CN116063427A - 黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2的应用。本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。过表达本发明所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2能够提高植物的抗盐能力。

Description

黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2的应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2的应用。
背景技术
VOZ(Vascularplant one-zinc fingerprotein)维管植物单锌指蛋白是高等植物特有的转录因子家族，普遍存在于维管植物和藓类植物中，在植物响应生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要的作用。
VOZ转录因子家族首次于2004年由Mitsuda等人在拟南芥中被克隆，在拟南芥中，VOZ转录因子有两个成员：AtVOZ1和AtVOZ2，AtVOZ1在韧皮部组织中特异表达，AtVOZ2在根中表达丰度较高，与此同时在水稻和小立碗藓中也发现其同源基因。研究表明，VOZ转录因子家族具有两个保守的结构域：Domain-A和Domain-B，其中Domain-B具有DNA结合结构域和蛋白二聚化的重要功能，因此Domain-B被确定为VOZ转录因子家族成员的特征结构域VOZ-domain。由于VOZ在C端区域与NAC蛋白具有同源性，因此亦可归属为NAC subgroup VIII-2。
研究显示，VOZs(VOZ1和VOZ2)积极响应生物和非生物胁迫。比如，在拟南芥中，双突变体voz1voz2植株能够增强对冷冻和干旱胁迫的耐受力，但对真菌病原体等生物胁迫的耐受力减弱；VOZ1和VOZ2分别作为DREB2C和DREB2A的转录抑制子，介导植物的热胁迫响应；VOZs还可作为多个盐响应基因的正调节因子，并在耐盐的过程中起到功能冗余的作用。在水稻中，OsVOZ1/OsVOZ2以功能冗余的方式负调控水稻细胞死亡和基础抗病性，但OsVOZ1/OsVOZ2能够与抗病蛋白Piz-t相互作用，介导对非亲和稻瘟菌小种的抗病性。VOZs除了在胁迫反应中的作用外，还可以促进植物的开花，比如在拟南芥中，VOZs主要通过光周期途径，独立于FLC，与CO互作调控FT的表达促进植物的开花，亦与光敏色素B互作调控下游基因的表达，在植株幼年到成年开花的转变中起到重要的作用。VOZs在拟南芥中对光敏色素B介导的种子萌发具有负调节作用。以上也充分说明了VOZs在植物生长发育以及调控非生物和生物胁迫中发挥着重要的作用。
黄瓜(Cucumis sativusL.)属于葫芦科黄瓜属，是我国设施蔬菜的主要作物之一。由于设施生产中不恰当的栽培方式，不合理的水肥管理以及半封闭的设施环境等因素，导致可溶性盐含量普遍偏高，栽培土壤次生盐渍化加剧，已经严重制约了设施蔬菜产业的发展，同时影响了黄瓜的发育，造成了产量和品质下降。因此，发现或者鉴定植物的耐盐基因从而了解植物的耐盐机理，对调控植物的耐盐性和盐敏感性具有非常重要的作用。在其他植物上如拟南芥、水稻、芒果等，人们对维管植物单锌指蛋白基因参与非生物胁迫有一定的认识，但在黄瓜中有关维管植物单锌指蛋白基因参与盐胁迫响应及其作用机理还未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。过表达本发明所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2能够提高植物的抗盐能力，尤其是转基因植物。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述植物包括转基因植物。
优选的，所述转基因植物包括拟南芥。
优选的，所述提高植物的抗盐能力包括：通过过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2来提高植物的抗盐能力。
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在植物育种中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在转基因植物育种中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述转基因植物包括拟南芥。
有益效果：
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现黄瓜维管植物单锌指蛋白及其黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2对盐胁迫表现出耐盐的能力，且其过表达能明显提高对盐胁迫的耐受性。本发明实施例结果证明：在含有氯化钠的培养基上，尤其在150mM氯化钠胁迫培养基上，发现CsVOZ2基因(黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2)过表达的不同拟南芥株系种子的萌发率显著高于野生型对照，而且具有CsVOZ2基因过表达的拟南芥株系在150mM氯化钠胁迫培养基上的根长长于野生型对照，此外，还可以看出atvoz1voz2拟南芥突变体株系在150mM氯化钠胁迫培养基上的种子萌发速率和根长都明显低于对照和CsVOZ2基因过表达的拟南芥植株。可见，过表达CsVOZ2的转基因株系种子的萌发率高于野生型对照，根长也高于野生型对照；相反，atvoz1voz2突变体拟南芥种子的萌发率和根长低于野生型，在atvoz1voz2突变体植株中过量表达CsVOZ2基因，种子的萌发率和根长与野生型相当。由此可见，黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2在拟南芥中的过量表达提高了转基因植株的盐胁迫耐受性，拟南芥atvoz1voz2突变体对盐胁迫敏感，CsVOZ2基因过量表达在atvoz1voz2突变体中回补了其功能，表现于野生型相当。因此，过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2能够提高转基因植物的抗盐能力。
附图说明
图1为CsVOZ2基因在黄瓜不同的器官的表达机制，其中R为根，S为茎，L为叶，MF为雄花，FF为雌花，-2dF为开花前两天果实，0dF为开花当天果实；
图2为用150mM Nacl胁迫黄瓜植株0、1、3、6、9、12、24和36h的根和叶中CsVOZ2基因表达量，其中，A是150mM Nacl胁迫黄瓜植株0、1、3、6、9、12、24和36h后叶中CsVOZ2基因表达量，B是150mM Nacl胁迫黄瓜植株0、1、3、6、9、12、24和36h后根中CsVOZ2基因表达量；
图3为分别用0、75、150mM Nacl胁迫引起的渗透处理对不同处理的种子萌发的影响，其中，左侧图片是WT、V2-1300、V12和V2-V12在MS培养基上生长12h、24h、48h、96h的种子萌发率，中间图片是WT、V2-1300、V12和V2-V12在含有75mM Nacl的MS培养基上生长12h、24h、48h、96h的种子萌发率，右侧图片是WT、V2-1300、V12和V2-V12在含有150mM Nacl的MS培养基上生长12h、24h、48h、96h的种子萌发率，WT为野生型对照，V2-1300为V2-1300-1，是CsVOZ2过表达至野生型拟南芥Col-0的转基因株系1，V2-V12为V2-V12-1，是CsVOZ2过表达至atvoz1voz2的转基因株系1，V12为拟南芥突变体atvoz1voz2植株，简称atvoz1/2；
图4为Col-0、atvoz1/2、V2-1300-1、V2-1300-2、V2-V12-1和V2-V12-2在MS培养基上生长的根长对比图；
图5为Col-0、atvoz1/2、V2-1300-1、V2-1300-2、V2-V12-1和V2-V12-2在含有75mMNacl的MS培养基上生长的根长对比图；
图6为Col-0、atvoz1/2、V2-1300-1、V2-1300-2、V2-V12-1和V2-V12-2在含有150mMNacl的MS培养基上生长的根长对比图；
图4～图6第一排从左到右依次为Col-0、atvoz1/2、V2-1300-1，第二排从左到右依次为V2-V12-1、V2-V12-2、V2-1300-2，其中Col-0为拟南芥哥伦比亚野生型株系，V2-1300-1为CsVOZ2过表达至野生型拟南芥Col-0的转基因株系1、V2-1300-2为CsVOZ2过表达至野生型拟南芥Col-0的转基因株系2、atvoz1/2为拟南芥突变体atvoz1voz2植株、V2-V12-1为CsVOZ2过表达至atvoz1voz2的转基因株系1，V2-V12-2为CsVOZ2过表达至atvoz1voz2的转基因株系2。
具体实施方式
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MPKGLKSKCQSTSHQLLKEKAKNRVNDLQGIFTNLQNARKESRTTDVAVLEEQVHQMLREWNAELNEPSPASSLVEGSLGSFSQELARLLEHCDEQDDATSTLAEPKAEPELHCILGSNPSNFVQDGFCIPELQHESFFGFEECKVSPLDIQNYSFYKSDMATQSNCQSFKLDQNLEQTTMVSKDDMSTLNCHILNSQPEFDYGVLIGASDVGDFIQDTKPSILPNIAPRPSAFMGPICALWDCFRPAQGSKWCQDYCSSCHSVLAINEGLPGMIPILRPGGIGFKDGPLFAALQAKTQAKEVGIPICDGAATRKSPWNAPELFDITFLEGETIREWLYFDKPRRAFESGNRKQRSLPDYSGRGWHESRKLVMKEFGGQKKSYYMDPQPSSTLEWHLYEYDITNYDSFALYRLELKHADTKKSPKGKLAADPLADLQKKMGRLTAEGPVELGQQVKGKMTMKRNN。
在本发明中，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，具体为ATGCCGAAGGGTTTGAAGAGTAAATGTCAATCTACTTCTCATCAGCTTTTGAAGGAAAAAGCAAAGAACCGTGTTAATGACCTTCAAGGGATATTTACTAATCTTCAAAATGCAAGAAAGGAGAGTCGTACTACTGACGTTGCTGTCTTGGAGGAGCAAGTCCATCAGATGCTCAGGGAGTGGAATGCTGAGCTTAATGAACCTTCACCTGCATCTTCATTAGTTGAGGGTAGTCTTGGATCATTCTCACAAGAGTTAGCCCGTCTTCTTGAGCATTGTGATGAGCAAGATGATGCAACTAGTACATTGGCTGAACCAAAGGCTGAACCTGAACTCCACTGCATTCTTGGCAGCAATCCGTCAAATTTCGTACAGGATGGTTTTTGTATTCCAGAGCTCCAACACGAAAGTTTTTTCGGATTTGAGGAGTGCAAAGTGTCTCCTTTAGATATTCAGAATTATTCATTTTACAAATCGGACATGGCTACTCAGTCTAATTGTCAAAGTTTCAAATTAGATCAAAACTTAGAGCAGACCACGATGGTCAGTAAGGATGATATGTCTACTTTGAATTGCCATATATTGAATTCACAACCAGAGTTTGACTATGGGGTTCTTATTGGGGCATCGGATGTGGGAGACTTTATTCAGGACACAAAGCCCAGTATTCTCCCAAATATTGCACCCCGACCATCTGCTTTTATGGGCCCGATATGTGCTCTCTGGGATTGTTTCAGACCTGCTCAAGGATCCAAATGGTGTCAGGACTATTGCAGTAGCTGTCATTCTGTTCTTGCTATAAACGAAGGCCTTCCTGGAATGATTCCAATATTGCGTCCTGGGGGAATTGGGTTTAAGGATGGTCCTTTGTTTGCTGCTCTTCAGGCAAAGACACAAGCCAAAGAAGTTGGAATACCCATATGTGATGGTGCTGCAACAAGGAAATCTCCATGGAATGCTCCTGAGCTTTTTGATATTACATTTCTTGAGGGGGAGACAATCAGGGAATGGCTCTACTTCGACAAGCCTAGACGAGCCTTTGAGAGTGGCAATCGAAAGCAAAGGTCATTGCCGGATTATAGTGGCCGTGGTTGGCATGAATCAAGGAAGCTAGTGATGAAGGAGTTTGGTGGTCAGAAGAAGTCTTATTACATGGATCCACAGCCATCAAGCACTCTTGAATGGCATTTGTATGAGTATGATATCACCAATTATGATTCATTCGCATTATATAGGCTGGAACTCAAACATGCTGATACAAAAAAGAGTCCAAAGGGAAAATTGGCAGCGGATCCTCTGGCCGATCTTCAGAAGAAGATGGGAAGGCTTACTGCAGAGGGCCCTGTTGAGCTTGGACAACAAGTTAAAGGCAAGATGACGATGAAGAGAAATAATTAA。
在本发明中，用于扩增CsVOZ2编码区的引物对优选包括CsVOZ2-CDS-F和CsVOZ2-CDS-R；所述CsVOZ2-CDS-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示；所述CsVOZ2-CDS-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示。
本发明发现黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2对盐胁迫表现出耐盐的能力，且其过表达能明显提高对盐胁迫的耐受性，因此，本发明通过构建含有该编码基因的重组载体进而获得高表达编码基因CsVOZ2的植物，达到耐盐的效果。
本发明优选提供了含有编码基因CsVOZ2的重组表达载体，也称为super1300-CsVOZ2-GFP。本发明还优选提供了用于构建super1300-CsVOZ2-GFP载体的引物对优选包括Super1300-CsVOZ2-F和Super1300-CsVOZ2-R；所述CsVOZ2-F-super1300的核苷酸序列SEQID NO.3所示；所述CsVOZ2-R-super1300的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。采用本发明所述引物对能够快速、准确扩增出带有super1300载体臂的编码基因CsVOZ2。本发明对所述super1300载体的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可。
在本发明中，用于检测编码基因CsVOZ2的引物对优选包括FP和RP；所述FP的核苷酸序列SEQ ID NO.5所示；所述RP的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示。采用本发明所述引物对能够特异、准确检测编码基因CsVOZ2的表达。
在本发明中，所述植物优选包括转基因植物，进一步优选包括拟南芥，更优选为拟南芥。在本发明中，所述提高转基因植物的抗盐能力优选包括：通过过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2来提高转基因植物的抗盐能力。本发明黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在转基因植物盐胁迫抗性中有重要作用，过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2能够提高转基因植物的抗盐能力中的应用。
本发明提供了黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在植物育种中的应用，进一步的过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在植物育种中的应用。在本发明中，所述植物进一步包括转基因植物，更优选包括拟南芥，最优选为拟南芥。在本发明中，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列和黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2编码区的核苷酸序列已在上文进行详细的描述，在此不作赘述。本发明将植物中所述基因CsVOZ2进行过表达使其更加抗盐胁迫，由此可以提高植物耐盐性，为培育出耐盐的优良品种提供一个良好的应用，因此，黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2能够用于育种中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的黄瓜维管植物单锌指蛋白及其编码基因CsVOZ2的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
参照华北型黄瓜9930的基因组序列，通过PCR的方法克隆维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区全长。反应混合物如下：高保酶Mix 25μL，上游引物CsVOZ2-CDS-F(10μM，具体为ATGCCGAAGGGTTTGAAGAGTA，SEQ ID NO.7)1.5μL，下游引物CsVOZ2-CDS-R(10μM，具体为TTAATTATTTCTCTTCATCGTCATCTTG，SEQ ID NO.8)1.5μL，模板(反转录的cDNA)2μL，ddH2O 20μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸2min，34个循环，最后72°延伸5min。
取50μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒(产品货号：AP-GX-250)纯化回收目的片段。
黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区序列全长为1398bp(SEQ IDNO.2)，编码465个氨基酸(SEQ ID NO.1)，该基因具有保守的Domain-A和Domain-B结构域，该基因的编码区序列如SEQ NO.2所示。
实施例2
黄瓜不同组织部位不同时期CsVOZ2基因表达量：
取新泰密刺黄瓜材料：
空间表达取样：同一黄瓜植株上的根、茎、叶、雄花和雌花，其中根记为R，茎记为S，叶记为L，雄花记为MF，雌花记为FF；
时间表达取样：花前两天果实、开花当天果实，其中花前两天果实记为-2dF，开花当天果记为0dF；
以上每份样品均取3个生物学重复。
用华越洋提取RNA试剂盒(产品编号：0416-50)提取上述材料的RNA，利用诺维赞反转录试剂盒(货品编号：Vazyme.R211-01)反转录为cDNA，并用诺维赞荧光定量试剂盒(Vazyme.Q311-02)检测CsVOZ2基因的表达情况(以TUA基因为内参基因)，通过黄瓜数据库搜索CsVOZ2基因序列，避开保守结构域设计特异性定量引物。采用引物FP(SEQ ID NO.5，CCACGATGGTCAGTAAGGATG)和引物RP(SEQ ID NO.6，TTTGTGTCCTGAATAAAGTCTCCC)组成的引物对检测CsVOZ2基因的表达，采用引物FP2(SEQ ID NO.9，CATTCTCTCTTGGAACACACTGA)和引物RP2(SEQ ID NO.10，TCAAACTGGCAGTTAAAGATGAAA)组成的引物对检测TUA基因的表达。结果如图1所示，CsVOZ2基因在黄瓜的不同组织部位均有表达，其中在根、雄花和雌花中表达量较高。
实施例3
黄瓜幼苗获得：黄瓜新泰密刺种子55℃温汤浸种，28℃催芽，种子露白以后对其进行水培于光照培养箱培养，保持日夜温度为28℃/18℃(白天温度为28℃，夜间温度为18℃)，16/8h的光周期(光照16h，黑暗8h)。待生长至两叶一心，使用200mL 150mM氯化钠溶液对36株黄瓜幼苗进行盐胁迫处理，以添加同样体积的自来水作为对照，分别于处理后0、1、3、6、9、12、24h后收集地上的叶样品和地下部的根样品，其中地上的叶样品每次取0.5g，地下部的根样品每次取0.5g。
提取上述材料的RNA用华越洋提取RNA试剂盒(产品编号：0416-50)，并合成第一链cDNA诺维赞反转录试剂盒(货品编号：Vazyme.R211-01)，采用qRT-PCR(诺维赞荧光定量试剂盒(Vazyme.Q311-02))的方法检测CsVOZ2基因在氯化钠胁迫下的表达情况(以TUA基因为内参基因)，采用引物FP(SEQ ID NO.5)和引物RP(SEQ ID NO.6)组成的引物对检测CsVOZ2基因的表达，采用引物FP2和引物RP2组成的引物对检测TUA基因的表达。
黄瓜在150mM氯化钠溶液分别处理0、1、3、6、9、12、24h后黄瓜地上部(叶)和地下部(根)中编码基因CsVOZ2基因的表达量结果如图2所示。
由如图2可知，无论是根样品还是叶样品，随着氯化钠胁迫时间的递增，与0h相比，CsVOZ2基因的表达大部分都有一定的改变。其中，在黄瓜的叶中，150mM Nacl胁迫的第12hCsVOZ2基因的表达有明显的增强，在黄瓜的根中，150mM Nacl胁迫的第0h到第1h CsVOZ2基因的表达量有显著的增加。
实施例4
CsVOZ2过表达至野生型拟南芥Col-0的转基因株系，简称CsVOZ2过表达转基因株系，记为V2-1300。Col-0为拟南芥哥伦比亚野生型株系。拟南芥突变体atvoz1voz2植株，记为V12。CsVOZ2过表达至atvoz1voz2的转基因株系，即为在拟南芥突变体atvoz1voz2为背景下，转入CsVOZ2过表达的转基因植株，也称为V2-V12纯合株系，记为V2-V12。
转基因拟南芥CsVOZ2过表达植物的获得：
Super1300-CsVOZ2-GFP载体的构建:用PCR的方法扩增上下游分别含有酶切位点XbaI和SmaI的CsVOZ2基因；反应混合物如下：高保酶Mix 25μL，上游引物Super1300-CsVOZ2-F(10μM)1.5μL，下游引物Super1300-CsVOZ2-R(10μM)1.5μL，模板(纯化回收后的CsVOZ2基因编码区的片段)2μL，ddH2O20μL；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸2min，34个，最后72℃延伸5min。
Super1300-CsVOZ2-F：CGATACACCAAATCGACTCTAGTCTAGAATGCCGAAGGGTTTGAAGAGTA(画横线部分为Xba I酶位点)，SEQ ID NO.3；Super1300-CsVOZ2-R：CACTAGTATTTAAATGTCGACCCCGGGATTATTTCTCTTCATCGTCATCTTG(画横线部分为Sma I酶切位点)，SEQ ID NO.4；
取50μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒(产品货号：AP-GX-250)纯化回收目的片段。与此同时将Super1300载体(Li Y,Feng S etal(2017)Spatiotemporal Expression and Substrate SpecificityAnalysis oftheCucumber SWEET Gene Family.Front Plant Sci.Vol.8)用相同的限制性内切酶Xba I和Sma I酶切，酶切体系(采用塔克拉公司的限制酶，Xba I和Sma I)：Xba I 2μL，Sma I 2μL，10×T+BSA 4μL，Super1300载体1μg，补充ddH2O到40μL，37℃3h，之后85℃失活5min。利用同源重组技术(近岸同源重组试剂盒货号NR005-01A)，将回收目的片段和酶切后的载体进行连接，转化大肠杆菌，得到的阳性克隆通过PCR和测序鉴定，获得构建成功的重组表达载体，命名为Super1300-CsVOZ2-GFP。
通过拟南芥蘸花法(Clough,Steven J Bent et al(1998)，Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana.The Plant Journal Vol.176.)，将CsVOZ2的过表达载体转入农杆GV3101，分别转入哥伦比亚野生型(Col-0)和拟南芥突变体atvoz1voz2(转入方法参考文献为：Kumar S,Choudhary P et al(2018),Vascular plant one-zinc finger1(VOZ1)and VOZ2interactwith constans and promote photoperiodic flowering transition.PlantPhysiol.Vol.176(4).)中。筛选获得生长良好的CsVOZ2转基因T3代株系，其中由上面转入哥伦比亚野生型获得的植株中筛选得到黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2过表达转基因纯合株系，记为V2-1300以及由上面转入拟南芥突变体atvoz1voz2获得的的植株中筛选得到V2-V12纯合株系。
将V2-1300、V2-V12、V12和哥伦比亚野生型拟南芥植株(野生型对照，简称WT或Col-0)的种子分别种在含有0、75和150mM的NaCl的MS培养基上，每个处理种400～500粒种子，观察种子的萌发情况和植株的表型。其中V2-1300采用了两个株系进行实验，分别记为V2-1300-1和V2-1300-2，V2-1300-2为备用株系，V2-V12采用了两个株系进行实验，分别记为V2-V12-1和V2-V12-2，V2-V12-2为备用株系；在V2-1300和V2-V12中，调查V2-1300-1和V2-V12-1的种子萌发情况，调查V2-V12-1、V2-V12-2、V2-V12-1和V2-V12-2的植株的表型。
种子的萌发情况见表1和图3。
表1不同盐胁迫处理后拟南芥种子萌发率(％)
Figure BDA0003808578090000101
种子的萌发情况如表1和图3所示，在含有0mM NaCl的MS培养基上，V2-1300、V2-V12、V12在12h后开始萌发，在含有75mM NaCl的MS培养基上，V2-1300、V2-V12、V12在12h后开始萌发、且萌发速率在第4天基本一致，在0h～48h时间内相比其他株系，V2-1300的种子萌发数量较多；当在含有150mM NaCl的MS培养基上，所有植株的种子萌发时间延迟，在24h后开始萌发，萌发速率与0、75mM的相比大大降低，其中V2-1300、V2-V12的种子萌发数量多于WT和V12，V12株系的种子萌发数量最低。
植株的表型情况如图4所示，在含有0mM、75mM NaCl的MS培养基上，与Col-0相比，V2-1300-1和V2-1300-2植株的根长较长，V2-V12-1和V2-V12-2的根长与Col-0相当，atvoz1/2的植株根长最短，当在含有150mM NaCl的MS培养基上，所有植株的根长都明显受到了抑制，V12株系(突变体atvoz1/2)的根长抑制最为严重，V2-1300-1、V2-1300-2、V2-V12-1、V2-V12-2与Col-0相当。
综上所示可知，本发明鉴定了CsVOZ2过表达转基因株系(V2-1300-1、V2-1300-2)能明显降低拟南芥对于盐胁迫的敏感性。在MS培养基中添加氯化钠(NaCl)，CsVOZ2过表达转基因株系(V2-1300-1、V2-1300-2)的种子萌发率高于野生型对照，根长也明显长于WT；V12无论是种子萌发速率还是根长都明显低于野生型对照，V2-V12植物中，过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2提高了V12对盐胁迫的耐受性，在盐胁迫下种子的萌发速率和根长高于V12株系，仅次于WT。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在提高植物的抗盐能力中的应用，其特征在于，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括转基因植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述转基因植物包括拟南芥。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高植物的抗盐能力包括：通过过表达黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2来提高植物的抗盐能力。
6.黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在植物育种中的应用，其特征在于，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.黄瓜维管植物单锌指蛋白或黄瓜维管植物单锌指蛋白的编码基因CsVOZ2在转基因植物育种中的应用，其特征在于，所述黄瓜维管植物单锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转基因植物包括拟南芥。
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