CN116042605A - 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒 - Google Patents

自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116042605A
CN116042605A CN202310146894.4A CN202310146894A CN116042605A CN 116042605 A CN116042605 A CN 116042605A CN 202310146894 A CN202310146894 A CN 202310146894A CN 116042605 A CN116042605 A CN 116042605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
centrifuge tube
dna
magnetic beads
solution
intestinal wall
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310146894.4A
Other languages
English (en)
Inventor
颜菁
邵庆博
林依颖
陈皓睿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Meihui Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Meihui Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Meihui Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Suzhou Meihui Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202310146894.4A priority Critical patent/CN116042605A/zh
Publication of CN116042605A publication Critical patent/CN116042605A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法和试剂盒。该自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法包括如下步骤：采集的粪便样本置于保存液中，所述保存液中含有核酸裂解试剂及质量分数1～10％的交联聚乙烯吡咯烷酮；取保存液中的粪便样本离心取上清液，将上清液置于一离心管中；向离心管中加入磁珠，混匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，停止施加磁场；向离心管中加入洗涤液，使磁珠分散均匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，停止施加磁场；将离心管中的磁珠分散并使残留的溶剂挥发；向离心管中加入DNA洗脱液，混匀，收集DNA。本发明操作简便，且允许对粪便样本常温保存的前提下保护脱落的人肠壁上皮细胞，提高DNA提取质量。

Description

自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法和试剂盒。
背景技术
结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。结肠直肠癌的发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。
对于近期出现排便习惯改变或血便的病人应不失时机地进行直肠指诊、X射线钡剂灌肠、乙状结肠镜或纤维结肠镜检查。X射线钡剂空气双重对比造影可以显示出钡剂充盈缺损、肠腔狭窄、粘膜破坏等征象，从而确定肿瘤的部位和范围。乙状结肠镜及纤维结肠镜检查可以直接观察到全结肠及直肠粘膜形态，对可疑病灶能够在直视下采取活体组织检查，对提高诊断的准确率，尤其对微小病灶的早期诊断很有价值。直肠指诊检查是诊断直肠癌的最简单而又非常重要的检查方法，它不仅可以发现肿物,而且可以确定肿块的部位、大小、形态、手术方式及其预后，许多直肠癌病人常因为没有及时做此项检查而被误诊为痔、肠炎等，以致长期延误治疗。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR技术现已被广泛用于各种临床疾病、动物疾病、食品安全及科学研究中。如对肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤疾病诊断，遗传基因检测实现对遗传病诊断。将实时荧光定量PCR应用于结直肠癌诊断中，将提高检测的准确度，适于进行结直肠癌的预防早筛和预后监测。因此，自人类粪便中提取脱离的肠道上皮细胞的DNA将有利于将实时荧光定量PCR应用于结直肠癌诊断中，且提取质量对诊断结果具有较大的影响。
虽然已有自排泄物中提取细胞DNA的方法，但排泄物采集后大多需要运送到检测场地后才能进行DAN提取、扩增等后续操作。由于肠道菌群的多样性，一旦离开人体，其活性和结构都会发生巨大变化。目前粪便保存的常用方法是-20℃～-80℃保存，不能适用于多样的采集环境。而且常见的粪便保存液，稳定性较差，即使可用于常温保存，也不能保证其中DNA的稳定性。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法和试剂盒，操作简便，且允许对粪便样本常温保存的前提下保护脱落的人肠壁上皮细胞，提高DNA提取质量。
一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，用于非诊断治疗目的，该方法包括如下步骤：
(A)采集的粪便样本置于保存液中，所述保存液中含有核酸裂解试剂及质量分数1～10％的交联聚乙烯吡咯烷酮；
(B)取保存液中的粪便样本离心取上清液，将上清液置于一离心管中；
(C)向离心管中加入磁珠，混匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，
停止施加磁场；
(D)向离心管中加入洗涤液，使磁珠分散均匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，停止施加磁场；
(E)将离心管中的磁珠分散并使残留的溶剂挥发；
(F)向离心管中加入DNA洗脱液，混匀，收集DNA。
可选地，步骤(A)中在采集的粪便样本置于保存液中常温或低于常温保存72小时内，离心取上清。
优选地，所述保存液中交联聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为2％～5％。
优选地，所述核酸裂解试剂选自硫氰酸胍和盐酸胍中的一种或两种的组合。更优选地，核酸裂解试剂包括硫氰酸胍和盐酸胍两种。
优选地，所述核酸裂解试剂的浓度为1～10mol/L。更优选地，所述核酸裂解试剂在保存液中的浓度为3～5mol/L。
优选地，所述保存液还包括：乙二胺四乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、缓冲液及无水乙醇。更优选地，乙二胺四乙酸的浓度为0.5M，pH＝8.0，体积分数为2～8％，例如2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％。更优选地，氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L或7-10g/L，例如7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。更优选地，柠檬酸钠的浓度为0.01～0.03mol/L或3-7g/L，例如3g/L、4g/L、5g/L、6g/L或7g/L。更优选地，缓冲液为1M体积分数为1％的Tris-HCL(pH＝10.0)。
优选地，步骤(C)中，混匀时间为10～30min。更优选地，混匀时间为10～20min；具体地，混匀时间为15min。更优选地，加入磁珠后，将离心管上下颠倒混匀。
优选地，步骤(C)中，向离心管中加入无水乙醇和磁珠，放入颠倒混匀仪混匀10～30min，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将离心管中的废液排出。更优选地，将离心管放入磁力架中，通过磁力架施加磁场。
优选地，步骤(D)中，向离心管中加入第一洗涤液，使磁珠分散均匀，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将未吸附到磁珠上的废液排出；向离心管中加入第二洗涤液，使磁珠分散均匀，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将未吸附到磁珠上的废液排出。更优选地，将离心管放入磁力架中，通过磁力架施加磁场。
更优选地，所述第一洗涤液包含硫氰酸胍和缓冲液，所述第二洗涤液包含氯化钠。
更优选地，所述第一洗涤液和所述第二洗涤液采用无水乙醇定容，第一洗涤液中硫氰酸胍和缓冲液的浓度分别为1～3mol/L、0.2～0.7M，第二洗涤液中氯化钠的浓度为0.2～0.8mol/L。
优选地，步骤(E)中，向离心管中的磁珠施加磁场，将离心管底部液体吸出，停止施加磁场，使离心管振动将磁珠分散，对离心管加热，使残留的溶剂挥发。更优选地，将离心管放入磁力架中，通过磁力架施加磁场。
优选地，步骤(F)中，离心管冷却至室温后，加入DNA洗脱液，振动离心管使磁珠和DNA洗脱液混匀，加热3～10min，收集DNA并低温保存。
优选地，DNA洗脱液包含乙二胺四乙酸和Tris-HCL缓冲液。更优选地，DNA洗脱液包括10mmol/L Tris-HCL和0.1mmol/L EDTA，pH为7.0。
本发明还采用如下技术方案：
一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的试剂盒，包括保存液、洗涤液、DNA洗脱液和磁珠，所述保存液包含核酸裂解试剂及质量分数1～10％的交联聚乙烯吡咯烷酮，所述核酸裂解试剂选自硫氰酸胍和盐酸胍中的一种或两种的组合。
优选地，所述保存液中交联聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为2％～5％。
优选地，核酸裂解试剂包括硫氰酸胍和盐酸胍两种。
优选地，所述核酸裂解试剂的浓度为1～10mol/L。更优选地，所述核酸裂解试剂在保存液中的浓度为3～5mol/L。
优选地，所述保存液还包括：乙二胺四乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、缓冲液及无水乙醇。
更优选地，乙二胺四乙酸的浓度为0.5M，pH＝8.0，体积分数为2～8％，例如2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％。更优选地，氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L或7-10g/L，例如7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。更优选地，柠檬酸钠的浓度为0.01～0.03mol/L或3-7g/L，例如3g/L、4g/L、5g/L、6g/L或7g/L。更优选地，缓冲液为1M体积分数为1％的Tris-HCL(pH＝10.0)。
优选地，所述洗涤液包括独立放置的第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液包含硫氰酸胍和缓冲液，所述第二洗涤液包含氯化钠；所述DNA洗脱液包含乙二胺四乙酸和Tris-HCL缓冲液。
更优选地，所述第一洗涤液和所述第二洗涤液采用无水乙醇定容，第一洗涤液中硫氰酸胍和缓冲液的浓度分别为1～3mol/L、0.2～0.7M，第二洗涤液中氯化钠的浓度为0.2～0.8mol/L。
更优选地，DNA洗脱液包括10mmol/L Tris-HCL和0.1mmol/L EDTA，pH为7.0。
本发明中，术语“常温”是指15～25℃。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的提取方法及试剂盒，粪便样本采集后即置于保存液中，能够常温保存同时对样本中的脱落细胞(尤其是人肠道上皮细胞)进行裂解处理，使核酸物质释放并对其进行保护，在样本采集后的72h内均可以对样本直接进行提取处理，操作方便，具有较高的提取效率，提取的人肠道上皮细胞DNA具有较好的提取质量且能够满足下游应用。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。
本申请的发明人提出了将采集后的粪便样本直接置于含有核酸裂解试剂和交联聚乙烯吡咯烷酮的保存液中，快速对粪便中的微生物进行裂解，使粪便中的脱落肠道上皮细胞的DNA裂解释放，并对核酸物质进行保护，避免DNA降解；同时，保存液中的乙二胺四乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、缓冲液及无水乙醇共同作用，通过鳌合粪便悬液中的钙离子，稳定离子浓度，中和酸性幅值，有效阻止生物体反应和酶反应，能够快速对粪便中各种微生物进行裂解，提高核酸物质的解聚和释放；并且为肠道上皮细胞DNA提供了稳定的保存环境，保障了粪便中核酸物质的稳定性。粪便样本采集后可在该保存液中常温保存72h，在72h内对样本进行下一步的洗涤和洗脱处理即可。可随时随地的采集粪便样本，实现了粪便样本的常温保存，并保证其中肠道上皮细胞DNA的稳定性，也方便了粪便样品的长途运输及长时间保存。
本实施方式的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的试剂盒，包括保存液、洗涤液、DNA洗脱液和磁珠。保存液包括：PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1～10％)、1～10mol/L核酸裂解试剂(硫氰酸胍、盐酸胍)、0.5M体积分数为4％的EDTA(pH＝8.0)、0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.03mol/L柠檬酸钠、缓冲液(1M体积分数为1％的Tris-HCL(pH＝10.0))、无水乙醇(体积分数为20％)。乙二胺四乙酸能够螯合溶液中的钙离子，有效阻止生物体反应和酶反应；Tris-HCl能够为核酸提供一个合适的缓冲体系；氯化钠能够稳定溶液的离子浓度；柠檬酸钠可以中和粪便中的酸性物质；通过上述各成分合理搭配，在其共同作用下，能够快速对粪便中各种微生物进行裂解，提高核酸物质的解聚和释放；并且为微生物核酸物质提供了稳定的保存环境，保障了粪便中各种微生物核酸物质的稳定性，进而提高了对粪便中微生物测序分析的准确性。洗涤液配制两种，洗涤液1包含：2.0mol/L硫氰酸胍、0.5MTris-HCL(pH＝8.0)；洗涤液2包含：0.5mol/L氯化钠；溶剂均为。DNA洗脱液包含：10mmol/LTris-HCL和0.1mmol/L EDTA，pH为7.0。
实施例1
本实施例采用的试剂盒包括：
保存液：3.1mol/L硫氰酸胍、1mol/L盐酸胍、1M Tris-HCL(pH＝10.0)体积分数为1％、氯化钠8g/L、柠檬酸钠6g/L、0.5M EDTA(pH＝8.0)体积分数为4％、无水乙醇体积分数为20％。
处理液1：2.0mol/L硫氰酸胍、0.5M Tris-HCL(pH 8.0)，用无水乙醇定容。
处理液2：0.5mol/L氯化钠，用无水乙醇定容。
DNA洗脱液：10mmol/L Tris-HCL和0.1mmol/L EDTA，pH为7.0。
本实施例的一种非诊断治疗目的的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，采用上述的试剂盒，具体如下：
1、采集人粪便5ml～20mL置于保存液中，震荡溶解，将保存液中的粪便样本常温放置72h。
2、将上述粪便样本离心取上清500ul转移至新的5mL离心管中。
3、加入1000μL无水乙醇和50μL磁珠，上颠倒混匀仪，混匀15min。
4、瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
5、加入1000μL处理液1，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
6、重复步骤5一次。
7、加入1000μL处理液2，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
8、重复步骤7一次。
9、瞬时离心后置于磁力架上，使用小枪头吸取5mL离心管底部液体，轻弹离心管底部，使磁珠分散。
10、5mL离心管开盖置于56℃金属浴上加热1min，使残留乙醇挥发完全。
11、冷却至室温后，加入65μLDNA洗脱液，轻弹离心管底部，混匀后，置于56℃金属浴上加热5min，收集DNA溶液并保存在-20℃。
采用实施例1的方法对来10位患者的粪便样本进行采集和DNA提取，提取完成后对粪便中的脱落肠道上皮细胞的DNA进行了浓度及纯度的测定，具体参见表1。
实施例2
本实施例的一种非诊断治疗目的的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，采用上述的试剂盒，具体如下。
1、采集人粪便5ml～20mL置于保存液中，震荡溶解，室温孵育15min。
2、将上述粪便样本离心取上清500ul转移至新的5mL离心管中。
3、加入1000μL无水乙醇和50μL磁珠，上颠倒混匀仪，混匀15min。
4、瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
5、加入1000μL处理液1，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
6、重复步骤5一次。
7、加入1000μL处理液2，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
8、重复步骤7一次。
9、瞬时离心后置于磁力架上，使用小枪头吸取5mL离心管底部液体，轻弹离心管底部，使磁珠分散。
10、5mL离心管开盖置于56℃金属浴上加热1min，使残留乙醇挥发完全。
11、冷却至室温后，加入65μL DNA洗脱液，轻弹离心管底部，混匀后，置于56℃金属浴上加热5min，收集DNA溶液并保存在-20℃。
采用实施例2的方法对来10位患者的粪便样本进行采集和DNA提取，提取完成后对粪便中的脱落肠道上皮细胞的DNA进行了浓度及纯度的测定，具体参见表1。
对比例
本对比例的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法具体如下。
1、采集人粪便5ml～20mL置于保存液中，震荡溶解，将保存液中的粪便样本常温放置72h。其中，保存液包括：3.1mol/L硫氰酸胍、1mol/L盐酸胍、0.5M体积分数为4％的EDTA(pH＝8.0)、0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.03mol/L柠檬酸钠、缓冲液(1M体积分数为1％的Tris-HCL(pH＝10.0))、无水乙醇(体积分数为20％)；即保存液不包含PVPP。
2、将上述粪便样本离心取上清500ul转移至新的5mL离心管中。
3、加入1000μL无水乙醇和50μL磁珠，上颠倒混匀仪，混匀15min。
4、瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
5、加入1000μL上述处理液1，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
6、重复步骤5一次。
7、加入1000μL上述处理液2，使用移液器轻柔吹吸磁珠以使磁珠分散均匀，瞬时离心后置于磁力架上，待磁珠被完全吸附后弃废液。
8、重复步骤7一次。
9、瞬时离心后置于磁力架上，使用小枪头吸取5mL离心管底部液体，轻弹离心管底部，使磁珠分散。
10、5mL离心管开盖置于56℃金属浴上加热1min，使残留乙醇挥发完全。
11、冷却至室温后，加入65μL上述DNA洗脱液，轻弹离心管底部，混匀后，置于56℃金属浴上加热5min，收集DNA溶液并保存在-20℃。
采用对比例的方法对来10位患者的粪便样本进行采集和DNA提取，提取完成后对粪便中的脱落肠道上皮细胞的DNA进行了浓度及纯度的测定，具体参见表1。
表1自粪便中脱落细胞提取的肠道上皮细胞的DNA的浓度及纯度
Figure BDA0004089432950000081
Figure BDA0004089432950000091
从表1可以看出，采用实施例1的方法在粪便样本常温保存72h后提取的肠道上皮细胞DNA的纯度及浓度与实施例2对粪便样本即时提取的肠道上皮细胞DNA的纯度及浓度相差不大，上述的试剂盒能够对粪便样本常温保存72h保证肠道上皮细胞DNA的提取质量；而对比例的方法在粪便样本常温保存72h后提取的肠道上皮细胞DNA的纯度及浓度较低，提取质量不好。
应用实施例
实施例1提取的人肠道上皮细胞的DNA可用于结直肠癌筛查。具体为将提取的DNA中的β-actin基因作为内参基因，ACTB(β-ACtin)基因为常用管家基因，用于评估检测中样本DNA含量和质量。具体地针对ACTB基因设计特异性引物和荧光探针，进行扩增和荧光定量PCR检测。
引物和探针的具体信息参见下表2。
表2
Figure BDA0004089432950000092
将内参ACTB基因的引物和探针放入反应管，反应管内还含有天根生化科技有限公司的FastFire qPCR PreMix。其中，ACTB的探针5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有BHQ-2荧光淬灭基团。FastFire qPCR PreMix具体包括以下组分：Taq酶、buffer、dNTPs。
验证过程具体描述如下。
(1)反应管内反应液试剂成分组成见表3。
表3
反应试剂 体积
2×FastFire qPCR PreMix 15
ACTB探针(100μM) 0.05μL
ACTB上游引物(100μM) 0.1μL
ACTB下游引物(100μM) 0.1μL
模板(实施例1提取的DNA) 14μL
(2)PCR扩增反应程序参见下表4。
Figure BDA0004089432950000101
实施例1的自10个样本中提取的人肠道上皮细胞DNA中ACTB基因的扩增结果检测结果参见下表5。
表5
Figure BDA0004089432950000102
结合表1和表5，证明本实施例的方法和试剂盒能够有效自粪便中的脱落细胞提取人肠壁上皮细胞DNA，提取的DNA的纯度和浓度均较好，而且PCR扩增的Ct值均在18～30之间，保证了实时荧光定量PCR检测的准确性，从而能够应用于下游的结直肠癌筛查中。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)采集的粪便样本置于保存液中，所述保存液中含有核酸裂解试剂及质量分数1～10％的交联聚乙烯吡咯烷酮；
(B)取保存液中的粪便样本离心取上清液，将上清液置于一离心管中；
(C)向离心管中加入磁珠，混匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，停止施加磁场；
(D)向离心管中加入洗涤液，使磁珠分散均匀，然后施加磁场，将未吸附到磁珠上的废液排出，停止施加磁场；
(E)将离心管中的磁珠分散并使残留的溶剂挥发；
(F)向离心管中加入DNA洗脱液，混匀，收集DNA。
2.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(A)中在采集的粪便样本置于保存液中常温或低于常温保存72小时内，离心取上清。
3.根据权利要求1或2所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，所述核酸裂解试剂选自硫氰酸胍和盐酸胍中的一种或两种的组合。
4.根据要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，所述核酸裂解试剂的浓度为1～10mol/L，所述保存液还包括：乙二胺四乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、缓冲液及无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(C)中，混匀时间为10～30min。
6.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(C)中，向离心管中加入无水乙醇和磁珠，放入颠倒混匀仪混匀10～30min，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将离心管中的废液排出。
7.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(D)中，向离心管中加入第一洗涤液，使磁珠分散均匀，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将未吸附到磁珠上的废液排出；向离心管中加入第二洗涤液，使磁珠分散均匀，瞬时离心后将离心管置于磁场中，将未吸附到磁珠上的废液排出；所述第一洗涤液包含硫氰酸胍和缓冲液，所述第二洗涤液包含氯化钠。
8.根据权利要求7所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，所述第一洗涤液和所述第二洗涤液采用无水乙醇定容，第一洗涤液中硫氰酸胍和缓冲液的浓度分别为1～3mol/L、0.2～0.7M，第二洗涤液中氯化钠的浓度为0.2～0.8mol/L。
9.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(E)中，向离心管中的磁珠施加磁场，将离心管底部液体吸出，停止施加磁场，使离心管振动将磁珠分散，对离心管加热，使残留的溶剂挥发。
10.根据权利要求1所述的自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的方法，其特征在于，步骤(F)中，离心管冷却至室温后，加入DNA洗脱液，振动离心管使磁珠和DNA洗脱液混匀，加热3～10min，收集DNA并低温保存；DNA洗脱液包含乙二胺四乙酸和Tris-HCL缓冲液。
11.一种自粪便提取人肠壁上皮细胞DNA的试剂盒，其特征在于，包括保存液、洗涤液、DNA洗脱液和磁珠，所述保存液包含核酸裂解试剂及质量分数1～10％的交联聚乙烯吡咯烷酮，所述核酸裂解试剂选自硫氰酸胍和盐酸胍中的一种或两种的组合。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述保存液还包括：乙二胺四乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、缓冲液及无水乙醇。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括独立放置的第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液包含硫氰酸胍和缓冲液，所述第二洗涤液包含氯化钠；所述DNA洗脱液包含乙二胺四乙酸和Tris-HCL缓冲液。
CN202310146894.4A 2023-02-22 2023-02-22 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒 Pending CN116042605A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310146894.4A CN116042605A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310146894.4A CN116042605A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042605A true CN116042605A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86125624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310146894.4A Pending CN116042605A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042605A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017114150A1 (zh) 一种肿瘤分子检测/诊断试剂
CN109207592B (zh) 用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用
EP3800273A1 (en) Use of detection reagent for detecting methylation of genes associated with colorectal cancer, and kit
US8754204B2 (en) Method for preparing stool sample, solution for preparing stool sample, and kit for collecting stool
US20160010081A1 (en) Systems, methods and kits for extracting nucleic acid from digestive fluid
CN109097477A (zh) 一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用
CN110373470A (zh) 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
US20110183332A1 (en) Method for recovering nucleic acid from stool sample, nucleic acid analysis method and stool sample processing apparatus
CN116121380A (zh) 一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法
CN113981083B (zh) 用于结直肠癌基因甲基化检测的核酸组合、试剂盒
CN113355416A (zh) 一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
WO2017101756A1 (zh) 一种结直肠癌检测试剂盒
Ahmed et al. Improved methods for extracting RNA from exfoliated human colonocytes in stool and RT-PCR analysis
CN115627297B (zh) 一种检测人粪便幽门螺旋杆菌核酸的试剂盒
CN116042605A (zh) 自粪便提取人肠壁上皮细胞dna的方法和试剂盒
CN109486809B (zh) 一种大量提取转化粪便dna的方法
WO2022160750A1 (zh) 结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
CN114507739A (zh) 用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的引物和探针
CN112592979A (zh) 一管式筛查肿瘤患者体内etv6-ntrk3融合基因的引物、探针和方法
CN112553356A (zh) 一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法
WO2020190613A1 (en) Methods of detecting minimal residual disease
CN111793693A (zh) 一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
Nielsen et al. Relationship between urinary β-aminoisobutyric acid and transfer RNA turnover in cancer patients
WO2024001602A1 (zh) 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途
Takahashi et al. Microsatellite instability and loss of heterozygosity in the nondysplastic colonic epithelium of ulcerative colitis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication