CN116064407A - 肺癌细胞及其建立方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肺癌细胞及其建立方法和应用。所述的肺癌细胞高表达CD18、Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子。是将普通LLC细胞接种至C57BL/6小鼠，取肺部转移灶培养，将原代培养的转移灶细胞再次接种至C57BL/6，再次取肺部转移灶不同克隆培养，经过筛选而成的细胞株。经过两次肺部转移灶成瘤和筛选，和LLC细胞相比，肺癌细胞构建转移模型使用的时间更短，主要脏器发生转移率更高；为更好的研究肿瘤侵袭转移的机制，提供了高效的细胞模型。

Description

肺癌细胞及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于肺癌细胞株模型及其构建技术领域，具体涉及一种肺癌细胞及其建立方法和应用。
背景技术
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤第二位，死亡率居于恶性肿瘤之首，其中80％-85％为非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC的治疗近年来取得了进步，但是仍然有很多病人会复发进展。NSCLC的5年总体生存率为19％左右。肿瘤侵袭转移是恶性肿瘤致死的主要原因。肿瘤细胞从原发灶脱离经过一系列复杂的生物学过程到达远处器官并形成转移灶，这一过程称为侵袭转移，期间涉及多个步骤。目前，肿瘤侵袭转移的确切生物学过程和具体分子机制尚不十分清楚。因此，为了更好的研究肿瘤肿瘤侵袭转移的机制，需要高效的细胞模型和动物模型来模拟这一过程。
Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)是一种发生于C57BL小鼠的肺癌。1951年，由Wistar研究所的Margaret R.Lewis博士发现。该肿瘤组织可以在免疫正常小鼠之间传代，广泛用于肺癌模型的构建。1980由John S.Bertram和PrzemyslawJanik建立细胞系，命名为LLC1(后面如无特殊说明，LLC细胞均为LLC1细胞)。该细胞株广泛用作转移模型，并有助于研究癌症化疗药物的机制。有研究报道该细胞具有高度的致瘤性，但在小鼠中转移性较弱。
发明内容
本发明的目的是提供一种更加高效的侵袭转移能力更强的LLC细胞，以用于免疫正常鼠转移模型的构建。
本发明肺癌细胞，高表达CD18分子。
所述的肺癌细胞，具有很强的侵袭转移能力。不表达或低表达CD18分子后，侵袭转移能力减弱。
进一步，所述的肺癌细胞高表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子。
所述的肺癌细胞，高表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≥2，低表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≤0.5。表达量一般为FPKM值，即二代测序RNAseq的基因表达水平。
本发明所述的表达包括mRNA或蛋白表达。
本发明的肺癌细胞株LLC-ML2，保藏编号为CCTCC NO:C2022102。来源于小鼠。
本发明还提供了所述的肺癌细胞的构建方法，采用以下任一方式构建：
(1)直接筛选所述的高表达、不表达或低表达分子的肺癌细胞得到；
(2)通过对肺癌细胞过表达CD18分子，或者通过过表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子，干扰或者敲除表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子的方式得到。
进一步地，本发明还提供了所述的肺癌细胞的构建方法，将普通LLC细胞接种至C57BL/6小鼠，取肺部转移灶培养，将原代培养的转移灶细胞再次接种至C57BL/6小鼠，再次取肺部转移灶不同克隆培养，经过筛选而成。
具体是通过体外细胞基质胶侵袭实验和体内小鼠成瘤转移实验，挑选转移能力最强的克隆株。
所述的构建方法，具体包括以下步骤：
第一阶段：在C57鼠皮下接种2×106个LLC细胞后饲养60天，取肺转移灶肿块，剔除正常组织后洗净、剪碎，胶原酶I消化1h，吹散后100um过滤网过滤后300g水平转子离心5分钟，使用DMEM+10％FBS+1％双抗培养，得LLC-ML1细胞；
第二阶段：在C57鼠皮下接种2×106个LLC-ML1细胞后饲养50天，取肺转移灶不同克隆，剔除正常组织后洗净、剪碎，胶原酶I消化1h，吹散后100um过滤网过滤后300g水平转子离心5分钟，使用DMEM+10％FBS+1％双抗培养，通过体外细胞基质胶侵袭实验和体内小鼠成瘤转移实验，挑选转移能力最强的克隆株。
所述的构建方法，筛选的标准包括高表达CD18分子；
进一步地，筛选的标准还包括高表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子。
进一步地，高表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≥2，低表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≤0.5。
进一步地，通过对小鼠肺癌细胞过表达或者干扰或者敲除表达分子的方式来获得。
本发明还提供了所述的肺癌细胞的应用，作为肺癌研究的模型工具。
本发明将普通LLC细胞接种至C57BL/6小鼠，取肺部转移灶培养，将原代培养的转移灶细胞再次接种至C57BL/6小鼠，再次取肺部转移灶不同克隆培养，经过筛选而成的细胞株。经过两次肺部转移灶成瘤和筛选，LLC-ML2细胞和LLC细胞相比构建转移模型使用的时间更短，主要脏器发生转移率更高；为更好的研究肿瘤肿瘤侵袭转移的机制，提供了高效的细胞模型。LLC-ML2细胞的主要分子特征为高表达CD18分子。更详细分子特征为LLC-ML2细胞高表达CD18(Itgb2)、Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或极低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子(和野生型LLC细胞比)。
本发明的小鼠肺癌细胞LLC-ML2于2022年6月28日在中国典型培养物保藏中心进行了专利保藏，保藏编号为CCTCC NO:C2022102；地址为中国武汉大学。
附图说明
图1：LLC-ML2细胞形态图。
图2：LLC、LLC-ML2细胞生长曲线比较。
图3：LLC、LLC-ML2集落形成实验比较。
图4：LLC、LLC-ML2细胞迁移和侵袭实验比较。
图5：LLC-ML2细胞在小鼠体内具有更高的转移能力证明结果图；
A：生存曲线图；B：LLC、LLC-ML2细胞小鼠体内侵袭转移发生率统计图；C：LLC、LLC-ML2细胞小鼠体内肺转移灶实物图；D：为C的统计图；E：LLC、LLC-ML2细胞小鼠体内肝转移灶实物图；F：为E的统计图。
图6：LLC细胞和LLC-ML2细胞特征分子表达量热图。
图7：LLC细胞和LLC-ML2细胞特征分子表达量统计图。
图8：Western blot检测各细胞中CD18蛋白的表达。
图9：LLC细胞中过表达CD18可以明显增加细胞的迁移侵袭能力；
A:Western blot检测重组CD18分子在LLC细胞中的表达，1为LLC转染空载体，2为LLC转染重组CD18表达质粒，带有strepII标签；B:平板克隆实验；C:划痕实验；D：基质胶侵袭实验；*表示为p<0.05，具有显著性。
图10：LLC-ML2细胞中敲除CD18可以明显降低细胞的迁移侵袭能力；
A:Western blot检测鉴定CD18敲除的阳性克隆，1-D5和2-C4-2为完全敲除无CD18表达的克隆；B:平板克隆实验；C:CCK8细胞增殖实验；D：基质胶侵袭实验；E：C57小鼠成瘤实验；F：C57小鼠侵袭转移实验，左上图为肺脏转移，右下图是肝脏转移，右上图为转移灶数目和转移器官数目的统计图，右下图是各组小鼠的生存曲线图；*表示为p<0.05，具有显著性。NTCG为转染了无关序列的阴性对照细胞。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：本发明小鼠肺癌细胞LLC-ML2的构建
具体步骤：
第一阶段：在12只C57鼠皮下接种2×106个LLC细胞后饲养60天(12只，存活3只，其中1只肝、肺转移)，取肺转移灶肿块(混合克隆)，剔除正常组织后洗净、剪碎，胶原酶I消化1h，吹散后100um过滤网过滤后300g水平转子离心5分钟，使用DMEM+10％FBS+1％双抗培养，得LLC-ML1细胞。
第二阶段：在10只C57鼠皮下接种2×106个LLC-ML1细胞后饲养50天(5只小鼠有内脏转移，其中：1只肺转移；2只肺肝转移；3只肺肝肾转移)，取肺转移灶不同克隆，剔除正常组织后洗净、剪碎，胶原酶I消化1h，吹散后100um过滤网过滤后300g水平转子离心5分钟，使用DMEM+10％FBS+1％双抗培养，通过体外细胞基质胶侵袭实验和体内小鼠成瘤转移实验，挑选转移能力最强的克隆株为LLC-ML2细胞。细胞形态见图1。
实施例2：本发明LLC-ML2细胞的培养条件:
LLC-ML2细胞培养于37℃，5％CO2的恒温培养箱中，使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养。细胞贴壁生长到80-90％密度时，使用胰酶消化液(含0.125％trypsin、0.265mM EDTA，为通常胰酶浓度的一半)进行消化传代。细胞可以使用含有10％DMSO的完全培养基进行冻存，保存在液氮中。
实施例3：本发明细胞生长检测(CCK-8assay)
(1)准备所需要检测的细胞进行培养，待细胞生长为对数期时进行种板(96孔板)，每天5个重复孔，检测6天，每孔1×103个细胞并均匀分布在100μL含10％ FBS的细胞培养基中，置于5％ CO2，37℃的培养箱中培养；
(2)待细胞完全贴壁后，在第一天的每个孔中加入10μL CCK-8试剂，37℃培养箱中孵育2h(第2-6天，保证每天孵育的时间相同)；
(3)利用多功能酶标仪在波长450nm处检测每孔的吸光值，以吸光值(平均值)为纵坐标，孵育天数为横坐标，绘制生长曲线。
体外细胞生长实验表明，LLC(野生型)和LLC-ML2细胞在生长速度上没有明显差异，见图2。
实施例4：本发明细胞集落形成实验
(1)细胞悬液的制备：用一般传代方法将对数生长期的单层培养细胞分散成单细胞悬液，计数；
(2)接种细胞：准备需要检测的细胞进行种板(6孔板)，每组3个重复孔，每孔1×103个细胞并均匀分布于2mL含10％ FBS的细胞培养基中；置于5％ CO2，37℃的培养箱中培养；每隔两天用D-Hanks溶液对细胞进行清洗2-3次，更换新鲜的培养基；
(3)培养：置于5％ CO2，37℃的培养箱中培养，静置2周；
(4)固定：当细胞长成可以用肉眼看见的单克隆时，终止培养。用1×PBS缓冲液或D-Hanks溶液将细胞小心清洗3次，加入1mL 4％多聚甲醛固定细胞30min；
(5)染色：弃去多聚甲醛，0.1％结晶紫染料着色10-30min，流水缓缓洗去染料，室温晾干；
(6)使用显微镜观察，拍照。
集落形成实验表明，LLC和LLC-ML2细胞在生长速度上没有明显差异，见图3。
实施例5：本发明细胞迁移和侵袭实验
(1)在处理需要检测的细胞之前，先将所需Transwell小室放置在24孔板中，然后在小室中铺上15μL的基质胶(基质胶：RPMI-1640完全培养基＝1：2)，随后在37℃培养箱中凝固1h；
(2)将需要检测的细胞消化，计数，种板，每个小室铺1×105个细胞并均匀分布于200μL不含FBS的细胞培养基中，下室中加入700μL含15％FBS的培养基，实验分别为不添加基质胶的迁移组和添加基质胶的侵袭组，置于5％ CO2，37℃的培养箱中培养；
(3)固定：用镊子小心取出Transwell小室，放置在新的24孔中，加入适量4％多聚甲醛至完全浸没小室，固定细胞30min；
(4)染色：用1×PBS缓冲液缓慢清洗小室3次，将小室倒置，在室温环境下晾干，小室倒置后滴加适量结晶紫染料染色5min，用水清洗掉结晶紫染料，然后用棉签缓慢的擦干净小室膜内侧的染料；
(6)将小室重新放置在24孔板中，加满去离子水，用显微镜观察并拍照。
细胞迁移和侵袭实验表明，LLC-ML2细胞的迁移和侵袭能力显著性增强，见图4。
实施例6：本发明LLC-ML2细胞小鼠体内转移能力检测
1.取野生型LLC、LLC-ML2细胞，分别皮下接种C57鼠15只，每只接种细胞量2×106个，编号，定期测量小鼠体重及肿瘤大小、破溃、死亡时间等情况。
2.接种27天处理，其中转移灶组小鼠8只，原发灶组小鼠13只。将小鼠脱颈处死后，分别取肿块、肺、肝、肾组织，观察每组小鼠转移情况并统计结果。
3.LLC-ML2小鼠模型和野生型LLC小鼠模型相比更容易发生死亡，具有更短的生存时间(图5A)。LLC-ML2组的远处器官转移发生率为69％，LLC组的远处器官转移发生率为6.67％，两者相比具有显著性差异(图5B)。其中，LLC-ML2组肺表面肉眼可见转移灶个数为2.25±2.435明显高于LLC组0个(图5C、D)；同时，LLC-ML2组肝脏表面肉眼可见转移灶个数为4.5±3.7明显高于LLC组0.2±0.599个(图5E、F)。这说明LLC-ML2细胞和LLC细胞相比构建转移模型使用的时间更短，主要脏器发生转移率更高。
实施例7：LLC-ML2细胞分子特征
1.将2×106个LLC-ML2细胞接种于60mm培养皿中，培养24小时。
2.向培养皿中加入2ml TRIzol。并按TRIzol说明书步骤提取LLC-ML2细胞的RNA。
3.将RNA送测序公司使用二代测序技术进行RNAseq的基因表达水平测定。
4.使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，设计合成各个基因特异性引物进行荧光定量PCR检测，检测基因的表达水平。
5.CD18基因蛋白水平的测定为将2×106个LLC-ML2细胞接种于60mm培养皿中，培养24小时，加入细胞裂解液并提取细胞蛋白，电泳后，使用western blot检测CD18蛋白的表达。
LLC-ML2细胞的主要分子特征为高表达Itgb2(CD18)、Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或极低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子；图6为LLC细胞和LLC-ML2细胞特征分子表达量热图；图7为LLC细胞和LLC-ML2细胞特征分子表达量统计图。本发明中高表达为LLC-ML2/LLC至少≥2，低表达为LLC-ML2/LLC至少≤0.5(表达量一般为FPKM值，即二代测序RNAseq的基因表达水平)。将研究聚焦于CD18分子，western blot检测两种细胞的CD18在蛋白水平的表达，发现和mRNA水平结果一致：LLC-ML2细胞高表达CD18分子，而LLC-WT细胞(即野生型)几乎没有表达CD18分子(图8)。
实施例8：在LLC细胞中过表达CD18其迁移侵袭能力明显增加
1.构建过表达CD18质粒：于PB510b质粒(piggybac系统)中插入CD18基因CDS序列及Twin-Strep序列，其中Twin-Strep序列位于CD18基因的C末端，测序检验插入基因成功，提取PB510b-CD18-c-Twin-Strep质粒备用。
2.将1×106个LLC-细胞接种于30mm培养皿中，培养24小时。
3.LLC细胞中将5ug PB510b-CD18-c-Twin-Strep质粒和1ug PBT转座酶质粒使用Lipofectamine3000进行共转染。
4.转染后，正常培养48小时后，加用2.5ug/ml的嘌呤霉素培养基连续培养筛选7天。
5.提取细胞蛋白，western blot检测。
在LLC细胞，过表达人工重组的CD18分子，使得LLC拥有高水平CD18分子(图9A)。CD18高表达对细胞增殖的影响小，平板克隆实验显示两者无显著性差异(图9B)。但是，CD18高表达可以明显提高LLC细胞的迁移和侵袭能力(图9C，D)。证明CD18高表达是LLC细胞转化为高转移性LLC-ML2细胞的关键分子。
实施例9：在LLC-ML2细胞中敲除CD18细胞生长和迁移侵袭能力明显降低
构建敲除CD18的质粒：根据CD18基因CDS序列设计3对sgRNA，具体序列如下：Px458-CD18-1：
5-CACCGACACTCACTGCTGCTTGCCC-3；见SEQ ID NO.1；Px458-CD18-2：
5-CACCGGGACTGTTCTTCCTGGGATC-3；见SEQ ID NO.2；
Px458-CD18-3：5-CACCGGACTGTATCCAGTCGGGGCC-3；见SEQ ID NO.3。
合成3条序列并分别插入至Px458质粒(含GFP基因)中，测序比对插入片段成功，分别提取Px458-CD18-1/2/3质粒备用。
2.将2×106个LLC-ML2细胞接种于60mm培养皿中，培养24小时。
3.按步骤LLC-ML2细胞分别加入5ug Px458-CD18-1/2/3质粒进行转染。正常培养48小时后，使用流式细胞仪分选带绿色荧光的LLC-ML2细胞于96孔板中培养。
4.待单克隆细胞形成，逐步扩大培养，种于60mm培养皿至细胞长满皿，加入细胞裂解液并提取细胞蛋白，电泳后，使用western blot检测CD18蛋白的表达。完全无CD18蛋白表达的LLC-ML2细胞株认定为完全敲除成功。
在LLC-ML2细胞，使用CRISPR/Case9技术敲除LLC-ML2中的CD18，使得LLC-ML2细胞完全缺失CD18的表达(图10A)。体外细胞实验显示，敲除CD18后可以显著的抑制细胞的生长增殖(图10B C)，同时可以极大的抑制LLC-ML2细胞的迁移和侵袭能力(图10D)。体内小鼠模型实验也表明，LLC-ML2细胞完全缺失CD18后，明显抑制了移植瘤的生长(图10E)，同时显著抑制LLC-ML2细胞的小鼠体内主要器官的远处转移能力(图10F)。这充分证明了CD18高表达是LLC-ML2细胞具有高侵袭转移能力的关键分子。

Claims (10)

1.肺癌细胞，其特征在于，高表达CD18分子。
2.根据权利要求1所述的肺癌细胞，其特征在于，高表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子。
3.根据权利要求1或2所述的肺癌细胞，其特征在于，高表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≥2，低表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≤0.5。
4.肺癌细胞LLC-ML2，保藏编号为CCTCC NO:C2022102。
5.权利要求1-3任一项所述的肺癌细胞的构建方法，其特征在于，采用以下任一方式构建：
(1)直接筛选所述的高表达、不表达或低表达分子的肺癌细胞得到；
(2)通过对肺癌细胞过表达CD18分子，或者通过过表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子，干扰或者敲除表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子的方式得到。
6.权利要求1-4任一项所述的肺癌细胞的构建方法，其特征在于，将普通LLC细胞接种至C57BL/6小鼠，取肺部转移灶培养，将原代培养的转移灶细胞再次接种至C57BL/6小鼠，再次取肺部转移灶不同克隆培养，经过筛选而成。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，筛选的标准包括高表达CD18分子；
进一步地，筛选的标准还包括高表达Strc、Cd79a、Amigo2、Plet1、Angptl4、Plac1分子；不表达或低表达Ddx3y、Cbr3、Sox11、Pid1、Kdm5d、Eif2s3y、Capn6分子。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，高表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≥2，低表达是指肺癌细胞和野生型LLC细胞的表达量之比≤0.5。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，通过对小鼠肺癌细胞过表达或者干扰或者敲除表达分子的方式来获得。
10.权利要求1-4任一项所述的肺癌细胞或者权利要求5-9任一项所述的构建方法构建得到的肺癌细胞的应用，其特征在于，作为肺癌研究的模型工具。
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