珀酸脱氢酶蛋白质的部分残基，单氟烯烃上的氟在亲和力上起到很大作用，例如与蛋白质残基ILE-218、HIS-216、MET-39等存在相互作用力。另外由于加长了化合物的链长，使得另外一个苯环与蛋白质残基的π-π作用力更显著。因此，我们设计该系列化合物。
实施例1：(Z)-N-(2-(2-([1，1'-联苯]-4-基)-1-氟乙烯基)苯基)-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物1)的合成
Figure BDA0004072867030000051
合成步骤a，中间体II 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰基氯的合成：在N2氛围保护下，将市售3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸(1.47g，10mmol)置于三口瓶中，加入无水二氯甲烷20ml，两滴无水N，N-二甲基甲酰胺，于0℃下向体系中滴加草酰氯(1.1mL,12mmol)，移至室温反应2小时。并用饱和氢氧化钠溶液吸收反应产生的酸性气体，TCL监测原料反应完全之后，向体系中加入水以淬灭未反应完全的酰氯，并用二氯甲烷(3×30mL)萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩得中间体II，此中间体直接用于下步反应。产率：80％。
合成步骤b，中间体III 3-(二氟甲基)-N-(2-碘苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺的合成：在N2氛围保护下，将2-碘苯胺(2.19g，10mmol)置于三口瓶中，加入20ml无水二氯甲烷，加入三乙胺(1.52g，15mmol)，用10ml的无水二氯甲烷溶解中间体II，在冰浴条件下向三口瓶中滴加含有中间体II的无水二氯甲烷溶液，缓慢升至室温下反应2小时。通过TLC监测原料反应完全之后，加水5ml淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次(3×20ml)，合并有机相并用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩得粗品中间体III，用乙酸乙酯和石油醚(1:2)重结晶得到白色固体中间体I。产率：75％。
合成步骤c，中间体V 4-(2,2-二氟乙烯基)-1,1'-联苯的合成：在N2氛围保护下，向三口圆底烧瓶中加入三苯基膦(3.94g，15mmol)，二氟氯乙酸钠(1.85g，12mmol),向三口圆底烧瓶中10ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，随后加入中间体IV对苯基苯甲醛(1.82g，10mmol)，升温至100℃反应1h。通过TCL监测中间体IV对苯基苯甲醛反应完全之后，向反应体系中加入5ml水淬灭反应，用石油醚萃取(3×50mL)，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过柱层析(石油醚)得产物V。产率：70％。
合成步骤d，中间体VI(Z)-2-(2-([1，1'-联苯]-4-基)-1-氟乙烯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧杂环戊烷的合成：(Cy3P)2CuCl催化剂的配制：在手套箱中，称量CuCl(99mg，1mmol)，Cy3P(560.86mg，2mmol)于圆底烧瓶中，加入10ml四氢呋喃搅拌1小时待用。在手套箱中，称取中间体V(620mg，2mmol)、2ml(Cy3P)2CuCl的四氢呋喃溶液、乙酸钠(463.2mg，2.4mmol)、联硼酸频那醇酯(Bpin)2(761.82mg，3mmol)于史莱克管中，再加入10ml无水四氢呋喃，密封带出手套箱移至油锅40℃反应过夜，通过TCL监测中间体V反应完全之后，向反应体系中加入5ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥旋蒸得到中间体VI，此步直接用于下步反应。
合成步骤e，目标产物VII(Z)-N-(2-(2-([1，1'-联苯]-4-基)-1-氟乙烯基)苯基)-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺的合成：在手套箱称取中间体VI(318mg，1mmol)、中间体III(300mg，0.8mmol)，四三苯基膦钯(57.78mg，5％)加到圆底烧瓶中，密封好带出手套箱加入经氮气鼓泡的四氢呋喃10ml，移至45℃反应，通过TCL监测中间体V反应完全之后，向反应体系中加入5ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥旋蒸柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得到目标产物VII。产率：65％。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.42(s,1H),8.22(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(s,1H),7.68(d,J＝8.3Hz,2H),7.63(s,4H),7.51(d,J＝7.7Hz,1H),7.48–7.39(m,3H),7.37(t,J＝7.4Hz,1H),7.22(t,J＝7.6Hz,1H),6.94(t,J＝54.1Hz,1H),6.12(d,J＝39.5Hz,1H),3.93(s,3H).
13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ159.91,156.70(d,J＝259.7Hz),144.06(t,J＝27.7Hz),140.76,140.73(d,J＝2.3Hz),135.59,134.87,132.44(d,J＝3.6Hz),130.78,129.83–129.59(m),129.19,127.84,127.56,127.28,125.29–125.04(m),123.87,117.24,111.44(d,J＝10.6Hz),111.33(t,J＝234.2Hz),39.97.
19F NMR(565MHz,Chloroform-d)δ-100.36,-110.41.
实施例2:(Z)-3-(二氟甲基)-N-(2-(1-氟-2-(4-氟苯基)乙烯基)苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物2)的合成
Figure BDA0004072867030000071
合成步骤a、b与实施例1相同。
合成步骤c，中间体V1-(2,2-二氟乙烯基)-4-氟苯的合成：在N2氛围保护下，向三口圆底烧瓶中加入三苯基膦(3.94g，15mmol)，二氟氯乙酸钠(1.85g，12mmol),向三口圆底烧瓶中10ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，随后加入中间体IV对氟苯甲醛(1.24mg，10mmol)，升温至100℃反应1小时。通过TCL监测中间体IV对氟苯甲醛反应完全之后，向反应体系中加入5ml水淬灭反应，用石油醚萃取(3×50mL)，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过柱层析(石油醚)得产物V1-(2,2-二氟乙烯基)-4-氟苯，产率：70％。
合成步骤d：中间体VI(Z)-2-(1-氟-2-(4-氟苯基)乙烯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧杂环戊烷的合成：氯苯(三环己基膦)铜(一)(Cy3P)2CuCl催化剂的配制：在手套箱中，称量CuCl(99mg，1mmol)，Cy3P(560.86mg，2mmol)于圆底烧瓶中，加入10ml四氢呋喃搅拌1小时待用。在手套箱中，称取中间体V(620mg，2mmol)、2ml(Cy3P)2CuCl的四氢呋喃溶液、乙酸钠(463.2mg，2.4mmol)、联硼酸频那醇酯(761.82mg，3mmol)于史莱克管中，再加入10ml无水四氢呋喃，密封带出手套箱移至油锅40℃反应过夜，通过TCL监测中间体V反应完全之后，向反应体系中加入5ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥旋蒸得到中间体VI，此部直接用于下步反应.
合成步骤e：目标产物VII(Z)-3-(二氟甲基)-N-(2-(1-氟-2-(4-氟苯基)乙烯基)苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺的合成：在手套箱称取中间体VI(268mg，1mmol)、中间体III(300mg，0.8mmol)，四三苯基膦钯(57.78mg，5％)圆底烧瓶中，密封好带出手套箱加入经氮气鼓泡的四氢呋喃10ml，移至45℃反应，通过TCL监测中间体V反应完全之后，向反应体系中加入5ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并有机相干燥旋蒸柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到目标产物VII。产率：45％。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.38(s,1H),8.21(d,J＝8.3Hz,1H),7.93(s,2H),7.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.45(t,J＝7.9Hz,1H),7.35–7.14(m,3H),7.07(t,J＝9.4Hz,1H),6.93(t,J＝54.1Hz,1H),6.34(d,J＝39.1Hz,1H),3.93(s,3H).
13C NMR 151(MHz,Chloroform-d)δ159.87(d,J＝249.3Hz),159.69,158.79–
155.67(m),143.87(t,J＝27.8Hz),135.40,134.67,130.77,130.21(dd,J＝13.3,2.5Hz),129.59(d,J＝4.3Hz),129.41(d,J＝8.3Hz),124.98,124.72(d,J＝24.1Hz),124.36(d,J＝3.6Hz),123.67,121.03(dd,J＝11.8,3.6Hz),117.01,115.41(d,J＝22.2Hz),111.12(t,J＝234.2Hz),102.88(dd,J＝10.0,7.2Hz),39.73.
19F NMR(565MHz,Chloroform-d)δ-98.87,-110.57,-116.32.
按照以上合成路线，我们合成了一系列化合物，这些化合物都是在吡唑酰胺类琥珀酸脱氢酶抑制剂的基础上引入氟烯烃改进而来，其中一些代表性的化合物结构如下：
Figure BDA0004072867030000091
实施例3：新型琥珀酸脱氢酶抑制剂对纹枯菌的抑菌活性
将植物源真菌纹枯菌(Rhizoctonia solani)接种于PDA培养基上，置于25±0.1℃恒温培养箱中培养3-6天，菌丝长好后备用。
1.化合物对纹枯菌的抑制率测定
离体抑制活性采用菌丝生长速率法测定。将供试化合物或对照药剂用二甲基亚砜(DMSO)配制成40mM的药液，随后将计算量的药液与PDA培养基配制成终浓度为1μM的测试浓度，将培养基在9cm培养皿中制备成平板，刮取0.15mm纹枯菌菌块上的菌丝放置于培养基中间，接种后置于25±0.1℃的恒温培养箱中培养24小时，待空白对照培养皿中的菌落直径7.5-8cm后用十字交叉法测量各处理及对照的菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。以DMSO作为空白对照，啶酰菌胺(Boscalid)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)为阳性对照。
菌丝生长抑制率(％)＝[空白菌落增长直径(mm)-含药培养基上菌落增长直径(mm)]/对照菌落增长直径(mm)×100。
所合成的琥珀酸脱氢酶抑制剂对纹枯菌的抑制率见下表：
抑制剂 抑制率(％) 抑制剂 抑制率(％)
化合物1 90.82 化合物8 91.62
化合物2 88.40 化合物9 87.76
化合物3 91.26 化合物10 92.43
化合物4 86.63 化合物11 89.21
化合物5 87.44 化合物12 89.05
化合物6 90.34 化合物13 92.11
化合物7 84.54 化合物14 90.82
啶酰菌胺 42.97 氟唑菌酰胺 84.38
2.化合物抑制纹枯菌的EC50测定
为了进一步测定这些新化合物的杀菌活性，根据菌丝生长抑制率进行机率值(y)和质量浓度对数(x)之间的线性回归关系，使用SPSS Statistics软件分析数据，计算药剂的毒力回归方程y＝a+bx，抑制中浓度(EC50)及相关系数(R2)。
供试化合物：根据初筛选取化合物效果较好的化合物进行复筛，以啶菌酰胺、氟唑菌酰胺为阳性对照，DMSO为空白对照。
实验方法：对纹枯菌(Rhizoctonia solani)，设定浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μM六个带PDA培养基浓度梯度，两倍稀释，试验设不含药剂的PDA培养基。以加DMSO的PDA为空白对照，将培养基在9cm培养皿中制备成平板，刮取0.15mm纹枯菌菌块上的菌丝放置于培养基中间，接种后置于25±0.1℃的恒温培养箱中培养24小时，待空白对照培养皿中的菌落直径7.5-8cm后用十字交叉法测量各处理及对照的菌落直径，每个试验组和空白对照重复三次。
测试结果见下表:
抑制剂 regression equation EC50(nM) 95％confidenceinterval <![CDATA[R<sup>2</sup>]]>
化合物3 Y＝3.02+1.54X 91.20±1.05 65.889-119.175 0.976
化合物6 Y＝4.42+1.95X 187.9±1.71 151.543-233.703 0.988
化合物9 Y＝3.96+1.84X 172.5±2.56 137.758-217.474 0.956
化合物10 Y＝3.72+1.74X 136.6±2.31 106.558-172.453 0.982
化合物12 Y＝3.69+1.87X 92.14±2.72 70.514-115.836 0.951
化合物13 Y＝3.26+1.38X 227.1±1.67 162.208-312.048 0.919
化合物14 Y＝2.57+1.48X 54.65±1.55 14.215-101.280 0.905
氟唑菌酰胺 Y＝4.84+2.07X 210.8±0.15 125.832-375.091 0.893
啶酰菌胺 Y＝8.04+2.35X 2702.2±89.0 2129.482-3680.138 0.963
根据以上结果，本发明所合成的化合物对纹枯菌的抑制效果普遍优于商品化的琥珀酸脱氢酶抑制剂，本发明是在吡唑酰胺类杀菌剂的基础上通过在疏水性结构中引入单氟烯烃改进而来，通过抑菌试验进一步证实了单氟烯烃结构能够提高吡唑酰胺类杀菌剂的生物活性。
实施例4：新型琥珀酸脱氢酶抑制剂对其它植物真菌的抑菌活性
以化合物14为例，在200μM进一步考察了抑制剂对其它多种植物真菌如赤霉菌(Fusarium graminearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis)、桃褐腐(Monilinia fructicola)、茶树链格孢病菌(Altermaria alternata)、玉米小斑(Cochliobolus heterostrophus)、茶树链格孢病菌(Altermaria alternata)的抑制率。试验方法如下：
玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小菌块上的菌丝放置于培养基中间，室温放置培养7天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养4天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养3天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
赤霉菌(Fusarium graminearum)：置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
茶树链格孢病菌(Altermaria alternata)：置PDA固体培养基，然后培养基中加入琥珀酸脱氢酶抑制剂，加入终浓度为(200uM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养3天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，每组3个重复。
试验结果见下表：
Figure BDA0004072867030000121
从以上结果可以看出，本发明合成的化合物对多种植物真菌具有抑制作用，其中对玉米小斑病菌、桃褐腐病菌、链格孢病菌的抑制率显著高于商品化吡唑酰胺类杀菌剂。
实施例5：活体试验
选取化合物14进行油菜、番茄活体实验，具体试验方法如下：
核盘菌的油菜叶片：油菜叶片由华中农业大学植物科学学院提供，摘取健康无病、叶龄一致的油菜叶片，用75％的酒精对叶片表面擦拭处理，之后用无菌水清洗叶片，置于灭菌的滤纸上晾干，用湿棉球包裹住叶柄。将化合物14和对照药剂啶酰菌胺配置成浓度为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM的溶液。用小刀片在油菜叶相似的位置划伤0.1cm的伤口，分别向油菜叶子伤口滴加目标化合物和对照药剂10μL，然后于每片叶片伤口上分别接种油菜菌核菌饼1块(d＝5mm)。
灰霉菌的果实：摘取健康无病、大小一致的番茄，用75％的酒精对表面擦拭处理，之后用无菌水清洗叶片，置于灭菌的滤纸上晾干待用，用经消毒的刀片在番茄上划出长2cm的十字交叉伤口，然后滴加含有化合物14和啶酰菌胺灰霉菌孢子悬浮液于番茄伤口上，放置在恒温培养箱中培养四天，观察伤口感染情况。
从图3和图4可以看出，本发明合成的化合物对油菜叶片、番茄的真菌病害具有较好的活体保护作用，且具有明显的剂量依赖性。

Claims (5)

1.一种琥珀酸脱氢酶抑制剂，其结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0004072867020000011
式(Ⅰ)中，R1为二氟甲基或三氟甲基；
R2为H或苯环上的常规取代基，所述常规取代基包括卤素、烷基、烷氧基、三氟甲基，单取代或者多取代。
2.如权利要求1所述的琥珀酸脱氢酶抑制剂，其特征在于：R1为二氟甲基；R2为3、4、5-三氟。
3.一种合成权利要求1或2所述琥珀酸脱氢酶抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
Figure FDA0004072867020000012
在合成步骤a中，将原料I溶于无水二氯甲烷中，加入N,N-二甲基甲酰胺作催化剂，然后滴加草酰氯室温反应2-3小时，用饱和的氢氧化钠溶液吸收尾气，反应完毕用二氯甲烷萃取，有机相浓缩干燥，得到中间体II；
在合成步骤b中，以二氯甲烷为反应溶剂，在N2氛围保护下，将2-碘苯胺与中间体II反应，待反应完毕后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取，有机相浓缩干燥后用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到中间体III；
在合成步骤c中，在N2氛围保护下，加入三苯基膦、二氟氯乙酸钠、N，N-二甲基甲酰胺、原料IV，升温至100℃进行反应，待反应完毕后，用石油醚萃取，合并有机相并浓缩干燥，柱层析后得到中间体V；
在合成步骤d中，以四氢呋喃为反应溶剂，(Cy3P)2CuCl为催化剂，将中间体V、乙酸钠、联硼酸频那醇酯进行反应，待反应完毕后，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机相并浓缩干燥，得到中间体VI；
合成步骤e中，以四氢呋喃为反应溶剂，四三苯基膦钯为催化剂，将中间体VI和中间体III进行反应，待反应完全后，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机相浓缩干燥，柱层析后得目标产物VII。
4.权利要求1或2所述的琥珀酸脱氢酶抑制剂在防治植物真菌病害中的应用。
5.一种用于防治植物真菌病害的杀菌剂，其活性成分中含有权利要求1或2所述的琥珀酸脱氢酶抑制剂。
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