CN116064845A - 母猪早期妊娠诊断miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种母猪早期妊娠诊断miRNA标志物及其应用。本发明通过大量的研究得出血清外泌体ssc‑let‑7c在母猪妊娠和非妊娠状态下，表达量具有显著差异；具体为，母猪在妊娠第9天ssc‑let‑7c的表达量即显著低于非妊娠状态的母猪，ssc‑let‑7c可以作为母猪早期妊娠诊断的标志物。本发明为母猪早期妊娠诊断提供了一种新的分子标志物，为母猪早期妊娠诊断提供更多可选择的分子标志物，对母猪早期妊娠诊断具有相当的必要性。

Description

母猪早期妊娠诊断miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用。
背景技术
母猪妊娠诊断是母猪繁殖管理的一项重要内容，早期诊断对于缩短母猪产仔间隔有着重要意义。母猪妊娠诊断确定的时间早晚，对于缩短其胎次间隔，提高母猪繁殖力，对于日常的母猪生产有很重要的作用，另外提前的确定有利于我们对母猪进行及时补配，防止空怀的发生。妊娠的早期准确诊断对于经济型猪场的有效管理非常重要。
早期妊娠检测的方法主要有观察法、直肠检查法、超声波测定法等，但这几种方法局限性较大，超声波检测法一般在母猪妊娠第28天时才有较高的检出率。
外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，直径大约在30～150nm。目前发现这种微小囊泡中含有细胞特异的蛋白、脂质、核酸分子等物质，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，不同细胞分泌的外泌体具有不同组成成分和功能。MicroRNA是外泌体中包含的一种非编码RNA，长度约为17-25个核苷酸，这些小RNA可以和靶基因的mRNA配对，在转录后水平上调控目标基因的表达。
通过检测外泌体携带物含量水平的变化判断母猪是否妊娠成功，是最近发展起来的一项母猪早期妊娠诊断方法，利用母猪血清外泌体及其携带的MicroRNA作为母猪早期妊娠标志物来快速准确的确定母猪的妊娠状况，提高母猪的繁殖性能。现有技术《一种血清外泌体ssc-miR-92b-3p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用》中提供了一种通过检测外泌体携带物表达水平变化来进行母猪早期妊娠诊断的方法。
因此研发探究可用于母猪妊娠诊断的分子标志物，对于母猪早期妊娠具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用，提供一种可用于母猪早期妊娠诊断的分子标志物。
本发明的首要目的是提供ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用。
本发明的另一目的是提供检测ssc-let-7c的试剂在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用。
本发明的又一目的是提供一种母猪早期妊娠诊断产品。
本发明通过以下技术方案实现上述发明目的：
本发明研究得出血清外泌体ssc-let-7c在妊娠9天和非妊娠的母猪中的表达量有显著性差异，可用于作为母猪妊娠诊断的标志物。
基于此，本发明提供了下述技术方案：
本发明提供了ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用，所述ssc-let-7c的核苷酸序列如下所示：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’。
本发明还提供了检测ssc-let-7c的试剂在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用。
优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包括引物ssc-let-7c Forward Primer；所述引物ssc-let-7c Forward Primer的核苷酸序列为：5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3’。
更优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂还包括引物ssc-let-7c Reverse Primer；所述引物ssc-let-7c Reverse Primer的核苷酸序列为：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
更优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂还包括引物Universal miRNA qPCRPrime；该引物由TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供。
另外，优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包括引物ssc-let-7c RT Stem-loopprimer sequence；所述引物ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence的核苷酸序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'。
另外，优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包括茎环反转录法、实时荧光定量PCR所需的试剂。
更优选地，所述茎环反转录法所需的试剂包括RT Stem-loop primer、2×TSReaction Mix、RT/RI Enzyme Mix、gDNA Remover、RNase-free Water；所述实时荧光定量PCR所需的试剂包括Forward Primer、Reverse Primer、SYBR Green、RNase-free Water。
另外，优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包括加尾反转录法、实时荧光定量PCR所需的试剂。
更优选地，所述加尾反转录法所需的试剂包括TransScript miRNA RT EnzymeMix、2×TS miRNA Reaction Mix、RNase-free Water；所述实时荧光定量PCR所需的试剂包括Forward Primer、Universal miRNA qPCR Primer、2×TransStart Top/Tip Green qPCRSuperMix、Nuclease-free Water。
本发明还提供了一种母猪早期妊娠诊断产品，包含检测ssc-let-7c的试剂。
优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包含引物ssc-let-7c Forward Primer；所述引物ssc-let-7c Forward Primer的核苷酸序列为：5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3’。
更优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂还包含引物ssc-let-7c Reverse Primer；所述引物ssc-let-7c Reverse Primer的核苷酸序列为：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
更优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂还包含引物Universal miRNA qPCRPrime；该引物由TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供。
优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包含引物ssc-let-7c RT Stem-loop primersequence；所述引物ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence的核苷酸序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'。
优选地，所述检测ssc-let-7c的试剂包含茎环反转录法或加尾反转录法所需的试剂。
更优选地，所述茎环反转录法所需的试剂包括RT Stem-loop primer、2×TSReaction Mix、RT/RI Enzyme Mix、gDNA Remover、RNase-free Water。
更优选地，所述加尾反转录法所需的试剂包括TransScript miRNA RT EnzymeMix、2×TS miRNA Reaction Mix、RNase-free Water。
更优选地，还包括RT-qPCR所需的试剂。
作为一种可选择的优选地实施方式，当使用茎环反转录法合成cDNA时，RT-qPCR所需的试剂包括Forward Primer、Reverse Primer、SYBR Green、RNase-free Water。
作为一种可选择的优选地实施方式，当使用加尾反转录法合成cDNA时，RT-qPCR所需的试剂包括Forward Primer、Universal miRNA qPCR Primer、2×TransStart Top/TipGreen qPCR SuperMix、Nuclease-free Water。
本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明提供了ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用，本发明通过大量的研究得出血清外泌体ssc-let-7c在母猪妊娠和非妊娠状态下，表达量具有显著差异；具体为，母猪在妊娠第9天ssc-let-7c的表达量即显著低于非妊娠状态的母猪，ssc-let-7c可以作为母猪早期妊娠诊断的标志物。本发明为母猪早期妊娠诊断提供了一种新的分子标志物，为母猪早期妊娠诊断提供更多可选择的分子标志物，对母猪早期妊娠诊断具有相当的必要性。
附图说明
图1为透射电镜拍摄的血清外泌体鉴定图。
图2为外泌体粒径分析图。
图3为Western Blot实验得出的血清外泌体膜表面蛋白分子的条带图。
图4为ssc-let-7c二级结构图。
图5为实际生产中独立样本差异基因ssc-let-7c的验证结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1血液样品采集与外泌体分离鉴定
一、血液样本的采集
在某繁殖场内挑选20头经产母猪进行同期发情处理。
其中，同期发情处理的具体方式为：
在发情周期的14-18天，每头每天饲喂20毫克孕酮，母猪在停止饲喂后的4-8天内同期出现发情。
同期发情处理1天后，对其中15头进行人工授精处理，另外5头进行假受精处理。母猪接受受精处理后即进入妊娠状态。
分别在进行假受精处理的母猪假受精9天和进行受精处理的母猪妊娠9天、妊娠12天、妊娠15天用促凝管采取耳缘静脉的血液样本，并及时放入-80℃冰箱冷冻保存备用。
二、血清外泌体的分离
1、血清的分离
对采集的血液在一个小时内进行促凝析出血清；将析出的血清即时在离心机以4000×g速度离心10min去除血细胞、细胞碎片和血小板；获得血清立即分装并放入液氮中速冻并转移至-80℃冰箱保存备用。
2、外泌体的分离
外泌体的分离采用超速离心法，具体操作为：
S1.在4℃的条件下将分离好的血清以2000×g的速度离心20分钟，去除漂浮的细胞和碎片，保留上清液。
S2.将S1所得上层清液在4℃的环境下以11000×g的速度高速离心30分钟排除更大的膜囊泡，保留上清液。
S3.为了进一步去除颗粒物，将高速离心所得上层清液利用0.22μm的过滤器(Merck Millipore，Ireland)挤压过滤，将过滤后的上清液利用Optima XPN-100超速离心机(Beckman Coulter，USA)在转子SW32Ti中以111，000×g转速，4℃环境下超速离心2h，保留沉淀即分离得到血清外泌体，超速离心下得到的外泌体等颗粒用PBS反复吹洗溶解，储存于-80℃冰箱。
三、血清外泌体的鉴定
1、透射电镜分析及纳米粒径分析
采用透射电镜观察上述分离得到的血清外泌体的形态及分析血清外泌体的粒径大小。
其中，外泌体的负染步骤包括：
S1.首先处理铜网，对铜网进行辉光放电以消除静电，在真空室内放置带有栅格的顶部(碳朝上)，并拉动真空和辉光放电50秒；排空后，将铜网放置于超净工作台并置于培养皿中。
S2.然后剪一小块Parafilm(封口膜)紧贴于倒扣放的平板皿上；之后用移液枪吸取10μL的外泌体样品滴于封口膜上，用镊子夹取铜网轻轻倒贴于样品滴上，让铜网在样品滴上吸附(孵育)10min；再用移液枪吸取10μL 3％(wt)乙酸铀滴于样品旁的封口膜上孵育3min；待孵育时间结束后，用镊子轻轻夹起样品滴上的铜网，用Whatman纸在铜网边缘轻轻吸收多余的样品缓冲液；将铜网倒置于3％(wt)的乙酸铀滴上吸附(孵育)2min；孵育时间结束后，用镊子夹起吸附过乙酸铀的铜网，在铜网边缘用Whatman纸轻轻吸附多余的液体，并将负染好的铜网放回至铜网盒里自然干燥，待透射电镜观察，记录好每个样品放至铜网盒的坐标位置。
S3.最后利用FEI TalosTM场发射透射电镜对外泌体进行形态学的观察。
电镜结果显示血清外泌体形态良好，质膜明显，呈椭圆凹陷状(图1)；其大小主要分布在100nm左右，直径大部分分布在30～150nm(图2)。
2、WB蛋白免疫印迹分析
用RIPA裂解缓冲液(CWBIO，PMSF：RIPA＝1：100)处理外泌体以分离总蛋白。使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(CWBIO)来测量蛋白质浓度。将外泌体蛋白热变性，并通过10％SDS-PAGE凝胶分离。将外泌体蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，USA)上，并在室温下用6％脱脂奶粉封闭2.5小时。然后孵育抗Hsp70、Tsg101(Abcam，UK)和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小兔IgG(Abcam，UK)。使用BeyoECL Moon化学发光开发套件(Beyotime)进行了印迹曝光。
WB检测到了外泌体表面标志蛋白Hsp70、Tsg101的存在(图3)，表明成功分离出了外泌体。
实施例2外泌体RNA的分离提取
将实施例1超速离心分离获得的外泌体进行解冻，利用miRNeasy Serum/PlasmaKit(Qiagen，Germany)抽提外泌体RNA。具体步骤如下：
S1.每1mL外泌体添加700μL QIAzol Lysis Reagent，涡旋含有裂解物(QIAzolLysis Reagent)的试管后并在室温(15～25℃)下静置孵育5分钟；该步骤促进核蛋白复合物的解离，得到裂解液；
S2.向每个样品中添加3.5μL外源cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参并充分混合；
S3.向裂解液中加入90μL氯仿并盖紧试管盖子，震荡15秒，并在室温(15～25℃)下孵育2分钟；
S4.在4℃环境下以12，000×g转速离心15分钟；(离心后，样品分离为3个相含有RNA的上层无色水相；一层薄的中间白色相；以及下层的红色有机相。水相的体积大约为400μL。)
S5.将上层水相转移到收集管中，避免转移任何其它液相，然后加入2倍体积的100％乙醇并通过吸管上下吸吹数次充分混合，得上层水相混合液；
S6.将700μL上层水相混合液吸入RNeasy MinElute吸附柱中，轻轻盖上盖子，在室温(15～25℃)下以8，000×g转速离心15秒，丢弃滤液；对于剩下的上层水相混合液液体可重复该步骤进行富集，弃掉滤液；
S7.将700μL RWT缓冲液加入RNeasy MinElute吸附柱上；轻轻盖上盖子，以8，000×g转速离心15秒，弃掉离心下的滤液；
S8.将500μLRPE缓冲液加到RNeasy MinElute吸附柱上；轻轻盖上盖子，以8，000×g转速离心15秒，弃掉离心下的滤液；
S9.将500μLRPE缓冲液移液到RNeasy MinElute吸附柱上；盖上盖子，以8，000×g转速离心2分钟，丢弃收集管和离心下的滤液；
S10.将RNeasy MinElute离心柱放入新的2mL收集管中，打开吸附柱的盖子，10000×g离心5分钟以干燥吸附柱膜，弃掉离心下的滤液；
S11.将RNeasy MinElute离心柱放入新的1.5mL收集管中，将14μL无RNase的水直接添加到吸附柱膜的中心，轻轻盖上盖子，让柱子静置孵育1分钟，然后10000×g离心1分钟以洗脱RNA。
实施例3Illumina测序及差异基因的筛选
对实施例2提取得到每个时期(C9、P9、P12、P15；n＝3)的RNA进行小RNA测序，按照试剂盒说明书使用
Figure BDA0004027795470000071
(NEB，USA)的NEBNext Multiplex将小RNA制备生成cDNA文库。文库在Illumina Novaseq 6000平台上进行测序，利用生物信息学技术对测序结果进行分析，获得在非妊娠和妊娠期间具有显著差异表达的潜在标志物：血清外泌体ssc-let-7c。
血清外泌体ssc-let-7的前体序列为：
5’-UGUGUGCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCGUGGGAGUUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCCUUGGAGCACACU-3’；
血清外泌体ssc-let-7c的序列为：
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’；
血清外泌体ssc-let-7c的二级结构如图4所示。
实施例4RT-qPCR验证测序数据中差异表达的基因ssc-let-7c
通过RT-qPCR，对ssc-let-7c进行测序结果差异基因的验证。
1、实验方法
RT-qPCR使用的引物序列为：
ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence：
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'
cel-miR-39RT Stem-loop primer sequence：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT-3’
其中，RT-qPCR的体系及参数如表1所示。
表1
Figure BDA0004027795470000081
2、结果发现血清外泌体ssc-let-7c在妊娠(P9、P12、P15)与非妊娠(C9)时的表达量具有显著差异，与Illumina测序结果相符。为进一步在实际生产中独立检测做准备。
实施例5在实际生产中使用RT-qPCR独立验证妊娠早期差异基因ssc-let-7c
一、血液样本的采集
在一个独立扩大样本(n＝16)的母猪群体中，对其进行同期发情处理并进行人工授精和假授精(具体过程同实施例1，人工授精和假受精样本量分别为8头)，分别采集0天(授精当天)，假受精9天，妊娠9天、12天、15天的母猪血液，分离得到血清(具体方法同实施例1)。
二、外泌体RNA样本的制备
参照实施例1的方法，使用超速离心法分离获得血清外泌体并利用实施例2所述RNA抽提试剂盒miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，Germany)进行抽提外泌体RNA。分离过程中添加外源cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参。
三、茎环法反转录miRNA的RT-qPCR验证
(1)茎环引物法反转录合成cDNA
ssc-let-7c基因引物按照Oligo合成制造商(BGI)协议进行稀释。使用所有外泌体RNA样本使用反转录试剂盒(TransGen，CHINA)通过茎环引物法创建了miRNA的cDNA文库。
通过茎环引物法反转录miRNA创建cDNA文库的过程如下：
S1.将miRNA模板、引物与RNase-free Water混匀，65℃孵育5min后，冰浴2min，然后再加入表1中的其他反应组分；
S2.轻轻混匀，42℃孵育15min；
S3.85℃加热5秒钟失活RT/RI与gDNA Remover。
其中，茎环引物法反转录所使用引物的序列如下所示：
ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence：
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'
cel-miR-39RT Stem-loop primer sequence：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT-3’
茎环引物法反转录反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0004027795470000091
Figure BDA0004027795470000101
(2)实时荧光定量PCR检测
合成的cDNA文库稀释10倍，然后在ABI 7300实时PCR仪(life，USA)上对miRNAcDNA进行时荧光定量PCR检测(实验重复3次)，荧光定量程序：活化：94℃活化30秒；94℃变性5秒；60℃退火30秒；40个循环；溶解曲线：94℃，15秒，60℃，1分钟，94℃，15秒。
茎环法实时荧光定量PCR所使用引物的序列如下所示：
ssc-let-7c Forward Primer：5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3’
ssc-let-7c Reverse Primer：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’
cel-miR-39Forward Primer：5’-GCGCTCACCGGGTGTAAATC-3’
cel-miR-39Reverse Primer：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’
实时荧光定量PCR的反应体系如表3所示。
表3
Figure BDA0004027795470000102
qPCR程序(两步法)如表4所示。
表4
Figure BDA0004027795470000103
Figure BDA0004027795470000111
利用Microsoft Excel处理基因表达原始数据，使用2-ΔΔCt计算ssc-let-7c、cel-miR-39的相对表达水平，采用配对t检验和方差分析两种方法进行分析，P值<0.05为显著差异，并使用GraphPad Prism 9软件进行作图统计分析。对ssc-let-7c、cel-miR-39进行独立定量结果显示，实验结果如图5所示，结果显示，早在妊娠第9天采集的母体血清外泌体中，ssc-let-7c的表达水平均极显著下降，P<0.01。
通过对猪血清外泌体miRNAs进行RNA测序和独立的qPCR分析，我们首次确定了最早在怀孕的第9天血清中外泌体miRNA的水平变化。我们的结果表明，循环血清外泌体miRNA在猪的早期妊娠中起重要作用。具体而言，我们确定了在妊娠母猪与空怀母猪ssc-let-7c表达的水平的差异，该miRNA可以作为猪早期妊娠的新的生物标记物。
四、加尾反转录法反转录miRNA的RT-qPCR的验证
除茎环反转录法，加尾反转录法也得到同样的结果。
(1)加尾法合成cDNA
利用全式金试剂盒TransScriptmiRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix进行加尾反转录法通用反转录。
加尾反应和第一链cDNA合成，反转录引物由TransScriptmiRNA First-StrandcDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供。
加尾反转录法反转录反应体系如表5所示。
表5
Figure BDA0004027795470000112
Figure BDA0004027795470000123
加尾反转录法反转录反应参数：
S1.将表4所述的反应体系混匀，37℃孵育1小时；
S2.85℃加热5秒钟失活RT Enzyme Mix。
(2)实时荧光定量PCR检测
加尾反转录法反转录所得cDNA稀释10倍后使用。
上游引物为miRNA特异引物，根据目的miRNA设计其引物序列如下：
ssc-let-7c Forward Primer：5′-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3′；
下游引物为TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供的通用引物Universal miRNA qPCR Primer(10μM)。
加尾反转录法荧光定量PCR体系如表6所示。
表6
Figure BDA0004027795470000121
qPCR程序(两步法)如表7所示。
表7
Figure BDA0004027795470000122
加尾反转录法同样检测到在妊娠第9天采集的母体血清外泌体中，ssc-let-7c的表达水平均极显著下降，结果与茎环反转录法相同。
无论用茎环法还是加尾反转录法，在进行qPCR均需注意：
1)在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分混匀。这一点是PCR平行性的保证。
2)配制体系尽量在冰上进行。
3)请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余，保证分装到最后稍有剩余。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.ssc-let-7c在作为母猪早期妊娠诊断标志物中的应用，其特征在于，所述ssc-let-7c的核苷酸序列如下所示：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’。
2.检测ssc-let-7c的试剂在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包括引物ssc-let-7c Forward Primer；所述引物ssc-let-7c Forward Primer的核苷酸序列为：5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3’。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包括引物ssc-let-7c Reverse Primer；所述引物ssc-let-7c Reverse Primer的核苷酸序列为：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包括引物ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence；所述引物ssc-let-7c RT Stem-loop primersequence的核苷酸序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'。
6.一种母猪早期妊娠诊断产品，其特征在于，包含检测ssc-let-7c的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包含引物ssc-let-7c Forward Primer；所述引物ssc-let-7c Forward Primer的核苷酸序列为：5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGT-3’。
8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂还包含引物ssc-let-7c Reverse Primer；所述引物ssc-let-7c Reverse Primer的核苷酸序列为：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
9.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包含引物ssc-let-7c RT Stem-loop primer sequence；所述引物ssc-let-7c RT Stem-loop primersequence的核苷酸序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3'。
10.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述检测ssc-let-7c的试剂包含茎环反转录法或加尾反转录法所需的试剂。
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