CN116056707A - 治疗前列腺癌的方法 - Google Patents

治疗前列腺癌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116056707A
CN116056707A CN202180057167.XA CN202180057167A CN116056707A CN 116056707 A CN116056707 A CN 116056707A CN 202180057167 A CN202180057167 A CN 202180057167A CN 116056707 A CN116056707 A CN 116056707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
inhibitor
day
lsd
dose
administered
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180057167.XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·德阿尔瓦罗
J·L·帕拉-帕劳
Z·尼科洛娃
J·迪马丁诺
E·菲尔瓦洛夫
I·阿隆奇克
M·马拉泰斯塔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celgene Quanticel Research Inc
Original Assignee
Quanticel Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quanticel Pharmaceuticals Inc filed Critical Quanticel Pharmaceuticals Inc
Publication of CN116056707A publication Critical patent/CN116056707A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4166—1,3-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. phenytoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本申请一般涉及使用赖氨酸特异性脱甲基酶‑1(LSD‑1)抑制剂治疗前列腺癌的方法，其中赖氨酸特异性脱甲基酶‑1(LSD‑1)抑制剂使前列腺癌细胞对雄激素受体途径抑制剂(ARPI)治疗再敏感。

Description

治疗前列腺癌的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月5日提交的美国临时专利申请号No.63/035,622的优先权，其内容通过引用特别地并入本文。
领域
本申请一般涉及使用赖氨酸特异性脱甲基酶-1(LSD-1)抑制剂治疗前列腺癌的组合物和方法，其中赖氨酸特异性脱甲基酶-1(LSD-1)抑制剂使前列腺癌细胞对雄激素受体途径抑制剂(ARPI)治疗再敏感。
背景
前列腺癌是癌症相关死亡的第二主要原因，也是男性中最常诊断的癌症。前列腺癌肿瘤主要由前列腺腔上皮细胞组成。前列腺腔上皮细胞的分化部分地受雄激素受体(AR)驱动的前列腺特异性标志物的表达所控制。AR是类固醇受体，其作为转录因子起作用，通过尚不清楚的机制控制细胞存活。雄激素的消耗导致正常前列腺腔上皮细胞的死亡，这证明AR途径在其存活中的关键作用。癌性前列腺细胞持续表达AR，并且它们的存活也取决于雄激素的存在，这使得雄激素耗竭成为患有晚期前列腺癌患者的治疗选择。前列腺癌的一线治疗旨在通过使用雄激素耗竭疗法(ADT)来降低循环雄激素水平。尽管ADT最初在减少前列腺癌生长方面是有效的，但在2至3年的治疗后，大部分患者进展为去势抗性(castration-resistant)前列腺癌(CRPC)，并且即使在去势水平的雄激素存在下，肿瘤生长也将继续进行。在疾病进展的这一点上，治疗选择的数量变得非常有限。
几乎所有类型的前列腺癌均为腺癌。这些癌症由前列腺细胞发育而来，前列腺细胞是制造添加到精液中的前列腺液的细胞。存在起源于前列腺的其他类型的癌症，并且一些由其起源的组织定义，而另一些由其对疗法的抗性定义。
尽管使用雄激素耗竭疗法(ADT)，但去势抗性前列腺癌(CRPC)通过疾病进展来定义，并且可以表现为血清前列腺特异性抗原水平的持续升高、预先存在的疾病的进展和/或新转移灶的出现。有效的激素疗法如阿比特龙(abiraterone)和恩杂鲁胺(enzalutamide)可以是患有去势抗性前列腺癌(CRPC)的男性的有效治疗方法。然而，几乎所有男性最终对这些药剂均产生抗性。
神经内分泌细胞是前列腺中的上皮细胞群之一。神经内分泌性前列腺癌(NEC)被视为前列腺上皮性肿瘤的一种特殊的神经内分泌分化类型。神经内分泌前列腺癌的定义仍在出现，并且包括多种亚型。
因此，仍然需要更有效的前列腺癌治疗方法，而本公开满足了这种需求。
概述
本申请一般涉及治疗前列腺癌的组合物和方法。所述方法包括施用赖氨酸特异性脱甲基酶-1(LSD-1)抑制剂或其药学上可接受的盐，其中赖氨酸特异性脱甲基酶-1(LSD-1)抑制剂使前列腺癌细胞对雄激素受体途径抑制剂(ARPI)治疗重新敏感。在一些实施方案中，这些方法包括施用LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐与雄激素受体途径抑制剂(ARPI)或其药学上可接受的盐。
本公开的各个方面和实施方案提供了用于治疗患有前列腺癌的受试者的方法和药物组合物，所述前列腺癌例如去势抗性前列腺癌(CPRC)、神经内分泌前列腺癌(NEPC)、抗雄激素药抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿比特龙抗性前列腺癌、ARPI诱导的药物抗性前列腺癌。在一些实施方案中，前列腺癌是转移性前列腺癌。至少一个实施方案提供了治疗前列腺癌的方法，其中施用ARPI通过使前列腺癌细胞对ARPI再敏感来增强治疗效果。
在一个方面提供了对有需要的受试者治疗转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法，包括向所述受试者施用LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，所述化合物具有如下结构：
Figure BDA0004113422080000021
在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，通过下列方式施用LSD-1抑制剂：(a)通过口服；和/或(b)以约600mg的剂量；和/或(c)每周1次；和/或(d)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天。
在一些实施方案中，受试者在先的ARPI疗法已经失败。在一些实施方案中，在先ARPI疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用ARPI和皮质类固醇如泼尼松与LSD-1抑制剂的组合的步骤。在一些实施方案中，受试者在先的ARPI疗法已经失败，且所述ARPI与在先的ARPI不同或相同。在一些实施方案中，在先ARPI疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，ARPI为阿比特龙。在一些实施方案中，通过下列方式施用阿比特龙：(a)通过口服；和/或(b)以约1000mg的剂量；和/或(c)每日1次；和/或(d)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在一些实施方案中，皮质类固醇为泼尼松。在一些实施方案中，通过下列方式施用泼尼松：(a)通过口服；和/或(b)以约5mg的剂量；和/或(c)每12小时一次；和/或(d)每日2次；和/或(e)以约10mg/天的总剂量；和/或(f)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在一个方面提供了对有需要的受试者治疗mCRPC的方法，包括向所述受试者施用LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，所述化合物具有如下结构：
Figure BDA0004113422080000031
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换所致的去势抗性。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用ARPI和皮质类固醇如泼尼松与LSD-1抑制剂的组合的步骤。在一些实施方案中，受试者在先的ARPI疗法已经失败，且所述ARPI与在先的ARPI不同或相同。在一些实施方案中，在先的ARPI疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，ARPI为阿比特龙。在一些实施方案中，通过下列方式施用阿比特龙：(a)通过口服；和/或(b)以约1000mg的剂量；和/或(c)每日1次；和/或(d)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在一些实施方案中，通过下列方式施用泼尼松：(a)通过口服；和/或(b)以约5mg的剂量；和/或(c)每12小时一次；和/或(d)每日2次；和/或(e)以约10mg/天的总剂量；(f)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在另一个方面，提供了治疗受试者中mCRPC的方法，所述受试者在先使用恩杂鲁胺的疗法已经失败，所述方法包括：第一步：在28-天周期中向所述受试者施用具有如下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure BDA0004113422080000041
(a)通过口服；和/或
(b)以约600mg的剂量；和/或
(c)每周1次；和/或
(d)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换所致的去势抗性，
此后，第二步：伴随施用LSD-1抑制剂、阿比特龙和泼尼松，其中在28-天周期中通过下列方式施用LSD-1抑制剂：
(e)通过口服；和/或
(f)以约60mg、40mg或20mg的剂量；和/或
(g)每周1次；和/或
(h)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中通过下列方式施用阿比特龙：
(i)通过口服；和/或
(j)以约1000mg的剂量；和/或
(k)每日1次；和/或
(l)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天，并且
其中通过下列方式施用泼尼松：
(m)通过口服；和/或
(n)以约5mg的剂量；和/或
(o)每12小时一次；和/或
(p)每日2次；和/或
(q)以约10mg/天的总剂量；
(r)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在一些实施方案中，与基线相比，肿瘤尺寸已经减小，或前列腺特异性抗原(PSA)水平已经降低。
此前的概述以及随后的附图简介和详细描述均为示例性和说明性的。它们旨在提供本发明的进一步细节，但不应被解释为限制性的。根据以下的发明详细描述，其他目的、优点和新颖性特征对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
图1A和1B显示用所示浓度的化合物A处理3天的PC3细胞。在第0天和第3天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图2A和2B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM在第0天和第3天处理总计6天的LNCaP-AR CRISPRi TP53/RB1细胞。在第0天和第6天测定增殖，并且使用CellTiterGlo发光测定法来测定生长百分比。
图3A和3B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM在第0天和第3天处理总计6天的TKO细胞。在第0天和第6天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图3C和3D显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM在第0天和第6天处理总计14天的TKO细胞。在第0天和第14天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图4A和4B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM在第0天和第6天处理总计14天的DKO细胞。在第0天和第14天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图5A和5B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺(10uM)处理总计8天的TKO和DKO细胞。Krt8基因表达通过qPCR测定。
图6A和6B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺处理总计3天的LNCaP-AR细胞。在第0天和第3天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图7A和7B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM处理3天的VCaP细胞。在第0天和第3天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图8A和8B显示用所示浓度的化合物A和恩杂鲁胺10uM处理6天的LNCaP细胞。在第0天和第6天测定增殖，并且使用CellTiter Glo发光测定法来测定生长百分比。
图9显示实施例2的总体研究设计。
详细描述
I.概述
本发明涉及治疗前列腺癌和/或相关症状的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用赖氨酸特异性脱甲基酶-1(LSD-1)抑制剂或其药学上可接受的盐，其中LSD-1抑制剂使前列腺癌细胞对雄激素受体途径抑制剂(ARPI)再敏感。在一些情况中，受试者在先的ARPI疗法已经失败。在一些实施方案中，该方法包括向有此需要的受试者施用LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐与ARPI或其药学上可接受的盐。
本公开认识到，在本文所述的实施方案中，所述方法通过使前列腺癌细胞对ARPI再敏感来增强ARPI的治疗效果，LSD-1抑制剂阻断和/或逆转前列腺癌细胞的谱系转化，和/或所述阻断或逆转导致延长ARPI的有效性，从而积极影响前列腺癌治疗。
如实施例1中所详述，LSD-1抑制剂如化合物A可以与至少一种ARPI组合使用以治疗前列腺癌细胞并在CRPC和NEPC细胞中延长临床有益的抗雄激素药疗法的持久性。实施例1中使用的模型ARPI为恩杂鲁胺(ENZA)。特别地，实施例1中的数据表明，LSD-1抑制剂化合物A可以使神经内分泌和/或去势抗性前列腺癌细胞对ARPI治疗再敏感。此外，发现LSD-1抑制剂化合物A增强前列腺癌细胞中的ARPI反应。
前列腺癌是美国男性中第二常见的恶性肿瘤。目前的护理标准由雄激素耗竭疗法(ADT)组成，但在快速缓解后，癌细胞最终获得抗性，并且去势抗性前列腺癌(CRPC)进展。CRPC用下一代ARPI治疗，包括但不限于恩杂鲁胺。在大多数情况下，在初始反应后，疾病复发为雄激素依赖性CRPC。在ARPI治疗后，一小组患者反而发展为雄激素受体(AR)非依赖性疾病，其特征在于神经内分泌(NE)表型。导致耐药性和NE表型发展的机制仍未完全了解，但近期研究启示，细胞可塑性和干细胞样性质的重新获得可能导致抗性。
使用各种细胞和动物模型来评价单独使用化合物A、单独使用ARPI和化合物A+ARPI的组合的抗癌治疗的有效性。所用的细胞系包括：(i)VCaP细胞，其表现出临床前列腺癌的特征，包括前列腺特异性抗原(PSA)和雄激素受体(AR)的表达；(ii)前列腺癌细胞PC3，其是广泛接受的NEPC细胞模型；(iii)耗尽肿瘤蛋白53(TP53)和视网膜母细胞瘤蛋白1(RBI)的LNCaP-AR细胞；(iv)DKO细胞(双重敲除)和TKO细胞(三重敲除)，其来自基因工程的、磷酸酶和张力蛋白同源物(Pten)、Rb1和Trp53耗尽的小鼠模型，其用于研究NEPC表型。
LSD-1抑制剂+ARPI显示对PC3细胞的显著抑制：前列腺癌细胞PC3是广泛接受的人NE前列腺癌(NEPC)细胞模型。为了测试LSD-1抑制剂是否可以影响NEPC的细胞生长，用化合物A和模型ARPI ENZA处理PC3细胞。如前所述，并且如图1A和1B中所示，这些细胞对ENZA具有抗性。此外，化合物A作为单一药剂不影响PC3细胞的细胞增殖。令人惊讶的是，用化合物A和恩杂鲁胺的共同处理导致PC3细胞的47％的生长抑制(图1A和1B)。
与LSD-1抑制剂共同治疗可以使NEPC对ARPI治疗再敏感：比较前列腺腺癌与NEPC的全面下一代测序研究已经鉴定了关键的遗传改变。在40％的NEPC样品中发现原癌基因MYCN扩增，RB1在70-90％的病例中缺失，并且TP53在56-67％的病例中缺失。此外，在50％的NEPC肿瘤中一起发现RB1缺失和TP53突变或消失。近期研究报道，过表达AR的LNCaP细胞中TP53和RB1的耗尽促进谱系可塑性，从而增加基础和神经内分泌标志物的表达并减少管腔标志物的表达。此外，TP53和RB1的沉默足以赋予抗雄激素药敏感性LNCaP-AR前列腺细胞以抗性。
为了进一步证实LSD-1抑制剂使NEPC对ENZA再敏感的能力，将使用CRISPR干扰(CRISPRi)技术(LNCaP_AR向导p53/RBL)耗尽TP53和RBI的LNCaP_AR用化合物A和ENZA作为单一药剂和组合进行处理。结果显示，单独的化合物A或ENZA不影响这些细胞的增殖(图2A和2B)。然而，令人惊讶的是，用化合物A和ENZA共同处理显示细胞增殖减少27％(图2A和2B)。
基因表达谱已经显示，来源于耗尽磷酸酶和张力蛋白同源物Pten、Rb1和Trp53的小鼠的肿瘤，类似于人前列腺癌神经内分泌变体。耗尽Pten和Rb1(双重敲除_DKO小鼠)或耗尽Pten、Rb1和Trp53(三重敲除_TKO小鼠)的基因工程小鼠模型已用于研究NEPC。为了测试LSD1抑制剂是否可以影响这些小鼠来源的NEPC细胞的增殖，用化合物A作为单一药剂并与ENZA组合处理DKO和TKO细胞。单独的化合物A显示出对TKO和DKO细胞增殖的轻微影响(图3A、3B、4A和4B)。然而，当化合物A和模型ARPI ENZA组合时，观察到更大的增殖减少。具体地，在TKO细胞中，在处理后6天实现55％的细胞增殖减少，并且在处理14天后观察到65％(图3A、3B、3C和3D)。在DKO细胞中，用>3uM的化合物A实现了细胞生长停滞，并且更高浓度的化合物A诱导细胞死亡(图4A和4B)。
为了进一步证实LSD1抑制在将NE表型逆转为AR驱动的上皮状态的NEPC可塑性中具有作用，用化合物A单独和与ENZA组合处理DKO和TKO细胞。化合物A作为单一药剂诱导DKO细胞中管腔谱系标志物Krt8的表达，并且当与ENZA组合处理时，角蛋白8(Krt8)表达的诱导甚至更显著(分别为1.5倍和4.5倍)(图5A和5B)。此外，TKO细胞表达更高水平的神经内分泌标志物，并且已显示对ADT更具抗性。在TKO细胞中，作为单一试剂的化合物A即使在≥1μM的较低浓度下也能够诱导Krt8的表达(图5A和5B)。
这些结果表明，LSD-1抑制剂如化合物A能够通过改变谱系转化使NEPC对ARPI治疗再敏感。
LSD-1抑制剂化合物A使去势抗性前列腺癌细胞对ARPI治疗再敏感：目前CRPC的护理标准由ARPI治疗组成。AR的过表达先前已用作AR依赖性CRPC的模型。为了测试LSD-1抑制是否可以使已经获得对ARPI如ENZA的抗性的AR依赖性CRPC细胞再敏感，用化合物A和ENZA处理LNCaP_AR细胞。发现化合物A作为单一药剂对细胞增殖没有影响；然而，当与ENZA结合时，观察到细胞生长减少50％(图6A和6B)。
与在NEPC细胞中所述的相似，这些数据显示LSD-1抑制剂如化合物A可以使对ARPI如恩杂鲁胺具有抗性的CRPC细胞再敏感。
LSD-1抑制剂化合物A增强恩杂鲁胺在前列腺癌细胞中的反应：ARPI如恩杂鲁胺目前用作前列腺癌的标准治疗。为了测试LSD-1抑制是否可以增加对恩杂鲁胺疗法的敏感性，用化合物A单独和与恩杂鲁胺组合处理两种充分表征的前列腺癌细胞模型VCaP和LNCaP。结果显示，化合物A作为单一药剂不影响VCaP或LNCaP细胞的增殖(图7A、7B、8A和8B)。然而，发现与ARPI如ENZA共同处理增强了ENZA在两种细胞系中的作用，导致VCaP细胞中的细胞死亡，并导致LNCaP细胞中细胞增殖减少60％(图7A、7B、8A和8B)。
II.LSD-1抑制剂
在本文所述的实施方案中，LSD-1抑制剂为具有如下结构的化合物：
Figure BDA0004113422080000091
或其药学上可接受的盐。上述化合物的化学名为4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈，其具有C23H21F2N5O2的化学式，分子量为437.44，且CAS编号为1821307-10-1。4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈描述在美国专利申请号No.14/701,304(美国专利号No.9,255,097)中。
III.雄激素受体途径抑制剂(ARPI)
雄激素受体(AR)是类固醇和核受体超家族的成员。在该蛋白质大家族中，仅已知五种脊椎动物类固醇受体，包括雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、糖皮质激素受体和盐皮质激素受体。AR是作为细胞内转录因子起作用的可溶性蛋白。AR功能通过雄激素的结合来调节，其引发受体的顺序构象变化，其影响受体-蛋白质相互作用和受体-DNA相互作用。
ARPI的实例包括但不限于阿比特龙、奥特罗内尔(orteronel)、比卡鲁胺、尼鲁米特、氟他胺、羟基氟他胺、恩杂鲁胺(也称作MDV3100；CAS号:915087-33-1)、阿帕鲁他胺(apalutamide)、达罗拉他胺(darolatamide)、加来特龙(galeterone)、雷酚内酯(triptophenolide)、去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)(DHEA)、醋酸环丙孕酮、螺内酯(spironolactone)、RU58841、EPI-001、Andarine、ARN-509(CAS号956104-40-8)、RD162(CAS号.915087-27-3)及其任何药学上可接受的盐。
在本文所述的任一实施方案中，ARPI可以为恩杂鲁胺或其药学上可接受的盐。恩杂鲁胺的化学名为4-{3-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-5,5-二甲基-4-氧代-2-亚硫烷基咪唑烷-1-基}-2-氟-N-甲基苯甲酰胺。恩杂鲁胺的结构如下所示：
Figure BDA0004113422080000101
并且具有464.44的分子量和C21H16F4N4O2S的分子式。
在本文所述的任一实施方案中，ARPI可以为阿比特龙。在本文所述的任一实施方案中，ARPI可以为阿比特龙或其药学上可接受的盐，如醋酸盐。阿比特龙的化学名为(3β)-17-(吡啶-3-基)雄甾-5,16-二烯-3-醇。阿比特龙的结构如下所示：
Figure BDA0004113422080000102
醋酸阿比特龙具有391.55的分子量和C26H33NO2的分子式。
在一些实施方案中，将ARPI与皮质类固醇一起施用。适合的皮质类固醇的实例包括但不限于泼尼松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、氢化可的松和地塞米松。在一些实施方案中，皮质类固醇为泼尼松。
IV.治疗方法
本申请提供了使用LSD-1抑制剂与至少一种ARPI或其药学上可接受的盐的组合治疗前列腺癌的方法。在一些实施方案中，前列腺癌的治疗使用4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈进行，共同施用或依次施用至少一种ARPI或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，前列腺癌的治疗使用LSD-1抑制剂和ARPI恩杂鲁胺或其药学上可接受的盐进行。在一些实施方案中，前列腺癌的治疗使用4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈和恩杂鲁胺或其药学上可接受的盐进行。在一些实施方案中，前列腺癌的治疗使用LSD-1抑制剂和ARPI阿比特龙或其药学上可接受的盐进行。在一些实施方案中，前列腺癌的治疗使用4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈和阿比特龙或其药学上可接受的盐进行。在一些实施方案中，ARPI的治疗与皮质类固醇如泼尼松组合进行。
在本文所述的任一实施方案中，使用治疗有效量的LSD-1抑制剂和/或ARPI。在一些实施方案中，LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐增强ARPI的治疗有益性。在一些实施方案中，LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐阻断和/或逆转前列腺癌细胞的谱系转化。在一些实施方案中，这种阻断或逆转导致ARPI的有效性延长，由此积极地影响前列腺癌的治疗。在一些实施方案中，LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐以实质上诱导前列腺癌细胞的细胞周期阻滞的量使用。
在一些实施方案中，治疗方法包括两个阶段：第一阶段，其中首先在第一个28-天周中将LSD-1抑制剂作为单一疗法施用；和第二阶段，其中将LSD-1抑制剂与至少一种ARPI(与或不与皮质类固醇)在第二和随后的28-天周期中联用。如果当与至少一种ARPI联合施用时LSD-1抑制剂的剂量不耐受，则将LSD-1抑制剂的剂量调整至较低剂量(例如60mg-40mg或20mg/天)。例如，如果约60mg的LSD-1抑制剂剂量与ARPI如阿比特龙组合不耐受，则使LSD-1抑制剂的剂量降至约20mg或约40mg的剂量。
在一个方面提供了对有需要的受试者治疗mCRPC的方法，包括向所述受试者施用具有如下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure BDA0004113422080000111
在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，通过口服施用LSD-1抑制剂。在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，以约20mg-约60mg的剂量施用LSD-1抑制剂，包括约20mg、40mg和60mg。在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，以约60mg的剂量施用LSD-1抑制剂。在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，每周1次施用LSD-1抑制剂。在一些实施方案中，在第一个28-天周期中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天施用LSD-1抑制剂。
在一些实施方案中，受试者在先的雄激素受体途径抑制剂疗法已经失败。如本文所用，对在先的雄激素受体途径抑制剂疗法失败可以定义为与基线相比肿瘤进展(尺寸增加)、无肿瘤尺寸减小和/或前列腺特异性抗原(PSA)进展。肿瘤进展可以通过实体瘤反应评估标准(RECIST)版本1.1的软组织疾病的放射学进展或在骨扫描上有或没有PSA进展情况下有2个或更多个记录的新骨病变的骨转移来评估。PSA进展定义为最少为3的升高PSA水平，在每次测定之间以≥1周的间隔。如果PSA是进展的唯一指征，则筛选时的PSA值必须≥1μg/L(1ng/mL)；接受全身性糖皮质激素以控制症状的受试者必须具有根据前列腺癌临床试验工作组(PCWG3)标准记录的PSA进展(Scher等人,J Clin Oncol.,34:1402-1418(2016))，同时在开始使用LSD-1抑制剂的单一疗法治疗之前使用全身糖皮质激素。在一些实施方案中，PSA进展定义为PSA的增加大于约25％且高于最低点>约2ng/ml，通过在相隔至少3周的2个时间点的进展证实。
在一些实施方案中，在先ARPI疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，所述方法还包括与LSD-1抑制剂组合施用雄激素受体途径抑制剂和糖皮质激素如泼尼松的步骤。在一些实施方案中，受试者在先的雄激素受体途径抑制剂疗法已经失败，且雄激素受体途径抑制剂与在先的雄激素受体途径抑制剂不同或相同。在一些实施方案中，在先的雄激素受体途径抑制剂疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，雄激素受体途径抑制剂为阿比特龙。在一些实施方案中，阿比特龙通过口服施用。在一些实施方案中，通过下列方式施用阿比特龙：以约250至约2000mg或约250至约1000mg的剂量，包括约250mg、约500mg、约750mg、约1000mg、约1250mg、约1500mg、约1750mg、约2000mg。在一些实施方案中，以约1000mg的剂量施用阿比特龙。在一些实施方案中，每日1次或2次施用阿比特龙。在一些实施方案中，每日1次施用阿比特龙。在一些实施方案中，以约1000mg的剂量、每日1次施用阿比特龙。在一些实施方案中，在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天施用阿比特龙。
在一些实施方案中，皮质类固醇为泼尼松。在一些实施方案中，泼尼松通过口服施用。在一些实施方案中，泼尼松以约2.5mg、约5mg或约10mg的剂量施用。在一些实施方案中，泼尼松以约5mg的剂量施用。在一些实施方案中，每12小时施用1次泼尼松。在一些实施方案中，泼尼松以每12小时约5mg的剂量施用。在一些实施方案中，每日1次或2次施用泼尼松。在一些实施方案中，每日2次施用泼尼松。在一些实施方案中，以约2.5mg、约5mg或约10mg/天的总剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，以约10mg/天的总剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天施用泼尼松。
在一个方面提供了对有需要的受试者治疗转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法，包括向所述受试者施用具有如下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure BDA0004113422080000131
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换引起的去势抗性。
评估由于谱系转换引起的去势抗性的逆转可以通过实施例2中描述的以下任一种或其任何组合来确定：(i)18-氟-脱氧葡萄糖(FDG/FDHT)摄取的成像数据；(ii)关于活检、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)、神经内分泌肽PD(NEPD)和前列腺特异性抗原(PSA)的生物标志物数据；和(iii)临床反应。参见Berger,Nat Rev Clin Oncol.,15(6):353-365(2018)。
由于谱系转换引起的去势抗性的逆转可以定义为如下的一种或多种：(a)如实施例2中所述，从基线FDHT-PET增加至少30％；和/或(b)循环肿瘤细胞(CTC)的约10％至约90％的变化；和/或(c)循环肿瘤DNA(ctDNA)分析中约10％至约90％的变化；和/或(d)血清神经内分泌肽PD(NEPD)标志物的约10％至约90％的变化，其包括但不限于Pro-GRP、CgA、SYP和NSE；和/或(e)如通过评估雄激素受体DNA和RNA标志物所确定的，来自肿瘤活组织检查的雄激素受体水平的约10％至约90％的变化。
在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转定义为从基线FDHT-PET增加至少10％、增加至少15％、增加至少20％、增加至少25％，如实施例2中所述。在一些实施方案中，如实施例2中所述，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转定义为从基线FDHT-PET增加至少30％。使用FDHT-PET成像的示例性方案描述在Kelloff,Clin Cancer Res.2005年4月15日；11(8):2785-808和Wahl,J.Nucl.Med.,2009年5月；50增刊1:122S-50S中。
在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转被定义为循环肿瘤细胞(CTC)约10％至约90％的变化。在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转由循环肿瘤细胞(CTC)的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的变化定义。使用循环肿瘤细胞的示例性方案描述在Krebs,Ther Adv MedOncol.2010；2(6):351-365中。
在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转通过循环肿瘤DNA(ctDNA)分析的约10％至约90％的变化来定义。在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转由循环肿瘤DNA(ctDNA)分析的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的变化定义。用于使用循环肿瘤DNA分析的示例性方案描述在Donaldson,Annu Rev Med.2018年1月29日；69:223-234中。
在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转通过血清神经内分泌肽PD(NEPD)标记物的约10％至约90％的变化来定义。在一些实施方案中，由于谱系转换引起的去势抗性的逆转定义为血清神经内分泌肽PD(NEPD)标志物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的变化。示例性NEPD标志物包括但不限于Pro-GRP、CgA、SYP和NSE。
在一些实施方案中，由谱系转换引起的去势抗性的逆转定义为通过评估雄激素受体DNA和RNA标志物确定的、来自肿瘤活组织检查的雄激素受体水平的约10％至约90％的变化。在一些实施方案中，由谱系转换引起的去势抗性的逆转定义为如通过评估雄激素受体DNA和RNA标志物所确定的、来自肿瘤活检的雄激素受体水平的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的变化。
在一些实施方案中，所述方法还包括与LSD-1抑制剂联合施用ARPI和皮质类固醇如泼尼松的步骤。在一些实施方案中，受试者在先ARPI疗法已经失败，并且ARPI与在先ARPI不同或相同。在一些实施方案中，先前ARPI疗法为恩杂鲁胺。
在一些实施方案中，ARPI为阿比特龙。在一些实施方案中，阿比特龙通过口服施用。在一些实施方案中，以约250至约2000mg或约250至约1000mg的剂量施用阿比特龙，包括约250mg、约500mg、约750mg、约1000mg、约1250mg、约1500mg、约1750mg、约2000mg。在一些实施方案中，以约1000mg的剂量施用阿比特龙。在一些实施方案中，每天1次或2次施用阿比特龙。在一些实施方案中，每天1次施用阿比特龙。在一些实施方案中，以约1000mg的剂量每天1次施用阿比特龙。在一些实施方案中，在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天施用阿比特龙。
在一些实施方案中，泼尼松通过口服施用。在一些实施方案中，以约2.5mg、约5mg、约10mg的剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，以约5mg的剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，每12小时施用1次泼尼松。在一些实施方案中，以约5mg的剂量、每12小时1次施用泼尼松。在一些实施方案中，每天1次或2次施用泼尼松。在一些实施方案中，每天2次施用泼尼松。在一些实施方案中，以约2.5mg、约5mg或约10mg/天的总剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，以约10mg/天的总剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天施用泼尼松。
在另一个方面提供了治疗受试者的转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法，所述受试者在先使用恩杂鲁胺的疗法已经失败，所述方法包括：
第一步：在28-天周期中向受试者施用具有如下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐：
Figure BDA0004113422080000161
(a)通过口服；和/或
(b)以约600mg的剂量；和/或
(c)每周1次；和/或
(d)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换引起的去势抗性，此后，
第二步伴随施用LSD-1抑制剂阿比特龙和泼尼松，其中在28-天周期中施用LSD-1抑制剂：
(e)通过口服；和/或
(f)以约60mg、约40mg或约20mg的剂量；和/或
(g)每周1次；和/或
(h)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中通过下列方式施用阿比特龙：
(i)通过口服；和/或
(j)以约1000mg的剂量；和/或
(k)每日1次；和/或
(l)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天，并且
其中通过下列方式施用泼尼松：
(m)通过口服；和/或
(n)以约5mg的剂量；和/或
(o)每12小时一次；和/或
(p)每日2次；和/或
(q)以约10mg/天的总剂量；
(r)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
在一些实施方案中，对在先ARPI疗法失败，定义为如本文所述与基线相比肿瘤进展(尺寸增加)、无肿瘤尺寸减小和/或PSA进展。
在一些实施方案中，与基线相比，本文所述的治疗方法减小了肿瘤尺寸和/或降低了前列腺特异性抗原(PSA)水平。
在本文所述方法的一个方面，所述方法导致实质上诱导前列腺癌细胞的细胞周期阻滞，其中“实质上”定义为前列腺癌细胞至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的细胞周期阻滞。前列腺癌细胞的细胞周期阻滞百分比可以使用任何临床上可接受的技术测定。
在另一个方面，所述方法导致完全诱导前列腺癌的细胞周期阻滞。前列腺癌细胞的细胞周期阻滞可以使用任何临床上可接受的技术测定。
最终，在本文所述方法的另一个方面，所述方法导致诱导雄激素非依赖性癌细胞的细胞凋亡。例如所述方法可以导致诱导约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约35％或以上、约40％或以上、约45％或以上、约50％或以上、约55％或以上、约60％或以上、约65％或以上、约70％或以上、约75％或以上、约80％或以上、约85％或以上、约90％或以上、约95％或以上或约100％的雄激素非依赖性癌细胞的细胞凋亡。雄激素非依赖性癌细胞的细胞凋亡可以使用任何临床上可接受的技术测定。
在一个方面提供了治疗有需要的受试者的前列腺癌的方法，包扩向受试者施用包含LSD-1抑制剂、ARPI或其药学上可接受的盐的组合物。
在本文所述的任一实施方案中，前列腺癌为CPRC、神经内分泌前列腺癌(NEPC)、抗雄激素药抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿比特龙抗性前列腺癌、ARPI诱导的药物抗性前列腺癌、转移性前列腺癌或其任意组合。
在本文所述的任一实施方案中，所述方法导致(a)癌细胞增殖减少至少约40％；(b)癌细胞增殖减少约40％至约99％；和/或(c)癌细胞增殖减少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，所述方法导致癌细胞增殖减少至少约40％。在一些实施方案中，所述方法导致癌细胞增殖减少约40％至约99％。在一些实施方案中，所述方法导致癌细胞增殖减少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在本文所述的任一实施方案中，所述方法导致(a)肿瘤尺寸减小至少约40％；(b)肿瘤尺寸减小约40％至约99％；和/或(c)肿瘤尺寸减小约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，所述方法导致肿瘤尺寸减小至少约40％。在一些实施方案中，所述方法导致肿瘤尺寸减小约40％至约99％。在一些实施方案中，所述方法导致肿瘤尺寸减小约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在本文所述的任一实施方案中，与作为单一药剂施用ARPI或LSD-1抑制剂相比，所述方法提供了癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的更大降低。在一些实施方案中，与作为单一药剂施用ARPI或LSD-1抑制剂相比，所述方法提供癌细胞增殖的更大降低。在一些实施方案中，与作为单一药剂施用ARPI或LSD-1抑制剂相比，所述方法提供肿瘤尺寸的更大减小。
在本文所述的任一实施方案中，癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的减少可以比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂观察到的高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少95％或至少约100％。
在本文所述的任一实施方案中，癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的减少可以比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时所观察到的高约5％至约100％。在本文所述的任一实施方案中，癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时观察到的高约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
在一些实施方案中，癌细胞增殖的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂所观察到的高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
在一些实施方案中，癌细胞增殖的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时所观察到的高约5％至约100％。在本文所述的任何实施方案中，癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时观察到的高约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
在一些实施方案中，肿瘤尺寸的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时观察到的高至少约5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
在一些实施方案中，肿瘤尺寸的减小比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时所观察到的高约5％至约100％。在本文所述的任一实施方案中，癌细胞增殖和/或肿瘤尺寸的减少比施用ARPI或LSD-1抑制剂或其药学上可接受的盐作为单一药剂时观察到的高约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。V.实体瘤中反应评价标准(RECIST)指南
如本文所述，实体瘤反应评价标准(RECIST)可用于测量癌症患者对治疗的反应。以下信息从Eisenhauer,2009,New Response Evaluation Criteria in Solid Tumors:Revised RECIST Guideline(版本1.1)(Eur J Cancer.2009年1月；45(2):228-47.)中提取/概括。
在筛选时，将肿瘤病灶/淋巴结分类为可测量的或不可测量的。
可测量的疾病:可以在至少一个维度(记录测量平面中的最长直径)上精确测量肿瘤病变，其中最小尺寸为：
●10mm，CT扫描(CT扫描切片厚度不大于5mm)
●通过临床检查10mm测量卡尺(不能用卡尺精确测量的病变应记录为不可测量)
●胸部X-射线20mm
恶性淋巴结：为了被认为是病理性扩大和可测量的，当通过CT扫描评估时，淋巴结的短轴必须≥15mm(CT扫描切片厚度推荐不大于5mm)。在基线和随访中，仅测量和跟踪短轴。
不可测量的疾病：所有其他病变、包括小病变(最长直径<10mm或短轴≥10至<15mm的病理性淋巴结)以及真正不可测量的病变。认为真正不可测量的病变包括软脑膜疾病、腹水、胸膜或心包积液、炎性乳腺疾病、皮肤或肺的淋巴管受累、腹部肿块/腹部器官巨大症通过体检发现，其不可通过可重复的成像技术测量。
肿瘤反应评价：目标病变：当在基线时存在多于一个可测量的肿瘤病变时，则代表所有涉及器官的最多总共5个病变(并且每个器官最多2个病变)的所有病变可以被鉴定为目标病变，并且可以在基线时记录和测量。应当基于它们的大小(具有最长直径的病变)来选择目标病变，其代表所有涉及的器官，但是另外应当是使其自身适于可再现的重复测量的那些目标病变。注意，病理结节必须满足通过CT扫描短轴≥15mm的可测量标准，并且仅这些结节的短轴将贡献于基线总和。所有其他病理结节(短轴≥10mm但<15mm的那些)被认为是非目标病变。短轴<10mm的结节被认为是非病理性的，并且不被记录或跟踪。在基线时，可以记录目标病变的总和(肿瘤病变的最长直径加上淋巴结的短轴：总体最大值为5)。
筛查后，在eCRF上为每次评估的所有鉴定的目标病变提供一个值，即使非常小。如果极小且微弱的病变不能被准确地测量但被认为存在，则可以使用5mm的默认值。如果病变过小而不能测量并且实际上被认为不存在，则可以使用0mm的默认值。
非目标病变：所有不可测量的病变(或疾病部位)加上超出作为目标病变列出的那些的任何可测量的病变被认为是非目标病变。不需要测量，但这些病变可以在筛查时记录，并且应随访为“存在”、“不存在”或“明确进展”。
反应标准：可以分别评估目标和非目标病变的反应，然后可以将肿瘤负荷作为整体评估为总体反应。
目标病变反应：如下评估目标病变：
●完全反应(CR)：所有目标病变消失。任何病理性淋巴结(无论是目标还是非目标)的短轴必须减小至<10mm。
·部分反应(PR)：以基线直径总和作为参考，目标病变的直径总和减少至少30％。·进行性疾病(PD)：以研究中的最小总和(如果筛查总和是研究中最小的，则这包括筛查总和)作为参考，目标病变直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加之外，总和还必须表现出至少5mm的绝对增加。(注意：一个或多个新病变的出现也被认为是进展)。
·稳定的疾病(SD)：以研究时的最小直径总和作为参考，既没有足够的收缩以符合PR，也没有足够的增加以符合PD。
非目标病变反应：非目标病变将如下评估：
·完全反应(CR)：所有非目标病变的消失和肿瘤标志物水平的正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(短轴<10mm)。
·非CR/非PD：一个或多个非目标病变的持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常限度以上。
·进行性疾病(PD)：现有非目标病变的明确进展(参见下面的评论)。(注意：一个或多个新病变的出现也被认为是进展)
当受试者还患有可测量的疾病时：在这种情况下，为了在非目标疾病的基础上实现“明确的进展”，非目标疾病必须具有显著恶化的总体水平，使得即使在目标疾病中存在SD或PR的情况下，总体肿瘤负荷也增加到足以值得停止治疗。一个或多个非目标病变的大小的适度“增加”通常不足以定性明确的进展状态。因此，在面对目标疾病的SD或PR时，仅基于非目标疾病的变化来指定总体进展将是极其罕见的。
当受试者仅具有不可测量的疾病时：这种情况出现在一些3期试验中，此时具有可测量疾病不是进入研究的标准。如上所述，相同的一般概念适用于此；然而，在这种情况下，没有可测量的疾病评估来考虑对不可测量疾病负担增加的解释。因为非目标疾病的恶化不能容易地量化(根据定义：如果所有病变都是真正不可测量的)，当评估受试者的明确进展时可以应用的有用测试是，考虑基于不可测量疾病的变化的总体疾病负荷的增加是否在幅度上与对于可测量疾病声明PD所需的增加相当：即肿瘤负荷的增加表示“体积”的另外73％增加(其相当于可测量病变中直径的20％增加)。实例包括胸腔积液从“痕量”增加到“大量”，淋巴管疾病从局部增加到广泛，或在方案中可描述为“足以需要改变治疗”。如果看到“明确进展”，则应认为受试者在该点具有总体PD。虽然理想的是具有客观标准以应用于不可测量的疾病，但是该疾病的本质使得不可能这样做：因此，增加必须是实质性的。
总体反应：对于具有目标病变的受试者，应根据表A评估总体反应，对于仅具有非目标病变的受试者，应根据表B评估总体反应。
Figure BDA0004113422080000221
CR＝完全反应,PR＝部分反应,SD＝稳定的疾病,PD＝进行性疾病,NE＝不可评估
Figure BDA0004113422080000222
CR＝完全反应,PR＝部分反应,SD＝稳定的疾病,PD＝进行性疾病,NE＝不可评估.
a对于非-目标疾病，“非-CR/非-PD”优于“稳定的疾病”，因为在一些试验中，SD越来越多地用作疗效评估的终点，因此不建议在无法测量病变的情况下将其归于该类。
症状恶化：需要停止治疗而此时没有疾病进展的客观证据的、健康状况全面恶化的受试者应报告为“症状恶化”。症状恶化不是客观反应的描述符：它是停止研究疗法的原因。这类受试者的客观反应状态将通过评估目标和非目标疾病来确定。
VI.定义
提供以下定义以便于理解本说明书中使用的某些术语。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法可用于实施本文所述的方法。
如在发明的说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”可互换使用，并且旨在也包括复数形式，并且落入每个含义内，上下文另有明确说明的除外。此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖所列项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方案(“或”)解释时缺乏组合。
如本文所用，“约”为本领域普通技术人员所理解，并且根据其使用的上下文而在某种程度上变化。如果考虑到使用该术语的上下文，本领域普通技术人员不清楚该术语的使用，则“约”将意指特定术语的至多加或减10％。
本文所用的术语“施用”包括开据处方施用以及实际施用，并且包括由所治疗的受试者或他人通过物理方式施用。
如本文所用，术语“AR抑制剂”、“AR途径抑制剂”(ARPI)或“AR拮抗剂”在本文中可互换使用，并且是指抑制或降低雄激素受体(AR)的至少一种活性的药剂。示例性AR活性包括但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核易位。
如本文所用，“受试者”、“患者”或“个体”是指任何受试者、患者或个体，并且这些术语在本文中可互换使用。在这方面，术语“受试者”、“患者”和“个体”包括哺乳动物，特别是人。当与“有需要”结合使用时，术语“受试者”、“患者”或“个体”意指具有特定症状或病症或处于特定症状或病症风险中的任何受试者、患者或个体。
如本文所用，在“剂量”或“量”的上下文中，短语“治疗有效的”或“有效的”是指提供所施用的一种或多种化合物的特定药理学作用的剂量或量。必须强调，治疗有效量在给定受试者中实现预期效果方面并不总是有效的，不过，这样的剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。仅为方便起见，本文提供了示例性剂量。本领域技术人员可以根据本文公开的方法调节这样的量以治疗患有特定症状或病症的特定受试者。治疗有效量可以基于施用途径和剂型的不同而改变。
术语“治疗”或其任何变化形式包括减轻、改善或消除(i)一种或多种特定症状和/或(ii)特定疾病的一种或多种症状或作用。术语“预防(prevention)”、“预防(preventing)”或其任何变化形式包括降低、改善或消除发生(i)一种或多种特定症状和/或(ii)特定病症的一种或多种症状或影响的风险。
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。本文所述的被取代的杂环衍生物化合物中的任一种的药学上可接受的盐旨在涵盖任何和所有药学上合适的盐形式。本文所述化合物的优选药学上可接受的盐是药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐包括苯磺酸盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，其在生物学上或其他方面不是不合乎需要的，并且其与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等形成。还包括与有机酸形成的盐，所述有机酸例如脂族一元羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等，并且包括例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。因此，示例性的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐(besylates或besilates)、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还关注氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐和半乳糖醛酸盐(参见例如Berge S.M.等人Pharmaceutical Salts,J.Pharma.Sci.66:1-19(1997))。在一些实施方案中，碱性化合物的酸加成盐通过根据本领域技术人员熟悉的方法和技术使游离碱与足量的期望的酸接触形成盐来制备。
“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，其在生物学上或其它方面不是不合乎需要的。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐与金属或胺如碱金属和碱土金属或有机胺形成。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂的盐，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、乙二苯胺(ethylenedianiline)、N-甲基葡糖胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。
实施例
如下列实施例中使用的，化合物A是指4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈，包括苯磺酸盐。
以下列表显示了在以下实施例中使用的缩写。
ADT     雄激素耗竭疗法
CRPC    去势抗性前列腺癌
ARPI    雄激素受体途径抑制剂
AR      雄激素受体
NE      神经内分泌
NEPC    神经内分泌前列腺癌
ENZA    恩杂鲁胺
RB1     视网膜母细胞瘤1
TP53    肿瘤蛋白53
CRISPRi CRISPR干扰
Pten    磷酸酶和张力蛋白同源物
DKO     双重敲除
TKO     三重敲除
LSD1    赖氨酸-特异性组蛋白脱甲基酶1
Krt8    角蛋白8
实施例1
本实施例的目的在于评价包含ARPI和LSD-1抑制剂化合物的组合的治疗前列腺癌的方法的有效性。
本文所述的实验证明，化合物A如何使神经内分泌和/或去势抗性前列腺癌细胞对ARPI如恩杂鲁胺的治疗再敏感。此外，评价了化合物A以观察其是否可以增强前列腺癌细胞中的ARPI反应。
材料和方法
细胞培养：获得VCaP、LNCaP和PC3癌细胞系。在补充有8％ FBS的DMEM培养基中培养VCaP细胞，在补充有10％ FBS的RPMI1640培养基中培养LNCaP细胞，并且在补充有10％FBS的F12K培养基中培养PC3细胞。LNCaP_AR和LNCaP_AR CRISPRi gTP53/RB1细胞得自Charles L.Sawyers实验室，并在补充有10％ FBS+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+10mMHepes的RPMI1640中培养。DKO和TKO细胞得自David W.Goodrich实验室，并在补充有2.5％活性炭处理的FBS+5μg/ml胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS)+10μg/ml牛垂体提取物(BPE)+10μg/ml表皮生长因子+1μg/ml霍乱毒素的DMEM培养基中培养。DKO细胞衍生自完整小鼠，因此也在1nM R1881的存在下培养。
增殖测定：将细胞接种在384-孔板中，并在处理前使其粘附24小时。将药物以1:3从10μM滴定至0.1M，其中9个剂量一式三份。根据制造商的说明书，使用Cell Titer-Glo试剂(Promega)，在处理当天(第0天)和第3天或第6天或第14天测量细胞增殖。使用GraphPadPrism 7.03(GraphPad Software,Inc.)、通过非线性回归拟合针对DMSO媒介物对照和第0天校准的细胞生长。
基因表达分析：使用RNeasy试剂盒(Qiagen)、根据制造商的说明书从细胞中纯化RNA。在ABI QuantStudio 7Flex实时PCR系统上使用TaqMan测定(Thermo FisherScientific)进行定量RTPCR。
结果
PC3、VcaP、LNCaP-AR细胞系研究PC3细胞模型：前列腺癌细胞PC3是广泛接受的人NE前列腺癌(NEPC)细胞模型。为了测试LSD-1抑制剂是否影响NEPC的细胞生长，用化合物A和恩杂鲁胺(ENZA)处理PC3细胞。化合物A作为单一药剂不影响PC3细胞的细胞增殖。令人惊讶的是，发现用化合物A和恩杂鲁胺的共同处理导致PC3细胞的47％的生长抑制(图1A和1B)。
AR的过表达先前已被用作AR依赖性CRPC的模型。为了测试LSD-1抑制是否再敏感已对恩杂鲁胺获得抗性的AR依赖性CRPC细胞，发现首先用单独的化合物A处理的LNCaP-AR细胞对细胞增殖没有影响；然而，当细胞暴露于化合物A后加入恩杂鲁胺时，观察到细胞生长减少50％(图6A和6B)。
通常用作前列腺癌细胞模型的充分表征的人细胞系VCaP和LNCaP用单独的化合物A和其与恩杂鲁胺的组合处理。发现化合物A作为单一药剂对VCaP或LNCaP细胞的增殖没有影响(图7A、7B、8A和8B)。然而，发现用化合物A和恩杂鲁胺的组合处理增强了恩杂鲁胺在两种细胞系中的作用，导致VCaP中的细胞死亡，并导致LNCaP细胞中的增殖减少60％(图7A、7B、8A和8B)。
肿瘤可塑性：TP53和RB1耗竭的LNCaP-AR细胞模型：靶向雄激素受体(AR)的药物最初是有效的，但大多数肿瘤最终变得具有抗性。特别地，前列腺癌细胞通过谱系身份的变化逃避ADT的作用。比较前列腺腺癌与NEPC的全面下一代测序研究已经鉴定了ADT抗性肿瘤中的关键遗传改变。在40％的NEPC样品中发现原癌基因MYCN扩增，视网膜母细胞瘤1(RB1)在70-90％的病例中丢失，并且肿瘤蛋白53(TP53)在56-67％的病例中丢失。此外，在50％的NEPC肿瘤中一起发现RB1丢失和TP53突变或缺失。肿瘤抑制因子TP53和RB1的功能丧失促进AR依赖性管腔上皮细胞向AR非依赖性基底样细胞的转变。这种谱系可塑性是通过TP53和RB1功能的丧失而实现的。因此，耗尽TP53和RB1的LNCaP-AR细胞系充当ADT抗性肿瘤细胞类型的额外模型。
为了进一步证实LSD-1抑制剂使NEPC对恩杂鲁胺再敏感的能力，用化合物A和恩杂鲁胺作为单一药试剂以及其组合处理使用CRISPR干扰(CRISPRi)技术耗尽TP53和RBI的LNCaP AR细胞(LNCaP_AR导向TP53/RB1)。结果显示，单独的化合物A和单独的恩杂鲁胺不影响TP53/RB1耗尽的LNCaPAR细胞的增殖(图2A和2B)。然而，令人惊讶地发现，用化合物A和恩杂鲁胺的共同处理显示TP53和RB1耗尽的LNCaPar细胞的增殖速率降低27％。(图2A和2B)。
小鼠模型:基因表达谱显示，来源于磷酸酶和张力蛋白同源物(Pten)、Rb和Trp53耗尽的小鼠的肿瘤类似于人前列腺癌神经内分泌变体。耗尽Pten和Rb1(双重敲除_DKO小鼠)或耗尽Pten、Rb1和Trp53(三重敲除_DKO小鼠)的基因工程小鼠模型已用于研究NEPC。为了测试赖氨酸-特异性组蛋白脱甲基酶1(LSD-1)抑制剂是否影响这些小鼠来源的NEPC细胞的增殖，用化合物A作为单一药剂并与恩杂鲁胺组合处理DKO和TKO细胞。单独的化合物A对TKO和DKO细胞增殖均显示出适度的影响(图3A、3B、4A和4B)。然而，当合并化合物A和恩杂鲁胺时，观察到更大的增殖作用。在TKO中，在处理后6天实现55％的细胞增殖减少，并且在处理14天后观察到65％(图3A、3B、3C和3D)。在DKO中，用>3uM的化合物A实现完全(100％)细胞生长停滞，并且更高浓度的化合物A诱导细胞死亡(图4A和4B)。
为了进一步证实LSD-1抑制可以在将NE表型逆转为AR驱动的上皮状态的NEPC可塑性中起作用，用单独的化合物A和与恩杂鲁胺组合的化合物A处理DKO和TKO细胞，并测量管腔谱系标志物KRT8的表达。化合物A作为单一药剂诱导DKO细胞中管腔谱系标志物Krt8的表达，并且当化合物A与恩杂鲁胺组合时，角蛋白8(Krt8)表达的诱导甚至更显著(分别为1.5倍和4.5倍)(图5A和5B)。此外，TKO细胞表达更高水平的神经内分泌标志物，并且已显示对ADT更具抗性。在TKO细胞中，作为单一药剂的化合物A即使在≥1μM的较低浓度下也能够诱导Krt8的表达(图5A和5B)。
实施例2
作为下列实施例中使用的，化合物A是指4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢-嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈，包括苯磺酸盐。
研究目标：主要目标为确定化合物A是否逆转患有转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)受试者中由于谱系转换引起的去势抗性生物学，所述受试者对作为最后在先疗法的恩杂鲁胺已经失败，然后进行化合物A与阿比特龙和泼尼松组合的剂量发现研究。
次要目标为：(1)评估化合物A作为单一药剂在mCRPC中的安全性和耐受性；(2)评估化合物A与阿比特龙和泼尼松组合的安全性和耐受性，并确定化合物A与阿比特龙和泼尼松组合的推荐2期剂量(RP2D)；(3)评估化合物A联合阿比特龙和泼尼松的初步抗肿瘤活性；和(4)评估治疗期间的前列腺特异性抗原(PSA)动力学。
探索性目标为：(1)表征化合物A与阿比特龙和泼尼松组合给予时的药代动力学(PK)特性；(2)评估化合物A对外周血和肿瘤样品(如果有的话)中的基因表达的药效学(PD)作用；(3)评估化合物A对血液中分泌的神经肽(如Pro-GRP、CgA、Syp和NSE)的PD作用；(4)探索化合物A剂量、血浆暴露和所选临床终点(例如毒性、初步活性和/或生物标志物的测量)之间的关系；和(5)探索筛查、治疗中和/或肿瘤样品中基因表达的变化(如果可用)、血液中分泌的神经肽水平、循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)分析、18-氟-脱氧葡萄糖(FDG/FDHT)摄取的变化与临床反应之间的相关性。
研究终点如下表1中所示。
Figure BDA0004113422080000291
AE＝不良反应；AR＝雄激素受体；CTC＝循环肿瘤细胞；CTCAE＝不良反应常用技术标准；DLT＝剂量限制毒性；FDG/FDHT＝18-氟-脱氧葡萄糖；FDHT＝16β-[18F]-氟-5α双氢睾酮正电子发射断层摄影术；ICF＝知情同意表；PCWG3＝前列腺癌临床实验工作组；PSA＝前列腺特异性抗原
研究设计：本研究将是一项开放标记的、正电子发射断层摄影术(PET)成像生物学证据(POB)研究，以确定化合物A是否通过诱导雄激素受体(AR)表达、在恩杂鲁胺作为最新在先疗法已经失败的、患有mCRPC的受试者中逆转由于谱系转换引起的去势抗性。除了神经内分泌标志物的上调之外，LSD-1活性还可导致前列腺肿瘤中AR水平的下调。本研究旨在评估化合物A是否可以诱导AR表达，并因此使肿瘤对抗激素疗法再敏感。
筛查期将在化合物A的第一剂量之前28天(±3天)开始。知情同意书(ICF)必须在任何其它研究特定程序开始之前由受试者和施用人员签署和注明日期。所有筛查测试和程序必须在化合物A的第一剂量之前28天(±3天)内完成。
在第1周期中，约10名可评价的受试者将用化合物A单一疗法以60mg PO QW治疗4周。在第1周期结束时，受试者将经历FDG/FDHT PET成像，将与筛查评估进行比较以确定AR表达的变化。受试者必须在周期1期间服用最少3个剂量的化合物A才能被认为是可评估的。从周期2开始，设计剂量递减以探索较低剂量水平的化合物A 40mg和20mg，在60mg QW与阿比特龙1000mg PO QD和泼尼松5mg PO/12小时(10mg QD)/阿比特龙标签的组合不耐受的情况下。DLT评估的窗口期将为4周(28天)。受试者必须在DLT评估期间服用最少3个剂量的化合物A才能进行DLT评估。将利用Bayesian间隔剂量发现设计(Bayesian Interval Dose-Finding Design)、改进的毒性概率间隔方法-2(MTPI 2)(Guo等人Contemp ClinTrials.2017年7月；58:23-33)来辅助指导化合物A与阿比特龙和泼尼松组合的剂量递减决定。最终剂量水平决定将由SRC做出。基于毒性率(pT)低于或接近目标水平0.3且等效区间为(0.25，0.35)的假设，预先计算最佳决策的决策表(表2)，以考虑毒性估计值的变异性。需要至少3名剂量限制性毒性(DLT)可评估的受试者来做出剂量递减决定。将估计DLT率最接近30％且至少6名可评估受试者所治疗的剂量确定为RP2D。
Figure BDA0004113422080000301
Figure BDA0004113422080000311
E＝递增至下一较高剂量，但如果当前剂量为60mg，则保持在60mg；S＝停留在当前剂量；D＝降低至下一较低剂量，但如果当前剂量为20mg，则停止试验；DU＝逐步降低(de-escalating)至下一较低剂量，并且由于不可接受的毒性而从试验中排除该剂量或较高剂量；DLT＝剂量限制性毒性；
在第1周期和第3周期后，受试者将经历FDG/FDHT PET成像，将其与筛查进行比较，并确定AR表达的变化，根据基于PET成像分析的局部MSKCC定义建立。从第2周期开始，将基于PCWG3标准对受试者进行随访。只要安全可行，则将获得活组织检查，以进行治疗前和治疗中PD分析。如果存在疾病进展、不可接受的毒性或受试者/临床医师决定退出的证据，则可以停止研究治疗。
图9显示总体研究设计，其如下所示。
Figure BDA0004113422080000312
研究人群/受试者数量：其为单中心、开放标签研究，其中将招募约10名可评估的受试者。
选择标准：受试者将满足以下标准以备招募至研究中：(1)受试者在签署知情同意书(ICF)时是≥18岁的男性。(2)组织学证实为前列腺的腺癌。(3)手术或药物去势，其中睾酮水平≤50ng/dL(<2.0nM)。如果用促黄体素释放素(LHRH)激动剂/拮抗剂治疗受试者(未经历睾丸切除术的受试者)，则该疗法必需在第1周期的第1天前至少4周开始，并且必须在本研究自始至终持续。(4)受试者必须对在先使用恩杂鲁胺的疗法失败：(a)已经完成在先使用恩杂鲁胺的连续疗法至少12周；和(b)在开始研究治疗前不使用恩杂鲁胺治疗不>15天。(5)在恩杂鲁胺之前已经接受阿比特龙的受试者是合格的。(6)允许一至两线的先前基于紫杉烷的化学疗法。如果多西他赛化学疗法使用超过一次，则这将视为一种方案。(7)由研究者评估的记录在案的前列腺癌进展，具有以下之一：(a)PSA进展，其定义为每次测定之间至少3个升高的PSA水平，间隔≥1周。如果PSA是进展的唯一指征，则筛查时的PSA值必须≥1μg/L(1ng/mL)；接受全身性糖皮质激素以控制症状的受试者在开始第1周期第1天治疗之前，在接受全身性糖皮质激素时，必须具有根据PCWG3标准记录的PSA进展；和(b)通过RECIST 1.1的软组织疾病的放射学进展，或在骨扫描上具有2个或更多个记录的新骨病变的骨转移，有或没有PSA进展。(8)受试者必须具有>2cm病变的FDHT病变，其在骨中具有2.9或更小的SUVmax，或在软组织中具有2.4或更小的SUVmax，或满足那些标准的两个或多个较小病变。(9)筛查时Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)体能状态为0或1。(10)受试者必须具有以下实验室值：(a)绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.5x 109/L，在没有生长因子支持下持续7天(如果受试者接受聚乙二醇非格司亭(pegfilgastrim)，则为14天)；(b)血红蛋白(Hgb)≥9g/dL(≥90g/L或>5.59mmol/L)；(c)血小板计数(PiT)≥100x 109/L；(d)血清钾浓度在正常范围内，或可用补充剂校正；(e)血清AST/SGOT和ALT/SGPT≤3.0x正常上限(ULN)或≤5.0x ULN(如果存在肝转移)；(f)血清总胆红素≤1.5x ULN(在记录的Gilbert的情况下≤2x ULN)；(g)受试者必须具有≥3.0g/dL的血清白蛋白；(h)血清肌酐≤1.5x ULN，或用外源过滤标记物如碘海醇(iohexol)、菊粉、51Cr EDTA或125I碘酞酸盐(iothalamate)测量的肾小球滤过率(GFR)≥60mL/min/1.73m2。在血清肌酐<1,5xULN的情况下，不需要计算GFR；(i)PT(或INR)和活化部分凝血活酶时间(APTT)(i)在正常范围内且≤1.5ULN。
筛查期筛查窗口期在化合物A的第一次剂量前28天(±3天)开始。在任何情况下，在进行该试验期间不允许放弃该方案。安全性实验室分析将在当地进行。筛查实验室值必须证明受试者合格，但如果必要，可以在筛查窗口期内重复。
研究产品(阿比特龙)阿比特龙(商品名ZytigaTM)为250mg白色至黄白色片剂。
阿比特龙将作为标准护理由当地开据处方、供应和施用。阿比特龙的管理(即处理、储存、施用和处置)将根据相关的当地指南和包装说明书进行。
研究产品(泼尼松)本说明书用于2mg片剂。泼尼松为黄白色片剂。
泼尼松将作为标准护理由当地开据处方、供应和施用。泼尼松的管理(即处理、储存、施用和处置)将根据相关的当地指南和包装说明书进行。
治疗施用和方案化合物A将在4周周期中以60mg口服QW施用。化合物A将与至少240mL水一起施用。受试者应在化合物A施用之前禁食最少4小时，并且在给药后避免任何食物摄入达1小时。
由于与阿比特龙和泼尼松的组合之前尚未进行过测试，因此可以使用阿比特龙和泼尼松的组合。在60mg化合物A与阿比特龙和泼尼松组合不耐受的情况下，Bayesian间隔剂量发现设计、改进的毒性概率间隔方法-2(MTPI-2)(Guo,Contemp Clin Trials.2017年7月；58:23-33)将用于辅助指导化合物A剂量降低至较低剂量水平40mg和20mg，最终决定由SRC做出。
在需要PK评估的研究日，化合物A将在任何剂量前评估完成后在诊所施用。在所有其他研究日，受试者将在家中自行施用其指定的剂量，并记录给药时间和禁食期。
如果有临床上显著的疾病进展、不可接受的毒性或受试者/临床医师决定退出的证据，则可以停止研究治疗。
阿比特龙的推荐剂量为1000mg(四片250mg片剂)PO QD，其不能与食物一起服用(表3)。片剂应在进食后至少2小时服用，并且在服用药片后至少1小时不应进食食物。这些应与水一起整体吞咽。与食物一起服用片剂增加了阿比特龙的全身暴露。
泼尼松剂量为每12小时5mg PO(10mg QD)(表3)。施用将从阿比特龙的第一天开始，并持续直至停用阿比特龙。
Figure BDA0004113422080000341
PO＝口服施用；QD＝每天
主要和功效分析：功效分析基于可评估人群。生物学证明的主要终点是AR水平的百分比变化，在单一疗法期的第4周和自化合物A与阿比特龙和泼尼松的组合疗法期的筛查的第12周，使用FDG/FDHT PET成像进行评估。待分析的另外的功效终点包括目标软组织反应(Objective Soft Tissue Response)、总体反应率(ORR)(定义为最佳反应是完全反应或部分反应的受试者的百分比)、放射照相无进展存活期(rPFS)(定义为从化合物A的第一剂量到放射照相进展或任何原因的死亡的第一目标证据的时间，以先发生为准，对于所有治疗的患有软组织和/或骨病的受试者，定义为从化合物A第一剂量开始的时间)和无进展存活期(PFS)(定义为从第一剂研究药物到第一次发生疾病进展或任何原因死亡的时间，以先发生为准)，由研究者根据PCWG3标准对化合物A和阿比特龙和泼尼松的组合所评估。将基于治疗的受试者描述性分析主要和功效终点。将报告点估计和双侧95％精确Clopper-Pearson置信区间(CI)。
目标软组织反应：目标软组织反应率定义为根据PCWG 3标准达到部分反应或更好(PR或CR)的最佳反应的受试者比例。目标软组织反应的分析将基于治疗人群和患有软组织疾病的可评估人群。将呈现以下反应类别中的受试者的数量和百分比：部分反应(PR)、完全反应(CR)、总体反应(CR+PR)、稳定疾病(SD)、进行性疾病(PD)和不可评估(NE)。
还将提供每个反应类别的相应95％精确Clopper-Pearson CI。
反应期限：软组织疾病的反应持续时间定义为从记录的软组织反应的最早日期(PR或CR PCWG3标准)到第一次记录的软组织疾病进展或死亡的时间，以先发生者为准。反应持续时间将使用Kaplan-Meier估计、根据剂量水平来总结。分析人群仅限于已经反应的那些人群。截止到数据截止日期既没有进展也没有死亡的受试者将在其最后一次充分的软组织肿瘤评估之日审查。
存活和未进展的受试者比例：存活且未进展的受试者的比例定义为在6个月随访时未进展的存活受试者的比例，其中进展根据PCWG3标准定义。对于治疗人群，将使用Kaplan-Meier方法评估在6个月时存活且未进展的受试者的比例。
无进展存活期：将计算所有治疗的受试者的PFS期限，其定义为从第一剂研究药物到第一次发生疾病进展或任何原因的死亡(以先发生者为准)的时间。疾病进展定义为感觉PCWG3的进行性疾病。将在统计分析计划(SAP)中描述审查的公约。将使用Kaplan-Meier方法估计治疗人群的PFS。
放射学无进展存活期：将所有患有软组织和/或骨病的治疗受试者的rPFS期限计算为从化合物A的第一剂量到放射学进展或任何原因的死亡的第一目标证据(以先发生者为准)的时间。将放射学疾病进展定义为根据PCWG3的进行性疾病。将在统计分析计划(SAP)中描述审查的公约。将使用Kaplan-Meier方法估计治疗人群的rPFS。
总生存期：总生存期(OS)定义为从第一剂化合物A到任何原因死亡的时间。在分析的临床截止日期仍然存活的受试者将在最后已知的存活日期审查。对于治疗人群，将使用Kaplan-Meier方法总结在12个月和24个月时的OS比率。
尽管已经示例和描述了某些实施方案，但是应当理解，在不脱离如所附权利要求中限定的其更广泛方面的技术的情况下，本领域普通技术人员可以在其中进行改变和变型。

Claims (22)

1.对有需要的受试者治疗转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法，包括向所述受试者施用具有以下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure FDA0004113422070000011
2.权利要求1的方法，其中在第一个28-天周期中，通过下列方式施用LSD-1抑制剂：
(a)通过口服；和/或
(b)以约600mg的剂量；和/或
(c)每周1次；和/或
(d)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天。
3.权利要求1或2的方法，其中所述受试者的在先的雄激素受体途径抑制剂疗法已经失败。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中在先的雄激素受体途径抑制剂疗法为恩杂鲁胺。
5.权利要求1-4任一项的方法，还包括与LSD-1抑制剂组合施用雄激素受体途径抑制剂和泼尼松的步骤。
6.权利要求5的方法，其中所述受试者的在先的雄激素受体途径抑制剂疗法已经失败，且所述雄激素受体途径抑制剂与在先的雄激素受体途径抑制剂不同或相同。
7.权利要求5的方法，其中在先的雄激素受体途径抑制剂疗法为恩杂鲁胺。
8.权利要求6的方法，其中所述雄激素受体途径抑制剂为阿比特龙。
9.权利要求8的方法，其中通过下列方式施用阿比特龙：
(a)通过口服；和/或
(b)以约1000mg的剂量；和/或
(c)每日1次；和/或
(d)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
10.权利要求5的方法，其中通过下列方式施用泼尼松：
(a)通过口服；和/或
(b)以约5mg的剂量；和/或
(c)每12小时一次；和/或
(d)每日2次；和/或
(e)以约10mg/天的总剂量；
(f)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换引起的去势抗性。
12.权利要求11的方法，还包括与LSD-1抑制剂组合施用雄激素受体途径抑制剂和泼尼松的步骤。
13.权利要求11的方法，其中所述受试者的在先的雄激素受体途径抑制剂疗法已经失败，且所述雄激素受体途径抑制剂与在先的雄激素受体途径抑制剂不同或相同。
14.权利要求11的方法，其中在先的雄激素受体途径抑制剂疗法为恩杂鲁胺。
15.权利要求12的方法，其中所述雄激素受体途径抑制剂为阿比特龙。
16.权利要求15的方法，其中通过下列方式施用阿比特龙：
(a)通过口服；和/或
(b)以约1000mg的剂量；和/或
(c)每日1次；和/或
(d)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
17.权利要求12的方法，其中通过下列方式施用泼尼松：
(a)通过口服；和/或
(b)以约5mg的剂量；和/或
(c)每12小时一次；和/或
(d)每日2次；和/或
(e)以约10mg/天的总剂量；
(f)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
18.治疗受试者的转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法，所述受试者在先使用恩杂鲁胺的疗法已经失败，所述方法包括：
(a)第一步，在28-天周期中向受试者施用具有以下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure FDA0004113422070000031
(i)通过口服；和/或
(ii)以约600mg的剂量；和/或
(iii)每周1次；和/或
(iv)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换引起的去势抗性，此后
(b)第二步，伴随施用LSD-1抑制剂、阿比特龙和泼尼松，其中在28-天周期中通过下列方式施用LSD-1抑制剂：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约60mg、40mg或20mg的剂量；和/或
(iii)每周1次；和/或
(iv)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中通过下列方式施用阿比特龙：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约1000mg的剂量；和/或
(iii)每日1次；和/或
(iv)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天，并且其中通过下列方式施用泼尼松：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约5mg的剂量；和/或
(iii)每12小时一次；和/或
(iv)每日2次；和/或
(v)以约10mg/天的总剂量；
(vi)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
19.权利要求18的方法，其中与基线相比，肿瘤在尺寸上已经减小，或PSA水平已经降低，或其组合。
20.用于治疗有需要的受试者的转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的药物组合物，其中该组合物包含具有以下结构的LSD-1抑制剂化合物的苯磺酸盐，
Figure FDA0004113422070000041
21.权利要求20的组合物，用于权利要求2-17任一项的方法中。
22.用于治疗在先使用恩杂鲁胺的疗法已经失败的受试者的转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)的方法中的药物组合物，其中该组合物包含具有以下结构的LSD-1抑制剂的苯磺酸盐化合物，
Figure FDA0004113422070000051
其中所述方法包括第一步：在28-天周期中向受试者施用所述药物组合物：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约600mg的剂量；和/或
(iii)每周1次；和/或
(iv)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中LSD-1抑制剂逆转因谱系转换引起的去势抗性，且
其中此后，所述方法包括第二步：伴随施用LSD-1抑制剂、阿比特龙和泼尼松，其中在28-天周期中通过下列方式施用LSD-1抑制剂：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约60mg、40mg或20mg的剂量；和/或
(iii)每周1次；和/或
(iv)在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天，
其中通过下列方式施用阿比特龙：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约1000mg的剂量；和/或
(iii)每日1次；和/或
(iv)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天，并且其中通过下列方式施用泼尼松：
(i)通过口服；和/或
(ii)以约5mg的剂量；和/或
(iii)每12小时一次；和/或
(iv)每日2次；和/或
(v)以约10mg/天的总剂量；
(vi)在28天周期的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28天。
CN202180057167.XA 2020-06-05 2021-06-04 治疗前列腺癌的方法 Pending CN116056707A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063035622P 2020-06-05 2020-06-05
US63/035,622 2020-06-05
PCT/US2021/035863 WO2021247977A1 (en) 2020-06-05 2021-06-04 Methods of treating prostate cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116056707A true CN116056707A (zh) 2023-05-02

Family

ID=76695856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180057167.XA Pending CN116056707A (zh) 2020-06-05 2021-06-04 治疗前列腺癌的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230241063A1 (zh)
EP (1) EP4161507A1 (zh)
JP (1) JP2023529367A (zh)
KR (1) KR20230035569A (zh)
CN (1) CN116056707A (zh)
WO (1) WO2021247977A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012009475A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Oregon Health & Science University Methods of treating cancer with inhibition of lysine-specific demethylase 1
US20180009785A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Janssen Pharmaceutica Nv Substituted hydantoin and thiohydantoin derivatives as androgen receptor antagonists
CN108473442A (zh) * 2015-11-05 2018-08-31 赛尔基因昆蒂赛尔研究公司 包含赖氨酸特异性脱甲基酶-1的抑制剂的组合物
CN109803660A (zh) * 2016-08-10 2019-05-24 细胞基因公司 复发性和/或难治性实体瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3137169T3 (da) 2014-05-01 2022-02-14 Celgene Quanticel Res Inc Hæmmere af lysin-specifik demethylase-1

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012009475A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Oregon Health & Science University Methods of treating cancer with inhibition of lysine-specific demethylase 1
CN108473442A (zh) * 2015-11-05 2018-08-31 赛尔基因昆蒂赛尔研究公司 包含赖氨酸特异性脱甲基酶-1的抑制剂的组合物
US20180009785A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Janssen Pharmaceutica Nv Substituted hydantoin and thiohydantoin derivatives as androgen receptor antagonists
CN109803660A (zh) * 2016-08-10 2019-05-24 细胞基因公司 复发性和/或难治性实体瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
彭波: "前列腺疾病300问", 31 March 2018, 上海交通大学出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230035569A (ko) 2023-03-14
EP4161507A1 (en) 2023-04-12
WO2021247977A1 (en) 2021-12-09
JP2023529367A (ja) 2023-07-10
US20230241063A1 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6742391B2 (ja) 併用療法
RU2748549C2 (ru) Способ лечения почечно-клеточного рака с использованием n-(4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)фенил)-n&#39;-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида, (2s)-гидроксибутандиоата
JP2013067645A (ja) 転移性乳癌の治療
CA3059562A1 (en) Combination therapy for prostate cancer
Zhang et al. Sintilimab for the treatment of non-small cell lung cancer
Felip et al. A Phase IB, dose-finding study of erlotinib in combination with a fixed dose of pertuzumab in patients with advanced non–small-cell lung cancer
US20220323446A1 (en) Sotorasib dosing regimen
US20200397796A1 (en) Methods of treatment of cancer comprising chk1 inhibitors
US20210393620A1 (en) Methods of Treatment of Cancer Comprising CDC7 Inhibitors
WO2016172517A1 (en) Methods of treating prostate cancer
CN116056707A (zh) 治疗前列腺癌的方法
CA3218575A1 (en) Sotorasib dosing regimen
WO2023049363A1 (en) Sotorasib and afatinib for treating cancer comprising a kras g12c mutation
US20220040173A1 (en) Methods of delaying pain progression and treating prostate cancer
TWI569808B (zh) 肝細胞腫瘤（ｈｃｃ）之治療
JP2022532597A (ja) Ｃｈｋ１阻害剤を使用してがんを治療する方法
ES2919083A2 (es) Métodos de tratamiento de cáncer de próstata
US20240091230A1 (en) Use of kras g12c inhibitor in treating cancers
Carducci et al. A Randomized Phase II Study Comparing Bipolar Androgen Therapy vs. Enzalutamide in Asymptomatic Men with Castration Resistant Metastatic Prostate Cancer: The TRANSFORMER Trial (Testosterone Revival Abolishes Negative Symptoms, Fosters Objective Response and Modulates Enzalutamide Resistance)
CA3230424A1 (en) Methods of treating cancer
Carducci et al. A Randomized Phase II Study Comparing Bipolar Androgen Therapy vs. Enzalutamide in Asymptomatic Men with Castration Resistant Metastatic Prostate Cancer: The TRANSFORMER Trial (Testosterone Revival Abolishes Negative Symptoms, Fosters Objective Response and Modulates Enzalutamide Resistance)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination