KR20190103156A - 암에서 비-유전적 약물 내성 프로그램을 표적으로 하는 약물의 동정 - Google Patents

암에서 비-유전적 약물 내성 프로그램을 표적으로 하는 약물의 동정 Download PDF

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Abstract

세포-기반 스크리닝 방법이 제공된다. 상기 스크리닝 방법은 개별의 과-활성화된 신호전달 경로의 저해제와의 병용 약제에서 과-활성화된 신호전달 경로를 갖는 세포를 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 약물을 동정하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, SOX2의 발현 수준이, MAPK 및 EGFR 경로의 저해제에 대한 저항의 발생을 방지하는 화합물을 동정하기 위해, 결정된다.

Description

암에서 비-유전적 약물 내성 프로그램을 표적으로 하는 약물의 동정
본 발명은 암 치료에 유용한 화합물, 구체적으로 전적으로는 아니지만, MAPK 및 EGFR 경로의 저해제들과 조합하여 유용한 화합물을 동정하기 위한 세포-기반 모듈식 스크리닝 접근법 (cell-based modular screening approach)에 관한 것이다.
암 세포의 유전적 변형은 종종 세포 주기 조절, 증식, 분화 및/또는 신호 전달에 중요한 유전자에 영향을 미친다 (Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2000), Cell 100, 57-70; Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2011), Cell 144, 646-674). MAPK 경로의 종양발생 활성화는 흑색종, 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer: NSCLC) 및 췌장암을 포함하는 많은 인간 암의 시그니쳐 특성이다 (Dhillon, A.S. et al. (2007), Oncogene 26, 3279-3290). 예를 들어, 흑색종의 50%는 구성적 MAPK 신호전달을 활성화하는 BRAF-V600E 종양단백질에 의해 유발된다 (Davies, H. et al. (2002), Nature 417, 949-954). BRAF-V600E 특이적 소분자 저해제는 BRAF-V600E-양성 전이 흑색종 치료를 위한 표준 치료적 접근법이다. 상기 치료법은 처음 몇 개월간은 극적인 종양 수축을 유도하지만, 거의 모든 환자들은 치료가 계속되면 내성을 획득한다 (Flaherty, K.T. et al. (2010), N. Engl . J. Med . 363, 809-819; Johnson et al. (2015), Eur J Cancer, 51(18):2792-9). 무진행 생존 (progression free survival)은 병용 요법으로 예를 들어 BRAF와 제2 저해제, 예컨대 하류 키나제 MEK를 동시에 표적으로 함으로써 연장될 수 있다고 개시되었고, 상기 방법은 WO 2011/112678 A1 및 WO 2014/147573 A2에서 개발되었지만, 대부분의 환자들은 여전히 상기 분자적으로 표적화된 약물의 이익을 제한하는 내성-유발하는 유전적 변형을 획득하였다 (Flaherty, K.T. et al. (2012), N. Engl . J. Med . 367, 1694-1703; Larkin, J. et al. (2014), N. Engl . J. Med . 371, 1867-1876; Long, G.V. et al. (2014), N. Engl . J. Med . 371, 1877- 1888). EGFR을 표적으로 하는 항체 또는 소분자 저해제에 의한 NSCLC의 치료에서 환자는 항상 새로운 내성을 유발하는 돌연변이를 획득하기 때문에 유사한 임상적 장애에 직면하였다 (Janne et al. (2005), J. Clin. Oncol., 23:3227-3234; Kobayashi et al. (2005), N Engl J Med, 352:786-792).
전술한 기술 수준에 기반하여, 본 발명의 목적은 MAPK 및 EGFR 경로의 저해제에 대한 저항 발생을 방지할 수 있고, 구체적으로 MAPK 및 EGFR 경로 및/또는 유사한 약물 내성 기전이 나타나는 다른 요법의 저해제와의 병용 약제로 신규한 화합물을 동정하기 위한 수단 및 방법을 제공하는데 있다. 상기 목적은 본 명세서 중 청구범위에 의해 달성된다.
용어 및 정의
본 명세서의 문맥에서 용어 "신호전달 경로에 포함된 단백질"은 세포에서 상호작용하여 특정 세포 기능, 예컨대 증식, 분화 또는 아폽토시스를 조절하는 분자에 관한 것이다. 하나의 신호전달 경로에 포함되는 분자는 협동 활성화 캐스케이드 (concerted activation cascade)의 일부이다. 자극에 따라, 상기 경로에서 제1 분자는 하나 또는 수 개의 하류 분자를 활성화한다. 상기 활성화는 활성화 사슬에서 마지막 분자가 활성화되고 세포 기능이 수행될 때까지 전달된다.
MAPK 경로와 관련하여, 이는 NGF, NRG, BDNF, NT3/4, EGF, FGF, PDGF, CACN, TrkA/B, EGFR, FGFR, PDGFR, ROS, ALK, MET, KIT, GFB2, SOS, HRAS, KRAS, NRAS, RasGRF, RasGRP, CNasGEF, PKC, PKA, Rap1, G12, Gap1m, NF1, p120GAF, RafB, ARAF, BRAF, CRAF, Mos, MEK1, MEK2, MP1, ERK1, ERK2, PTP, MKP, Tau, STMN1, cPLA2, MNK1/2, RSK2, CREB, Elk-1, Sap1a, c-Myc, SRF 및 c-fos를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 특정 리간드, 수용체 및 하류 전사 인자 (downstream transcription factors)에 관한 것이다.
본 명세서의 문맥에서 용어 "활성화 돌연변이 (activating mutation)"는 유전자 산물의 증가된 활성을 초래하는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 변경에 관한 것이다. 상기 증가된 활성은 증가된 효소 활성, 연장된 반감기 또는 유전자 산물의 과발현에 기인할 수 있다.
본 명세서의 문맥에서 용어 "SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자"는, SOX2가 동일한 세포에서 발현되지 않는 경우의 제1 발현 수준, 및 SOX2가 동일한 세포에서 발현되는 경우의 제2 발현 수준을 특징으로 하는 유전자에 관한 것이다. 상기 제1 발현 수준은 상기 제2 발현 수준보다 낮다.
소정의 구체예에서, SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자는 Nanog , OCT4 , FGF4 , FBX15, FOXP4 , KLF9 , CD24, CD271, CD36, ITLN2 , TNFSF12 , NOX3 , CLEC7A , ACYAP1 , UNC5C , UNC5D , MUC16 , VAV3, FOXD3 , VGLL3 , ALPP , C3, F2R , ENPP2 , ETV4 , NTNG1 , NTRK2, ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
SOX2의 발현 수준 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준은 단백질 발현 및/또는 mRNA 발현 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 (treatment)"는 질환의 적어도 하나의 증상을 예방, 완화, 감소 또는 경감시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료는 암과 같은 장애의 하나 또는 수개의 증상들의 감소 또는 장애의 완전한 박멸일 수 있다. 본 발명의 의미 안에서, 용어 "치료"는 또한 발병 (즉, 질병의 임상적 증상 발현 이전의 기간)을 정지, 지연시키고 및/또는 질병이 발전 또는 악화되는 위험을 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "흑색종"은 멜라닌세포로부터 발생하는 형태 암 (form cancer)을 나타낸다. 흑색종은 통상적으로 피부에 영향을 주지만, 또한 입, 장, 또는 눈에 영향을 줄 수 있다. 흑색종은 또한 혈액 또는 림프계를 통해 장기 및 뼈로 퍼질 (전이될) 수 있다. 흑색종은 피부에서 기존 기태 (mole) 또는 다른 반점으로부터 또는 반점이 없는 피부로부터 발생할 수 있다.
용어 "비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer)" 및 "NSCLC"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 귀리 세포 (oat cell) (또는 소세포) 유형이 아닌 폐의 악성 신생물을 나타내고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 선암종, 편평 세포 암종 및 대세포 암종을 포함하는 인식되는 유형의 기관지 암종 (기관지 내측에서 발생하는 암종)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "저항 (resistance)" 및 유사어는 저해제에 의한 치료에 대해 무-반응성 또는 감소된 반응성을 포함한다. 무-반응성 또는 감소된 반응성은 치료 유익의 부재 또는 감소, 예컨대 질병의 적어도 하나의 증상의 완화, 감소 또는 경감의 감소 또는 중지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉 (contact)" 및 유사어는 신호전달 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성 돌연변이를 갖는 세포에 물리적으로 근접하게 신호전달 경로의 저해제 및/또는 시험 화합물을, 직접적 또는 간접적으로, 함께 하도록하는 것을 의미한다. 상기 세포를 저해제 및/또는 시험 화합물과 접촉시키는 것은 세포의 생존을 촉진하는 임의의 배양 배지에서 및 임의의 배양 조건하에 수행될 수 있다. 접촉시키는 것은, 예를 들어, 신호전달 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이를 갖는 세포를 포함하는 용기, 예컨대 비이커, 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate), 세포 배양 플라스크 또는 마이크로어레이 등에 신호전달 경로의 저해제 및/또는 시험 화합물을 넣는 것을 포함한다. 대안으로서, 접촉시키는 것은 하나의 작용제를 다른 작용제에 근접하게 가져가서 작용제들 모두가 서로 상호작용할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어 항체 또는 다른 결합 구성원을 세포내의 단백질에 근접하게 가져갈 수 있고, 상기 항체가 상기 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 경우, 상기 항체는 상기 단백질에 결합할 것이다. 또 다른 예에서, 제1 핵산은 제2 상보적 핵산 (표적 서열을 갖는 프라이머)에 근접하게 가져갈 수 있고, 인큐베이트하여 결합이 검출될 수 있거나 또는 표적 서열의 증폭이 발생될 수 있다.
또한, 청구범위에서 단어 "포함하는"은 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않으며, 부정관사 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "저해제"에 대한 언급은 하나 이상의 저해제들을 포함한다.
설명
본 발명의 제1 양상에 따르면, 암 치료에 유효한 화합물을 동정하기 위한 세포-기반 스크리닝 방법이 제공된다. 상기 암은 과-활성화된 신호전달 경로를 특징으로 하는 세포를 특징으로 한다. 상기 과-활성화는 신호전달 경로에서 작용하는 단백질을 코딩하는 유전자의 활성화 돌연변이 또는 이의 증폭에 의해 유발된다. 당업자는 신호전달 경로의 과-활성화가 또한 NF1과 같이 신호전달 경로의 저해제를 코딩하는 유전자의 억제 돌연변이 또는 결실에 의해 유발될 수 있다는 것을 알고 있다. 상기 화합물은 개별의 과-활성화된 신호전달 경로의 저해제를 포함하는 병용 약제로 암 치료에 효과적이다. 세포 기반 스크리닝 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 신호전달 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이를 갖는 세포를 제공하는 단계.
b. 상기 세포를 신호전달 경로의 저해제 및 시험 화합물과 접촉시키는 단계.
c. SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계.
d. 상기 시험 화합물에 점수를 부여하는 단계로서, 상기 점수는 상기 시험 화합물의 효능을 반영하는 것인 단계.
SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 구체적으로 Nanog , OCT4 , FGF4, FBX15 , FOXP4 , KLF9 , CD24, CD271, CD36, ITLN2 , TNFSF12 , NOX3 , CLEC7A , ACYAP1 , UNC5C , UNC5D , MUC16 , VAV3 , FOXD3 , VGLL3 , ALPP , C3, F2R , ENPP2, ETV4 , NTNG1, NTRK2 , ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준이 미리결정된 역치 (predetermined threshold)보다 낮은 경우 점수는 높다. 상기 미리결정된 역치는, 시험 화합물을 제외한, 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준에 해당한다. 따라서, 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서, SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 예컨대 상기에 열거된 유전자들 중 하나의 발현이, 신호전달 경로의 저해제를 본 발명의 방법에서 사용된 시험 화합물과 함께 접촉시킨 세포에서 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현보다 낮은 경우, 점수는 높게 결정된다.
SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 구체적으로 Nanog , OCT4 , FGF4, FBX15 , FOXP4 , KLF9 , CD24, CD271, CD36, ITLN2 , TNFSF12 , NOX3 , CLEC7A , ACYAP1 , UNC5C , UNC5D , MUC16 , VAV3 , FOXD3 , VGLL3 , ALPP , C3, F2R , ENPP2, ETV4 , NTNG1, NTRK2 , ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 그룹으로부터 선택된 유전자의 발현 수준이 미리결정된 역치와 동일하거나 또는 더 높은 경우, 상기 점수는 낮다. 따라서, 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서, SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 예컨대 상기에 열거된 유전자들 중 하나의 발현이, 신호전달 경로의 저해제를 본 발명의 방법에서 사용된 시험 화합물과 함께 접촉시킨 세포에서 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현보다 높은 경우, 점수는 낮게 결정된다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 점수는 다른 시험 화합물과 비교하여 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현이 감소되면 증가한다. 즉, SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 더 많은 발현이, 상기에 정의된 대조군 세포와 비교하여 감소되면, 점수는 더 높아질 것이다. 유사하게, 상기 점수는 다른 시험 화합물과 비교하여, SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현이 증가되면 감소한다. 즉, SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 더 많은 발현이 상기에 정의된 대조군 세포와 비교하여 증가되면, 점수는 더 낮아질 것이다.
소정의 구체예에서, 단계 a 내지 d는 복수의 세포로 동시에 수행된다.
소정의 구체예에서,
a. 복수의 세포를 단계 a에서 동시에 사용한다;
b. 상기 복수의 세포를 단계 b로 함께 제공한다;
c. SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 구체적으로 Nanog , OCT4, FGF4 , FBX15 , FOXP4 , KLF9 , CD24, CD271, CD36, ITLN2 , TNFSF12 , NOX3 , CLEC7A , ACYAP1 , UNC5C , UNC5D , MUC16 , VAV3 , FOXD3 , VGLL3 , ALPP , C3, F2R , ENPP2, ETV4 , NTNG1 , NTRK2 , ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 유전자의 평균 발현 수준을 상기 복수의 세포에서 동시에 결정한다;
d. SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 평균 발현 수준이 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 평균 발현 수준보다 낮은 경우 높은 점수가 상기 시험 화합물에 부여된다.
소정의 구체예에서,
a. 복수의 세포를 단계 a에서 동시에 사용한다;
b. 상기 복수의 세포를 단계 b로 함께 제공한다;
c. SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준이 처리되지 않은 세포에 대해 결정된 발현 수준보다 높은 경우 단일 세포를 "SOX2 양성"으로 평가하고, 전체 세포에 대한 "SOX2 양성" 세포의 비율이 상기 복수의 세포에 대해 결정된다;
d. 상기 시험 화합물로 처리된 세포에 대해 결정된 비율이 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에 대해 결정된 비율보다 낮은 경우 높은 점수가 상기 시험 화합물에 부여된다.
본 발명자들은 돌연변이체 BRAF 및 MEK의 저해제 (이후에 포괄적으로 MAPK 저해제, MAPKi라고 함)가 약물 적용 수 시간 내에 흑색종 세포에서 급성 전사 반응 (즉 적응 저항 프로그램 (adaptive resistance program); ARP)을 유도한다는 것을 발견하였다. 상기 ARP는 SOX2-의존성 줄기세포능 (stemness)의 전사 유도, 액손 유도 (axon guidance) 및 EMT (상피에서 중간엽으로의 전이) 유전자를 포함하고, 이는 약물-내성 세포의 풀을 생성한다 (도 1). 상기 약물-내성 세포는 장기간에 걸쳐 획득된 저항의 발달을 촉진시킬 수 있다. 약물-내성 세포의 수는 줄기세포능의 주요 조절인자이고 MAPKi-유도된 ARP의 주요 유도인자인, SOX2의 siRNA 매개된 녹다운에 의해 유의하게 감소될 수 있다 (도 2). 결과적으로, 임상적 맥락에서 MAPKi-유도된 SOX2를 블런팅하여 (blunting) ARP 유도를 방지하는 것은 획득된 약물 저항을 방지하여 임상적으로-사용된 MAPK 저해제의 지속력을 연장시키므로 최고의 치료적 가치를 가질 것이다.
SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2는, 또한 SOX2로 알려져 있고, 미분화된 배아 줄기 세포의 자가-재생, 또는 만능성을 유지하는데 필수적인 전사 인자이다. 상기 단백질은 전사 인자의 Sox 패밀리의 구성원이고, 이는 포유동물 발달의 많은 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Sox2는 폐 발달에서 기관지 나무 (bronchial tree)의 분지 형성 (branching morphogenesis) 및 기도 상피의 분화를 조절한다. 정상 조건하에, Sox2는 성인 기관 상피에서 기저 세포의 자가-재생 및 적합한 비율을 유지하는데 중요하다. 그러나, 그의 과발현은 발달하고 있거나 다 자란 마우스 폐 모두에서 광범위한 상피 과다형성으로 결국 암종을 유도한다. 더욱이, 편평 세포 암종에서, 유전자 증폭은 종종 3q26.3 영역을 표적으로 한다. Sox2에 대한 유전자는 상기 영역내에 있고, 이는 효과적으로 Sox2를 종양유전자 (oncogene)로 특성화한다. 예를 들어, Sox2는 위암에서 종양유전자로 확인되었다 (Yajun et al. (2014), J. Cancer Res. Clin. Oncol., 140(7):1117-24). Sox2는 폐 편평 세포 암종에서 주요 상향조절되는 인자이고, 많은 유전자들이 종양 진행에 관여되도록 한다. Sox2 과발현은 Lkb1 발현의 손실과 결합하여 마우스에서 편평 세포 폐암을 촉진한다. 이의 과발현은 또한 세포 이동 및 고착-비의존성 성장 (anchorage-independent growth)을 활성화한다. SOX2는 다형성아교모세포종 (glioblastoma multiforme)에 관련되어 있고, SOX2에 대한 다운스트림 표적은 최근에 ChIP-seq 및 마이크로어레이 분석에 의해 확인되었다 (Fang et al. (2011), BMC Genomics, 6;12:11). Sox2 발현은 또한 높은 글리슨 등급 (leason grade)의 전립선암에서도 발견되었고, 거세-저항 (castration-resistant) 전립선암 성장을 촉진한다. Sox2는 유방암에서 타목시펜 (Tamoxifen) 저항의 발생과 관련이 있는 것으로 나타났다. 또한, SOX2와 상호작용하는 OCT4는 약물-저항 전립선암 세포에서 상향조절되는 것으로 나타났다 (Fang et al. (2011), Genes Cancer, 1(9): 908-916). SOX2는 또한 EGFR 저해제에 노출되었을 때 배양된 NSCLC 세포주에서 전사적으로 유도되는 것으로 나타났다 (Rothenberg, M.S. et al (2015), eLife, vol. 4, 16). 이러한 지식에도 불구하고, SOX2의 발현 수준 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준을 결정하여 MAPK 및 EGFR 경로의 저해제에 대한 저항의 발생을 방지하는 화합물을 동정하는 세포-기반 스크리닝 방법은 없었다. 이는 놀랍게도 본원에 제시된 바와 같이 인 비트로 세포-기반 스크리닝 방법에 의해 화합물이 발견될 수 있다는 것을 본 발명자가 처음으로 발견하였기 때문이다. 본 발명의 양상의 소정의 구체예에서, SOX2의 발현 수준 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준은 단백질 발현 및/또는 mRNA 발현 분석에 의해 결정된다.
단백질 (SOX2 또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 단백질)은 항체-매개된 염색에 의해 바로 가시화되고 정량화될 수 있다. (SOX2 또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의) mRNA는 인 시투 혼성화 (in situ hybridization)에 의해 바로 가시화될 수 있고, 개별의 mRNA 분자는 정량화될 수 있다.
따라서, 본 발명 안에서, 유전자 발현 수준은 당 분야에 알려져 있는 임의의 기술, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 (mRNA 전사물)의 혼성화에 기반한 방법, 폴리뉴클레오티드 시퀀싱 또는 폴리뉴클레오티드 증폭에 기반한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
mRNA 유전자 전사물의 정량화는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 노던 블로팅 (northern blotting), 인 시투 혼성화, RNAse 프로테아제 분석, PCR 기반 방법 예컨대 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR) 및 실시간 정량적 PCT qRT- PCR을 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 핵산 듀플렉스 (duplex)에 결합 특이성을 갖는 항체를 사용하여 mRNA 수준을 결정할 수 있다. 특정 결합 구성원이 기질, 예를 들어 유리 슬라이드 또는 마이크로칩 기질 상에 플레이트된 또는 어레이된 관심 있는 RNA에 대한 특정 결합 구성원, 예를 들어 관심 있는 RNA에 특이적인 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 관심 있는 mRNA에 특이적인 항체를 사용하는 마이크로어레이 기술이 사용될 수 있다. 특정 결합 구성원은 어드레스가능한 (addressable) 위치에서 기질 상에 제공될 수 있고, 어드레스가능한 위치의 수는, 예를 들어 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 1000개 또는 적어도 10,000개 또는 초과로 다양할 수 있다. 구체예에서, 상기 어드레스가능한 위치의 수는 1000개 미만, 100개 미만, 50개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만으로 다양할 수 있다. 이러한 구체예에서, 상기 세포는 어레이와 접촉되고, 상기 어레이된 특정 결합 구성원은 세포에서 표적물과 검출가능한 상호작용을 형성할 수 있다. 상기 상호작용은 적절한 표지 (labels)를 사용하여 검출될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브가 활용되는 경우, 적절한 조건하에, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 핵산 서열에 "혼성화"되어 상보적 염기 서열을 갖는 핵산 분자와 염기-쌍 듀플렉스를 형성할 수 있다. 특정 엄격성 (stringency) 정도를 초래하는 혼성화 조건은 혼성화 방법의 특성 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 가변할 것이다.
엄격한 혼성화는, 핵산이 최소의 배경으로 표적 핵산에 결합할 때 일어난다. 통상적으로, 엄격한 혼성화를 달성하기 위해, Tm (상기 분자의 반이 그의 파트너로부터 해리되는 용융 온도)보다 약 1℃ 내지 약 20℃, 더 바람직하게는 5℃ 내지 약 20℃ 낮은 온도가 사용된다. 그러나, 이는 또한 용액의 이온 강도 및 pH로 정의된다. 적합한 혼성화 조건은 당 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있고, 예시되는 혼성화 조건은 하기와 같다: 매우 높은 엄격성 (적어도 90% 동일성을 공유하는 서열을 검출) - 65℃에서 약 16시간 동안 혼성화 5x SSC, 높은 엄격성 (적어도 80% 동일성을 공유하는 서열을 검출) - 65℃에서 16시간 동안 혼성화 5x-6x SSC, 및 낮은 엄격성 (적어도 50% 동일성을 공유하는 서열을 검출) - 실온 내지 55℃에서 20 내지 30분 동안 혼성화 6x SSC.
매우 엄격한 세척 조건의 예로는 72℃에서 약 15분 동안 0.15 M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예로는 65℃에서 15분 동안 0.2X 소듐 클로리드 및 소듐 시트레이트 (SSC) 세척이다 (Sambrook and Russell, infra, for a description of SSC buffer 예를 들어 175.3g의 NaCI 및 88.9 g의 소듐 시트레이트를 800 ml의 증류수에 용해시켜서 2Ox SSC를 제조하였다. pH를 pH7.0으로 HCI (IM)에 의해 조정하였고, 부피를 증류수로 IL로 조정하였다). 종종, 높은 엄격성 세척은 낮은 엄격성 세척에 선행하여 배경 프로브 신호를 제거하였다. 듀플렉스, 예를 들어 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 중간 엄격성 세척의 예로는 45℃에서 15분 동안 1X SSC이다. 듀플렉스, 예를 들어 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스의 낮은 엄격성 세척의 예로는, 40℃에서 15분 동안 4-6X SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 있어서, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 통상적으로 약 1.5 M 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 M의 염 농도, Na 이온 농도 (또는 다른 염)를 포함하고, 상기 온도는 긴 프로브 (예를 들어, > 50개의 뉴클레오티드)에 대해 통상적으로 적어도 약 30℃ 및 적어도 약 60℃이다.
PCR 방법 예를 들어 RT-PCR 및 PCT 및 RT-PCR에서 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 방법은 RNA의 단리를 필요로 할 수 있다. 이러한 단리 기술은 당 분야에 알려져 있고, 제조사 예컨대 Qiagen으로부터 상업적으로 입수가능한 RNA 단리 키트를 활용할 수 있다.
단백질 발현 면역조직화학 (IHC) 및 ELISA의 결정은 단백질 발현을 검출하는데 유용한 기술이다. 항체 또는 항체의 결합 단편 (모노클로날 또는 폴리클로날)이 개시된 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 항체는 항체의 직접 표지화 (direct labeling) 또는 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 1차 항체에 특이적인 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 상기 2차 항체는 검출가능한 모이어티에 의해 표지될 수 있거나, 합텐 (예컨대 비오틴 등)에 콘쥬게이트될 수 있고, 상기 합텐은 검출가능하게 표지된 동족의 (cognate) 합텐 결합 분자, 예를 들어 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제 (streptavidin horseradish peroxidise)에 의해 검출가능하다.
항체 (특정 항원, 예컨대 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 다른 유전자에 결합 특이성을 갖는 항체)의 결합 특이성은 원발성 종양의 취급을 모방한 포르말린-고정된, 파라핀-매립된 세포주의 면역조직화학 분석과 병행하는, 웨스턴 블로팅을 사용하여 확립될 수 있다 (O'Brien et al., 2007, International Journal of Cancer, 120:1434-1443에 개시된 바와 같음).
대안으로서, 단백질은 압타머 (예를 들어 특정 서열 의존성 형태를 취하고 FKBPL 단백질에 높은 친화도 및 특이성으로 결합하는 단일 가닥 핵산 분자 (예컨대, DNA 또는 RNA)), 거울상 압타머 (mirror image aptamers) (SPIEGELMERTM), 조작된 비면역글로불린 결합 단백질, 예를 들어 피브로넥틴 (ADNECTINSTM), CTLA-1 (EVIBODIESTM), 리포칼린 (ANTICALINSTM), 단백질 A 도메인 (AFFIBODIESTM) 등을 포함하는 골격에 기반한 비면역글로불린 결합 단백질을 사용하여 검출될 수 있다. 구체예에서, 압타머는 100개 미만의 뉴클레오티드, 75개 미만의 뉴클레오티드, 50개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 25 내지 50개의 뉴클레오티드, 10 내지 50개의 뉴클레오티드, 10 내지 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
소정의 구체예에서, SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질의 단편을 포함하는 단백질 서열 또는 SOX2 단백질 또는 그의 단편에 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하는 어레이가 제공될 수 있다. 상기 단백질 서열 또는 항체는 기질에 결합될 수 있다. 단백질 발현의 변화는, 예를 들어, 세포가 상기 어레이와 접촉될 때 SOX2 단백질 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 다른 유전자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체에 결합하는 SOX2 단백질 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 다른 유전자의 수준을 측정하여 검출될 수 있다.
어레이 및 어레이 포맷에 사용하기에 적합한 기질은 당업자에게 알려져 있다.
소정의 구체예에서 IHC 시료는 자동 이미지 분석 시스템을 사용하여 분석되어, 맹검 분석 (blinded analysis)을 제공할 수 있다. 이를 위해, 먼저 전체-슬라이드 디지털 이미지 (whole-slide digital images)를 ScanScope XT 슬라이드 스캐너 (Aperio Technologies)를 사용하여 2Ox로 캡쳐할 수 있다. 두번째, 포지티브 픽셀 카운트 알고리즘 (positive pixel count algorithm) (Aperio Technologies)을 사용하여 SOX2 발현에 대한 정량적 스코어링 모델을 개발할 수 있다. 조직 마이크로어레이-유도된 데이터의 통계적 분석은 trend, Fisher's exact에 대한 v2 테스트를 사용하여 수행될 수 있고, SOX2 발현과 Kaplan-Meier 플롯의 비교를 위한 Mann-Whitney 테스트는 생존 분석을 위해 사용될 수 있고, 곡선은 로그-순위 테스트 (log-rank test)를 사용하여 비교되었다. Cox 비례 위험 회귀 (Cox proportional hazards regression)는 비례 위험 비율을 추정하고 상기에 개시된 바와 같이 다변수 분석 (multivariate analyses)을 수행하는데 사용될 수 있다. 모든 산출은 SPSS v11.0 (SPSS, IL)으로 수행될 수 있다. 또한, 구별되는 다중-마커 테스트 (multi-marker test)의 생성을 촉진하기 위해, 형광-태그된 항체 (겹쳐지지 않은 형광단을 가짐) 및 부가의 관련 바이오마커를 동시에 사용할 수 있다. 유익하게 최근에 개발된 Aperio로부터의 형광 스캐닝 시스템, 예를 들어, ScanScope FL 시스템이 사용될 수 있다. 상기 분석 방법은 기존의 명시야 이미징 (brightfield imaging)에 의해 제공되는 것보다 더 정량적인 분석을 제공하여 한층 더 정교함을 제공할 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, SOX2의 발현, 세포 중에 SOX2의 위치 또는 SOX2의 활성을 검출하는 방법은 본원에 개시되거나 또는 청구되는 본 발명의 방법과 관련하여 적용할 수 있다.
본 발명의 각 양상의 바람직한 특성 및 구체예는 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 다른 양상의 각각에 대해 같다.
2개의 분자가 유의한 수의 상보적 뉴클레오티드를 공유하여 가닥들이 서로 결합 (혼성화)하는, 예를 들어 Watson-Crick 염기쌍을 형성할 때 안정한 듀플렉스 또는 트리플렉스 (triplex)를 형성하는 경우 핵산 분자는 다른 핵산 분자와 상보적이라고 할 수 있다. 상보성 (Complementarity)은 2개 분자의 특정 영역내에 2개의 핵산 분자들 사이에 염기쌍 비율의 백분율로 개시될 수 있다.
검출이라는 것은, 2개의 활성제 예를 들어 2개의 단백질 또는 2개의 핵산 사이에 상호작용이 존재하는지 여부를 결정하는 것을 의미한다. 이는 정량화를 포함할 수 있다. 검출은 예를 들어 분광분석기, 유세포분석기 또는 현미경을 사용하여 검출할 수 있는 활성제 (표지)의 사용을 포함할 수 있다. 예시되는 표지는 방사성 동위원소 (예컨대 3H, 14C, 15N, 35S, 90V, 99Tc, 111Ln, 125I1Or 131I), 형광단 (예컨대 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 등), 발색단, 리간드, 화학발광제, 생체발광제 (예컨대 루시퍼라제, 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 황색 형광 단백질), 검출가능한 반응 산물을 생산할 수 있는 효소 (예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제) 및 그의 조합을 포함한다.
특정 결합은 하나의 결합 파트너와 다른 결합 파트너, 예를 들어 프라이머와 표적 서열 또는 단백질 특이적 항체와 단백질 사이의 특정 상호작용을 의미한다. 하나의 결합 파트너와 다른 결합 파트너 사이의 상호작용은, 하나 이상의, 통상적으로 하나 초과의 비-공유 결합에 의해 매개될 수 있다. 특정 결합을 특성화하는 예시되는 방법은 특정 결합 곡선에 따른다. 소정의 구체예에서, 상기 방법은 세포 주기 단계가 신호전달 경로의 저해제 및 시험 화합물로 처리된 세포에서 결정되는 단계를 포함한다. 소정의 구체예에서, 세포 주기 정지가 검출된다. 처리된 세포가 세포 주기 정지를 겪고 상기 세포 주기 정지를 극복하지 못하면 시험 화합물에 높은 점수가 부여된다.
소정의 구체예에서, 과-활성화된 신호전달 경로는 MAPK- 또는 EGFR 경로이다.
소정의 구체예에서, 상기 암은 MAPK 또는 EGFR 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이 또는 증폭을 갖는 암 세포를 특징으로 한다.
소정의 구체예에서, MAPK 또는 EGFR 경로에서 활성화 돌연변이 또는 증폭은 NRAS, KRAS , HRAS , ARAF , BRAF , CRAF , MEK1 /2, ERK1 /2, ROS , ALK , MET, KIT 또는 EGFR에 영향을 준다.
소정의 구체예에서, 상기 암은 흑색종, 비-소세포 폐암, 전립선암, 담도암, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 난소암, 결장직장 종양, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발 골수종, 간암, 유방암, 식도암, 두경부암 및 신경아교종으로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 암은 흑색종 및 비-소세포 폐암으로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 과-활성화된 신호전달 경로에서 작용하는 단백질을 코딩하는 유전자의 활성화 돌연변이 또는 증폭을 특징으로 하고, 스크리닝 방법을 위해 선택되는 세포는 BRAF 돌연변이를 갖는 흑색종 세포 또는 비-소세포 폐암 세포 및 EGFR 돌연변이, 증폭 또는 과발현을 갖는 비-소세포 폐암 세포로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 BRAF 돌연변이는 BRAF-V600E 또는 BRAF-V600K 돌연변이를 포함한다. 돌연변이들 모두는 코돈 600에서 발린을 각각 글루타메이트 또는 리신으로 치환되는 것을 특징으로 하고, 상기 효소의 키나제 도메인에 영향을 주었다.
소정의 구체예에서, 과-활성화된 신호전달 경로의 저해제는 EGFR 경로의 저해제 (EGFRi) 및 MAPK 경로의 저해제 (MAPKi)로부터 선택된다.
본 발명의 임의의 양상의 소정의 구체예에서, 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi), 및 ERK의 저해제 (ERKi)로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 BRAFi는 베무라페닙 (vemurafenib) (CAS No. 1029872-54-5), 다브라페닙 (dabrafenib) (CAS No. 1195765-45-7), 엔코라페닙 (encorafenib) (CAS No. 1269440-17-6), LGX818 (CAS No. 1269440-17-6), PLX4720 (CAS No. 918505-84-7), TAK-632 (CAS No. 1228591-30-7), MLN2480 (CAS No. 1096708-71-2), SB590885 (CAS No. 405554-55-4), XL281 (BMS-908662, CAS No. 1029873-02-6, CAS No. 870603-16-0) 및 RAF265 (CAS No. 927880-90-8)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 MEKi는 AZD6244 (CAS No. 606143-52-6), 트라메티닙 (trametinib) (CAS No. 871700-17-3), 셀루메티닙 (selumetinib) (CAS No. 606143-52-6), 코비메티닙 (cobimetinib) (CAS No. 934660-93-2), 비니메티닙 (binimetinib) (CAS No. 606143-89-9), MEK162 (CAS No. 606143-89-9), RO5126766 (CAS No. 946128-88-7), GDC-0623 (CAS No. 1168091-68-6), PD 0325901 (CAS No. 391210-10-9), CI-1040 (CAS No. 212631-79-3) 및 TAK-733 (CAS No. 1035555-63-5)을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 ERKi는 울릭세르티닙 (ulixertinib) (CAS No. 869886-67-9), SCH772984 (CAS No. 942183-80-4), XMD8-92 (CAS No. 1234480-50-2), FR 180204 (CAS No. 865362-74-9), GDC-0994 (CAS No. 1453848-26-4), ERK5-IN-1 (CAS No. 1435488-37-1), DEL-22379 (CAS No. 181223-80-3), BIX 02189 (CAS No. 1265916-41-3, 1094614-85-3), ERK 저해제 (CAS No. 1049738-54-6), ERK 저해제 III (CAS No. 331656-92-9), GDC-0994 (CAS No. 1453848-26-4) 및 VTX11e (CAS No. 896720-20-0)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
소정의 구체예에서, 상기 EGFRi는 세툭시맙 (cetuximab) (CAS No. 205923-56-4), 파니투무맙 (panitumumab) (CAS No. 339177-26-3), 잘루투무맙 (zalutumumab) (CAS No. 667901-13-5), 니모투주맙 (nimotuzumab) (h-R3, BIOMAb EGFR, TheraCIM, Theraloc, CIMAher, CAS No. 828933-51-3), 마투주맙 (matuzumab) (CAS No. 339186-68-4), 게피티닙 (gefitinib) (CAS No. 184475-35-2), 에를로티닙 (erlotinib) (CAS No. 183321-74-6), 라파티닙 (lapatinib) (Tykerb, Tyverb, CAS No. 231277-92-2, CAS No. 388082-78-8), AP26113 (Brigatinib, CAS No. 1197953-54-0), EGFR 저해제 (CAS No. 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS No. 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS No. 179248-61-4), EGFR 저해제 II (BIBX 1382, CAS No. 196612-93-8), EGFR 저해제 III (CAS No. 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 II (CAS No. 944341-54-2) 및 PKCβII/EGFR 저해제 (CAS No. 145915-60-2)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
신호전달 경로의 저해제와 함께 세포를 처리하는 시험 화합물은 SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준을 저해한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 제2 화학 물질은 SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전자를 저해한다. 상기 시험 화합물은 SOX2의 발현을 저해하는 것이 바람직하다.
상기 시험 화합물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 소분자 화합물, 핵산, siRNA, mirRNA, shRNA, 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 압타머, 탄수화물 및 지질을 포함한다. 이러한 시험 화합물은 천연 또는 합성일 수 있다.
시험 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 다양한 출처로부터 입수될 수 있다. 소정의 구체예에서, 시험 화합물의 라이브러리는 본 발명의 방법으로 스크리닝될 수 있다. 예로는, 이에 한정되지 않고, 펩티드 라이브러리, 핵산 라이브러리, 펩티드 핵산 라이브러리 및 소분자 라이브러리를 포함한다. 소정의 구체예에서, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물 라이브러리가 이용가능하거나 또는 용이하게 생산될 수 있다. 또한, 천연 또는 합성으로 생산된 라이브러리 및 화합물은 기존의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시되는 바와 같이 MAPK 및 EGFR 경로의 저해제에 대한 저항의 발생을 방지하는 화합물을 동정하는 방법은 또한 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening)에 적용될 수 있다. 고속 대량 스크리닝 (HTS) 기술은 통상적으로 대규모 세포의 급속 처리를 정의하는데 사용된다. 소정의 구체예에서, 다양한 농도에 대한 상이한 반응을 얻기 위해 상이한 시험 화합물 농도와 함께 복수의 스크린을 병렬로 실행할 수 있다. 당분야에 알려져 있는 바와 같이, 활성제의 유효 농도를 결정하는 것은 통상적으로 1:10, 또는 다른 로그 스케일의 희석으로부터 유래된 농도 범위를 사용한다. 상기 농도는 필요하다면 제2 희석 시리즈로 더 정제될 수 있다. 통상적으로, 상기 농도들 중 하나는 네가티브 대조군, 즉 제로 (zero) 농도 또는 활성제의 검출 수준 이하 또는 표현형의 검출가능한 변화를 주지 않는 활성제의 농도 이하로 제공한다. 일부 예에서, 포지티브 대조군이 또한 수행될 수 있다.
본 발명은 하기 도면에 의해 더 설명되고, 이로부터 추가적인 구체예 및 이점을 유도할 수 있다. 상기 예들은 본 발명을 설명하려는 것으로 그의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
도 1은 RNA-Seq에 의해 분석되는 MAPKi에 의한 급성 처리시에 줄기세포능 및 EMT 시그니쳐의 유도를 보여주었다. (A) A375-P 세포는 PLX4720 (BRAFi) 또는 DMSO로 6시간 동안 처리되었고, RNA가 단리되었고, RNA-Seq가 수행되었다. 산점도 (Scatter plot)는 ≥0.5 RPKM의 최소 정규화 풍도 (minimal normalized abundance)를 갖는 모든 유전자를 보여주었다. 경로 분석을 위해 선택된 차별적으로 발현된 유전자 (Differentially expressed gene: DEG)는 전사 변화의 방향에 따라 적색 및 청색 점으로 나타내었다 (적색 유전자는 PLX4720에서 유도되고, 청색 유전자는 PLX4720에서 억제됨). (B) 분석된 DEG의 유의한 농축을 갖는 5개의 상위 경로를 보여주는 막대 그래프. 막대가 길어지면 유의성이 더 강해지는 것을 나타낸다. (C) PLX4720으로 처리시에 상위 조절해제된 유전자 (좌측 컬럼). PLX4720에 의해 유도 및 억제된 상위 유전자는 개별 목록으로 나타내었다. (D) 지시된 세포주를 1 μM PLX4720 또는 0.01% DMSO (0시간)로 지시된 시간 동안 처리하였고, 줄기세포능/EMT와 관련된 선택된 유전자의 발현 변화는 qPCR로 확인하였다. 모든 세포주는 BRAF 저해시에 유사한 적응 유전자 프로그램을 발현하였다. 개시된 데이터는 독립적인 생물학적 3회 실험 (triplicate)의 평균 ± SEM을 나타내었다. (E) (D)에 개시된 것과 동일한 실험의 웨스턴 블롯 분석. 줄기세포능 시그니쳐의 핵심 역할로서, SOX2 수준을 평가하였다. P-ERK1/2 수준은 포지티브 처리 대조군으로 제공하였다. 전체 ERK1/2 수준은 로딩 대조군 (loading control)으로 제공하였다. (F) A375-P 세포를 1 μM PLX4720, 0.5 μM AZD6244 (MEK1/2 저해제) 또는 0.01% DMSO로 지시된 시간 동안 처리하였고, SOX2 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. BRAF의 저해 및 MEK1/2의 저해는 유사한 SOX2 수준을 유도하는 것을 유의하고, 이는 종양발생 MAPK 저해의 일반적 특성임을 시사하였다. (G) A375-P 세포를 1 μM PLX4720 (BRAFi), 0.5 μM AZD6244 (MEKi), 두 약물의 조합 또는 0.01% DMSO로 지시된 시간 동안 처리하였고, SOX2 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. BRAFi 및 MEKi는 SOX2 수준에서 비교가능한 효과를 가지며, 상기 두 약물의 조합은 약간 더 높은 SOX2 수준을 유도하는 것에 유의한다. (H) A375-P 세포를 1 μM PLX4720 (BRAFi), 0.5 μM AZD6244 (MEKi), 두 약물의 조합 또는 0.01% DMSO로 24시간 동안 처리하였고, 줄기세포능/EMT와 관련된 선택된 유전자의 발현 변화는 qPCR로 확인하였다. BRAFi 및 MEKi는 전사물 수준에서 비교가능한 효과를 가지며, 두 약물의 조합은 전사물 유도에서 약간 더 효과적임을 유의한다. 모든 웨스턴 블롯에 대해, 개별 시점은 적어도 2회의 독립적인 실험으로 평가되었다. 대표적인 데이터가 개시되어 있다.
도 2는 MAPKi-유도된 항-증식 효과로부터 SOX2의 보호 효과를 보여주었다. (A) A375-P 세포를 SOX2를 표적으로 하는 100 nM siRNA 또는 네가티브 대조군 siRNA로 형질감염시켰다. 그 다음에 세포를 PLX4720 (BRAFi) 또는 DMSO로 48시간 동안 처리하였다. 수확하기 2시간 전에, 세포를 세포 주기를 표지하기 위해 3 uM EdU로 펄스 처리하였다. EdU-양성 세포를 유세포 분석기를 사용하여 검출하였다. SOX2 녹다운은 BRAF가 활성일 때 (DMSO) 세포 증식에서 효과가 없지만, BRAFi 조건에서 약물-내성 세포 주기의 풀을 감소시킨다는 점을 유의한다. 대표적인 데이터가 개시되어 있다. (B) 실험 (A)의 정량화. 각 조건에 있어서, SOX2의 siRNA 녹다운에서 세포 주기의 백분율을 네가티브 대조군 siRNA에 대해 정규화하였다. 개시된 데이터는 독립적인 생물학적 3회 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. (C) pTRIPZ-SOX2 벡터로 안정하게 형질도입된 A375-P 세포를 지시된 농도의 독시사이클린으로 3일 동안 또는 1 μM PLX4720 (PLX)로 24시간 동안 처리하였다. SOX2 과발현은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 라민 A는 로딩 대조군으로 제공하였다. 개별의 농도는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 평가하였다. 대표적인 결과가 개시되어 있다. (D) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포를 0 ng / ml (네가티브 대조군) 또는 50 ng / ml 독시사이클린으로 24시간 동안 전-처리하였고, 후속하여 DMSO 또는 PLX4720으로 추가 48시간 동안 처리하였다. 수확하기 2시간 전에, 세포를 세포 주기를 표지하기 위해 3 uM EdU로 펄스 처리하였다. EdU-양성 세포는 유세포 분석기를 사용하여 검출하였다. 개시된 데이터는 독시사이클린이 없는 조건에서 세포 주기의 백분율에 대해 정규화하였다. 독립적인 생물학적 3회 실험의 평균 ± SEM으로 나타내었다. (E-F) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포를 0 ng / ml (네가티브 대조군) 또는 50 ng / ml 독시사이클린으로 24시간 동안 전-처리하였고, 후속하여 PLX4720의 일련의 희석물로 추가 4일 동안 처리하였다. 세포 생존력은 PrestoBlue 분석으로 평가하였고, IC50 값을 산출하였다. 독시사이클린은 pTRIPZ-대조군 세포에서 효과가 없지만, pTRIPZ-SOX2 세포에서 생존 곡선을 우측으로 이동시키는 것에 유의하며, 이는 SOX2가 과발현될 때 약물 민감도가 감소되는 것을 나타낸다. IC50 값은 생존 곡선 위에 명시되어 있다. 개시된 데이터는 DMSO-처리된 세포에 대해 정규화되었다. 오차 막대는 3회의 독립적인 실험의 SEM을 나타낸다. (G) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포를 0 ng / ml (네가티브 대조군) 또는 50 ng / ml 독시사이클린으로 24시간 동안 전-처리하였고, 후속하여 DMSO 또는 PLX4720으로 추가 48시간 동안 처리하였다. 생존 신호전달은 웨스턴 블롯으로 평가되었다. S6K 및 BAD를 통한 생존 신호전달은 PLX4720으로 억제되지만, SOX2가 독시사이클린 처리에 의해 과발현될 때 구제된다.
도 3은 모듈식 스크리닝 접근법의 판독값을 나타내었다. BRAFV600E-돌연변이된 인간 흑색종 세포에서 SOX2의 면역형광 염색.

Claims (11)

  1. 과-활성화된 신호전달 경로의 저해제와의 병용 약제에서, 과-활성화된 신호전달 경로를 특징으로 하는 세포를 특징으로 하는 암을 치료하는데 효과적인 화합물을 동정하기 위한 세포-기반 스크리닝 (cell-based screening) 방법으로서,
    a) 상기 신호전달 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이 또는 증폭을 갖는 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 세포를 하기와 접촉시키는 단계:
    i. 상기 신호전달 경로의 저해제; 및
    ii. 시험 화합물;
    c) SOX2 및/또는 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자, 구체적으로 Nanog , OCT4, FGF4 , FBX15 , FOXP4 , KLF9 , CD24, CD271, CD36, ITLN2 , TNFSF12 , NOX3 , CLEC7A , ACYAP1 , UNC5C , UNC5D , MUC16 , VAV3 , FOXD3 , VGLL3 , ALPP , C3, F2R , ENPP2, ETV4 , NTNG1 , NTRK2 , ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    d) 상기 시험 화합물에 점수를 부여하는 (assigning) 단계로서,
    i. 상기 SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준이 미리결정된 역치 (predetermined threshold)보다 낮은 경우 상기 점수는 높고, 상기 역치는 상기 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준에 해당하고;
    ii. 상기 SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준이 상기 미리결정된 역치와 동일하거나 높은 경우 상기 점수는 낮은 것인 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    a) 복수의 세포를 단계 a에서 동시에 사용하고;
    b) 상기 복수의 세포를 단계 b로 함께 제공하고;
    c) SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 평균 발현 수준이 상기 복수의 세포에 대해 결정되고; 및
    d) 상기 SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 평균 발현 수준이 상기 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 평균 발현 수준보다 낮은 경우 높은 점수가 상기 시험 화합물에 부여되는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    a. 복수의 세포를 단계 a에서 동시에 사용하고;
    b. 상기 복수의 세포를 단계 b로 함께 제공하고;
    c. 상기 SOX2 발현 수준 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준이 처리되지 않은 세포에 대해 결정된 발현 수준보다 높은 경우 단일 세포는 "SOX2 양성"으로 평가되고, 전체 세포에 대한 "SOX2 양성" 세포의 비율이 상기 복수의 세포에 대해 결정되고; 및
    d. 상기 시험 화합물로 처리된 세포에 대해 결정된 비율이 상기 신호전달 경로의 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에 대해 결정된 비율보다 낮은 경우 높은 점수가 상기 시험 화합물에 부여되는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SOX2 발현 수준 및/또는 상기 SOX2의 전사 조절하에 있는 유전자의 발현 수준은 단백질 발현 및/또는 mRNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로의 저해제 및 상기 시험 화합물로 처리된 세포에서 세포 주기 단계 (cell cycle phase)가 결정되고, 구체적으로 세포 주기 정지 (cell cycle arrest)가 검출되는 단계를 포함하고, 상기 세포가 세포 주기 정지를 겪는 경우 높은 점수가 상기 시험 화합물에 부여되는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 MAPK 또는 EGFR 경로인 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 암은 MAPK 또는 EGFR 경로에 포함된 단백질을 코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이 또는 증폭, 구체적으로 NRAS , KRAS , HRAS, ARAF , BRAF , CRAF, MEK1 /2, ERK1 /2, ROS , ALK , MET, KIT 또는 EGFR에서 활성화 돌연변이 또는 증폭을 갖는 암 세포를 특징으로 하는 것인 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 암은 흑색종, 비-소세포 폐암, 전립선암, 담도암, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 난소암, 결장직장 종양, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발 골수종, 간암, 유방암, 식도암, 두경부암 및 신경아교종, 구체적으로 흑색종 및 비-소세포 폐암으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a에 제공된 세포는 BRAF 돌연변이, 구체적으로 BRAF-V600E 또는 BRAF-V600K 돌연변이를 갖는 흑색종 세포 또는 비-소세포 폐암 세포, 및 EGFR 돌연변이, 증폭 또는 과발현을 갖는 비-소세포 폐암 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 청구항 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로의 저해제는 EGFR 경로의 저해제 (EGFRi) 및 MAPK 경로의 저해제 (MAPKi)로부터 선택되고, 구체적으로 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi), 및 ERK의 저해제 (ERKi)로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 BRAFi는 베무라페닙 (vemurafenib), 다브라페닙 (dabrafenib), 엔코라페닙 (encorafenib), LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281 및 RAF265를 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 MEKi는 AZD6244, 트라메티닙 (trametinib), 셀루메티닙 (selumetinib), 코비메티닙 (cobimetinib), 비니메티닙 (binimetinib), MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040 및 TAK-733을 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 ERKi는 울릭세르티닙 (ulixertinib), SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS No. 1049738-54-6), ERK 저해제 III (CAS No. 331656-92-9), GDC-0994 및 VTX11e를 포함하는 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    상기 EGFRi는 세툭시맙 (cetuximab), 파니투무맙 (panitumumab), 잘루투무맙 (zalutumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 마투주맙 (matuzumab), 게피티닙 (gefitinib), 에를로티닙 (erlotinib), 라파티닙 (lapatinib), AP26113, EGFR 저해제 (CAS No. 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS No. 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS No. 179248-61-4), EGFR 저해제 II (BIBX 1382, CAS No. 196612-93-8), EGFR 저해제 III (CAS No. 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 II (CAS No. 944341-54-2) 및 PKCβII/EGFR 저해제 (CAS No. 145915-60-2)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
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