CN116042699B - 水稻促分蘖基因及其用途 - Google Patents

水稻促分蘖基因及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116042699B
CN116042699B CN202310036453.9A CN202310036453A CN116042699B CN 116042699 B CN116042699 B CN 116042699B CN 202310036453 A CN202310036453 A CN 202310036453A CN 116042699 B CN116042699 B CN 116042699B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
gene
tillering
yield
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310036453.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116042699A (zh
Inventor
陈析丰
马伯军
王勇祥
冯巍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Normal University CJNU
Original Assignee
Zhejiang Normal University CJNU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Normal University CJNU filed Critical Zhejiang Normal University CJNU
Priority to CN202310036453.9A priority Critical patent/CN116042699B/zh
Publication of CN116042699A publication Critical patent/CN116042699A/zh
Priority to PCT/CN2023/100979 priority patent/WO2024148764A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116042699B publication Critical patent/CN116042699B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及利用促分蘖基因提高水稻单株产量的方法。本发明公开了一种Os03g0280400基因在提高水稻促分蘖中的应用：Os03g0280400基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还同时提供了利用水稻促分蘖新功能基因Os03g0280400提高水稻单株产量的方法。

Description

水稻促分蘖基因及其用途
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及利用促分蘖基因提高水稻单株产量的方法。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物。20世纪中期，为了解决发展中国家的粮食问题，兴起的第一次“绿色革命”利用sd1(semi-dwarf 1)、Rht-1(reduced height-1)等半矮秆基因，选育了出矮化、多分蘖新品种，有效提高了水稻、小麦等粮食作物的产量。水稻多分蘖在一定程度上可促进植株的有效穗数，从而直接提高单株的籽粒数量；而植株矮化则有利于水稻增强在风、雨天气的抗倒能力，减少因倒伏带来的产量损失。因此，发掘水稻矮化多分蘖基因对提高水稻单株产量具有重要价值。目前，已经报道的MOC1、TAD1、D53、HTD1等基因参与了水稻分蘖和株高的协同调控，对深入解析水稻株型建成与高产育种提供了重要的理论依据，但是这些多分蘖基因并不一定能促进水稻的单株产量，只有促进植株的有效分蘖数，才能提高水稻的单株产量。因此，从水稻中发掘增加有效分蘖数的新基因，对粮食生产具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效提高水稻单株产量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种Os03g0280400基因在提高水稻促分蘖中的应用：Os03g0280400基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为本发明应用的改进：即增加水稻植株分蘖数，又降低株高(即增加了单株粒数，又升了抗倒伏能力)，从而提高了水稻的单株产量。
本发明还同时提供了一种利用水稻促分蘖新功能基因Os03g0280400提高水稻单株产量的方法：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为本发明的方法的改进：在水稻中过表达功能基因Os03g0280400能增加水稻植株分蘖数，又降低株高。
作为本发明的方法的改进：制备获得Os03g0280400基因过表达载体(Os03g0280400基因过表达载体中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)；将过表达载体转化水稻野生型品种日本晴，获得转基因水稻植株。
综上，本发明提供了一种利用水稻促分蘖新功能基因提高水稻单株产量的方法，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1所示序列在水稻数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中已公布，但是功能未知。
通过在水稻中过表达该新功能基因，可显著增加水稻植株分蘖数、同时适度降低株高，即增加了单株粒数，又升了抗倒伏能力，进而提高了水稻的单株产量。
本发明的技术方案具体如下：
利用PCR技术从水稻cDNA中扩增Os03g0280400基因的编码序列(SEQ ID NO：1)，并克隆到双元表达载体中，构建了由组成型启动子驱动的Os03g0280400基因表达载体。通过农杆菌介导法，将该载体分别转化到野生型粳稻品种“日本晴”与野生型籼稻品种“浙辐802”中，获得的相应的转基因植株。对这些转基因植株的DNA进行PCR扩增，鉴定是否含有目的序列(SEQ ID NO：1)，得到转基因阳性植株。然后，分别提取阳性植株的RNA，利用qPCR检测获得过表达Os03g0280400基因的植株：日本晴-OE与浙辐802-OE，其表达量远远高于其对应的野生型品种日本晴、浙辐802(图1)。在水稻成熟期，与各自的野生型对照品种相比，经统计分析发现过表达Os03g0280400基因株系的有效分蘖数均显著性高于野生型对照(图2)，而株高显著性低于野生型对照(图3)，单株产量显著高于野生型对照(图4)。
因此，在转基因水稻中过表达Os03g0280400基因可有效增加单株产量，且提高抗倒伏的能力，可减少因倒伏引起的产量损失，有效保障水稻的生产安全，这一基因的用途在高产育种中具有重要的应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1水稻植株中Os03g0280400基因的表达量分析；
图2成熟期水稻植株的有效分蘖数统计；
图3成熟期水稻植株的株高测量统计；
图4成熟期水稻植株的单株产量统计；
图中，(A)为日本晴及其转基因植株、(B)为浙辐802及其转基因植株；
日本晴、浙辐802为水稻野生型对照品种；日本晴-OE-#1与日本晴-OE-#2分别为过表达Os03g0280400基因的日本晴转基因植株2个不同株系；浙辐802-OE-#1与浙辐802-OE-#2为过表达Os03g0280400基因的浙辐802植株2个不同株系。*表示t检验存在显著性(P<0.05)差异；**表示t检验存在极显著性(P<0.01)差异。
具体实施方式
实施例1、
步骤1.水稻叶片总RNA的提取
在分蘖期，取水稻野生型品种日本晴的叶片，在液氮中研磨成粉末后，用RNeasyPlant Mini Kit(QIAGEN,德国)提取总RNA，具体操作步骤该产品有详细说明。然后，将提取好的RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,日本)反转录成cDNA，方法按照产品说明操作。
步骤2.Os03g0280400基因的PCR扩增
合成以下PCR引物，序列为：
F1:5’-cgcggatccATGGCTCTGGGAGATGACTC-3’
R1:5’-acgcgtcgacTCAGGAGCTGCTCACGCCTC-3’。
小写字母序列为：用于限制性内切酶BamH I、Sal I的酶切序列。
PCR扩增采用高保真酶HS DNA Polymerase(TaKaRa,日本)。PCR体系为20μL：PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.2μL、5×PrimerSTAR Buffer 4μL、cDNA 0.8μL、引物F1与R1(10μM)各0.5μL、dNTP Mixture 1.6μL、ddH2O 12.4μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。获得Os03g0280400基因的序列，即SEQ ID NO：1。
步骤3.Os03g0280400基因PCR产物与载体的酶切
首先，用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen,美国)对PCR产物进行纯化，方法按照产品说明操作；其次，采用TaKaRa公司(日本)的限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切。酶切反应体系为：BamH I与Sal I各1μl、3μl Buffer T(TaKaRa)、10μl PCR产物、ddH2O补足至20μl，37℃酶切4h；酶切产物再用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen,美国)对切酶产物进行纯化，方法按照产品说明操作。同时，按照同样的方法对pCAMBIA1300s载体质粒(http://www.kelei-biology.com/plus/view.php？aid＝1019)进行双酶切和纯化。
步骤4.Os03g0280400基因PCR产物与载体的连接
将步骤3经过酶切与纯化获得的Os03g0280400基因PCR产物与载体，用T4连接酶(Promega，美国)进行连接，反应体系为：1μl载体质粒、2μl PCR产物、0.5μl T4连接酶、1μlBuffer、ddH2O补足至10μl，4℃培养12小时。然后，取10μl连接产物与JM109感受态细胞冰上共孵育30min，42℃热激90sec，立即冰浴10min；加入800μl无抗生素的液体LB培养基，在37℃恒温振荡培养1h后，将菌液均匀涂布于含Kan(25mg/L)抗性的固体平板培养基上，37℃培养12小时。
步骤5.Os03g0280400基因过表达载体的PCR及其测序鉴定
在15ml的试管中，加入4ml含Kan(25mg/L)抗性的LB液体培养基，再从步骤4获得的固体平板上，挑取长出的单克隆菌落，置于试管液体培养基中，在37℃下200rpm摇床培养培养12小时。用2×Taq PCR预混试剂(天根，北京)对菌液进行PCR验证，反应体系：1μl菌液、10μl 2×Taq PCR MasterMixⅡ、1μF1+R1引物(10μM)，ddH2O补足至20μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min。取5μl PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
将PCR鉴定的阳性克隆菌落寄到生物技术公司，用pCAMBIA1300s的通用引物P1：5’-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3’和P2:5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3’测序，将插入基因序列全部测通；从而获得Os03g0280400基因过表达载体。即，该Os03g0280400基因过表达载体中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
步骤6.Os03g0280400基因过表达载体的水稻遗传转化
将以上构建好的过表达载体，用Nishimura等的方法(Nishimura et al,NatProtoc,2006)分别将载体转化水稻野生型品种日本晴，获得转基因水稻植株。
步骤7.转基因水稻中的Os03g0280400基因表达分析
对步骤6获得的转基因植株，按照步骤1的方法提取叶片的总RNA并合成cDNA。用Os03g0280400基因特异性引物F2：5’-CCCTGCCTCTTACATCCACA-3’，R2：5’-CCTTCTCCAGCTCCTTCCAT-3’，进行qPCR分析。使用TaKaRa公司的Premix ExTaqTM II试剂盒，反应体系为：10μl/>Premix Ex/>II，2μl cDNA模板，1μl 10μMF2+R2引物，0.4μl ROX Reference Dye，ddH2O补齐至20μl。用水稻Actin基因做为内参，PCR引物为F3：5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’，R3：5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’。PCR程序为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸30sec，40个循环。
说明：用水稻Actin基因做为内参，即，以F3+R3引物替代F2+R2引物，其余等同。每个样品3个重复，用2-ΔΔCT方法(Livak et al.,2001)，用内参基因Actin的表达量对每个样品的cDNA量进均一化校准，并计算出Os03g0280400基因的相对表达量。在两个不同的转基因株系(日本晴-OE-#1、日本晴-OE-#2)中，其Os03g0280400基因的表达量均显著高于对照日本晴(图1-A)。
步骤8、转基因水稻的有效分蘖数统计
将过表达Os03g0280400基因的两个株系(日本晴-OE-#1、日本晴-OE-#2)、及其野生型对照日本晴的种子，播种在水稻试验大田中，5月初播种，6月初插秧，进行常规的水稻种植户。在水稻成熟期(同年的10月)，随机选取日本晴-OE-#1株系10株、日本晴-OE-#2株系10株、野生型对照10株，统计单株的分蘖数、测量株高、测定单株的种子产量，并采用t-test方法分析转基因植株与野生型对照之间的显著性差异。
所得结果为：与野生型对照日本晴相比，过表达Os03g0280400基因植株的分蘖数显著增加(图2-A)，株高显著下降(图3-A)，单株产量显著上升(图4-A)。
实施例2、将实施例1中的水稻野生型品种由日本晴(粳稻，适合北方种植)改为另一个品种浙辐802(籼稻，适合南方种植)，与日本晴遗传背景差异较大，来证明Os03g0280400基因的功能普遍适用于不同品种的水稻，其余等同于实施例1。
所得结果为：与野生型对照浙辐802相比，过表达Os03g0280400基因植株的分蘖数显著增加(图2-B)，株高显著下降(图3-B)，单株产量显著上升(图4-B)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.Os03g0280400基因在提高水稻促分蘖中的应用，其特征在于：Os03g0280400基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；在水稻中过表达功能基因Os03g0280400能增加水稻植株分蘖数，又降低株高。
2.一种利用水稻促分蘖新功能基因Os03g0280400提高水稻单株产量的方法，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；在水稻中过表达功能基因Os03g0280400能增加水稻植株分蘖数，又降低株高。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：制备获得Os03g0280400基因过表达载体；将过表达载体转化水稻野生型品种日本晴，获得转基因水稻植株。
CN202310036453.9A 2023-01-10 2023-01-10 水稻促分蘖基因及其用途 Active CN116042699B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310036453.9A CN116042699B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 水稻促分蘖基因及其用途
PCT/CN2023/100979 WO2024148764A1 (zh) 2023-01-10 2023-06-19 水稻促分蘖基因及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310036453.9A CN116042699B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 水稻促分蘖基因及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116042699A CN116042699A (zh) 2023-05-02
CN116042699B true CN116042699B (zh) 2024-02-20

Family

ID=86116118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310036453.9A Active CN116042699B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 水稻促分蘖基因及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116042699B (zh)
WO (1) WO2024148764A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042699B (zh) * 2023-01-10 2024-02-20 浙江师范大学 水稻促分蘖基因及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110106199A (zh) * 2019-05-10 2019-08-09 浙江师范大学 基因LOC_Os05g38680在增加水稻有效分蘖数中的应用
CN110129330A (zh) * 2019-04-08 2019-08-16 浙江师范大学 基因在促进水稻籽粒产量上的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042699B (zh) * 2023-01-10 2024-02-20 浙江师范大学 水稻促分蘖基因及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129330A (zh) * 2019-04-08 2019-08-16 浙江师范大学 基因在促进水稻籽粒产量上的应用
CN110106199A (zh) * 2019-05-10 2019-08-09 浙江师范大学 基因LOC_Os05g38680在增加水稻有效分蘖数中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Oryza sativa Japonica Group cDNA clone;无;GenBank;ORIGIN部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116042699A (zh) 2023-05-02
WO2024148764A1 (zh) 2024-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106399323B (zh) 一种水稻叶色调控基因yl1及其应用
WO2020228839A1 (zh) 基因LOC_Os05g38680在增加水稻有效分蘖数中的应用
CN116042699B (zh) 水稻促分蘖基因及其用途
CN111333707A (zh) 一种植物粒型相关蛋白及其编码基因与应用
CN108642067A (zh) 一种水稻胚乳粉质相关的基因OsHsp70cp-2及其编码蛋白质和应用
CN111593058A (zh) Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用
CN112795588B (zh) OsSGD1蛋白在调控水稻籽粒大小中的应用
CN104628839B (zh) 一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用
CN116287384B (zh) 抗虫耐除草剂玉米转化事件ld05的核酸分子、检测方法及其应用
Li et al. Rapid generation of selectable marker-free transgenic rice with three target genes by co-transformation and anther culture
CN109207485A (zh) OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用
CN112662799B (zh) 一种用于检测玉米植物nd4401的核酸分子及其检测方法
CN114958906A (zh) 与烟草低钾胁迫相关的基因、启动子及其应用
CN116732048B (zh) 水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节氮素吸收中的应用
CN112899274B (zh) miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用
CN112521470B (zh) 植物淀粉合成相关蛋白OsFLO18及其编码基因与应用
CN115710588B (zh) 超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用
CN114807162B (zh) 一种提高水稻光合效率和产量的方法
CN116042648B (zh) OsGELP77基因在改良水稻抗病性中的应用
CN112481412B (zh) 一种用于检测玉米植物nd4403的核酸分子及其检测方法
CN112574987B (zh) 一种用于检测玉米植物nd6603的核酸分子及其检测方法
CN110734911B (zh) miR159b在调控水稻白叶枯病抗性中的应用
CN108892712B (zh) 蛋白质TabZIP60在调控植物产量中的应用
CN116004678A (zh) 一种调控谷子锈病抗性的SiTPS27基因及其应用
JP2023088612A (ja) 耐倒伏性植物の作出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant