CN116077522A - 一种用于治疗白血病的治疗制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗白血病的治疗制剂，属于白血病治疗技术领域。本发明所提供的白血病治疗制剂由车前草多糖和阿糖胞苷组成，本发明通过实验发现车前草多糖能够有效的抑制白血病细胞的增殖并促进白血病细胞的凋亡。同时，本发明发现车前草多糖能够与阿糖胞苷产生协同作用来抑制白血病细胞的增殖，从而可以制备更加高效的白血病治疗药物，也可以减少阿糖胞苷的用量，减少其所产生的副作用。
Description
技术领域
本发明属于白血病治疗技术领域，尤其涉及一种用于治疗白血病的治疗制剂。
背景技术
急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种具有异质性和侵袭的血液学恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。目前，尽管我们对AML病理生理学的复杂遗传学和生物学的理解有所进展，但是AML的发病因素仍然不明确。AML的治疗方式主要包括化疗、放疗、免疫治疗、骨髓移植、免疫治疗、靶向治疗及随后的巩固治疗。其中，化疗是AML的主要治疗手段，尽管多种化疗方案的出现使白血病的临床治疗有了相当大的进展，但是患者容易出现病情复发和化疗药物耐药的情况，因此我们迫切需要开发新的药物来实现更好的药物搭配来满足患者的生存需要。
现有研究表明多种中药的活性成分具有肿瘤抑制作用，因此从中药中寻找有效治疗AML的药物是一种有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于一种新的用于治疗白血病的治疗制剂。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种用于治疗白血病的治疗制剂，所述治疗制剂由车前草多糖，阿糖胞苷和药学上可接受的载体组成。
优选地，所述药学上可接受的载体为乳化剂、悬浮剂、湿润剂、防腐剂中一种或几种的混合。
优选地，所述车前草多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将车前草全草粉碎成粉末，过40目筛网，得到车前草粉末；
(2)将车前草粉末置于容器中，加入5倍量的无水乙醇脱脂4h后，过滤烘干；
(3)加入20倍量的水，100℃提取3h，过滤得到滤液后，对滤渣再次加入20倍量的水，100℃提取3h，合并滤液置于离心机中离心去除沉淀，保留上清；
(4)将上清使用旋转蒸发仪浓缩至上清体积的1/20，加入体积比4:1的氯仿-正丁醇的混合液去除蛋白，重复5次；
(5)使用0.45um微滤膜过滤后，过10Kda的超滤膜，在截留液中加入2倍量的无水乙醇醇沉48h；
(6)真空冷冻干燥，得到车前草多糖。
优选地，所述治疗制剂为液体药物制剂，所谓液体药物制剂中车前草多糖的浓度为20ug/ml-500ug/ml。
优选地，所述液体药物制剂中阿糖胞苷的浓度为20ug/ml。
其次，本发明提供了车前草多糖在制备白血病治疗制剂中的应用。
优选地，所述治疗制剂抑制白血病细胞的增殖并促进白血病细胞的凋亡；
所述治疗制剂中所述车前草多糖的浓度为20ug/ml-500ug/ml。
优选地的，所述车前草多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将车前草全草粉碎成粉末，过40目筛网，得到车前草粉末；
(2)将车前草粉末置于容器中，加入5倍量的无水乙醇脱脂4h后，过滤烘干；
(3)加入20倍量的水，100℃提取3h，过滤得到滤液后，对滤渣再次加入20倍量的水，100℃提取3h，合并滤液置于离心机中离心去除沉淀，保留上清；
(4)将上清使用旋转蒸发仪浓缩至上清体积的1/20，加入体积比4:1的氯仿-正丁醇的混合液去除蛋白，重复5次；
(5)使用0.45um微滤膜过滤后，过10Kda的超滤膜，在截留液中加入2倍量的无水乙醇醇沉48h；
(6)真空冷冻干燥，得到车前草多糖。
其次，本发明提供了车前草多糖在制备阿糖胞苷的增敏剂中的应用，所述增敏剂提高白血病细胞对于阿糖胞苷的敏感性。
其次，本发明提供了车前草多糖在制备白血病细胞增殖抑制剂药物中的应用。
其次，本发明提供了车前草多糖在制备白血病细胞凋亡促进药物中的应用。
优选地，所述车前草多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将车前草全草粉碎成粉末，过40目筛网，得到车前草粉末；
(2)将车前草粉末置于容器中，加入5倍量的无水乙醇脱脂4h后，过滤烘干；
(3)加入20倍量的水，100℃提取3h，过滤得到滤液后，对滤渣再次加入20倍量的水，100℃提取3h，合并滤液置于离心机中离心去除沉淀，保留上清；
(4)将上清使用旋转蒸发仪浓缩至上清体积的1/20，加入氯仿-正丁醇(体积比4:1)的混合液去除蛋白，重复5次；
(5)使用0.45um微滤膜过滤后，过10Kda的超滤膜，在截留液中加入2倍量的无水乙醇醇沉48h；
(6)真空冷冻干燥，得到车前草多糖。
本发明的有益效果在于：
本发明发现中药车前草中提取的车前草多糖能够有效的抑制白血病细胞的增殖，促进白血病细胞的凋亡，并且可以调控细胞凋亡相关蛋白，因此为白血病治疗提供了一种新的治疗药物。
其次，本发明发现本发明所提供的车前草多糖能够和阿糖胞苷产生协同的效果，增加阿糖胞苷对于白血病的抑制效果，从而制备出更高效的白血病治疗药物。同时，也可将车前草多糖用于制备阿糖胞苷的增敏剂，从而减少阿糖胞苷的使用，降低其副作用。
附图说明
图1为不同浓度车前草多糖对于HL-60细胞中BCL-2和BAX蛋白表达的调控。
具体实施方式
实施例1：制备车前草多糖
1.将100g车前草全草粉碎成粉末，过40目筛网，得到车前草粉末；
2.将车前草粉末置于容器中，加入500ml无水乙醇脱脂4h后，过滤烘干；
3.加入20倍量的水，100℃提取3h，过滤得到滤液后，对滤渣再次加入20倍量的水，100℃提取3h，合并滤液置于离心机中离心去除沉淀，保留上清；
4.将上清使用旋转蒸发仪浓缩至200ml，加入氯仿-正丁醇(体积比4:1)的混合液去除蛋白，重复5次；
5.使用0.45um微滤膜过滤后，过10Kda的超滤膜，在截留液中加入2倍量的无水乙醇醇沉48h；
6.真空冷冻干燥，得到车前草多糖。
实施例2：车前草多糖对于白血病细胞HL-60细胞增殖率的影响
1.以每孔1×105/ml细胞数将100ul对数生长期的HL-60细胞接种于96孔板中，待细胞安全贴壁之后，每孔加入不同浓度的车前草多糖(20，100,500ug/ml),然后设置3个复孔，空白对照组不加入车前草多糖；
2.将96孔板放置于细胞培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％CO2,培养24h；
3.在第20h时，每孔加入20ul 5mg/ml MTT溶液，继续培养4h；
4.去除上清，每孔加入150ul DMSO，震荡混匀后，使用酶标仪检测570nm吸光度，并计算车前草多糖的增殖抑制率((1-车前草多糖处理组/空白对照组)×100％)，实验结果如表1所示。
表1车前草多糖对于白血病细胞HL-60细胞增殖率的影响
| 分组 | 增殖抑制率(％) |
| 空白对照组 | 0 |
| 20ug/ml车前草多糖 | 12.93±2.34 |
| 100ug/ml车前草多糖 | 29.01±3.10 |
| 500ug/ml车前草多糖 | 33.55±3.11 |
根据表1可知，20,100,500ug/ml车前草多糖对于HL-60细胞的增殖都有一定程度的抑制作用。
实施例3：车前草多糖对于白血病细胞HL-60细胞凋亡的影响
1.以每孔1×105/ml细胞数将100ul对数生长期的HL-60细胞接种于96孔板中，待细胞安全贴壁之后，每孔加入不同浓度的车前草多糖(20，100,500ug/ml),然后设置3个复孔，空白对照组不加入车前草多糖；
2.处理24h后，使用PBS清洗细胞，每次清洗5min；
3.根据碧云天Caspase3活性检测试剂盒的说明书，检测各孔405nm下的吸光度，计算相对Caspase3相对酶活力,实验结果如表2所示。
表2车前草多糖对于白血病细胞HL-60细胞凋亡的影响
| 分组 | Caspase3相对酶活力 |
| 空白对照组 | 1.00±0.04 |
| 20ug/ml车前草多糖 | 1.553±0.22 |
| 100ug/ml车前草多糖 | 2.19±0.27 |
| 500ug/ml车前草多糖 | 2.45±0.18 |
根据表2可知，车前草多糖能够的提高Caspase3相对酶活力，从而导致白血病细胞HL-60细胞凋亡。
实施例4：车前草多糖对于白血病细胞HL-60细胞中凋亡调控蛋白BCL-2和BAX的影响
1.将2×105的HL-60细胞接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，每孔加入不同浓度的车前草多糖(20，100,500ug/ml),空白对照组不加入车前草多糖；
2.处理2h后，使用PBS洗涤细胞，加入100μl RIPA细胞裂解液；
3.使用细胞刮刀将细胞刮下后，将裂解液转移至离心管中，将离心管中置于离心机中，设定为12000g/min，4℃，10min；
4.离心后，将上清转移到新的离心管中，吸取2ul测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，沸水煮5min，得到各组的蛋白样品；
5.制备好电泳胶后，组装电泳槽，上层胶电压90V，下层胶120V进行电泳，待溴酚蓝即将跑出胶时，结束电泳；
6.按照“三明治模型”组装电转夹，装入电转槽中，加入电转液，250mA恒流1.5h；
7.电转结束后，将PVDF膜放入5％脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；
8.孵育BCL-2,BAX和GAPDH的一抗，4℃孵育过夜；
9.回收一抗，TBST洗膜后，孵育二抗，室温孵育1h，洗膜后，添加发光液，进行显像。
根据图1可知，车前草多糖能够有效的抑制凋亡抑制蛋白BCL-2的蛋白表达，并且能够有效的促进凋亡促进蛋白BAX的蛋白表达，从而可以有效的导致白血病细胞HL-60加速凋亡。
实施例5：车前草多糖和阿糖胞苷联用对于HL-60细胞增殖率的影响
1.以每孔1×105/ml细胞数将100ul对数生长期的HL-60细胞接种于96孔板中，待细胞安全贴壁之后，实验组1添加20ug/ml车前草多糖，实验组2添加20ug/ml阿糖胞苷，实验组3添加20ug/ml车前草多糖+20ug/ml阿糖胞苷，空白对照组不添加车前草多糖或阿糖胞苷；
2.将96孔板放置于细胞培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％ CO2,培养24h；
3.在第20h时，每孔加入20ul 5mg/ml MTT溶液，继续培养4h；
4.去除上清，每孔加入150ul DMSO，震荡混匀后，使用酶标仪检测570nm吸光度，并计算各种的增殖抑制率，实验结果如表3所示。
表3车前草多糖和阿糖胞苷联用对于HL-60细胞增殖率的影响
| 分组 | 增殖抑制率(％) |
| 空白对照组 | 0 |
| 实验组1 | 12.50±1.68 |
| 实验组2 | 24.40±2.84 |
| 实验组3 | 43.25±3.01 |
通过金氏公式计算两种药物联用的效果(q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb))，1.15＜q＜20表示两药协同，本发明计算出的q值为1.28符合两药协同，说明车前草多糖可以和阿糖胞苷协同抑制白血病细胞HL-60的增殖，增加白血病细胞对于阿糖胞苷的敏感性。
Claims (9)
1.一种用于治疗白血病的治疗制剂，其特征在于，所述治疗制剂由车前草多糖，阿糖胞苷和药学上可接受的载体组成。
2.根据权利要求1所述的治疗制剂，其特征在于，所述车前草多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将车前草全草粉碎成粉末，过40目筛网，得到车前草粉末；
(2)将车前草粉末置于容器中，加入5倍量的无水乙醇脱脂4h后，过滤烘干；
(3)加入20倍量的水，100℃提取3h，过滤得到滤液后，对滤渣再次加入20倍量的水，100℃提取3h，合并滤液置于离心机中离心去除沉淀，保留上清；
(4)将上清使用旋转蒸发仪浓缩至上清体积的1/20，加入体积比4:1的氯仿-正丁醇的混合液去除蛋白，重复5次；
(5)使用0.45um微滤膜过滤后，过10Kda的超滤膜，在截留液中加入2倍量的无水乙醇醇沉48h；
(6)真空冷冻干燥，得到车前草多糖。
3.根据权利要求1所述的治疗制剂，其特征在于，所述治疗制剂为液体药物制剂，所谓液体药物制剂中车前草多糖的浓度为20ug/ml-500ug/ml。
4.根据权利要求3所述的治疗制剂，其特征在于，所述液体药物制剂中阿糖胞苷的浓度为20ug/ml。
5.车前草多糖在制备白血病治疗制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述车前草多糖通过权利要求2所述的车前草多糖制备方法制备得到。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述治疗制剂抑制白血病细胞的增殖并促进白血病细胞的凋亡；
所述治疗制剂中所述车前草多糖的浓度为20ug/ml-500ug/ml。
8.车前草多糖在制备阿糖胞苷的增敏剂中的应用，其特征在于，所述增敏剂提高白血病细胞对于阿糖胞苷的敏感性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述车前草多糖通过权利要求2所述的车前草多糖制备方法制备得到。
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