CN116064656A - 一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法 - Google Patents

一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域，包括如下步骤：S1、农杆菌转化外植体：将西瓜种子置于萌发培养基中培育得到外植体，在使用重组后的农杆菌对外植体进行浸染，将浸染后的外植体于共培养培养基上进行暗培养；S2、外植体的筛选：将共培养后的西瓜外植体置于筛选培养基上进行培养，得到含有抗性芽的芽团；S3、目标芽团的培育：将筛选出的阳性抗性芽团置于伸长培养基上培养；S4、目标幼苗的生根筛选：将具有西瓜地上部分的幼苗置入生根筛选培养基中，诱导根的分化，进一步的筛选得到西瓜生根幼苗，本发明能够使得绿色荧光蛋白在西瓜植物上高效表达，提高了转基因表达的成功率以及阳性植株数量。

Description

一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)属于葫芦科作物，具有重要的经济价值，在世界范围内广泛种植。中国是西瓜主产国，产量占世界西瓜总产量的 60%以上，居世界首位。虽然目前市场上西瓜品种类型较多，但兼顾品质优、抗性好和产量高等特性的优质品种较少；因此，培育优质西瓜品种是提高市场竞争力的前提。由于西瓜遗传基础狭窄，利用常规育种选育新品种较为困难，而转基因技术具有投入成本低、转化效率高、转基因拷贝数低、插入片段确定性好、转基因表达和遗传稳定等优点。因此，利用基因工程技术手段进行种质创新，培育优质和高产的新品种已成为当前西瓜遗传育种研究的热点。
目前应用的西瓜育种技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。但西瓜是较难利用农杆菌介导法获得转基因材料的葫芦科植物，其继代过程出现的丛生芽玻璃化、叶片黄化、植株顶端褐化坏死等问题一直阻碍试验继续深入开展 ；另外，西瓜外植体对农杆菌的敏感程度、诱导丛生芽的能力以及再生芽的分化方式等因素都限制了西瓜转基因材料的成功获得。此外，绿色荧光蛋白（GFP）在葫芦科上作为常用的标记基因，其表达效果并不好，因此建立高效的西瓜遗传转化方法以及绿色荧光蛋白高表达方法是亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，该方法能够使得绿色荧光蛋白在西瓜上高效表达，提高了转基因表达的成功率以及阳性植株数量。
为解决上述技术问题，本发明提供一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，包括如下步骤：
S1、农杆菌转化外植体：将西瓜种子置于萌发培养基中得到培育得到外植体，在使用重组后的农杆菌对外植体进行浸染，并将浸染后的外植体置于共培养培养基上进行暗培养，得到共培养后的外植体；
S2、外植体的筛选：将共培养后的西瓜外植体置于筛选培养基上进行培养，得到含有抗性芽的芽团；
S3、目标芽团的培育：将筛选出的阳性抗性芽团置于伸长培养基上培养，得到伸长的地上部分西瓜幼苗；
S4、目标幼苗的生根筛选：将具有西瓜地上部分的幼苗置入生根筛选培养基中，诱导根的分化，进一步的筛选得到西瓜生根幼苗；
S5、目标西瓜苗的检测，对西瓜生根幼苗进行Basta抗性的鉴定。
作为本发明的又一种改进，S1中所述西瓜外植体为去掉胚轴培根生长点以及子叶尾部的西瓜子叶U型部位，所述萌发培养基为MS固体培养基，所述农杆菌菌株为EHA105，所述农杆菌菌株包含两种表达载体，表达载体①含有绿色荧光蛋白eGFP和Basta基因，表达载体②含有绿色荧光蛋白eGFP和hpt基因；
作为本发明的又一种改进，所述S1中农杆菌侵染液的制作包括以下步骤：
将用于侵染的重组农杆菌现在含50mg/L利福平和50mg/L卡纳霉素的LB固体培养基培养36-48h，再将菌体挑至MS液体培养基中，摇匀至OD值为0.3-0.5，再加入20mg/L的乙酰丁香酮。
作为本发明的又一种改进，所述MS液体培养基含有2mg/L的6-BA，所述共培育培养基内含有2mg/L的6-BA。
作为本发明的又一种改进，所述S2中筛选包括第一筛选阶段与第二筛选阶段，所述第一筛选阶段为抑制非抗性芽生长阶段，所述第二筛选阶段为促进抗性芽分化阶段，所述筛选培养基内含有Basta抗性和潮霉素抗性，所述筛选培养基组成为MS、6-BA、特美汀、Basta或者潮霉素的固体培养基；
所述筛选培养基中6-BA的浓度为0.8mg/L，特美汀的浓度为0.3mg/L；
所述第一筛选阶段中Basta筛选浓度为6-10mg/L，潮霉素筛选浓度为5mg/L，所述第二筛选阶段中Basta筛选浓度为3-6mg/L，潮霉素筛选浓度为3mg/L。
作为本发明的又一种改进，经所述表达载体①转化共培后的外植体进行第一阶段筛选，放在具有Basta抗性的筛选培养基上，所述表达载体②转化共培后的外植体进行第一阶段筛选，放在具有潮霉素抗性的筛选培养基上，第一阶段筛选时间为15d，第一筛选阶段结束后切掉旧的外植体，将生长诱导出的芽团进行第二阶段筛选，第二阶段筛选时间为45d，每15d更换培养基。
作为本发明的又一种改进，所述S3中伸长培养基内含有MS、KT、GA3、NAA、Basta或者潮霉素的固体培养基，所述KT、GA3、NAA、Basta和潮霉素的浓度分别为0.3mg/L、1mg/L、0.05mg/L、10mg/L、5mg/L。
作为本发明的又一种改进，所述S4中生根培养基内含有MS、IBA、Basta或者潮霉素的固体培养基，IBA、Basta、潮霉素的浓度分别为1mg/L、4mg/L、2mg/L。
作为本发明的又一种改进，所述S5中Basta抗性使用的检测方法为PCR检测、Bar试纸检测、手持荧光检测仪检测，潮霉素抗性使用的检测方法为PCR检测和手持荧光检测仪检测。
作为本发明的又一种改进，上述所有培养基的PH为5.8。
综上所述，本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果：
本发明主要是通过对培养基内组分的控制，达到对侵染的最优条件，使得农杆菌转化效率大大增加，且通过在筛选环节前期通过提高筛选浓度抑制再生芽的产生，促使抗性愈伤的生长，后期降低筛选浓度促进抗性愈伤的分化，提高了后续的转化效率，减少了无效转化的培养，杜绝了浪费。
附图说明
图1为种子萌发后外植体的U型部位示意图；
图2为共培养后外植体瞬时表达情况示意图；
图3为外植体筛选第一阶段生长情况示意图；
图4为外植体筛选第二阶段生长情况示意图；
图5为伸长生长示意图；
图6为生根筛选情况示意图；
图7为PCR检测情况示意图；
图8为手持荧光等照射荧光苗情况示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-8，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例在进行具体实施时提供了一种农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，该方法采用eGFP作为标记基因，Basta和潮霉素作为筛选剂，该方法包括以下具体步骤：
1、外植体的制备
选取饱满、外观正常的西瓜种子，去除种壳，不要伤到子叶及生长点、灭菌后，在MS固体培养基中25℃暗培养3天 。将萌发的西瓜种子去除子叶上半部分及胚轴和生长点，留U型部位，并将U型部位纵向切成两半，即一个萌发的西瓜种子可得到4个外植体，U型部位如图1所示；
2、构建3300-eGFP和1300-eGFP载体
将上述重组载体3300-eGFP和1300-eGFP导入农杆菌菌株EHAl05中；
3、侵染液的制备
用于侵染的重组农杆菌先在含50mg/L利福平和50mg/L卡纳霉素的LB固体培养基培养36-48h，再将菌体挑至MS液体培养基中，摇匀至OD值为0.3-0.5，再加入20mg/L的乙酰丁香酮；
4、侵染
将步骤1得到的外植体置于步骤2得到的含有3300-eGFP和1300-eGFP菌体的侵染液中，使侵染液没过外植体，侵染30min，侵染过程每隔5min摇动侵染液，侵染结束后取出外植体，将液体吸干，得到侵染后的外植体；
5、共培养
侵染完成后，将侵染后的外植体于共培养培养基中，暗培养4天，得到共培养后的外植体，荧光瞬时表达情况如图2所示；
6、筛选
将共培养后的外植体于筛选培养基上（阶段①培养基）培养，每个平板上放25个左右的外植体。15d后换至筛选阶段②培养基上，有抗性的芽团长出，生长情况如图3、4所示。
7、伸长
筛选完成后，将含有抗性芽的芽团至于伸长培养基中进行培养，每15d更换一次培养基，至幼芽长大，生长情况如图5所示；
8、检测
（1）PCR检测，可取幼嫩叶片提取DNA，进行PCR验证，转基因植株可得到约450bp的条带，而非转基因植株不能扩增出条带 ，如图7所示；
（2）BASTA试纸条(北京奥创金标生物技术有限公司)：选取步骤7得到的西瓜植株的叶片，按照试纸条的说明书进行，产生目标阳性线的植株即为完成遗传转化的西瓜植株，含有目的基因，不产生目标阳性线的植株非完成遗传转化的西瓜植株，不含有目的基因，如图8所示；
（3）荧光检测
用手持荧光检测仪检测，用蓝光照射西瓜苗，佩戴LUV-30V黄色眼镜观察，有绿色荧光代表是绿色荧光蛋白表达的荧光，没有绿色荧光代表绿色荧光蛋白未表达或者表达量低的苗子。
本实施例将目的基因转化栽西瓜早春红玉、西农8号、早佳8424、麒麟王、黑美人，均得到了阳性转基因植株，其结果如下：
表1 不同品种转化3300-eGFP和1300-eGFP共培养后的eGFP顺时表达效率（手持荧光灯照共培养后的外植体，有绿色荧光的外植体为eGFP瞬时表达外植体，eGFP瞬时表达率=eGFP瞬时表达外植体数量/总外植体数量*100%）
表2不同品种转化3300-eGFP和1300-eGFP的转化效率（转化效率=阳性苗数量/外植体总数%100%，潮霉素抗性阳性苗数量为PCR检测阳性数量，Basta抗性阳性苗数量为PCR检测和Bar试纸检测均为阳性的数量）
表3 不同品种转化3300-eGFP和1300-eGFP的eGFP表达效率（eGFP荧光表达效率=荧光苗株树/阳性苗株树*100%）
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、农杆菌转化外植体：培育西瓜种子发芽,使用西瓜芽制备获得外植体，使用含有重组农杆菌的侵染液对所述外植体进行浸染，所述重组农杆菌的载体上含有绿色荧光蛋白基因；
将浸染后的外植体进行暗培养，得到共培养后的外植体；
S2、外植体的筛选：将共培养后的西瓜外植体置于筛选培养基上进行培养，得到含有抗性芽的芽团；
S3、目标芽团的培育：将筛选出的阳性抗性芽团置于伸长培养基上培养，得到伸长的地上部分西瓜幼苗；
S4、目标幼苗的生根筛选：将具有西瓜地上部分的幼苗置入生根筛选培养基中，诱导根的分化，进一步的筛选得到西瓜生根幼苗；
S5、目标西瓜苗的检测，对西瓜生根幼苗进行Basta抗性的鉴定。
2.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于，S1中所述西瓜外植体为去掉胚轴培根生长点以及子叶尾部的西瓜子叶U型部位，所述萌发培养基为MS固体培养基，所述农杆菌菌株类型为EHA105农杆菌，所述农杆菌包含两种表达载体，表达载体①含有绿色荧光蛋白eGFP和Basta基因，表达载体②含有绿色荧光蛋白eGFP和hpt基因。
3.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于，所述S1中侵染液的制作包括以下步骤：
将用于侵染的重组农杆菌先在含50mg/L利福平和50mg/L卡纳霉素的LB固体培养基培养36-48h，再将菌体挑至MS液体培养基中，摇匀至OD值为0.3-0.5，再加入20mg/L的乙酰丁香酮。
4.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：所述S2中筛选包括第一筛选阶段与第二筛选阶段，所述第一筛选阶段为抑制非抗性芽生长阶段，所述第二筛选阶段为促进抗性芽分化阶段，所述筛选培养基内含有Basta抗性和潮霉素抗性，所述筛选培养基组成为MS、6-BA、特美汀、Basta或者潮霉素的固体培养基；
所述筛选培养基中6-BA的浓度为0.8mg/L，特美汀的浓度为0.3mg/L；
所述第一筛选阶段中Basta筛选浓度为6-10mg/L，潮霉素筛选浓度为5mg/L，所述第二筛选阶段中Basta筛选浓度为3-6mg/L，潮霉素筛选浓度为3mg/L。
5.如权利要求4所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：经所述表达载体①转化共培后的外植体进行第一阶段筛选，放在具有Basta抗性的筛选培养基上，所述表达载体②转化共培后的外植体进行第一阶段筛选，放在具有潮霉素抗性的筛选培养基上，第一阶段筛选时间为15d，第一筛选阶段结束后保留诱导出的芽团，将生长诱导出的芽团进行第二阶段筛选，第二阶段筛选时间为45d，每15d更换培养基。
6.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：所述S3中伸长培养基内含有MS、KT、GA3、NAA、Basta或者潮霉素的固体培养基，所述KT、GA3、NAA、Basta和潮霉素的浓度分别为0.3mg/L、1mg/L、0.05mg/L、10mg/L、5mg/L。
7.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：所述S4中生根培养基内含有MS、IBA、Basta或者潮霉素的固体培养基，IBA、Basta、潮霉素的浓度分别为1mg/L、4mg/L、2mg/L。
8.如权利要求1所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：所述S5中Basta抗性使用的检测方法为PCR检测、Bar试纸检测、手持荧光检测仪检测，潮霉素抗性使用的检测方法为PCR检测和手持荧光检测仪检测。
9.如权利要求1-8任一项所述的绿色荧光蛋白高效表达的西瓜遗传转化方法，其特征在于：上述所有培养基的PH为5.8。
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