JP6742391B2 - 併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異を特徴とする増殖性疾患に罹患する患者の治療のための第２の阻害剤と組み合わせたＢ−Ｒａｆ阻害剤の使用に関し、第２の阻害剤は、腫瘍サンプル中で同定される遺伝子異常に基づいて選択される。

黒色腫の発症に関連する分子変化の理解において重要な進展が見られている。ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路のセリン−スレオニンタンパク質キナーゼであるＢ−ＲＡＦの発癌性変異は、黒色腫において特に多く見られ、黒色腫の４０〜６０％がＢ−Ｒａｆ遺伝子に活性変異を担持している。アミノ酸６００におけるグルタミン酸のバリンへの置換（Ｖ６００Ｅ変異）は、報告されているＢ−Ｒａｆ変異の９５％超に相当する。この変異は、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路においてＢ−Ｒａｆ及び下流シグナル伝達を構成的に活性化し、癌細胞に増殖及び生存するよう信号を送る。黒色腫に加えて、そのようなＢ−Ｒａｆの変異は、他の増殖性疾患、例えば、結腸直腸癌、甲状腺癌、特に乳頭状甲状腺癌、星状細胞腫、膵癌、及び神経線維腫症において起こることが分かっている。そのような疾患をＢ−Ｒａｆ阻害剤で治療すると劇的な結果を生じることが知られているが、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療に対して耐性を生じるのが典型的であり、かなり短い期間に起こることが多い。

Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療に対する耐性には複数の経路が存在する。主な機序は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤の存在下でＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の再活性化をもたらす。この再活性化は、遺伝子増幅、ならびに過剰発現及び／またはリガンド産生、ＮＲＡＳ及びＭＥＫ１遺伝子における変異の獲得、ＣＯＴ及びＲＡＦ−１（ＣＲＡＦ）等のキナーゼの過剰発現によるＢＲＡＦの回避、変異ＢＲＡＦ対立遺伝子のスプライス変異体の発現、そして例えば、遺伝子増幅による変異ＢＲＡＦ対立遺伝子の発現増加による、遺伝子受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の活性の増加によって起こり得る。また、ＰＤＧＦＲ−β及びＩＧＦ−１Ｒ等のＲＴＫの活性化によるか、またはＰＴＥＮ遺伝子の損失によるかのいずれかである、ＭＡＰＫ経路とは異なるＰＩＫ３Ｃαシグナル伝達系等の生存経路の活性化も、耐性に関与し得る。ＲＴＫのｃ−ＭＥＴ及びＦＧＦＲファミリーによる他の機序は、複数の黒色腫においてＢ−Ｒａｆ阻害剤に対する耐性を促進し得る潜在的な機序である。

米国特許第７，４８２，３６７号 第ＷＯ２０１１／０２５９２７号 第ＷＯ０５／０５１９０６号 第ＷＯ０５／０２３２５１号 第ＷＯ０３／０７７８５５号 第ＵＳ２００５００４９４１９号 第ＵＳ７２３５５３７号 第ＷＯ２００７／１４０２２２号 第ＷＯ２０２１０／０２０６７５号 第ＷＯ２００６／１２２８０６号 第ＷＯ０７／０８４７８６号 第ＷＯ２００６／０００４２０号

Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４５，（２００９）２２８−２４７

上述の知見は、再発後の早い段階でＢ−Ｒａｆ阻害剤治療に対する合理的な併用療法を開始するために、リアルタイムで耐性の機序を同定することの重要性を強調するものである。再発時に患者の腫瘍に存在する遺伝子異常を治療前と比較することを伴う機序に基づくアプローチを用いれば、可能性のある耐性の機序を同定することが可能なはずである。このことは、耐性をよりよく回避するために、個々の患者に適した薬物併用療法を選択するのに役立つ。本発明は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤に対する耐性が生じた後に非常に不良な予後を有するＢＲＡＦ変異型の進行性または転移性黒色腫に罹患する患者の治療選択肢を拡張及び改善するための、機序に基づく組み合わせ治療アプローチに関する。

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異を特徴とする増殖性疾患に罹患する患者をＢ−Ｒａｆ阻害剤で治療することに関し、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤に対する耐性は、
（ａ）患者から採取した腫瘍サンプル中で遺伝子異常を決定し、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤からなる薬物併用療法を患者に施すことによって低下し、第２の阻害剤は、腫瘍サンプル中に見られる遺伝子異常に基づいて選択される。

式（Ｉ）の化合物及び化合物Ｆが、実施例４に記載されるようなｉｎ ｖｉｖｏのＨＴ−２９細胞株モデルの成長に及ぼす単剤としての効果及び組み合わせの効果を示す。 式（Ｉ）の化合物及び化合物Ｆが、実施例４に記載されるようなｉｎ ｖｉｖｏのＲＫＯ細胞株モデルの成長に及ぼす単剤としての効果及び組み合わせの効果を示す。 ＢＲＡＦＶ６００ＥをコードするＢＲＡＦの対立遺伝子を内部に有する２つの黒色腫由来細胞株において、ＲＡＦ阻害剤（式Ｉの化合物）及びＦＧＦＲ阻害剤化合物Ｈの組み合わせが増殖に及ぼす影響を示す。実施例５に記載されるようなインピーダンスに基づくｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞分析装置を使用して測定された、（上Ａ）ＣＯＬＯ ７４１及び（下Ｂ）ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞株のリアルタイムでの成長を示す。図示されるＦＧＦ２及び化合物Ｈは、それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１ｕＭの濃度で培地に添加された。式（Ｉ）の化合物は、５００ｎＭ（Ａ）及び１００ｎＭ（Ｂ）で使用された。 ｉｎ ｖｉｔｒｏの２つのＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異黒色腫由来細胞株において、式（Ｉ）の化合物とＦＧＦＲ阻害剤化合物Ｈ及びＦＧＦＲリガンドＦＧＦ２との組み合わせがシグナル伝達に及ぼす影響。式（Ｉ）の化合物（１００ｎＭ）、ＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）、及び化合物Ｈ（１ｕＭ）を用いた処理後に（Ａ）ＣＯＬＯ ７４及び（Ｂ）ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞から単離した、リン酸化及び全ＡＫＴの両方、ＥＲＫ１／２、ならびにＭＥＫ１／２タンパク質のウェスタン分析を示す。細胞は、実施例５に記載されるように、薬剤を単独でまたは組み合わせて２及び２４時間処理した。

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異、特にＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患に罹患する患者を治療するための方法であって、
（ａ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６を含む遺伝子のパネルにおいて遺伝子異常について検査することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤を含む薬物併用療法を施すこととを含み、第２の阻害剤は、腫瘍サンプル中に発見される遺伝子異常に基づいて選択される、方法に関する。

一実施形態において、増殖性疾患は癌である。用語「癌」は、全ての固形腫瘍及び血液系腫瘍を含む幅広い腫瘍を意味するために本明細書において使用される。そのような腫瘍の例として、限定されないが、以下の良性または悪性の腫瘍を含む：脳、肺（具体的には、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）、扁平細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭頸部、腎性、腎臓、尿管、卵巣、前立腺、結腸直腸、食道、精巣、婦人科（例えば、子宮肉腫、卵管癌、子宮内膜、子宮頸部、膣、または外陰部）、甲状腺、膵性、骨、皮膚、黒色腫、子宮、卵巣、直腸、肛門、結腸、精巣、ホジキン病、食道性、小腸、内分泌系（例えば、甲状腺、副甲状腺、または副腎）、軟組織肉腫、尿道、陰茎、白血病、リンパ腫、中枢神経系腫瘍、肉腫、骨髄腫、胆汁、肝臓、神経線維腫症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及びカポジ肉腫。

本発明のさらなる実施形態において、増殖性疾患は、黒色腫、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）等の腎臓癌、肝臓癌、子宮内膜癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、甲状腺癌、特に乳頭状甲状腺癌、膵癌、神経線維腫症、または肝細胞癌である。

本発明のさらなる実施形態において、増殖性疾患は固形腫瘍である。用語「固形腫瘍」は、特に、黒色腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び一般的に、消化管、子宮頸癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む）、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、またはカポジ肉腫を意味する。

より具体的には、本発明は、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異、例えば、Ｖ６００Ｅ変異を特徴とする増殖性疾患に罹患する患者を治療するための方法に関する。増殖性疾患は、しばしば、黒色腫、結腸直腸癌、甲状腺癌、特に乳頭状甲状腺癌、星状細胞腫、膵癌、及び神経線維腫症を含むそのような変異を特徴とする。本発明は特に、増殖性疾患が、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、またはＶ６００Ｇ変異を特徴とする黒色腫であるそのような方法に関する。

増殖性疾患を治療するためのＢ−Ｒａｆ阻害剤及びそれらの使用は、当該技術分野で既知である。ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）は、腫瘍がＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅを発現する黒色腫に罹患する患者の治療のためにＦＤＡによって承認されたＢＲＡＦ阻害剤である。ソラフェニブ及びダブラフェニブ及びＣＥＰ−３２４９６は、さらなる既知のＢ−Ｒａｆ阻害剤である。米国特許第７，４８２，３６７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるベンズイミダゾリルピリジルエーテルは、本発明の組み合わせ、特にＲＡＦ２６５において有用なＢ−Ｒａｆ阻害剤である。第ＷＯ２０１１／０２５９２７号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるピラゾールピリミジンは、本発明の組み合わせに有用な別のクラスのＢ−Ｒａｆ阻害剤である。

Ｂ−Ｒａｆ阻害剤と組み合わされる適切な第２の阻害剤は、腫瘍サンプル中に見られる遺伝子異常に基づいて、患者の治療のために表１に従って選択される。遺伝子異常は、遺伝子の増幅、遺伝子における変異、または遺伝子活性の損失から生じ得る。

表１に特定される遺伝子に関する情報、それらの配列及び関連するタンパク質は、当業者に既知であり、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ，２０８９４ＵＳＡ）によって提供されるデータベース、例えば、ＧＥＮＥ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）またはＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｅｎｅｒｇｙ．ｇｏｖ／）等の公的に利用可能なデータベースに見出される。

薬物併用療法は、併用療法の各々の薬物を、その組み合わせを用いて治療される疾患のベースラインの臨床的に観察可能な兆候及び症状に対する観察可能な改善を提供するのに十分な量で投与することに関与する。薬物は、患者が（好ましくは相乗的な）相互作用（共同治療効果）を示すように、具体的には、患者におけるＢ−Ｒａｆ阻害剤による治療に対する耐性が克服されるかまたは低下されるように、好ましい時間間隔で（時間的にずらした様式で、特に配列特異的な様式で）別々に投与されてもよい。

治療剤の組み合わせの「薬学的に有効な量」または「臨床的に有効な量」または「治療的に有効な量」という用語は、その組み合わせを用いて治療される疾患のベースラインの臨床的に観察可能な兆候及び症状に対する観察可能な改善を提供するのに十分な量である。

本明細書で使用される一般用語は、明示的にそうではないと記載されない限り、以下の意味で定義される：

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、別途記載のない限り、それらの開放的かつ非限定的な意味で本明細書において使用される。

本発明を示す文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び同様の指示対象は、本明細書において別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。化合物、塩等に複数形が使用される場合、単一の化合物、塩等も意味すると解釈される。

用語「組み合わせ」、「治療的組み合わせ」、「併用療法」、または「薬学的組み合わせ」は、本明細書で使用される場合、１つの単位剤形における固定の組み合わせ、またはパーツキット、または併用投与のための説明書のいずれかを定義し、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤は、組み合わせパートナーが、協同的な、例えば相乗的な効果を示すことができる時間間隔内で同時にまたは別々に独立して投与されてもよい。

用語「薬学的組成物」は、哺乳動物に影響を及ぼす特定の疾患または状態を予防または治療するために、対象（例えば、哺乳動物またはヒト）に投与される少なくとも１つの治療剤を含有する混合物または溶液を指すために本明細書で定義される。

用語「薬学的に許容される」は、正当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、及び他の問題、合併症を起こさない、妥当な利益／リスク比に見合った、対象、例えば、哺乳動物またはヒトの組織と接触するのに適した化合物、材料、組成物、及び／または投与形態を指すために本明細書で定義される。

「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、別途指示のない限り、本発明の化合物中に存在し得る酸性基または塩基性基の塩を含む。本質的に塩基性である本発明の化合物は、種々の無機酸及び有機酸と様々な塩を形成することができる。そのような本発明の塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用されてもよい酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物塩、塩化物塩、クエン酸塩、フマル酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、及び酒石酸塩を形成する酸である。別途特定されない限り、本発明の方法に使用される治療剤は、遊離型でまたは薬学的塩として投与される。

用語「組み合わせ製剤」は、上で定義したような組み合わせパートナー（ａ）及び（ｂ）を、独立して、または別々の量の組み合わせパートナー（ａ）及び（ｂ）を含む異なる固定の組み合わせの使用によって、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与することができるという意味で、特に「パーツキット」を指すために本明細書において定義される。次いで、パーツキットのパーツは、例えば、同時に、または時間的にずらして、すなわち、パーツキットのいずれかのパーツに関して異なる時点で、かつ等しいもしくは異なる時間間隔で投与することができる。組み合わせ製剤において投与される組み合わせパートナー（ｂ）に対する組み合わせパートナー（ａ）の総量の比率は、例えば、治療される患者亜集団の要求または１人の患者の要求に対処するために変更することができる。

用語「同時投与」、「併用療法」、または「併用投与」は、本明細書で使用される場合、１人の患者に対する選択された治療剤の投与を包含するために定義され、薬剤が必ずしも同じ投与経路によってまたは同時に投与されなくてもよい治療計画を含むことが意図される。

用語「治療すること」または「治療」は、本明細書で使用される場合、対象において少なくとも１つの症状を緩和、軽減、もしくは改善するか、または疾患の進行の遅延をもたらす治療を含む。例えば、治療は、疾患の１つもしくはいくつかの症状の減少、または癌等の疾患の完全な根絶であってもよい。本発明の意味の範囲内で、用語「治療」はまた、発症を抑制すること、遅延させること（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）及び／または疾患が発症するもしくは悪化するリスクを低下させることも意味する。用語「保護する」は、対象における疾患の発症または継続または悪化を予防する、遅延させる、もしくは治療すること、または必要に応じてこれら全部を意味するために本明細書において使用される。

本明細書で使用される用語「対象」または「患者」は、ヒト、例えば、増殖性疾患に罹患しているか、罹患するリスクがあるか、または潜在的に罹患可能なヒトを具体的に指す。しかしながら、哺乳動物、例えば、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ネズミ、ウサギ、ラット、及びトランスジェニック非ヒト動物の治療を除外することは意図されない。

用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の１０％以内、より好ましくは５％以内の意味を有するものとする。

したがって、本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６を含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常について検査することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤を含む薬物併用療法を施すこととを含み、第２の阻害剤は、表１に従って腫瘍サンプル中に発見される遺伝子異常に基づいて選択され、具体的には、
（ｉ）腫瘍サンプルが、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、もしくはＥＧＦＲ中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＭｅｋ１／２阻害剤であるか、または
（ｉｉ）腫瘍サンプルが、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、もしくはＰ１６中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＣＤＫ４阻害剤であるか、または
（ｉｉｉ）腫瘍サンプルが、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＴＥＮ、もしくはＰＩＫ３ＣＡ中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＰＩ３キナーゼ阻害剤であるか、または
（ｉｖ）腫瘍サンプルが、ｃＭＥＴ中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤であり、
（ｖ）腫瘍サンプルがＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、もしくはＦＧＦＲ３中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である。

したがって、本発明はさらに、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、またはＥＧＦＲを含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常を検出することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及びＭｅｋ１／２阻害剤である第２の阻害剤を含む薬物併用療法を患者に施すこととを含む。

本発明はまた、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法にも関し、該方法は、
（ｂ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、またはＰ１６を含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常を検出することと、
（ｄ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及びＣＤＫ４阻害剤である第２の阻害剤を含む薬物併用療法を患者に施すことと、を含む。

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）疾患進行後に患者から腫瘍サンプルを採取し、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＴＥＮ、またはＰＩＫ３ＣＡを含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常を検出することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及びＰＩ３キナーゼ阻害剤である第２の阻害剤を含む薬物併用療法を患者に施すこととを含む。

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）腫瘍サンプルを採取し、ｃＭＥＴを含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常を検出することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及びｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤である第２の阻害剤を含む薬物併用療法を患者に施すこととを含む。

本発明は、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ３を含む群から選択される遺伝子において遺伝子異常を検出することと、
（ｂ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及びＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である第２の阻害剤を含む薬物併用療法を患者に施すこととを含む。

本発明の重要な実施形態において、患者は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤の単剤療法を用いて以前に治療を受けている。具体的には、患者は、疾患進行までＢ−Ｒａｆ阻害剤の単剤療法を用いて治療され、その後、表１に従って決定される薬物併用療法を受ける。

好ましい実施形態において、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤は、疾患進行または薬物併用療法の開始まで単剤療法として連続的に投与され、薬物併用療法による治療中は連続投与が継続される。

別の実施形態において、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤は、断続的な投与計画で投与される：すなわち、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤が一定期間投与され、その後、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療を控える期間が続く。例えば、Ｒａｆ阻害剤は、３または４週間の期間毎日投与され、その後、治療を行わない１または２週間の期間が続き、このサイクルが繰り返される。

疾患進行は、ＲＥＣＩＳＴ基準等の適切な臨床基準によって評価される。ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）は、癌患者が治療中に改善するか（「奏功」）、同じ状態に留まるか（「安定」）、または悪化する（「進行」）時を定義する一連の規則書である。最初の基準は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（ＥＯＲＴＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐを含む国際共同研究によって２０００年２月に発行された。２００９年１月に発行されたＲＥＣＩＳＴ １．１は、最初の基準を更新したものである。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４５，（２００９）２２８−２４７を参照のこと。

疾患進行の機序は、再発時に患者の腫瘍に存在する遺伝子異常を、例えば、治療前と比較することによって決定される。遺伝子異常は、遺伝子の増幅、遺伝子における変異、または遺伝子活性の損失から生じ得る。遺伝子異常は、当該技術分野で既知の方法によって、典型的には、既知のシーケンシング方法によって決定される。好ましい実施形態において、再発時に採取された腫瘍サンプル中のＢ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６からなる群から選択される遺伝子が、治療前と比較される。

したがって、本発明はまた、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療後の疾患進行の機序を決定するために、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者から採取した腫瘍サンプルを、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６を含む遺伝子のパネルにおいて遺伝子異常について検査することにも関する。

本発明はまた、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤と組み合わされる第２の阻害剤を選択するための診断方法にも関し、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６から選択される１つ以上の遺伝子において遺伝子異常について、腫瘍サンプルを検査する。第２の阻害剤は、表１に従って選択される。好ましくは、第２の阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療に対する耐性を克服するように選択される。

本発明はまた、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６から選択される１つ以上の遺伝子において遺伝子異常を検出するために有用であるか、または上述の遺伝子の全てもしくはサブセットを含む、遺伝子チップにも関連する。遺伝子チップは、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤による治療に対する耐性の機序を決定するために、また、その耐性を克服する薬物併用療法に使用される第２の阻害剤を選択するために有用である。

本発明の特定の実施形態は、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法であって、該方法は、
（ａ）患者が疾患進行を示すまで治療有効量のＢ−Ｒａｆ阻害剤を患者に投与することと、
（ｂ）疾患進行後に患者から腫瘍サンプルを採取し、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６からなる群から選択される１つ以上の遺伝子において遺伝子異常について検査することと、
（ｃ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤を含む薬物併用療法を施すこととを含み、第２の阻害剤は、腫瘍サンプル中に見られる遺伝子異常に基づいて選択され、
（ｉ）遺伝子異常が、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、もしくはＥＧＦＲ中に存在する場合、第２の阻害剤はＭｅｋ１／２阻害剤であるか、または
（ｉｉ）遺伝子異常が、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、もしくはＰ１６中に存在する場合、第２の阻害剤はＣＤＫ４阻害剤であるか、または
（ｉｉｉ）遺伝子異常が、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＴＥＮ、もしくはＰＩＫ３ＣＡ中に存在する場合、第２の阻害剤はＰＩ３キナーゼ阻害剤であるか、または
（ｉｖ）遺伝子異常が、ｃＭＥＴ中に存在する場合、第２の阻害剤はｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤であるか、または
（ｖ）遺伝子異常が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、もしくはＦＧＦＲ３中に存在する場合、第２の阻害剤はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である。

本発明において有用な好ましいＢ−Ｒａｆ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物である。

式（Ｉ）の化合物及びＢ−Ｒａｆ阻害剤としてのその有用性は、第ＷＯ２０１１／０２５９２７号に開示されている。

したがって、本発明は、より具体的には、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）患者から腫瘍サンプルを採取し、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６からなる群から選択される１つ以上の遺伝子において遺伝子異常について検査することと、
（ｂ）式（Ｉ）
のＢ−Ｒａｆ阻害剤またはその薬学的に許容される塩及び第２の阻害剤を含む薬物併用療法を施すこととを含み、第２の阻害剤は、表１に従って腫瘍サンプル中に発見される遺伝子異常に基づいて選択され、具体的には、
（ｉ）腫瘍サンプルが、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、もしくはＥＧＦＲ中に遺伝子異常を有するか、またはステップ（ｂ）において遺伝子異常が見られない場合、第２の阻害剤はＭｅｋ１／２阻害剤であるか、または
（ｉｉ）腫瘍サンプルが、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、もしくはＰ１６中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＣＤＫ４阻害剤であるか、または
（ｉｉｉ）腫瘍サンプルが、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＴＥＮ、もしくはＰＩＫ３ＣＡ中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＰＩ３キナーゼ阻害剤であるか、または
（ｉｖ）腫瘍サンプルが、ｃＭＥＴ中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤であるか、または
（ｖ）腫瘍サンプルがＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、もしくはＦＧＦＲ３中に遺伝子異常を有する場合、第２の阻害剤はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である。

本発明のより具体的な実施形態は、薬物併用療法の前に、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を用いた単剤療法を提供することを含む。したがって、本発明はさらに、Ｂ−Ｒａｆの変異、具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、非常に具体的にはＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、
（ａ）治療有効量の式（Ｉ）
のＢ−Ｒａｆ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を、患者が疾患進行を示すまで患者に投与することと、
（ｂ）疾患進行後に患者から腫瘍サンプルを採取し、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３ ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６からなる群から選択される１つ以上の遺伝子において遺伝子異常について検査することと、
（ｃ）Ｂ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の阻害剤を含む薬物併用療法を施すこととを含み、第２の阻害剤は、表１に従って腫瘍サンプル中に発見される遺伝子異常に基づいて選択され、具体的には、
（ｉ）疾患進行の機序が、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ ＨＲＡＳ、もしくはＥＧＦＲ中の遺伝子異常を特徴とするか、またはステップ（ｂ）において遺伝子異常が見られない場合、第２の阻害剤はＭｅｋ１／２阻害剤であるか、または
（ｉｉ）疾患進行の機序が、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、もしくはＰ１６中の遺伝子異常を特徴とする場合、第２の阻害剤はＣＤＫ４阻害剤であるか、または
（ｉｉｉ）疾患進行の機序が、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＴＥＮ、またはＰＩＫ３ＣＡ中の遺伝子異常を特徴とする場合、第２の阻害剤はＰＩ３キナーゼ阻害剤であるか、または
（ｉｖ）疾患進行の機序が、ｃＭＥＴ中の遺伝子異常を特徴とする場合、第２の阻害剤はｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤であるか、または
（ｖ）疾患進行の機序が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、もしくはＦＧＦＲ３中の遺伝子異常を特徴とする場合、第２の阻害剤はＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である。

式（Ｉ）の化合物は、ステップ（ａ）及び（ｃ）において、連続的に、または断続的な投与計画で投与されてもよい。連続的に投与されることが好ましい。

上述の方法の各々において、好ましい実施形態は、増殖性疾患がＢ−ＲａｆのＶ６００変異、例えば、Ｖ６００Ｅ変異を特徴とするものを特に含む。増殖性疾患は、しばしば、黒色腫、結腸直腸癌、甲状腺癌、特に乳頭状甲状腺癌、星状細胞腫、膵癌、及び神経線維腫症を含むそのような変異を特徴とする。好ましくは、増殖性疾患は、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、またはＶ６００Ｇ変異を特徴とする黒色腫または結腸直腸癌である。本発明は特に、増殖性疾患が、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、またはＶ６００Ｇ変異を特徴とする黒色腫であるそのような方法に関する。

本発明において使用するための適切なＭｅｋ１／２阻害剤は、当該技術分野で既知である。本発明において有用なＭｅｋ１／２阻害剤は、ＰＤ３２５９０１、ＰＤ−１８１４６１、ＡＲＲＹ１４２８８６／ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−５０９、ＸＬ５１８、ＪＴＰ−７４０５７、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＺＤ８３３０、ＡＲＲＹ１６２、ＡＲＲＹ３００、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５／Ｒ−７１６７、ＧＳＫ１１２０２１２、またはＡＳ７０３０２６を含む。

重要な実施形態において、Ｍｅｋ１／２阻害剤は、第ＷＯ０３／０７７９１４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される化合物、具体的には、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物
もしくはその薬学的に許容される塩（これ以降、それぞれ、化合物Ａ及びＢと称される）、ならびに第ＷＯ０５／０５１９０６号、第ＷＯ０５／０２３２５１号、第ＷＯ０３／０７７８５５号、第ＵＳ２００５００４９４１９号、及び第ＵＳ７２３５５３７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される化合物を含む（増殖性疾患の治療のためのＭｅｋ１／２阻害剤としてのＮ３−アルキル化ベンズイミダゾール及び他の同様の複素環誘導体を包含する）。

ＣＤＫ４阻害剤は、当該技術分野で既知であり、フラボピリドール、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＬＥＥ０１１、ＡＴ７５１９、ＢＭＳ２６５２４６、ＬＹ２８３５２１９、及びＰＤ−０３３２９９１を含む。本発明の特定の実施形態において、ＣＤＫ４阻害剤は、第ＷＯ２００７／１４０２２２号または第ＷＯ２０２１０／０２０６７５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される化合物である。特定の実施形態において、ＣＤＫ４阻害剤は、式（ＩＶ）
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、これ以降、化合物Ｃと称される。

ＰＩ３キナーゼ阻害剤は、当該技術分野で既知であり、ペリフォシン、ＣＡＬ−１０１、ＰＸ−８６６、ＢＥＺ２３５、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ−０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、Ｚｓｔｋ４７４、ＰＴＷ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００−１１５、ＣＡＬ２８３、ＰＩ−１０３、ＢＹＬ７１９、ＧＮＥ−４７７、ＣＵＤＣ−９０７、及びＡＥＺＳ−１３６を含む。

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる第ＷＯ２００６／１２２８０６号は、ＰＩ３−キナーゼ阻害活性を有するイミダゾキノリン誘導体について記載している。本発明の非常に好ましい化合物は、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリル及びそのモノトシレート塩（化合物Ｄ）である。２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルの合成は、例えば、第ＷＯ２００６／１２２８０６号に実施例７及び１５２−３として記載される。本発明の別の非常に好ましい化合物は、８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピぺラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（化合物Ｅ）である。８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピぺラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンの合成は、例えば、第ＷＯ２００６／１２２８０６号に実施例８６として記載される。第ＷＯ０７／０８４７８６号は、ＰＩ３キナーゼ阻害活性を有するピリミジン誘導体について記載している。本発明の非常に好ましい化合物は、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン（化合物Ｆ）である。５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンの合成は、第ＷＯ０７／０８４７８６号に実施例１０として記載される。ＰＩ３−キナーゼ阻害活性を有する別の好ましい化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｘ）である。

ｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、当該技術分野で既知であり、クリゾチニブ、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＰＦ−０４２１７９０３、フォレチニブ、ＳＧＸ５２３、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＧＳＫ１３６３０８９、ＡＭＧ２０８、及びＩＮＣＢ２８０６０を含む。特定の実施形態において、ｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、式ＩＶ
の化合物またはその薬学的に許容される塩（これ以降、化合物Ｇ）である。

本方法に従って使用されるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、好ましくは選択的であり、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８を含むＡＴＰ競合性の汎用ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、第ＷＯ２００６／０００４２０号に開示されるアリール−ピリミジル−ウレア誘導体であり、具体的には、式（Ｖ）
の化合物またはその薬学的に許容される塩（これ以降、化合物Ｈ）である。

Ｍｅｋ１／２阻害剤が化合物Ａまたは化合物Ｂ、特に化合物Ｂであり、ＣＤＫ４阻害剤が化合物Ｃであり、ＰＩ３キナーゼ阻害剤が化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｆ、または化合物Ｘ、特に化合物Ｆであり、ｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤が化合物Ｇであり、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤が化合物Ｈであるか、もしくは上述の化合物の薬学的に許容される塩である場合、本方法の実施形態は特に好ましい。

式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤は、１日当たり１５０〜６００、好ましくは１日当たり４００〜６００、具体的には４５０〜６００ｍｇ／日の用量で投与される。薬物併用療法の第２の阻害剤として、化合物Ｂは、１５〜６０ｍｇ ＢＩＤ、好ましくは４５ｍｇ ＢＩＤの用量で投与され、化合物Ｃは、１００〜９００ｍｇ／日、好ましくは２００〜９００ｍｇ／日、例えば、２００、４００、７００、もしくは９００ｍｇ／日の用量で投与され、化合物Ｆは、３０〜１００ｍｇ／日、好ましくは６０〜１００ｍｇ／日もしくは６０〜８０ｍｇ／日の用量で投与され、化合物Ｇは、５０〜３００ｍｇ ＢＩＤ、好ましくは１００〜３００ｍｇ ＢＩＤ、例えば、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｍｇ ＢＩＤの用量で投与されるか、または化合物Ｈは、２５〜１２５ｍｇ／日、例えば、７５、１００、または１２５ｍｇ／日の用量で投与される。

上述の方法の重要な実施形態において、腫瘍サンプル中に発見されるＢＲＡＦの遺伝子異常は、Ｖ６００変異以外である。

本発明はさらに、個別、同時、または逐次投与のために、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、好ましくは式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、及びＦＧＦＲキナーゼ阻害剤からなる群から選択される第２の阻害剤とを含む治療的組み合わせに関する。より具体的には、個別、同時、または逐次投与のために、治療的組み合わせは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｆ、及び化合物Ｘ、もしくはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である第２の阻害剤とを含むか；または治療的組み合わせは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と、化合物Ｇもしくはその薬学的に許容される塩から選択されるｃ−Ｍｅｔ阻害剤である第２の阻害剤とを含むか；または治療的組み合わせは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と、化合物Ｈもしくはその薬学的に許容される塩から選択されるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤である第２の阻害剤とを含む。これ以降、そのような治療的組み合わせは、本発明の組み合わせと称される。

本発明はさらに、Ｂ−Ｒａｆの変異を特徴とする増殖性疾患、例えば、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、好ましくは式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ｃ−Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、及びＦＧＦＲキナーゼ阻害剤からなる群から選択される第２の阻害剤とを含む治療有効量の組み合わせを患者に投与することを含む。より具体的には、本発明は、Ｖ６００変異等のＢ−Ｒａｆの変異を特徴とする増殖性疾患、例えば、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療するための方法に関し、該方法は、治療有効量の本発明の組み合わせを患者に投与することを含む。好ましくは、これらの阻害剤は、組み合わせた場合に有益な効果を提供する治療有効投与量で投与される。投与は、個別、同時、または逐次であってもよい。

本発明はまた、それを必要とする患者において、増殖性疾患、具体的にはＢ−Ｒａｆの変異、特にＢ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする増殖性疾患、例えば、Ｂ−ＲａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫の治療または予防のための薬学的組成物または薬物の調製において使用される本発明の組み合わせにも関する。

本発明はさらに、増殖性疾患の進行の遅延または治療において使用される、治療剤としての本発明の組み合わせを、その同時、個別、または逐次投与のための説明書と一緒に含む市販のパッケージを提供する。

本発明の組み合わせの投与は、本発明の組み合わせにおいて使用される薬学的な治療剤のうちの一方のみを適用する単剤療法と比較して、例えば、症状の改善、その進行の遅延、または抑制に関連して、有益な効果、例えば、相乗的な治療効果をもたらし得るだけではなく、さらなる驚くべき有益な効果、例えば、より少ない副作用、より長期の反応、生活の質の改善、または罹患率の減少ももたらし得る。

以下の実施例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。

実施例１
試験の第１段階の間、患者は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を推奨ＩＩ相用量４５０ｍｇ／日の単剤として用いて治療される。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤は、経口用に処方されたカプセル型の固体分散剤として投与される。

試験の第２段階の間、患者は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を第２の標的薬剤と組み合わせて用いた治療を受ける（すなわち、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｆ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｈ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｇ、または式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｃ）。別の組み合わせ試験で以前に決定されていない限り、各組み合わせのＭＴＤ／ＲＰ２Ｄを確立するために、各組み合わせアームの用量漸増は、ベイズロジスティック回帰モデル（ＢＬＲＭ）によって誘導される。ＢＬＲＭを使用した非盲検用量漸増試験デザインは、癌患者においてＭＴＤ（複数可）及び／またはＲＰ２Ｄ（複数可）を推測するための十分に確立された方法である。試験に参加する患者の将来的なＤＬＴのリスクを制御するために、適合ＢＬＲＭは、過量投与制御を用いた用量漸増（ＥＷＯＣ）の原理によって誘導される。ＤＬＴを経験しなかった患者には最初のサイクル後に患者内用量漸増を許可する。

患者内用量漸増は、個々の患者の忍容性を反映した、修正されたＥＷＯＣ基準を用いてＢＬＲＭによって誘導される。小さいデータベースに関するベイズ反応適合モデルの使用はＥＭＥＡによって承認されており、その開発及び適切な使用は、ＦＤＡのクリティカルパス・イニシアチブ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐａｔｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）の態様の１つである。

併用薬の選択の理論的根拠
前臨床試験及び臨床試験からのデータは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｂの組み合わせを用いてＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の垂直な経路を同時に二重阻害することにより、臨床効果の増大を引き起こし、おそらくは、ＢＲＡＦ Ｖ６００依存性の進行型黒色腫に罹患する患者においていずれかの単剤に対する初期耐性を克服することができる。さらに、ＭＡＰＫシグナル伝達を再活性化するかまたはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路等の代替経路を活性化する他の機序は、ＢＲＡＦ阻害剤に対する初期耐性及び／または獲得耐性に関与し得る。したがって、それぞれ、ＰＩ３Ｋ、ｃ−ｍｅｔ、ＦＧＦＲ、及びＣＤＫ４／６キナーゼを標的とする選択された薬剤である化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、及び化合物Ｃとの組み合わせにおける式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の抗腫瘍活性もまた、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂに加えて評価される。個々の患者に投与される式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の組み合わせの選択は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤で進行が見られた時点でこの患者の腫瘍サンプル中に同定される遺伝子異常（複数可）に基づく（表１を参照）。

試験デザインの記述
これは、ＢＲＡＦ変異型の局所進行性または転移性の黒色腫に罹患する約１００人の患者を登録し、２つの治療段階からなる第II相多施設非盲検試験である。

最初の第１段階であるパートＩでは、選択的ＢＲａｆ阻害剤の投与歴のない患者が、ＲＰ２Ｄである４５０ｍｇ／日の式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤で疾患進行まで治療される（ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に定義される通り）。疾患進行の時点で腫瘍を生検し、選択されたパネルの遺伝子について分析する（表１）。

試験のパートＩで再発した患者は、適切な式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の合理的組み合わせを同定して開始することができるまで、耐性に関する生検の分子分析のための予定折り返し時間の間、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤を投与され続ける。

再発時の腫瘍生検から同定された遺伝子異常に基づいて、患者のコホートは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋第２の標的薬剤による目的に合った組み合わせ治療のために、試験の第２段階であるパートＩＩに参加する。調べられる５つの組み合わせ治療に対応する５つのアームが存在する：式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｆ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｈ、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｇ、及び式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｃ。第２の薬剤の選択は、表１の基準に従って規定される。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤で進行が見られた後、登録された患者の半数以上が、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂの組み合わせ治療を受けることが予想される。

ＢＲＡＦ Ｖ６００変異黒色腫に罹患する患者を式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤で治療した以前の試験で再発の見られたＢＲａｆ阻害剤治療の施用歴のある患者は、パートＩＩで式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤で進行が見られた後に登録することができる。これらの患者の場合、前回の治験から治療終了時の来院で採取された新しい腫瘍生検の分析結果が、パートＩＩにおける組み合わせ治療の割り当てに用いられる。

他の式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤試験（例えば、ＩＩＴ）で再発した患者は、進行後に式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を用いた治療が中止され、試験のパートＩＩにおいて合理的な組み合わせ治療に割り当てることができるまで式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤の投与を停止する。

この試験中、進行時のＣＴ前及び試験治療開始時の時間間隔が２８日以下である場合、これらの患者の進行性疾患は、以前の試験から確認されたと見なされ、試験のパートＩＩのベースラインの腫瘍評価として用いられる。

全ての患者が、規定されたＭＴＤ／ＲＰ２Ｄの二重の組み合わせで、またはＭＴＤ／ＲＰ２Ｄの二重の組み合わせが事前に決定されていない場合は、ベイズロジスティック回帰モデルによって許容される開始用量の第２の薬剤と組み合わせて、４５０ｍｇ／日のＲＰ２Ｄ（もしくはその患者による最終的な最大耐量）の式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤で合理的組み合わせを開始する。合理的な組み合わせ治療の段階は、ＭＴＤ／ＲＰ２Ｄの組み合わせが確立されるまで、第２の薬剤の用量を増加するという可能性を伴って続行される。ＢＬＲＭによって誘導される第２の薬剤の患者内用量漸増は、少なくとも１サイクルの間、所与の用量での組み合わせに耐容性を示した患者に対して予め規定された条件下で許容される。

組み合わせ治療は、疾患進行まで２１日サイクルで施され、組み合わせ治療中の腫瘍評価を再計算したベースラインと比較する（すなわち、腫瘍評価の結果が、パートＩまたは以前の試験のいずれかにおける式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤治療に対するＰＤ評価を導く）。

分子プレスクリーニング
試験のスクリーニング段階に参加するために、患者は、その地域で得られるはずである、新しい腫瘍生検（好ましい）または最新の入手可能な記録保存された腫瘍サンプルに関するＢＲＡＦ Ｖ６００変異についての文書を有していなければならない。しかしながら、本試験登録を検討した時点では分子状態が未知である患者、及び地域の研究所でＢＲＡＦ変異について日常的にスクリーニングされていない腫瘍を有する患者、及び新しい腫瘍採取が必要な患者は、分子プレスクリーニングに関するインフォームドコンセントに署名して、変異状態の局所的評価のために新しい腫瘍サンプルの採取を許可する。１回のみ、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異の状態が既知となるかまたは決定され、患者は、主要な試験用インフォームドコンセント用紙に署名することが許可され、スクリーニングが開始される。

スクリーニング
一旦、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異の状態が既知となるかまたは決定されると、患者は、主要な試験用インフォームドコンセント用紙に署名することが許可され、スクリーニングが開始される。試験治療薬の投与前に全てのスクリーニング評価が行われる必要がある。

治療期間
パートＩ及びパートＩＩの２つの治療段階が存在する：
第Ｉ段階＝単剤治療の段階であり、サイクル１の１日目に始まり、組み合わせ治療の開始まで続く。
第ＩＩ段階＝組み合わせ治療であり、再発時の腫瘍生検採取から遺伝子異常が既知となってから開始されるべきである。

試験治療薬は、２１日サイクルの間に投与され、疾患進行（二重の組み合わせ治療）、許容できない毒性、インフォームドコンセントの撤回、または死亡まで継続する。

患者集団
試験は、確認されたＢＲＡＦ Ｖ６００変異を内部に有する、局所進行性または転移性の黒色腫に罹患する成人患者において実施される。

治験の第１段階（パートＩ）に登録された患者は、選択的ＢＲａｆ阻害剤の投与歴があってはいけない。

以前に式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤を用いた治療を受けた患者は、再発時に腫瘍生検が採取された場合、パートＩＩに直接登録することができる。

本試験に登録した患者は、平行して治験薬または治験デバイスの試験に参加することは許可されない。さらに、試験を終了した患者は、第２の治療過程に再登録してはならない。

治験責任医師または被指名者は、以下の全ての組み入れ基準を満たし、除外基準のいずれも満たさない患者のみが、本試験において治療を提供されることを確実にしなければならない。

組み入れ基準
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の投与歴のない患者（パートＩに参加する資格がある）

試験の除外対象となる患者は、以下の基準の全てを満たさなければならない：
投与開始時の年齢≧１８歳
インフォームドコンセント用紙を理解して自由意思で署名することができること、ならびに予定された試験来院及び他のプロトコル要件に準拠する能力。書面のインフォームドコンセントは、スクリーニング手順の前に得られなければならない。
切除不能な病期ＩＩＩまたは転移性の黒色腫（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎＣａｎｃｅｒ［ＡＪＣＣ］によれば病期ＩＩＩＣ〜ＩＶ）の組織学的に確認された診断。
ＢＲＡＦ Ｖ６００変異に関する書類、
ベースライン時の新しい腫瘍生検、及び、医学的に矛盾がある場合、患者が再発時の強制的生検に合意すること。
ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１．によって決定されるような測定可能な疾患の証拠。
注）以前の放射線療法または他の局所領域的治療（例えば、経皮焼灼）の領域内の病変は、治療以来、病変の進行が立証されていない限り、測定可能であると考えられるべきではない。
余命≧３ヶ月
世界保健機関（ＷＨＯ）の活動指標≦２
妊娠の可能性のある全ての女性において、試験治療薬の最初の投与７２時間前以内に血清妊娠テストが陰性であること。
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤治療後の再発時に、強制的な新しい生検が入手可能でなければならない。

文書化された進行疾患を有する式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の他の単剤試験中の患者は、治療のための組み合わせアームの割り当てを決定する耐性プロファイルの結果に従って、パートＩＩに参加することができる。

これらの患者の進行性疾患は、腫瘍評価（アセスメント）を用いて以前の試験から確認されなければならない。疾患進行を立証する腫瘍評価と組み合わせ治療の最初の施用との間の時間間隔が４週間（２８日）を超える場合、新しい腫瘍評価が行われるべきである。前回の治験の治療終了時の来院で実行され、総合的遺伝子解析によって特徴付けられた生検が、組み合わせ治療の割り当てに必要である。

除外基準
本試験に参加する資格がある患者は、以下の基準のいずれも満たしてはならない：
パートＩ（式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤治療）への登録：
ＲＡＦ阻害剤を用いた以前の治療
症候性または未治療の軟髄膜疾患
症候性脳転移副腎皮質ステロイド療法の非存在下で無症候性である、以前にこの状態のための治療を受けているかまたは未治療の患者は、登録することを許可される。脳転移は、画像診断による検証を伴って、少なくとも３ヶ月は安定でなければならない（例えば、スクリーニングで終了した脳のＭＲＩまたはＣＴが、進行性の脳転移の証拠が現在認められないことを証明する）。患者は、酵素を誘導する抗てんかん薬を投与されることは許可されない。
既知の急性または慢性の膵炎
以下のうちのいずれかを含む臨床的に重要な心臓病：
治療を必要とするＣＨＦ（ＮＹＨグレード≧２）、ＭＵＧＡスキャンもしくはＥＣＨＯによって決定される場合ＬＶＥＦ＜４５％、または制御されない高血圧（ＷＨＯ−ＩＳＨガイドラインを参照のこと）。
臨床的に重要な心室性不整脈または心房細動の既往歴または存在
臨床的に重要な安静時の徐脈
試験薬を開始する３ヶ月前以内の不安定な狭心症
試験薬を開始する３ヶ月前以内の急性心筋梗塞（ＡＭＩ）
スクリーニングＥＣＧでＱＴｃＦ＞４８０ｍｓｅｃ
ベースライン時に以下の臨床検査値を有する患者：
好中球絶対数（ＡＮＣ）＜１，５００／ｍｍ３［１．５×１０９／Ｌ］
血小板＜１００，０００／ｍｍ３［１００×１０９／Ｌ］
ヘモグロビン＜９．０ｇ／ｄＬ
血清クレアチニン＞１．５×ＵＬＮ
血清総ビリルビン＞１．５×ＵＬＮ
ＡＳＴ／ＳＧＯＴ及びＡＬＴ／ＳＧＰＴ＞２．５×ＵＬＮ、または肝転移が認められる場合は＞５×ＵＬＮ
経口治験薬の吸収を著しく変化させる消化器（ＧＩ）機能障害またはＧＩ疾患（例えば、潰瘍性疾患、制御されない悪心、嘔吐、下痢、吸収不良症候群、小腸切除術）。
以前のまたは同時の悪性腫瘍例外：適切な治療が行われた基底細胞癌もしくは皮膚扁平上皮癌；治癒的に治療され、試験登録前の少なくとも３年間再発の証拠が見られない子宮頸部のｉｎ ｓｉｔｕ癌；または適切な治療が行われ、試験登録前の少なくとも３年間再発の証拠が見られない他の固形腫瘍。
６ヶ月以内に、一過性虚血発作、脳血管発作、深部静脈血栓症、または肺塞栓症を含む、血栓塞栓症または脳血管イベントの既往歴がある。
４週間（ニトロソウレア、マイトマイシンＣの場合は６週間）以内に放射線療法（＞３０％の骨髄予備能を含む）、化学療法、生物学的療法（例えば、抗体）を受けた患者、または試験薬開始前に、薬剤の５半減期以内（もしくは半減期が未知である場合は４週間以内）の連続的もしくは断続的な小分子治療薬もしくは治験薬を用いた治療を受けた患者、またはそのような治療の副作用（脱毛症を除く）から回復していない患者。
試験薬開始前の２週間以内に、いずれか大手術を受けた患者、または以前の手術から完全に回復していない患者。
既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染。
試験への参加もしくは試験薬の投与に関連するリスクを増加させ得るか、または試験結果の解釈を妨げ得、治験責任医師の判断において、患者を試験に不適切にするであろう、他の重度の急性もしくは慢性の医学的もしくは精神状態、または検査所見の異常。

妊娠中または授乳中（泌乳中）の女性：妊娠は、ｈＣＧ臨床検査が陽性（＞５ｍＩＵ／ｍＬ）であることによって確認される、受胎後の妊娠期間終了までの女性の状態として定義される。妊娠することが生理学的に可能な全ての女性として定義される妊娠の可能性のある女性は、試験を通して及び試験薬中止後１０日間、非常に効果的な避妊方法を使用していない限り、本試験に参加することは許可されない。

閉経後の女性は、本試験に参加することを許可される。適切な臨床プロファイル（例えば、年齢に応じた、血管運動性症状の既往歴）を伴う１２ヶ月間の自然（自発的）無月経の場合、あるいは６ヵ月間の自発的無月経であり、かつ血清卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）値が＞４０ｍＩＵ／ｍＬである場合、あるいは、スクリーニングの少なくとも６週間前に、外科的な両側卵巣摘出術（子宮摘出術を伴うかもしくは伴わない）または卵管結紮を行った場合、女性は閉経後であり、妊娠の可能性はないと見なされる。卵巣摘出術単独の場合、女性の生殖状態が、経過観察のホルモン値評価によって確認された場合にのみ、妊娠の可能性がないと見なされる。

性的に活発な男性は、薬を服用している間及び治療の中止後３ヶ月間は、性交中にコンドームを使用しなければならず、この期間中に子供を作るべきではない。コンドームは、精液を介した薬物の送達を防止するために、精管切除を受けた男性によっても使用される必要がある。

試験治療薬
本試験において使用される治験薬は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、化合物Ｂ、化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、及び化合物Ｃである。

試験治療薬は以下の通りである：
第Ｉ段階：式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤
第ＩＩ段階：二重の組み合わせ
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（ＱＤ）及び化合物Ｂ（ＢＩＤ）
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（ＱＤ）及び化合物Ｆ（ＱＤ）
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（ＱＤ）及び化合物Ｈ（ＱＤ）
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（ＱＤ）及び化合物Ｇ（ＢＩＤ）
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（ＱＤ）及び化合物Ｃ（ＱＤ）

投与計画
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋第２の薬剤の投与のための指示
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、化合物Ｆ、化合物Ｈ、及び化合物Ｃは、体重または体表面積によってではなく、均一の固定用量として日程に沿って（１日１回）経口投与される。

１日１回投与：患者は、毎日、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（及び化合物Ｆ、化合物Ｈ、または化合物Ｃ）のカプセルを大きなコップ１杯の水（約２５０ｍｌ）で朝に服用するように指示されるべきである。全ての用量の投与において、患者は、試験薬摂取の２時間前及び２時間後は絶食するべきである。患者が朝に薬剤を服用し忘れた場合、彼／彼女は、飲み損ねた投与から６時間以内にその用量を服用するべきである。６時間超が経過した場合、その日は投与を控えるべきであり、患者は、予定されている次の投与から治療を継続するべきである。何らかの理由で、朝食を摂取しなかった場合、患者は、なおもコップ１杯の水とともに予定された朝の用量を服用するべきである。これが完全ＰＫサンプリングの日に起こった場合、そのことは報告されるべきである。

化合物Ｂ及び化合物Ｇは、体重または体表面積によってではなく、均一の固定用量として日程に沿って１日２回（ＢＩＤ）経口投与される。

ＢＩＤ投与：化合物Ｂまたは化合物Ｇの用量は、１２±２時間空けて服用されるべきである。患者は、毎日、大きなコップ１杯の水（約２５０ｍｌ）で朝及び晩に薬剤を服用するよう指示される。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｇの組み合わせの場合、全ての用量の投与において、患者は、試験薬摂取の２時間前及び２時間後は絶食するべきである。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｂの組み合わせの場合、全ての朝の投与日に、患者は、試験薬摂取の２時間前以内には何も摂食すべきではなく、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｂの摂取後２時間は食事を控えるべきである。全ての晩の投与において、患者は、化合物Ｂ摂取の１時間前及び１時間後は絶食するべきである。両方の薬物（式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂ、または化合物Ｇ）は、朝に一緒に服用されるべきであり、ＢＩＤ投与される薬物のみ（化合物Ｂ、または化合物Ｇ）が、晩に服用されるべきであることに留意されたい。

ＰＫサンプリングが行われる日の投与に関する指示：
投与前ＰＫサンプルは、用量を摂取する直前に採取されるべきである。

各来院時に、治験施設の責任者は、適切な用量の各試験薬が投与されていることを確実にし、後の投与のために正しい量の試験薬（複数可）を患者に提供する。患者は、各来院時に未使用の試験薬を治験施設に返却するよう指示される。

患者は、カプセル／錠剤を咀嚼または破砕せずに、丸ごと嚥下するよう指示されるべきである。

抜かしたいずれの投与分も、予定されている次の投与の間または翌日のいずれか適用される方に、置き換えられたりまたは補われたりするべきではない。

ＣＹＰ３Ａ４が試験薬と相互作用する可能性があるため、患者は、全試験中、及び好ましくは試験薬の最初の投与の７日前には、グレープフルーツ、ザクロ、スターフルーツ、セヴィルオレンジ、または各々の果汁を含む製品の摂取を避けなければならない。オレンジジュースは許容される。

治療の過程で嘔吐及び／または下痢が起こった場合、予定されている次の投薬前に患者が再投与することは許されない。投与後４時間以内の嘔吐及び／または下痢（または排便回数の増加）の発生及び頻度は、ｅＣＲＦの有害事象の項に記載されなければならない。また、完全ＰＫサンプリングの日には、その日の投与後４時間以内の嘔吐のいずれのエピソードの発症時間も、Ｄｏｓｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄ ＰＫ ｅＣＲＦに記載されなければならない。

治験責任医師または治験施設の責任者は、患者にプロトコル通りに試験薬を服用するよう指示するべきである（コンプライアンスの促進）。試験中に患者に処方及び調剤された全ての投与量、ならびに全ての用量変更及び全ての抜かした投与は、Ｄｏｓａｇｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄ ｅＣＲＦに記録されなければならない。治験薬の管理は定期的に行われなければならない。患者は、各サイクルの終了時に未使用の試験薬を治験施設に返却するよう指示される。治験施設の関係者は、各来院時に適切な用量の各試験薬が投与されていることを確実にし、後の投与のために正しい量の試験薬を患者に提供する。

式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｆのみの組み合わせアームの場合
空腹時血糖値のモニタリングが行われる日の投与に関する指示：空腹時血糖値のモニタリングの日は、患者は、採血の少なくとも８時間前に一晩絶食しなければならない。空腹時血糖値の採取後には軽い朝食／軽食を摂取してもよい。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（及び該当する場合は化合物Ｆ）は、朝食後２時間で投与されてもよい。患者は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（及び該当する場合は化合物Ｆ）の投与後２時間は絶食を続けるべきである。

治療期間
患者は、許容できない毒性を経験するまで、及び／または治験責任医師の判断で、もしくはコンセントの撤回により治療が中止されるまで、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤を用いた治療を継続することができる。疾患進行の時点で、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の単剤治療後、患者は、再発生検で同定された遺伝子異常に従って組み合わせ治療に割り当てられる。患者は、許容できない毒性、疾患進行を経験するまで、及び／または治験責任医師の判断で、もしくはコンセントの撤回により治療が中止されるまで、組み合わせ治療を継続することができる。

用量漸増ガイドライン
開始用量の理論的根拠
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤
本治験の第１段階に登録された患者の式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の用量は、単剤のＲＰ２Ｄに相当する１日１回４５０ｍｇに設定されている。開始用量の選択は、癌に罹患する患者におけるファースト・イン・ヒューマン試験の開始用量を選択するためのＩＣＨ Ｓ９ガイドラインに従い、表６−２に示される。

化合物Ｂと組み合わせた式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤：
式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂの開始用量は、１日１回６００ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び１日２回４５ｍｇの化合物Ｂ、または安全であることが証明されている最も高い用量に設定される。

第２の薬剤（化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇまたは化合物Ｃ）と組み合わせた式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤：
本治験の第２段階では、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の薬剤の開始用量は、それぞれ１日１回４５０ｍｇ（ＲＰ２Ｄ）であるか、または式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の最終的な最大耐量及びＢＬＲＭによって許容される第２の薬剤の最大用量である（表３を参照）。

式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤のＲＰ２Ｄは、１日１回４５０ｍｇであると認定されている。

定性的ＤＤＩ評価は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤または化合物Ｆが同時投与された場合のこれらの曝露に対する著しい影響は予測しない。ＳｉｍＣＹＰシミュレーションを用いた定量的分析によって、この評価を裏付けた。したがって、この組み合わせ対の開始用量は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の現在確立されているＲＰ２Ｄ及び化合物Ｆの７５％ＭＴＤとして選択される：１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、及び７５ｍｇの化合物Ｆ。

Ｓｉｍｃｙｐシミュレーションを用いた定量的ＤＤＩ評価は、化合物Ｈと同時投与された場合に、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の曝露にわずかな変化を予測している。式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の用量である４５０ｍｇでは、化合物Ｈの曝露（Ｃｍａｘ及びＡＵＣ）が２０〜４０％減少することが予想される。したがって、この組み合わせ対の開始用量は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の現在確立されているＲＰ２Ｄ及び化合物Ｈの６０％ＭＴＤとして選択される：１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、及び７５ｍｇの化合物Ｈ。

Ｓｉｍｃｙｐシミュレーションを用いた定量的ＤＤＩ評価は、１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び１日２回１５０ｍｇの化合物Ｇが同時投与された場合、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤のＡＵＣ及びＣｍａｘにおいてそれぞれ７６％及び４３％の増加、ならびに化合物ＧのＡＵＣ及びＣｍａｘにおいてそれぞれ５４％及び３６％の減少を予測している。クリニックにおいて、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を１日１回最大７００ｍｇの用量で検査したところ、観察された有害事象は可逆的かつ管理可能であった：したがって、２つの分子間の潜在的なＤＤＩは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の濃度を現在確立されているＲＰ２Ｄよりも高くする可能性があるものの、有害事象が監視可能、管理可能、及び可逆的であるため、リスクをもたらすものではない。この組み合わせ対の開始用量は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の現在確立されているＲＰ２Ｄ及び化合物Ｇの５０％ＭＴＤとして選択される：１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、及び１５０ｍｇの化合物Ｇ。

Ｓｉｍｃｙｐシミュレーションを用いた定量的ＤＤＩ評価は、１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び３００ｍｇの化合物Ｃが同時投与された場合、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤のＡＵＣ及びＣｍａｘにおいてそれぞれ４３％及び２０％の増加、ならびに化合物ＣのＡＵＣ及びＣｍａｘにおいてそれぞれ４３％及び３７％の減少を予測している。クリニックにおいて、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を１日１回最大７００ｍｇの用量で検査したところ、観察された有害事象は可逆的かつ管理可能であった：したがって、２つの分子間の潜在的なＤＤＩは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の濃度を現在確立されているＲＰ２Ｄよりも高くする可能性があるものの、有害事象が監視可能、管理可能、及び可逆的であるため、リスクをもたらすものではない。化合物Ｃに関する最大耐量（ＭＴＤ）が達成されていないため、この組み合わせ対の開始用量は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の現在確立されているＲＰ２Ｄ、及び１日１回９００ｍｇの用量レベルで現在検査されている用量の約２３％として選択される：１日１回４５０ｍｇの式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、及び２００ｍｇの化合物Ｃ。

この試験では、潜在的な薬物間相互作用の評価のために、全ての組み合わせパートナー及びそれらの活性代謝物（該当する場合）の薬物動態を定常状態でできるだけ迅速に評価し、それぞれの単剤試験で得られたものと比較する。

最初の患者に組み合わせのうちの１つが投与される前に、現在進行中の単剤治験からの最新データを用いてこの組み合わせのベイズモデルを更新して、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び第２の薬剤について提案されている開始用量がなおも適切であること（すなわち、ＥＷＯＣ基準を満たすこと）を確認する。提案される開始用量が基準を満たさない場合、ＥＷＯＣ基準を満足させるより低い用量の組み合わせが使用される。

暫定的な用量レベル
表３は、本治験中に評価され得る組み合わせの試験治療薬の開始用量及び暫定的な用量レベルを記載する。最適な安全性及び忍容性、薬物動態、ならびに薬力学的データを提供するためにそのような変化が必要であると見なされる場合、現在特定されていないさらなる用量レベルが登録されてもよく、また、さらなる患者が既に検査された用量レベルで登録されてもよい。

用量漸増決定の実行
サイクルの最初の２１日間の間に、二重の組み合わせについて個々の患者の忍容性を評価した後で、第２の薬剤の用量を漸増するという決定が行われる。

用量漸増の決定を実行するために、入手可能な毒性情報（ＤＬＴではない有害事象及び検査所見の異常を含む）、ＢＬＲＭからの推薦、ならびに入手可能なＰＫ及びＰＤ情報が、用量決定の間に評価される。治験責任医師が、前回の用量レベルの結果が評価されたこと、及びより高い用量レベルへと進むことを容認できることを示す確認書を受け取るまで、次に高い用量レベルでの薬物投与へと進めることはできない。より高い用量レベルに漸増するという決定がなされたが、以前の用量レベルで治療を受けた１人以上のさらなる患者（複数可）が最初の治療サイクルの間にＤＬＴを経験している場合、そのより高い用量レベルで任意のさらなる患者が登録される前に、この新しい情報を用いてＢＲＬＭを更新する。

用量漸増プロセスは、段階的に実行され、患者３人のコホートで進められる。第２の薬剤、化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、または化合物Ｃのみが、ＢＬＲＭに従って漸増される。

式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤を用いた治療のパートＩ内のいずれの時点においても、患者内用量漸増は許容されない。

第２の薬剤の患者内用量漸増は、組み合わせ治療による第２段階の間に許容されるが、但し、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤及び化合物Ｂ（１日２回４５ｍｇ）の組み合わせの認定ＲＰ２Ｄで治療を受ける式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋化合物Ｂアームの患者は例外とする。

患者がより高い用量の化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、または化合物Ｃで治療を受けるためには、彼または彼女は、少なくとも１サイクルの治療の間、より低い用量の組み合わせに忍容性を示さなければならない（例えば、彼または彼女は、試験薬との関係を除外することができない、元々はＣＴＣＡＥグレード≧２の毒性を割り当てられたより低い用量対で経験していてはならない）。さらに、患者が治療される、新しいより高い用量対は、患者内漸増に用いられる修正されたＥＷＯＣ基準を満たさなければならない（項に参考を追加）。

次のコホートに新しく登録された患者は、最後の用量漸増検討会で決定された用量で治療を開始する。次いで、ベイズロジスティック回帰モデル（ＢＬＲＭ）及び患者内用量の境界を次のコホートのために更新する。

治療の中断及び治療の中止
患者が、予定されている次の投与が企図される日から連続して２１日を超える式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤、化合物Ｂ、化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｃ、または化合物Ｇの投与遅延を必要とする場合、患者は、試験治療を中止するべきである。例外的な状況として、患者が明らかに試験治療の恩恵を受けており（すなわち、病態の安定、部分奏功、完全奏功）、治験責任医師の意見において、安全性に関する懸念が存在しない場合、患者は、安全性に基づいて調整された用量レベルで試験治療に留まることができる。

分子プレスクリーニング
分子プレスクリーニングのインフォームドコンセント
分子プレスクリーニングのインフォームドコンセントは、試験に関連するあらゆる分子プレスクリーニング手順の前に署名されなければならない（ＢＲＡＦの変異状態が本試験外で既に評価されている場合は該当しない）。これは、パート１の患者にのみ適用される。

新しい生検または記録保存された生検のＢＲＡＦ変異状態
試験のスクリーニング段階に参加するために、患者は、その地域で得られるはずである、新しい腫瘍生検（好ましい）または最新の入手可能な記録保存された腫瘍サンプルに関するＢＲＡＦ Ｖ６００変異についての文書を有していなければならない。分子プレスクリーニングのインフォームドコンセントは、試験に関連するあらゆる分子プレスクリーニング手順の前に署名されなければならない（変異状態が本試験外で既に評価されている場合は該当しない）。

ＢＲＡＦ Ｖ６００コドンの変異（例えば、Ｖ６００Ｅ／Ｋ／Ｄ／Ｒ）が指定された地域の検査所によって確認され、治験施設によって文書化されてから、患者はスクリーニング手順を開始することができる。

治療期間
治療期間は２つの段階に分割される：
パートＩ：ＢＲａｆ阻害剤の投与歴のない患者が、サイクル１の１日目から始まる２１日（暦の上で３週）のサイクルで式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を連続的に投与される。サイクル間に休止期間は予定されていない。患者は、疾患進行後の組み合わせ治療の開始まで、または許容されない毒性が起こるまで（いずれか早い方）式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤を投与される。
パートＩＩ：少なくとも２１日サイクルの間、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤を投与されて進行した患者は、パートＩＩに参加し、再発時の腫瘍生検で同定された遺伝子異常に基づいて式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋第２の薬剤の治療組み合わせを施される。

決まった治療期間は存在しない：患者は、組み合わせ治療まで、及び最初の疾患進行の間にいかなるさらなる治療も妨げる許容されない毒性が起こるまで、ならびに／または、治験責任医師の判断で、もしくは患者の拒絶（コンセントの撤回）によって治療が中止されるまで、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤単剤による治療を継続することができる。最初の疾患進行時に、生検の分析結果が分かってから、患者は、２番目の疾患進行まで、いかなるさらなる治療も妨げる許容されない毒性が起こるまで、及び／または治験責任医師の判断で、もしくは患者の拒絶（コンセントの撤回）によって治療が中止されるまで、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤＋第２の阻害剤による組み合わせ治療を開始することができる。

患者が、２１日を超える投与中断が必要であるにもかかわらず、患者が試験に留まる場合、患者は臨床的有用性の客観的証拠を経験しており、治験責任医師の意見において、試験に留まることが患者の最前の利益であるためである。

ベイズロジスティック回帰モデル
ＥＷＯＣ原理によって誘導される適合ＢＬＲＭは、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と組み合わされる各試験薬（化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、または化合物Ｃ）の用量漸増を、そのそれぞれのＭＴＤ（複数可）／ＲＰ２Ｄ（複数可）になるよう誘導する。各組み合わせにつき、組み合わせ治療のための５パラメータＢＬＲＭを、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤と組み合わせて投与される化合物Ｆ、化合物Ｈ、化合物Ｇ、または化合物Ｃの用量−毒性関係をモデル化するために用量漸増を通して蓄積されたサイクル１用量制限毒性データ（すなわち、ＤＬＴの有無）に適合させる。

ＢＬＲＭの定義、以前のモデルパラメータの分布（標的とされる薬剤に関する現在入手可能な情報に基づく）、及び関連する以前のＤＬＴ率の分布を別表１に提供する。

用量の推奨
組み合わせパートナーの用量の推奨は、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の用量によって変化し、パートＩＩに参加する患者間で異なり得る。この推奨は、平均値、中央値、標準偏差、９５％信頼区間、及び各用量の組み合わせの真のＤＬＴ率が以下のカテゴリーのうちの１つに属する確率を含む、ＤＬＴ率の事後要約に基づいている：
［０％、１６％］過少投与
［１６％、３５％］標的とする毒性
［３５％、１００％］過剰な毒性

ＥＷＯＣの原理によれば、患者の各コホート後に、推奨される用量の組み合わせは、２５％未満の過剰な毒性の確率が存在する過量投与基準を満たす用量の間で標的間隔においてＤＬＴの最も高い事後確率［１６％，３５％］を有するものである。また、２つの試験薬にわたるコホート間の最大併用用量漸増は１００％に限定され、１００％は各試験薬の相対的な漸増の和を意味する：すなわち、式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤（用量は４５０ｍｇを超過できない）及び第２の標的薬剤（可能な場合はこのｓ．ａ．を超えて漸増できないＭＴＤ／ＲＰ２Ｄ）のそれぞれで、０％及び１００％である。

組み合わせパートナーの患者内用量漸増は５０％に限定され、個々の患者の忍容性を反映する以下の修正されたＥＷＯＣ基準に従ってＢＬＲＭによって誘導される：患者は、４０％未満の過剰な毒性の確率が存在する用量まで患者内漸増することができる。さらに、ある用量レベルで２人以上の患者にＣＴＣＡＥグレード２の治療に関連する毒性が観察された場合、またはいずれかの患者がグレード３以上の毒性を経験した場合、組み合わせパートナーの用量における増加は、その後のいずれの用量増加の場合も≦２５％とする。

入手可能な毒性情報（ＤＬＴではないＡＥを含む）、ＰＫ、ＰＤ、及び有効性情報、ならびにベイズモデルからの推奨の臨床合成は、用量漸増検討会で次のコホートの用量の組み合わせを決定するために使用される。治験責任医師及び治験担当者が意思決定に参加する。

３人目の患者の登録前にコホート内の最初の２人の評価可能な患者がＤＬＴを経験した場合、任意のさらなる患者がコホートに登録される前に、任意の組み合わせのモデルが再評価される。各組み合わせの最終的な推奨ＭＴＤ／ＲＰ２Ｄは、ＢＬＲＭからの推奨の検討と、検査される全ての異なる用量の組み合わせにおけるその後のサイクルからの忍容性データを考慮に入れた安全性の全体的評価とに基づいている。

実施例２
材料及び方法
最終濃度１０ｍＭの化合物ストック溶液をＤＭＳＯ中で調製する。２．７μＭ〜１．２ｎＭの範囲の最終アッセイ濃度に達するよう、作業ストック溶液を適切な細胞培養培地中で３倍ずつ段階希釈する。

細胞株、細胞培養液、細胞生存率の測定
Ａ−３７５及びＷＭ−２６６−４細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ａ−３７５細胞をＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）中で培養し、ＷＭ−２６６−４細胞をＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）中で培養し（両方に１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した）、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。一般的に存在する耐性を示す対立遺伝子を発現するように遺伝子操作した細胞株をＮｏｖａｒｔｉｓ−Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅから入手した。これらの耐性モデルは、変異ＭＥＫ１Ｐ１２４Ｌ、切断ｐ６１−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、または変異ＮＲＡＳＱ６１Ｋを発現するＡ−３７５細胞、及び変異ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓ、切断ｐ６１−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、または変異ＮＲＡＳＱ６１Ｋを発現するＷＭ−２６６−４細胞を含む。これらの細胞を、選択マーカーＧ４１８を含む適切な親培地中で、５ｕＭ ＬＦＥ１５８（ＭＥＫ変異体）またはＬＩＨ７２０（切断ｐ６１−ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）の存在下で培養した。

プレートの配置、細胞分注、及び化合物添加
スクリーニングのために、８チャネル標準カセットを備えたＭｕｌｔｉＤｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）内の８０ｕｌの培地に、ウェル当たり５００（Ａ−３７５）または７５０（ＷＭ−２６６−４）細胞の密度で細胞を播種した。ウェル全体にわたる細胞の均等な分布を促進するために、細胞を１０００ＲＰＭで短時間遠心分離し、室温で３０分間インキュベートした。化合物の添加前に全てのプレートを３７℃、５％Ｃ０２で２４時間インキュベートした。適切な培地中で化合物ストック溶液を新たに調製し、２００ｎｌピンツールを装備したＰＡＡロボットを使用して加えた。製造者のプロトコルに従ったＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び顕微鏡画像の両方で細胞のＡＴＰレベルを定量化することにより、最低でも３つの複製ウェルにおいて、７２時間後の単剤及び組み合わせの効果を評価した。画像診断のために、細胞をプレートに固定化し、制御された分注速度でＷｅｌｌＭａｔｅディスペンサーを用いてＰＢＳ中の１０％ＰＦＡ、０．３％ＴＸ−１００の溶液で透過処理した。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｈ３５７０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＢｉｏＴｅｋ洗浄機によって全ての必要な洗浄ステップを実行した。

自動画像分析
ＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８−９５３４−６３）からの画像はＴＩＦＦ形式であり、３８４ウェルプレートのウェル全体を取り込んだ２０４８×２０４８ピクセルのサイズを有していた。オープンソースの特注スクリプト、統計プログラミング言語であるＲ言語、及びＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅの機能を使用して、自動画像分析パイプラインを確立した。目的は、ウェル当たりの生存核（細胞）の数を細胞生存率の近似値として定量化することであった。パイプラインは７つのステップを含んでいた：（Ｉ．）強度ピークの数を減らすための画像の平滑化、（ＩＩ．）背景（ノイズ）から前景（シグナル）を分離するための閾値機能の適用、（ＩＩＩ．）核のためのシードとして機能する前景内の局所的最高点の特定、（ＩＶ．）近接する局所的最高点のフィルタリング、（Ｖ．）残りの局所的最高点からの核の伝搬（ＶＩ．）伝搬した核からの物体特徴の抽出（核の数、サイズ特徴、及び強度特徴）。最後のステップ（ＶＩＩ．）として、集計からデブリ（例えば、断片化された核）を除去するために、ＤＭＳＯ及びスタウロスポリン処理したウェル内で同定された物体を使用して生存核及び断片化された核それぞれの特徴分布を得た。これらは、生存核と断片化された核とを区別するカットオフを設定するために使用される。同定された物体の総数から断片化された核の数を差し引き、その結果は、ウェルの最終カウントとして報告される。

データの正規化
データは、各治療（化合物）条件、ＤＭＳＯ処理したウェルの４２個の複製、及びスタウロスポリン処理したウェルの複製について３通りの測定値を含んでいた。データをＤＭＳＯ測定値の中央値に対して正規化し、複製の中央値を算出することによって要約した。データをＣｈａｌｉｃｅに取り込み、化合物の相乗作用を算出した。

実施例３
７つの ＢＲＡＦ変異ＣＲＣ由来細胞株におけるＲＡＦ（式（Ｉ）の化合物）及びＰＩＫ３Ｃα（化合物Ｘ）キナーゼの阻害剤の増殖に対する単剤及び組み合わせの影響全ての細胞株はＢＲＡＦＶ６００Ｅタンパク質を発現する。既知のまたは推定上の活性化変異をＰＩ３Ｋα遺伝子の内部に有する細胞には（^＊）で印を付け、ＰＴＥＮ損失を有する細胞には（＃）で印を付けている。７２時間のＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ（商標）アッセイにおいて細胞増殖を測定したところ、供給された全ての結果は、少なくとも３通りの測定の結果であった。式（Ｉ）の化合物及び化合物Ｘの単剤ＩＣ５０値を示す。表６の各組み合わせてについて、５０％有効レベルでの相乗作用スコア（ＳＳ）測定値及び組み合わせ指数（ＣＩ５０）を提供する。ＳＳ値が≧２．０であり、ＣＩ値が≦０．５である場合に、相互作用は相乗的であると見なされた。ＳＳ値が≧２．０であるが、ＣＩ値が＞０．５である場合、またはＳＳ値が＜２．０であるが、ＣＩ値が≦０．５である場合のいずれかの場合に、相互作用は相加的／相乗的であると見なされた。ＳＳ値が＜２．０であり、ＣＩ値が＞０．５である場合に、相互作用は相加的であると称された。相乗作用の判定は、「効果の詳細」の列に示される。

実施例４
この実施例では、式（Ｉ）の化合物及び化合物Ｆが、単剤として及び組み合わせた場合に、ＨＴ−２９及びＲＫＯ細胞株のｉｎ ｖｉｖｏモデルの成長に与える影響を調べる。阻害剤の濃度及び投与スケジュールは、１日１回５０ｍｇ／ｋｇ（式（Ｉ）の化合物）、及び１日１回３２．７ｍｇ／ｋｇ（化合物Ｆ）であった。全ての化合物を、そのまま組み合わせて単剤として投与した。投与は、ＨＴ−２９モデルにおいて２８日目に停止され、ＲＫＯモデルにおいて２１日後に停止された。その結果を図１及び２にそれぞれ示す。

実施例５
全ての細胞株は、ＡＴＴＣから購入した（ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＵＡＣＣ−６２、ＣＯＬＯ ７４１、ＣＯＬＯ−８００、ＷＭ−２６６−４、Ｃｏｌｏ２０５、ＬＳ４１１Ｎ、ＳＷ １４１７）、ＥＣＡＣＣ（ＭＤＳＴ８）、ＤＳＭＺ（ＣＬ−３４）、及びＮＣＩ（ＬＯＸ ＩＭＶＩ）。供給者の推奨に従って１０％（またはＣＬ−３４細胞の場合は２０％）ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１００９９−１４１）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００１）またはＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００２）のいずれかで細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータで細胞株を培養し、Ｔ−７５フラスコ内で増殖させた。全ての場合において、細胞は凍結ストック溶液から解凍し、１：３希釈を用いて１回以上の継代によって増殖させ、集計し、ＶｉＣｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生存率について評価した後、９６ウェルまたは６ウェルプレートに播種した。細胞株を分割して増殖させるために、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を用いて細胞をフラスコから除去した。全ての細胞株は、Ｉｄｅｘｘ Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）で実行されるＰＣＲ検出方法によって測定された場合にマイコプラズマ汚染を含まないように、またＳＮＰのパネルの検出によって正しく同定されるように徹底させた。

式（Ｉ）の化合物及び化合物Ｈを１００％ＤＭＳＯ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号２５−２９０−ＣＱＣ）に１０ｍＭの濃度で溶解し、使用するまで−２０℃で保存した。深さ２ｍｌの９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号７８０２７１）内に化合物を配置し、３倍７回段階希釈して２２ｎＭ〜１６２００ｎＭの範囲の濃度を得た。組換えヒト塩基性ＦＧＦをＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２３３−ＦＢ）から購入し、滅菌ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌで再構成した。これを全ての実験において１００ｎｇ／ｍｌの一定濃度で使用した。

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）アッセイのために、組織培養処理した９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０４）に細胞を分注し、培地の最終体積を８０μＬとし、ウェル当たり３０００細胞の密度とした。 ｐｅｒ ｗｅｌｌ．播種から１２〜２４時間後、２０μＬの各化合物の希釈シリーズを細胞を含むプレートに移し、３倍希釈により２７００ｎＭ〜３．７ｎＭの範囲の化合物濃度、及び０．１６％の最終ＤＭＳＯ濃度を得た。各ウェルの総体積は１２０μＬであった。プレートを７２時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（ＣＴＧ、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＶｉｃｔｏｒ（商標） Ｘ４ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して化合物が細胞増殖に与える影響を決定した。リアルタイムの細胞増殖アッセイのために、全部で９０μｌの培地中、ウェル当たり４０００細胞の密度でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ−Ｐｌａｔｅ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０５２３２３６８００１）に細胞を播種し、播種から２４時間後、化合物を含むかまたは含まない１１μｌの培地をウェルに加えた。全ての細胞株及び治療群につき２〜４つの複製ウェルに播種したが、但し、ＬＧＸ８１８＋ＦＧＦ２で処理したＣＯＬＯ ７４１細胞（Ｎ＝１）は例外とする。化合物及び増殖因子の指示最終濃度は、化合物Ｈが１ｕＭ、ＦＧＦ２が１００ｎｇ／ｍｌ、式（Ｉ）の化合物は１００ｎＭ（ＳＫ−ＭＥＬ−５）または５００ｎＭ（ＣＯＬＯ ７４１）のいずれかであった。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイムインピーダンスに基づく細胞分析装置を用いて、２時間ごとに７日間継続的に細胞を監視した。インピーダンスはＥ−Ｐｌａｔｅ上の電極を使用して測定し、細胞の表面積被覆が増加すると電極インピーダンスが上昇した。電極インピーダンスは、細胞指数値として表示され、細胞の生存率及び数の代理として用いられた。全ての場合において、化合物添加直後の時点で細胞指数値を正規化した。

ウェスタン分析のために、２．０ｍｌの完全倍溶媒中、ウェル当たり５ｘ１０５細胞の密度で６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５０６）プレートに細胞を播種した。播種から１２〜２４時間後、種々の化合物で細胞を処理し、全ての実験において、式（Ｉ）の化合物、化合物Ｈ、及びＦＧＦ２をそれぞれ１００ｎＭ、１．０ｕＭ、及び１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。ホスファターゼ（ＰｈｏｓＳｔｏｐ，Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４９０６８４５００１）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１６９７４９８００１）の両方を添加した、新たに調製した細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号９８０３）中に化合物を添加し、２時間後及び２４時間後に細胞を回収した。ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉ Ｇｅｌ（Ｎｏｖｅｘ、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０）による電気泳動によって細胞可溶化物からタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に移し、その後、ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３、カタログ番号４０５８）、全ＡＫＴ（カタログ番号２９２０）、ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４、カタログ番号９１０１）、全ＥＲＫ１／２（カタログ番号９１０７）、ｐ−ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／２２１、カタログ番号９１２１）、及びβアクチン（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ４３０２）を認識するＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ，ＵＳＡ）からの抗体とともにインキュベートした。ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、カタログ番号９２６−６８０７１）及びＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、カタログ番号９２６−３２２１０）とともにインキュベーションした後、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）でスキャンしてウェスタンブロットを可視化した。

ＦＧＦＲが式（Ｉ）の化合物で処理したＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異黒色腫細胞株のサブセットをレスキューできるかどうかを決定するために、ＦＧＦＲ活性化リガンドＦＧＦ２の存在下または非存在下のいずれかで、１１個のＴ１７９９変異ＢＲＡＦ細胞株におけるその抗増殖効果を調べた。ＦＧＦ２の非存在下では、６つの黒色腫及び５つのＣＲＣ由来細胞株のＩＣ５０値は、それぞれ３．０〜４７０ｎＭ及び４．０〜１８５ｎＭの範囲であった（表７）。細胞株のうち６つについて測定されたＩＣ５０値は、ＦＧＦ２の存在による影響を受けていなかったが、残りの５つの細胞株の式（Ｉ）の化合物に対する反応は、大きく減少した（例えば、ＣＬ−３４）か、または完全に消失した（例えば、ｌｓ ４１１Ｎ）かのいずれかであった。したがって、ＦＧＦ２の存在は、一連のＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫由来細胞株を式（Ｉ）のＢ−Ｒａｆ阻害剤の抗増殖効果からレスキューすることが可能である。さらに、ＣＲＣ腫瘍に由来するＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異細胞株においても同様の効果が観察された。

ＢＲＡＦ Ｔ１７９９変異黒色腫及びＣＲＣ細胞株のパネルにおける、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含むまたは含まない式（Ｉ）の化合物の単剤ＩＣ５０値公開データから変異（ｍｕｔ）及び野生型（ｗｔ）の状態を決定した。それぞれＶ６００Ｋ及びＶ６００Ｄを有するＭＤＳＴ８（ｍｕｔ^＊）及びＷＭ−２６６−４（ｍｕｔ^＊＊）の場合を除いて、全てのＢＲＡＦ変異がＶ６００Ｅ置換をもたらした。ＰＴＥＮ ｍｕｔの記号表示は、ＰＴＥＮ遺伝子の突然変異、遺伝子コピー数、及びｍＲＮＡ発現情報に基づく略式名称を表す。

ＦＧＦ２によるＢＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫細胞株のレスキューがＦＧＦＲシグナル伝達に依存するかどうかを決定するために、我々は、選択的ＦＧＦＲ阻害剤化合物ＨがＦＧＦ２媒介性レスキューを阻止できるかどうかを調べた。ＦＧＦ２によって異なる程度までレスキューされた２つの細胞株（ＣＯＬＯ ７４１及びＳＫ−ＭＥＬ−５、表８−１）を、化合物Ｈの存在下または非存在下のいずれかで式（Ｉ）の化合物及びＦＧＦ２を含有する培地中で培養し、増殖をリアルタイムで測定した。

初期のＩＣ５０データと一致して、式（Ｉ）の化合物は両方の細胞株の増殖を抑制し、この増殖抑制はＦＧＦ２の添加により無効にされた（図３）。単剤として、化合物Ｈは、いずれの細胞株の増殖にも影響を与えず（パネルＡ、ＳＫ−ＭＥＬ−５については図示せず）、ＦＧＦ２の非存在下で式（Ｉ）の化合物と組み合わせた場合、その単剤活性に寄与しなかった。ＦＧＦ２の存在下で式（Ｉ）の化合物と組み合わせた場合、化合物Ｈは、ＦＧＦ２の非存在下で観察されたレベルまで抗増殖効果を回復した。これらの結果は、選択的ＦＧＦＲ阻害剤化合物Ｈの添加によりＦＧＦ２媒介性レスキューを回避できることを示している。

回復されたＭＡＰＫまたは活性化されたＰＩＫ３Ｃのいずれかのシグナル伝達が、ＦＧＦ２媒介性レスキューの根底にあるかどうかを調査するために、ＦＧＦ２がＭＡＰＫ及びＰＩＫ３Ｃシグナル伝達に与える影響をリン酸化ＭＥＫ１／２（ＭＡＰ２Ｋ１／２）、ＥＲＫ１／２（ＭＡＰＫ１／２）、及びＡＫＴ１／２／３のウェスタンブロット分析により調べた。図４に示すように、ＣＯＬＯ ７４１及びＳＫ−ＭＥＬ−５細胞を式（Ｉ）の化合物とともにインキュベーションすることによって、リン酸化ＭＥＫ及びＥＲＫの両方のレベルにおける減少によって判断されるように、化合物添加の２時間後及び２４時間後の両方でＭＡＰＫシグナル伝達の顕著な抑制がもたらされた。２時間では、ＡＫＴのリン酸化レベルは影響を受けていなかったが、２４時間ではＣＯＬＯ ７４１細胞においてわずかな減少を示した。対照的に、ＦＧＦ２または化合物Ｈのいずれも、単剤として加えられた場合、２時間または２４時間のいずれにおいてもシグナル伝達に影響を与えなかった。ＦＧＦ２及び式（Ｉ）の化合物を組み合わせた場合、処理後２時間で、式（Ｉ）の化合物単独の場合と比べてわずかなシグナル伝達の変化が観察されたが（ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞においてｐ−ＥＲＫの若干の増加が観察されたが）、リン酸化ＭＥＫ及びＥＲＫの両方のレベルは、２４時間までには完全ではないものの大分回復された。最後に、化合物Ｈを式（Ｉ）の化合物／ＦＧＦ２の組み合わせに添加すると、ＭＡＰＫ及びＰＩＫ３Ｃシグナル伝達におけるＦＧＦ２によって誘導された変化が完全に無効にされた。これらのデータは、ＦＧＦ２によるＢ−Ｒａｆ阻害剤の抗増殖効果の抑制が、ＭＡＰＫシグナル伝達の再活性化に起因するものであることを強く示唆しており、化合物Ｈは、これらのＦＧＦ２によって誘導されるシグナル伝達の変化を完全に抑制することが可能であることを示している。

実施例６
目的：５ｍｇ／ｋｇの式（Ｉ）の化合物（ＨＭＥＸ１９０６−Ｒ５）の存在下で増殖させ、それに対して耐性を示すＨＭＥＸ１９０６原発性黒色腫モデルにおいて、式（Ｉ）の化合物及びＣＤＫ４阻害剤化合物Ｃの組み合わせの有効性を評価すること。

薬物の配合：化合物Ｃを０．５％ＭＣ／０．５％Ｔｗｅｅｎ８０に配合し、式（Ｉ）の化合物を２０％ＰＥＧ３００／３％ＥＴＰＧＳに配合した。

腫瘍を懸濁液様細胞株に小片化／細分化した（腫瘍の均質化）。７ｍＬのマトリゲル及び１．５ｍＬのＨＢＳＳを加えた。マトリゲルが粘性を帯びるまで懸濁液を手のひらで温め、メスヌードマウスの右側腹部に１８Ｇ針で皮下注射により移植した。

移植後１８日に、平均腫瘍体積２６６ｍｍ^３及び平均体重２５グラムでマウスを以下の群に割り当てた。
群：マウス１０匹／群、経口経路、投与体積０．２ｍＬ
群１：ビヒクル、０ｍｇ／ｋｇ １日２回×１４
Ｇｒｏｕｐ ２：化合物Ｃ、２５０ｍｇ／ｋｇ ｑｄ×２１
群３：式（Ｉ）の化合物、５ｍｇ／ｋｇ１日２回×２１
群４：化合物Ｃ ２５０ｍｇ／ｋｇ １日１回×２１＋式（Ｉ）の化合物５ｍｇ／ｋｇ １日２回×２１

Claims (3)

1. Ｂ−ｒａｆのＶ６００変異を特徴とする黒色腫に罹患する患者を治療する方法で使用するための組成物であって、前記方法が
   式（Ｉ）の化合物
   及び
   化合物Ｂ
   であるＭｅｋ１／２阻害剤を含む薬物併用療法を施すことを含む、
   式（Ｉ）の化合物または化合物Ｂを含む組成物。
2. 式（Ｉ）の化合物を含む請求項１記載の組成物。
3. 化合物Ｂを含む請求項１記載の組成物。