CN116036286A - S100a7在肺鳞状细胞癌免疫检查点抑制剂治疗中的应用 - Google Patents

S100a7在肺鳞状细胞癌免疫检查点抑制剂治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了S100A7在肺鳞状细胞癌免疫检查点抑制剂治疗中的应用。本发明发现检测S100A7表达量的物质可以用于制备具有如下至少一种功能的产品：(1)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗肺鳞癌的疗效；(2)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗肺鳞癌后的无进展生存时间的长短。本发明的实验证明，S100A7可能具有预测肺鳞癌免疫治疗疗效的潜力，而且联合抑制S100A7表达可协同增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用。

Description

S100A7在肺鳞状细胞癌免疫检查点抑制剂治疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，S100A7在肺鳞状细胞癌免疫检查点抑制剂治疗中的应用。
背景技术
肺癌是严重威胁人类生命安全的常见恶性肿瘤，其死亡率在全球和中国均居首位，其中肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)由于缺乏有效的治疗手段，LUSC患者的总体治疗情况并不乐观。近年来，针对程序性细胞死亡蛋白1(programmed celldeath protein-1,PD-1)以及程序性细胞死亡配体蛋白1(programmed cell death-ligand1,PD-L1)的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)在临床中的应用一定程度上改善了LUSC患者的预后，但是只有一部分患者能够从ICIs治疗中获益。虽然研究发现肿瘤突变负荷、PD-L1表达量以及CD8+T淋巴细胞浸润与ICIs治疗疗效相关，但是上述方法仍然无法准确有效地筛选出能够从ICIs治疗中获益的LUSC患者。因此，需要寻找更精准并具有临床转化潜能的生物标志物以指导LUSC患者接受ICIs治疗的临床应用，不仅筛选出能从ICIs治疗中获益的人群以及耐药的人群，并且通过多靶点联合治疗扩大ICIs治疗的响应人群。
发明人前期研究发现S100A7(S100 calcium binding protein A7，也被称作psoriasin)不仅能够通过激活p-ERK通路和p-FAK通路从而促进肺鳞状细胞癌和食管鳞癌的进展，同时在食管鳞癌能够促进肿瘤微环境中M2型巨噬细胞浸润和血管生成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预测免疫检查点抑制剂治疗肺鳞状细胞癌的疗效以及如何联合免疫检查点抑制剂治疗肺鳞状细胞癌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备治疗和/或辅助治疗非小细胞肺癌产品中的应用；
或，抑制S100A7基因表达的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备治疗和/或辅助治疗非小细胞肺癌产品中的应用；
或，降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备抑制非小细胞肺癌生长产品中的应用；
或，抑制S100A7基因表达的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备抑制非小细胞肺癌生长产品中的应用。
上述应用中，所述非小细胞肺癌可为肺鳞状细胞癌。
本发明还提供了一种产品，所述产品由降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体组成，或由抑制S100A7基因表达的物质与PD-1或PD-L1抗体组成。
上文中，所述抑制S100A7基因表达的物质为降低S100A7基因表达量的核酸分子或为含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
所述核酸分子可为序列3的第448-468位或第485-505位，或为序列3的第448-468位转录的RNA或序列3的第485-505位转录的RNA。
所述重组载体可为pHS-ASR-LW1051或pHS-ASR-LW1052。
本发明还提供了检测S100A7表达量的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
(1)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗非小细胞肺癌的疗效；
(2)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗非小细胞肺癌后的无进展生存时间的长短。
上述应用中，所述检测S100A7表达量的物质可为检测待测非小细胞肺癌患者的基线血浆中的S100A7表达量的物质；
或，所述检测待测非小细胞肺癌患者的基线血浆中的S100A7表达量的物质为能特异结合S100A7的抗体或其他分子。
本发明还提供了检测S100A7表达量的物质作为标志物在开发、筛选和/或制备用于预测或辅助预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂治疗疗效的试剂中的应用。
上述应用中，所述免疫检查点抑制剂治疗采用的药物可为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
上述应用中，所述非小细胞肺癌可为肺鳞状细胞癌。
本发明中，所述PD-1抗体可为帕博利珠单抗(Pembrolizumab)和信迪利单抗(Sintilimab)。
人S100A7基因(序列1的第62-367位，编码序列2所示的蛋白质)在小鼠中同源基因为S100A7a(序列3的第111-434位，编码序列4所示的蛋白质)，在小鼠细胞系中进行体内实验时采用的是小鼠S100A7a。
实验证明，在疾病进展患者中S100A7的基线血浆水平较显著高于其他患者，且与进展生存率显著相关；进一步实验表明，与空载体对照相比，抗PD-L1单抗的抗肿瘤作用在S100A7a敲降组中更强，同时发现在没有抗PD-L1单抗的情况下，敲降S100A7a会降低肿瘤结节的生长速度。上述结果表明，降低S100A7a的表达，可以实现治疗肺鳞癌，联合抑制S100A7a表达可协同增强ICIs抗肿瘤作用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为患者中S100A7的基线血浆水平分析。A为PR、SD、PD患者的基线血浆水平分析，三组之间的差异分析显示p值为0.04；B为Non-PD、PD患者的基线血浆水平分析；C为ROC曲线；D为S100A7基线血浆水平与无进展生存率分析。
图2为慢病毒稳定转染的KLN205细胞中蛋白表达的Western-Blot检测结果。
图3为联合抑制S100A7表达可协同增强ICIs抗肿瘤作用实验结果。A为肿瘤体积；B为同型对照组小鼠肿瘤生长情况；C为抗PD-L1单抗组小鼠肿瘤生长情况。**表示差异达到显著水平(p＜0.01)，***表示差异达到显著水平(p＜0.001)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的统计方法：使用R软件(3.6.0版)和GraphPad Prism软件(8.0版，Graph Pad，San Diego，CA，USA)进行数据分析。使用Kruskal-Wallis H检验或Mann-Whitney U检验评估自变量之间的差异。Fisher精确检验用于分析分类变量。使用Pearson相关分析获得相关系数。使用对数秩检验和Kaplan-Meier分析评估存活率。此外，对预后进行单变量和多变量分析的Cox回归。所有的统计分析都是双向的，P值小于0.05认为有统计学意义。
实施例1、S100A7在预测肺鳞状细胞癌ICIs治疗疗效中的应用
实施例中病例选择：本发明为回顾性、非干预性临床研究。按照赫尔辛基宣言的原则进行，并已获得所有受试者的知情同意。
1.临床队列和反应评估
本发明共纳入了27名在中国医学科学院肿瘤医院(CICAMS)诊断为肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)并接受抗PD-1抗体治疗的患者队列，基线资料情况具体见表1。患者的入组标准为：1)临床诊断为局部晚期或晚期的肺鳞状细胞癌患者；2)首次接受免疫治疗，但不限治疗线数。排除标准为：1)排除胸腺癌、胸膜间皮瘤等其他类型胸部肿瘤；2)无基线治疗血标本。纳入研究的患者所用抗PD-1抗体为帕博利珠单抗(Pembrolizumab)和信迪利单抗(Sintilimab)，两种抗PD-1抗体均为200mg/次，每个患者采用一种单抗治疗，每三周治疗一次。患者是每六周进行一次颈胸腹部增强CT评估治疗效果，必要时增加头颅增强MRI完善疗效评价。
本研究纳入患者的一般情况包括初诊年龄、性别、ECOG PS评分、疾病分期和吸烟状态。临床资料包括免疫治疗线数和免疫治疗药物。
患者在治疗期间的疗效评价是根据实体瘤疗效评估标准1.1版本(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST version 1.1)进行评估的。疗效评价指标包括完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stabledisease,SD)和疾病进展(progressive disease,PD)。
无进展生存时间(progression-free survival,PFS)定义为患者自开始接受免疫检查点抑制剂治疗到疾病进展或死亡的时间。
以上资料均通过查询住院病历及电话随访获得。本实验获得CICAMS伦理委员会批准(批准号20/242-2438)。
表1、基线资料情况
Figure BDA0003897376820000041
Figure BDA0003897376820000051
2.样品采集和酶联免疫吸附试验(ELISA)
抗PD-1免疫治疗前收集患者血标本，将血样收集在EDTA采血管中。所有样品在收集后2小时内处理，并在4℃下以3000rpm离心10分钟，取上层血浆储存在-80℃用于ELISA检测。S100A7基因的GeneBank编号为NM_002963.4(序列1)，S100A7蛋白的GenPept的编号为NP_002954.2(更新日期为2022年6月2号)(序列2)。
血浆中游离S100A7蛋白采用采用CircuLex S100A7/Psoriasin ELISA Kit(MBL产品，货号为Cat#CY-8073)(该试剂盒是采用双抗体夹心的ELISA方法检测S100A7)进行检测，每个样品设计三个生物学重复。加入终止溶液后立即使用分光光度计(
Figure BDA0003897376820000052
190,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)在450nm处测量光密度(OD)。
检测结果：
1)27名肺鳞癌患者的血浆中S100A7蛋白浓度的检测
结果如图1中A、B和表2所示，PR为部分缓解，SD为疾病稳定，PD为疾病进展，Non-PD为部分缓解或者疾病稳定，基线血浆S100A7浓度分布范围是(0.226-3.226)pg/ml。结果显示，在疾病进展患者中S100A7的基线血浆水平较显著高于其他患者(p＝0.04；图1中A)。
2)ROC曲线
结合患者基线血浆S100A7蛋白浓度，进展状态和无进展生存时间，绘制了ROC曲线。结果如图1中C所示，AUC为0.869。发现S100A7的基线血浆水平测量值对免疫治疗反应具有潜在的预测价值。
3)生存曲线
然后，本发明根据ROC曲线计算的最佳分界值将患者分为两组(分界值＝0.903pg/ml)，一组S100A7的基线血浆水平大于或等于0.903pg/ml(记为高表达)，一组S100A7的基线血浆水平小于0.903pg/ml(记为低表达)。本发明发现较高的S100A7基线血浆水平与较差的无进展生存率显着相关(p＝0.00471；图1中D)。
表2、27名肺鳞癌患者治疗后的进展状态、无进展生存时间以及基线血浆中S100A7蛋白的浓度
Figure BDA0003897376820000061
Figure BDA0003897376820000071
上表中，第3列中“进展状态”的1表示第4列随访时间内复发，0表示第4列随访时间内无复发或者失访。
4.单因素和多因素分析
此外，单变量和多变量Cox回归分析显示，S100A7的基线血浆水平是一个独立的预后因素(表3)，血浆中S100A7高表达(即S100A7的基线血浆水平大于或等于0.903pg/ml)提示无进展生存期缩短。
而基线血浆S100A7表达水平是影响PFS的独立危险因素(p＝0.009，HR＝2.731，95％CI[1.284-5.811])。
表3、PFS的单因素与多因素分析
Figure BDA0003897376820000072
实施例2、联合抑制S100A7a表达可协同增强ICIs抗肿瘤作用
本发明体内小鼠实验实施，人S100A7基因在小鼠中同源基因为S100A7a，在小鼠细胞系中进行体内实验时采用的是小鼠S100A7a：
1.细胞系及动物
所用的小鼠KLN205细胞系(小鼠肺鳞状细胞癌细胞系)：美国ATCC细胞资源中心。
所用小鼠为雄性DBA-2J小鼠(SPF，5-6周龄)，北京华阜康有限公司(中国北京)。在标准条件下将小鼠饲养在CICAMS实验动物中心的动物护理设施中。所有程序均经CICAMS动物护理和使用委员会批准。
2.重组载体的制备
空载体(VEC)、S100A7a-过表达载体(OE)和S100A7a-knockown载体(Sh1和Sh2)如下：
空载体(VEC)：pHS-BVC-LW397(由北京合生基因科技有限公司合成，pLV-EF1a-hluc-P2A-mNeongreen-CMV-3Xflag-P2A-puro)，其序列为序列表中序列5。
S100A7a-过表达载体(OE)：pHS-AVC-LW2202(由北京合生基因科技有限公司合成，pLV-EF1a-hluc-P2A-mNeongreen-CMV-S100A7a-3Xflag-P2A-puro),其序列为序列表中序列6，该重组载体含有序列3的第111-434位所示的S100A7a基因，能够表达序列4所示的S100A7a蛋白质与3Xflag所形成的融合蛋白质，基因的表达由CMV启动子驱动。
S100A7a-knockown载体(Sh1)：pHS-ASR-LW1051(由北京合生基因科技有限公司合成，pLV-hU6-S100A7a shRNA01(Mouse)-CMV-3flag-P2A-Puro，其靶序列为5’-GGCAGTCTCTCATCACCAGAA-3’)，其序列为序列表中序列7。
S100A7a-knockown载体(Sh2)：pHS-ASR-LW1052(由北京合生基因科技有限公司合成，LV-hU6-S100A7a shRNA02(Mouse)-CMV-3flag-P2A-Puro，其靶序列为5’-GCCTGATCATGAACAGTGTAC-3’)，其序列为序列表中序列8。
3.载体稳定转染的KLN205细胞的制备
将空载体(VEC)、S100A7a-过表达载体(OE)、S100A7a-knockown载体(Sh1)、S100A7a-knockown载体(Sh2)作为待转基因的慢病毒质粒转染小鼠KLN205细胞系，制备载体稳定转染的KLN205细胞，制备方法如下：
(1)293T细胞的准备：使用完全培养基(含10％FBS的DMEM高糖培养基)培养293T细胞，待细胞汇合度达到70％左右时进行转染；
(2)试剂准备：配制DNA和脂质体的复合物，方法如下：
A管：在无菌的EP管中加入500μL的OPTI-MEM培养基和43.4μL的Lipo3000转染试剂(美国Invitrogen公司；Cat#L3000015)，用移液枪吹打混匀；
B管：在无菌的EP管中依次加入500μL的OPTI-MEM培养基，慢病毒包装制备系统(pLP1，pLP2，pLP/VSVG；InvitrogenTMViraPowerTMLentiviral Packaging Mix；美国Invitrogen公司；Cat#K497500)和待转基因的慢病毒质粒各6μg，48μL的P3000(美国Invitrogen公司；Cat#L3000015)，用移液枪吹打混匀；
将A管与B管混匀，室温下静置5-10min，得到DNA和脂质体的复合物；
(3)293T细胞的转染：从细胞培养箱中取出293T细胞，更换新鲜培养基后，将步骤(2)制备好的DNA和脂质体的复合物逐滴加入293T细胞的培养皿中，轻轻摇晃培养皿，充分混匀；
(4)病毒的纯化及浓缩：将步骤(3)完成后，将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中培养48-72小时后，用移液枪将细胞培养基转移至离心管中，2500rpm离心10min后去除细胞碎片，将上清(即病毒悬液)转移至病毒浓缩管中浓缩，设置离心参数为4℃、3500rpm，离心10-20min，得到病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装在无菌的1.5mL EP管，置于-80℃保存备用。
(5)目的细胞(小鼠KLN205细胞系)的汇合度达到80％-90％时，用胰酶消化细胞传代，取2×105细胞加入六孔板中，放入培养箱中过夜；
(6)第二天，显微镜下观察细胞的密度及状态，更换新鲜培养基，按照感染复数(MOI)为40加入适量体积的浓缩病毒液，并且加入适量体积的polybrene至终浓度为5μg/mL，轻轻混匀后放入培养箱中培养。12-24h后，弃去含有病毒液的上清，更换新的培养基；
(7)病毒转染48-72小时后，可以在荧光显微镜下观察细胞中荧光蛋白的表达情况进行感染效率的评估，然后加入浓度为2μg/mL的抗生素(即转染所用目的质粒中包含的嘌呤霉素抗性，Cat#A1113803，美国Gibco公司)的完全培养基进行药物筛选；
(8)药物筛选持续2周左右，待细胞能维持相对稳定的生长，不再继续死亡后，更换为低浓度的抗生素继续维持筛选，即可得到载体稳定转染的KLN205细胞。
Western-Blot结果显示S100A7a分别在稳定转染空载体(VEC)、过表达载体(OE)、敲除载体(Sh1和Sh2)的KLN205细胞系中的表达情况。以GAPDH为内参，所用抗体为Anti-GAPDH抗体[6C5](英国Abcam公司，Cat#ab8245)与S100A7抗体(美国Thermo公司，Cat#PA5-79947)。
结果见图2，结果显示，转染S100A7a-过表达载体(OE)的细胞系可成功表达目的蛋白S100A7；转染S100A7a-knockown载体(Sh1、Sh2)的细胞系中目的蛋白S100A7的表达均显著下降。
4.小鼠肺鳞癌皮下移植瘤模型
为了建立LUSC的小鼠模型，DBA-2J小鼠皮下植入小鼠KLN205衍生的同源移植物。具体移植步骤如下：
小鼠KLN205衍生的同源移植物的制备：所用细胞分别为步骤3所得空载体(VEC)、S100A7a-过表达载体(OE)、S100A7a-knockown载体(Sh1)、S100A7a-knockown载体(Sh2)载体稳定转染的KLN205细胞。将细胞悬液用1mL注射器缓慢注射入小鼠皮下(每只小鼠的注射剂量为100μL，含有细胞数量1×106个)，每3天观察小鼠皮下成瘤情况，用游标卡尺测量肿瘤体积并做好记录；然后将形成的皮下肿瘤取出剪成大小一致的小肿瘤块(大小为30mm3)，即为小鼠KLN205衍生的同源移植物，后续重新种植于DBA-2J小鼠皮下，每只小鼠移植一块，每种细胞得到的同源移植物移植至少5只小鼠。
移植后每三天使用卡尺测量肿瘤大小，并根据公式V＝L×W2/2(V：肿瘤体积；L：肿瘤长度；W：肿瘤宽度)计算肿瘤体积。
5.荷瘤小鼠的抗肿瘤处理
将每种移植的小鼠随机分为2组(即同型对照组与抗PD-L1单抗组)，每组5只，当最大肿瘤直径达到6mm时给予不同的治疗。
(1)对照组：分别于开始给药的第1，4，7，10天，给每只小鼠腹腔注射100μl的同种型对照(美国BioXell公司的产品，InVivoMab rat IgG2b isotype control,Cat#BE0090)；
(2)抗PD-L1单抗组：分别于开始给药的第1，4，7，10天，给每只小鼠腹腔注射100μl的抗PD-L1单抗(美国BioXell公司的产品，InVivoMab anti-mouse PD-L1，Cat#BE0101)；
上述每组5只，采用腹腔注射给药方式，具体的药量为同种型对照和抗PD-L1单抗都为10mg/kg/只。
当最大肿瘤直径达到20mm、体重减轻大于2g或死亡时定义终点。通过二氧化碳窒息处死所有小鼠。同种型对照处理的小鼠在第20天通过二氧化碳窒息处死，因为最大肿瘤直径达到20mm。
检测结果：
与空载体对照相比，抗PD-L1单抗的抗肿瘤作用在S100A7a敲降组中更强(p<0.001；图3中A)。同时发现在没有抗PD-L1单抗的情况下，敲降S100A7a会降低肿瘤结节的生长速度(p<0.001；图3与表4)。
上述结果表明，降低S100A7a的表达，可以实现治疗肺鳞癌，联合抑制S100A7a表达可协同增强ICIs抗肿瘤作用。
表4、给药第20天肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003897376820000101
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备治疗和/或辅助治疗非小细胞肺癌产品中的应用；
或，抑制S100A7基因表达的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备治疗和/或辅助治疗非小细胞肺癌产品中的应用；
或，降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备抑制非小细胞肺癌生长产品中的应用；
或，抑制S100A7基因表达的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体在制备抑制非小细胞肺癌生长产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非小细胞肺癌为肺鳞状细胞癌。
3.一种产品，由降低S100A7含量或活性的物质与PD-1抗体或PD-L1抗体组成，或由抑制S100A7基因表达的物质与PD-1或PD-L1抗体组成。
4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述抑制S100A7基因表达的物质为降低S100A7基因表达量的核酸分子或为含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.检测S100A7表达量的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
(1)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗非小细胞肺癌的疗效；
(2)预测或辅助预测免疫检查点抑制剂治疗非小细胞肺癌后的无进展生存时间的长短。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述检测S100A7表达量的物质为检测待测非小细胞肺癌患者的基线血浆中的S100A7表达量的物质；
或，所述检测待测非小细胞肺癌患者的基线血浆中的S100A7表达量的物质为能特异结合S100A7的抗体或其他分子。
7.检测S100A7表达量的物质作为标志物在开发、筛选和/或制备用于预测或辅助预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂治疗疗效的试剂中的应用。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述免疫检查点抑制剂治疗采用的药物为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
9.根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于：所述非小细胞肺癌为肺鳞状细胞癌。
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