CN1160452C - 一株重组广谱苏云金芽孢杆菌 - Google Patents
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本发明公开了一种既杀鳞翅目又杀鞘翅目害虫的广谱重组苏云金芽孢杆菌LCJ-12，该菌株具有稳定高效且广谱性的杀虫效果，使用其制成的杀虫剂具有多种杀虫特性，节约了生产成本和使用成本，提高了经济价值，且对人、畜及其它动植物无害，不污染环境，具有良好的经济、生态效益，有着良好的推广应用前景。其急性毒性和生态安全性获准了农业部遗传工程体中试级安全性评价和野外释放级安全性评价。
Description
本发明涉及芽孢杆菌，更具体涉及重组广谱苏云金芽孢杆菌。
本发明所称的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis LCJ-12)是通过基因工程手段构建的对鳞翅目和鞘翅目害虫均有高毒力的菌株，根据该菌株既杀鳞翅目昆虫又杀鞘翅目昆虫的特点，取鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、菌(Jun)的第一个字母组成其代码LCJ，又因该菌是从众多重组工程菌中筛选出来的毒力最高、且编号为12的一株，所以将该重组广谱苏云金芽孢杆菌命名为Bacillus thuringiensis LCJ-12。
鳞翅目是我国农林牧业生产中危害最大的害虫，而鞘翅目害虫对农林牧业生产的危害仅次于鳞翅目害虫，1991年我国新疆霍城地区首次发现马铃薯甲虫入侵，迅速蔓延并对农作物造成巨大危害。因此，构建出对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有效的重组广谱苏云金芽孢杆菌并运用其生产新型杀虫剂具有紧迫性和现实意义。现有技术中，文献“含二元毒素基因的苏云金杆菌重组子晶体蛋白质分析及其对蚊幼虫的毒性”(中国，微生物学杂志，1999，19(1)：1-5)是通过电转化法，将含球形芽孢杆菌二元毒素基因的重组质粒pCW2转化野生型苏云金芽孢杆菌以色列亚种，获得一株含二元毒素基因的重组菌株B+CW-1；重组菌株能表达二元毒素即内毒素和cytA毒素，并形成2类位于芽孢孢外膜外的伴孢晶体。文献“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”(中国，生物工程学报，1999，15(2)：215-220)分别以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将苏云金芽孢杆菌HD-1杀虫蛋白质基因cry1Ac导入水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916；工程菌株质粒酶切电泳分析，核酸印记(Southern)分析和杀虫生物活性测定结果证实了cry1Ac基因的导入及其在B916中的有效表达；抑菌测定证明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。文献“苏云金芽孢杆菌以色列亚种130000道尔顿杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中的表达”将苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊蛋白质基因亚克隆到pNQ122载体上，通过枯草芽孢杆菌原生质体转化，得到KMr-CMs的正反向克隆子；蛋白质免疫杂交(Western-blotting)证明杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的杀蚊蛋白质，所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。上述各种文献中的菌株均有自身的特点，对特定的害虫有良好的杀灭效果，但均不具备可同时杀鳞翅目害虫和鞘翅目害虫的能力。
本发明的目的是提供一种既杀鳞翅目又杀鞘翅目害虫的广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12。该菌株可高效表达外源杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac和自身杀虫晶体蛋白质基因cry3A，具备可同时杀鳞翅目害虫和鞘翅目害虫的能力，具有稳定高效且广谱性的杀虫效果。
为了达到上述目的，本发明所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis LCJ-12)具有如下特性：a、该菌株含有杀鳞翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac和杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry3A；b、该菌株产生菱形和四方形两种杀虫晶体蛋白质；c、该菌株可同时杀鳞翅目昆虫和杀鞘翅目昆虫；d、该菌株含有穿梭重组质粒pHT304/1Ac10。
上述穿梭重组质粒pHT304/1Ac10的大小为10453个碱基对，且含有苏云金芽孢杆菌质粒pHT1030及大肠杆菌(E.coli)质粒pUC19的复制原点序列、杀鳞翅目昆虫的cry1Ac基因、氨苄青霉素(Amp)抗性及红霉素(Em)抗性标记基因。
本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensisLCJ-12)可通过电击转化技术，将杀鳞翅目害虫的杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac转入高效杀鞘翅目的苏云金芽孢杆菌受体菌中，经红霉素(Em)抗性筛选、遗传稳定性测定和毒力生物测定，获得重组工程菌LCJ-12。
本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌可由下列方法制备：
a、采用一株高效杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌菌株(已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 201003)，作为受体菌株，该菌株含cry3A基因；采用pHT304/1Ac10重组质粒，该重组质粒含杀鳞翅目昆虫的cry1Ac基因；
b、在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种大肠杆菌，35-37℃剧烈摇晃培养8-12小时，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，加200μl溶液II；加150μl用冰预冷的溶液III，于4℃下12000g离心10分钟，用等量酚-氯仿-异戊醇抽提上清液，用2倍体积上清液的乙醇于-20℃沉淀DNA，得到大肠杆菌重组质粒pHT304/1Ac10；
c、将受体菌接种在LB培养基中，28-30℃摇动培养8-10小时后，冰浴20-30分钟，在4℃下12000g离心10分钟，先用电击洗脱液洗两次，再用电击缓冲液洗一次，最后悬浮在电击缓冲液中，得到受体菌电击感受态细胞，置-20℃保存；
d、将pHT304/1Ac10质粒DNA与受体菌感受态细胞悬液充分混均，取200μl注入电击转化杯中，用大肠杆菌电击转化仪(E.coli GenePulser)在2.5KV下电击一次，将电击液转入4mlLB培养基中，28-30℃振动培养2小时后，涂布于含20μg/ml红霉素的LB平板上，28-30℃下培养3天；
e、在20μg/ml红霉素抗性平板上挑选单个菌落，涂片镜检，选取具有苏云金芽孢杆菌特征的菌落在红霉素平板上传代，以检测其稳定性，经过二十代的遗传传代和毒力生物测定及PCR检测，获得毒力最高的并含有cry1Ac及cry3A基因的重组广谱苏云金芽孢杆菌，即为本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12。
所述的LB培养基为：0.5％氯化钠(NaCl)，0.5％酵母粉，1.0％胰蛋白胨，余者为水，pH 7.2-7.4。
所述的抗生素采用：氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，红霉素工作浓度为20μg/ml。
所述的电击洗脱液为：1mmol/L(pH7.0)N-双(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-(乙磺酸)，简称HEPES。
所述的电击缓冲液为：1mmol/L(pH7.0)HEPES，10％甘油。
所述的溶液I为：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，10mmol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)。
所述的溶液II为：0.2mol/mL氢氧化钠，1％十二烷基磺酸钠。
所述的溶液III为：5mol/L乙酸钾，2.5mol/L冰乙酸。
所述的毒力生物测定所用的试虫为：初孵棉铃虫(Helithis armigera)幼虫及2龄柳蓝叶甲(Playiodera versicolora)幼虫。
所述的PCR检测是指用特异性引物检测cry1Ac及cry3A基因；
检测cry1Ac基因的特异性引物序列为：
TYIUNI2 5’ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTATC3’
TYIIAC 5’TCACTTCCCATCGACATCTACC3’
检测cry3A基因的特异性引物序列为：
CoL1A 5’GTCCGCTGTATATTCAGGTG3’
CoL2A 5’AGGTGCCAACTAACCATGTT3’
本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12还具有如下特征：
形态特征和生化特性 LCJ-12菌株
杆状：宽(μm) 1.2-1.8
长(μm) 3.0-5.0
革兰氏反应 +
原生质上未染上色的小球 +
芽孢 椭圆 +
圆形 -
内生或偏内生 +
芽孢囊膨大 -
伴孢晶体 菱形和四方体形
运动性 +
接触酶 +
厌氧生长 兼性嫌气菌
V-P反应 +
V-P肉汤中的pH值 4.3-5.6
生长温度(℃)：最高 40-45
最低 10-15
卵黄反应 +
在0.001％溶菌酶上生长 +
在7％NaCL上生长 +
在pH6.0培养基上生长 +
葡萄糖产酸 +
阿拉伯糖产酸 -
木糖产酸 -
甘露糖产酸 -
水解淀粉 +
利用柠酸盐 +
还原NO3-NO2 +
1周内脱苯丙氨酸 -
溶血试验 +
RNA酶试验 +
基因型 cry1Ac，cry3A
抗生素抗性 红霉素(Em)抗性
本发明的优点和效果为：重组苏云金芽孢杆菌LCJ-12可高效表达外源杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac和自身杀虫晶体蛋白质基因cry3A，具有稳定高效且广谱性的杀虫效果。由于重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12杀虫范围包括了鳞翅目和鞘翅目害虫，使用其制备的杀虫剂具备杀鳞翅目害虫和鞘翅目害虫的多种杀虫特性，节约了生产成本和使用成本，因而提高了经济价值，降低了防治费用。现已证明重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12的安全性与野生苏云金芽孢杆菌无异，对人、畜及其它动、植物无害，不污染环境，且可提高农产品质量，有良好的经济和生态效益，具有良好的推广应用前景。
实施例
用重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12进行了发酵小试及中试、菌剂生产、田间试验、示范和大田应用、质量标准化及安全性试验，其质量达到了农业部规定的一级标准。其急性毒性和生态安全性获准了农业部遗传工程体中试级安全性评价和野外释放级安全性评价。
Claims (7)
1、一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12(Bacillusthuringiensis LCJ-12)，其特征在于，该菌株具有如下特性：a、含有杀鳞翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac和杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry3A，b、产生菱形和四方形两种杀虫晶体蛋白质，c、可同时杀鳞翅目昆虫和杀鞘翅目昆虫，d、含有穿梭重组质粒pHT304/1Ac10；该菌株由下列方法制备：
a、采用保藏号为CCTCC NO：M 201003的菌株作为苏云金芽孢杆菌的受体菌，该菌株含cry3A基因；采用pHT304/1Ac10重组质粒，该重组质粒含杀鳞翅目昆虫的cry1Ac基因；
b、在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种含重组质粒pHT304/1Ac10的大肠杆菌，35-37℃剧烈摇晃培养8-12小时，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，加200μl溶液II；加150μl用冰预冷的溶液III，于4℃下12000g离心10分钟，用等量酚-氯仿-异戊醇抽提上清液，用2倍体积上清液的乙醇于一20℃沉淀DNA，得到重组质粒pHT304/1Ac10；
c、将受体菌接种在LB培养基中，28-30℃摇动培养8-10小时后，冰浴20-30分钟，在4℃下12000g离心10分钟，先用电击洗脱液洗两次，再用电击缓冲液洗一次，最后悬浮在电击缓冲液中，得到受体菌电击感受态细胞，置-20℃保存；
d、将pHT304/1Ac10质粒DNA与受体菌感受态细胞悬液充分混均，取200μl注入电击转化杯中，用E.coli Gene Pulser大肠杆菌电击转化仪在2.5KV下电击一次，将电击液转入4mlLB培养基中，28-30℃振动培养2小时后，涂布于含红霉素20μg/ml的LB平板上，28-30℃下培养3天；
e、在20μg/ml的红霉素抗性平板上挑选单个菌落，涂片镜检，选取具有苏云金芽孢杆菌特征的菌落在红霉素平板上传代，以检测其稳定性，经过二十代的遗传传代和毒力生物测定及PCR检测，获得毒力最高的并含有cry1Ac及cry3A基因的重组广谱苏云金芽孢杆菌，即为本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12。
2、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中抗生素采用：氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，红霉素工作浓度为20μg/ml。
3、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中电击洗脱液为：pH7.0、1mmol/L的N-双(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-(乙磺酸)，简称HEPES。
4、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中电击缓冲液为：pH7.0的1mmol/L的HEPES，10％甘油。
5、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中溶液I为：50mmol/L葡萄糖，pH8.0的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH8.0的10mmol/L乙二胺四乙酸。
6、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中溶液II为：0.2mol/mL氢氧化钠，1％十二烷基磺酸钠。
7、根据权利要求1所述的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12，其特征在于，所述的制备方法中溶液III为：5mol/L乙酸钾，2.5mol/L冰乙酸。
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