CN116042446B - 用于废旧沥青混合料油石分离的鼠李糖脂产生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于废旧沥青混合料油石分离的鼠李糖脂产生菌及其应用，所述鼠李糖脂产生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM20221536，分类命名为铜绿假单胞菌。本发明通过鼠李糖脂产生菌将RAP中老化沥青与集料有效分离，不会破坏集料的原有构造棱角，减少新添加的材料与原有老化沥青及集料间的结团现象，消除RAP料再利用过程中假粒径的问题，减小性能变异性。此外，在鼠李糖脂产生菌分离RAP料中老化沥青与集料的同时，培养基中剩余的亚油酸对老化沥青也具有一定的再生作用，可以达到RAP料的油石分离及老化沥青再生的双重作用，节约能源，积极响应了国家节能减排的倡导。
Description
技术领域
本发明属于道路工程领域，涉及以沥青路面工程中常用的生物油再生剂为碳源的鼠李糖脂产生菌及其在废旧沥青混合料油石分离中的应用。
背景技术
我国已进入沥青路面的大规模养护及维修阶段，沥青混合料回收料(RAP)的再生技术是解决我国资源循环利用的重要途经。在传统再生技术中，由于回收料中旧沥青会黏附在集料表面，使得RAP性能存在变异性；同时，新料的添加会包裹旧沥青和骨料，导致旧沥青无法与再生剂充分融合，产生结团现象，导致RAP的利用率低，再生效果不佳。因此，应该通过一些方法来调整RAP的高效利用。分离式再生技术可以较好的将集料与老化沥青分离，但由于外界机械力的存在，导致集料被抛光了棱角，难以实现原位再利用。以生物油再生剂为碳源从油田土壤中筛选的细菌能够产生鼠李糖脂，是一种阴离子表面活性剂，具有较强的表面活性和乳化能力，对环境友好，能够有效的将废旧沥青混合料中的老化沥青从集料表面脱离，解决RAP料假粒径、变异性大等问题，提升RAP的利用率。
发明内容
针对目前RAP利用率低、再生沥青混合料结团的问题，本发明提供了一种用于废旧沥青混合料油石分离的鼠李糖脂产生菌及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一株用于废旧沥青混合料油石分离的鼠李糖脂产生菌，菌株名为W1，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期为2022年9月30日，保藏编号为CCTCC M20221536，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
上述鼠李糖脂产生菌的生理生化特征表现为：棒状杆菌；革兰氏染色阴性；有鞭毛；无芽胞；无荚膜；可生长温度范围为25～42℃，最适生长温度37℃；可生长pH范围为5.0～9.0，最适pH值为7.0；产生绿色荧光色素。
上述鼠李糖脂产生菌可用于废旧沥青混合料油石分离分离，具体方法如下：
步骤一：将破碎后的不同挡位RAP清洗干净，最后一遍采用无菌水冲洗，晾干备用；
步骤二：将鼠李糖脂产生菌接种于锥形瓶内发酵培养基中，于37℃、160r·min-1的摇床中大规模扩培养3～7天，得到高浓度鼠李糖脂发酵液，其中：
所述发酵培养基包含：KH2PO40.7g,NaHPO40.9g,NaNO32g,MgSO40.4g,CaCl20.1g,微量元素2号溶液1mL，亚油酸1ml，去离子水1000mL，溶解后调节pH值为7.0；
所述微量元素2号包含：FeCl30.16g，ZnSO41.5g，CuSO40.15g，MnSO41.5g，H3BO31.5g，去离子水1000mL；
步骤三：将RAP料装入锥形瓶内，置于涡旋振荡器2min，使鼠李糖脂发酵液与RAP料充分接触，然后置于37℃、250r·min-1摇床中培养3～7天，即可使老化沥青与集料分离。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1)本发明得到了一种以沥青路面工程中常用的亚油酸再生剂为碳源生长并产生鼠李糖脂的鼠李糖脂产生菌菌种。本发明中鼠李糖脂产生菌的筛选、鉴定方法具有高效性、环保性的特点，该鼠李糖脂产生菌为下一步研究菌株的生产性能和沥青路面中RAP料的油石分离开发创造了条件，同时对未来道路工程中废旧沥青路面的再生利用提供了新资源和新思路，在道路行业具有广阔的应用前景。
2)本发明通过微生物可降解产物鼠李糖脂产生菌将RAP中老化沥青与集料有效分离，与同类机械物理分离相比，分离效果更好，不会破坏集料的原有构造棱角，减少新添加的材料与原有老化沥青及集料间的结团现象，消除RAP料再利用过程中假粒径的问题，减小性能变异性。此外，在鼠李糖脂产生菌分离RAP料中老化沥青与集料的同时，培养基中剩余的亚油酸对老化沥青也具有一定的再生作用，可以达到RAP料的油石分离及老化沥青再生的双重作用，节约能源，积极响应了国家节能减排的倡导。
附图说明
图1是鼠李糖脂产生菌的菌落形态特征图。
图2是鼠李糖脂产生菌的显微镜检图。
图3是鼠李糖脂产生菌的16S rDNA序列系统发育树建树报告。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明针对目前RAP料回收利用率低、再生沥青混合料结团的问题，提供了一种基于土壤细菌代谢产物的老化沥青与集料分离的方法，具体步骤如下：
步骤一：取大庆采油一厂萨区块油田的油井井口周围土壤，筛除大颗粒杂质。
步骤二：称取130ml无菌水装入底层铺满玻璃珠的250ml锥形瓶中，121℃灭菌20min，冷却待用。
步骤三：称取15g过筛后的油田土壤装入加有玻璃珠的无菌水中，置于30℃控温摇床研磨8h，摇床转速160r·min-1。
步骤四：将研磨后的土壤液静置2.5h，取10ml土壤上清液接种于150ml筛选培养基中，上摇床培养7天，30℃，160r·min-1，得到1号富集液。
步骤五：取1号富集液5ml接种到筛选培养基中，上摇床培养7天，30℃，160r·min-1，得到2号富集液，重复此步骤，得到3号富集液。
步骤六：取3号富集液于LB平板培养基中划线，得到不同菌种的单菌落。
步骤七：挑取步骤六平板培养基上的单菌落分别置于发酵培养基中，于37℃，160r·min-1的摇床培养7天后，得到不同菌种的发酵液。
步骤八：将步骤七所得的不同菌种发酵液取样，利用薄层色谱法(TLC)及傅里叶红外光谱法(FTIR)进行测试，与鼠李糖脂标准品图谱进行对照，得到具有鼠李糖脂的发酵液并确定步骤六中鼠李糖脂产生菌菌落。
步骤九：将步骤六中得到的鼠李糖脂产生菌进行16S rDNA序列测定和建树分析。采用细菌引物对本发明中的鼠李糖脂产生菌菌株进行PCR扩增反应，然后对PCR扩增产物进行DNA序列测定与分析，鉴定结果表明，该鼠李糖脂产生菌为铜绿假单胞菌，基因序列如下：CTACCCATGCAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTACCACGG。生理生化特征表现为：棒状杆菌；革兰氏染色阴性；有鞭毛；无芽胞；无荚膜；可生长温度范围为25～42℃，最适生长温度为37℃；可生长pH范围为5.0～9.0，最适pH值为7.0；产生绿色荧光色素。鼠李糖脂产生菌的菌落形态特征图如图1所示，显微镜检图如图2所示，16S rDNA序列系统发育树建树报告如图3所示。
步骤十：将破碎后的不同挡位RAP清洗干净，最后一遍采用无菌水冲洗，晾干备用。
步骤十一：将步骤六中得到的鼠李糖脂产生菌继续接种于锥形瓶内发酵培养基中，于37℃，160r·min-1的摇床中大规模扩培养7天，得到高浓度鼠李糖脂发酵液。
步骤十二：将RAP料装入锥形瓶内，置于涡旋振荡器2min，使细菌及细菌产物(鼠李糖脂)与RAP料充分接触，然后置于37℃，250r·min-1摇床中3天，即可使沥青与集料较好的分离。
本发明中，所述筛选培养基包含：NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO41g，MgSO40.5g，CaCl20.2g，微量元素溶液1号溶液1mL，亚油酸0.5ml，去离子水1000mL，溶解后调节pH值为7.0。
本发明中，所述微量元素1号包含：MnSO440.0mg，ZnSO4·7H2O43.0mg,Fe·SO4·7H2O 21.4mg，CuSO440.5mg，去离子水1000mL。
本发明中，所述发酵培养基包含：KH2PO40.7g,NaHPO40.9g,NaNO32g,MgSO40.4g,CaCl20.1g,微量元素2号溶液1mL，亚油酸1ml，去离子水1000mL，溶解后调节pH值为7.0。
本发明中，所述微量元素2号包含：FeCl30.16g，ZnSO41.5g，CuSO40.15g，MnSO41.5g，H3BO31.5g，去离子水1000mL。
本发明中，所述LB平板培养基包含：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂粉15g，去离子水1000mL，溶解后调节pH值为7.0，121℃灭菌20min。
将本发明筛选得到的菌种及其产物与去离子水对废旧沥青混合料的分离效果进行对比，对比结果如表1所示。
表1菌液与去离子水对RAP料中老化沥青-集料的分离效果对比
Claims (4)
1.一种用于废旧沥青混合料油石分离的鼠李糖脂产生菌，其特征在于所述鼠李糖脂产生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221536，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
2.一种权利要求1所述鼠李糖脂产生菌在废旧沥青混合料油石分离中的应用。
3.根据权利要求2所述的鼠李糖脂产生菌在废旧沥青混合料油石分离中的应用，其特征在于所述废旧沥青混合料中油石分离的具体方法如下：
步骤一：将破碎后的不同档位RAP清洗干净，最后一遍采用无菌水冲洗，晾干备用；
步骤二：将鼠李糖脂产生菌接种于锥形瓶内发酵培养基中，于37℃、160r·min-1的摇床中大规模扩培养3～7天，得到高浓度鼠李糖脂发酵液；
步骤三：将RAP料装入锥形瓶内，置于涡旋振荡器2min，使鼠李糖脂发酵液与RAP料充分接触，然后置于37℃、250r·min-1摇床中培养3～7天，即可使老化沥青与集料分离。
4.根据权利要求3所述的鼠李糖脂产生菌在废旧沥青混合料油石离中的应用，其特征在于所述发酵培养基包含：KH2PO40.7 g,NaHPO40.9 g,NaNO32 g,MgSO40.4 g,CaCl20.1 g,微量元素2号溶液1mL，亚油酸1ml，去离子水1000mL，溶解后调节pH值为7.0，所述微量元素2号包含：FeCl30.16 g，ZnSO41.5 g，CuSO40.15 g，MnSO41.5g，H3BO31.5 g，去离子水1000mL。
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