CN108663524B - 过表达FAT10扰乱WISP1蛋白和mRNA表达促进肝癌的进展 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及过表达FAT10扰乱WISP1蛋白和mRNA表达促进肝癌的进展。本发明经过广泛而深入的研究，发现了FAT10与WISP1之间的关系，并首次发现，为肝癌治疗的全新靶点，WISP1蛋白以及WISP1蛋白促进剂可用于制备肝癌治疗药物，特异性识别WISP1的试剂可用于肝癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估，为肝癌的研究与治疗提出了新思路。

Description

过表达FAT10扰乱WISP1蛋白和mRNA表达促进肝癌的进展
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及过表达FAT10扰乱WISP1蛋白和mRNA表达促进肝癌的进展。
背景技术
蛋白质是由mRNA翻译而成，是所有生命活动的基础。通常来讲，同种基因的mRNA表达与蛋白的表达一致。但是，最近关于转录组与蛋白质组之间关系的研究显示，在肿瘤组织中只有大约89％的基因表现了mRNA表达和蛋白表达的一致性，其余基因mRNA和蛋白表达则表现出显著的不一致，甚至其中某些基因mRNA表达和蛋白表达的不一致表现为mRNA表达高，蛋白表达低。虽然有假说认为导致这种mRNA和蛋白表达不一致的原因可能与蛋白的翻译后修饰有关，但是，目前还没有证据支持这种假设。
FAT10(human leukocyte antigen F-associated transcript10)是种类泛素样蛋白，在蛋白质翻译后修饰中发挥着重要的作用。研究证实FAT10是唯一不依赖于泛素而直接经蛋白酶体降解底物蛋白的类泛素蛋白。越来越多的研究发现，FAT10表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。FAT10在肝癌等多种肿瘤中呈高表达，并与肿瘤的增殖、侵袭、转移和预后密切相关。因此，FAT10被认为是癌基因。既往FAT10的研究主要集中在其底物降解功能。我们首次报道了FAT10可以稳定其底物促进肝癌等肿瘤发生发展。我们发现，FAT10通过抑制beta-catenin蛋白的泛素化降解稳定其表达，从而促进肝癌细胞的侵袭和转移。此外，我们研究还表明，FAT10通过与泛素(ubituitin,ub)竞争结合真核翻译延伸因子1A1(EEF1A1)赖氨酸蛋白抑制EEF1A1泛素化降解，从而促进肝癌细胞的增殖。因此，FAT10被认为是一个特定的类泛素蛋白：既能降低底物又能稳定底物。然而，FAT10降解底物在肝癌发生发展中的作用尚未见报道。另一个有趣的问题是：FAT10作为一种独特的类泛素化蛋白是否与肿瘤中mRNA和蛋白的不一致性有关，如果有关，其机制又是什么？
Wnt1诱导的信号通路蛋白1(WNT1-inducible signaling pathway protein 1，WISP1)，也被称为CCN4或Elm1，是CCN家族的一个成员。尽管WISP1是近些年研究的焦点，但是其在肿瘤中的表达和功能仍存在争议。一方面，WISP1是β-catenin的下游靶蛋白，β-catenin在肿瘤中处在激活状态，WISP1在某些肿瘤中呈高表达，WISP1由此认为是癌基因；另一方面，又有研究表明，WISP1蛋白在其他肿瘤中低表达，被认为是抑癌基因。因此出现了令人困惑的问题：在某些肿瘤中β-catenin通路异常激活的情况下，为什么WISP1蛋白低表达？其潜在得到分子生物学机制是什么？此外，WISP1基因在肝癌组织中的表达和作用也尚不清楚。本研究旨在回答这些问题。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供过表达FAT10扰乱WISP1蛋白和mRNA表达促进肝癌的进展。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供FAT10在制备WISP1蛋白表达抑制剂中的用途。
本发明首次发现，过表达FAT10明显降低WISP1蛋白表达。
一种实施方式中，过表达FAT10明显降低肝癌细胞中WISP1蛋白表达。
一种实施方式中，FAT10与WISP1结合并降低WISP1蛋白的表达。
一种实施方式中，WISP1蛋白被FAT10化修饰，进而经蛋白酶体降解。
一种实施方式中，FAT10经FAT10化降解导致WISP1蛋白下降。
本发明的第二方面，提供FAT10在制备WISP1mRNA表达促进剂中的用途。
本发明首次发现，过表达FAT10明显增加WISP1mRNA表达。
一种实施方式中，过表达FAT10明显增加肝癌细胞中WISP1mRNA表达。
一种实施方式中，FAT10通过稳定β-catenin蛋白表达增加肝癌细胞中WISP1mRNA的表达。
本发明的第三方面，提供WISP1蛋白以及WISP1蛋白促进剂在制备肝癌治疗药物中的用途。
在一种实施方式中，所述肝癌治疗药物至少具有以下功用之一：
(1)抑制肝癌细胞的增殖；(2)阻滞细胞周期在肝癌细胞的G1期表达；(3)降低肝癌组织体积；(4)降低肝癌组织重量；(5)延长肝癌患者的存活时间。
一种实施方式中，所述WISP1蛋白促进剂提高WISP1蛋白水平的物质。
具体地，所述提高WISP1蛋白水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：
(1)调节WISP1蛋白通路以提高WISP1蛋白水平；
(2)于肝癌细胞内直接增加WISP1蛋白水平。
可通过过表达WISP1蛋白的方式直接增加WISP1蛋白水平。
调节WISP1蛋白通路可以是采用WISP1蛋白激动剂来提高WISP1蛋白活性。
提高WISP1蛋白活性是指使WISP1蛋白活性提高。优选地，相比提高前，WISP1蛋白活性提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。
本发明实施例已证实，通过过表达WISP1蛋白的方式，直接增加肝癌细胞内WISP1蛋白水平，可抑制肝癌细胞增殖、治疗肝癌。而基于现有技术可知，前述调节WISP1蛋白代谢通路的方法可上调WISP1蛋白水平。由此推知，前述调节WISP1蛋白代谢通路的方法亦可获得抑制肝癌细胞增殖、治疗肝癌的效果，进而认为这些方法亦可抑制肝癌细胞增殖、治疗肝癌。
所述肝癌治疗药物必然包括WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂，并以WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂作为前述功用的有效成分。
所述肝癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可以仅为WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂为所述肝癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肝癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肝癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述肝癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供一种治疗肝癌的方法，为向对象施用WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂。
所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患肝癌的患者或者期待预防或缓解肝癌的个体。或者可以是罹患肝癌的患者或者期待预防或缓解肝癌的个体的离体肝癌细胞。
WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂可以在接受肝癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第五方面，提供一种肝癌治疗药物，包括有效剂量的WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂。
在一种实施方式中，所述肝癌治疗药物，包括有效剂量的WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂及药用载体。
所述肝癌治疗药物必然包括WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂，并以WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂作为前述功用的有效成分。
所述肝癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅仅为WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂为所述肝癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肝癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肝癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述肝癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第六方面，提供一种治疗肝癌的方法，为向对象施用WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂。
所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患肝癌的患者或者期待预防或缓解肝癌的个体。或者可以是罹患肝癌的患者或者期待预防或缓解肝癌的个体的离体肝癌细胞。
本发明的第七方面，提供一种肝癌治疗药物组合，包括有效剂量的WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂和至少一种其他肝癌治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂和其他肝癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他肝癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肝癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。
二)将WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂和其他肝癌治疗药物配置成复方制剂，在将WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂和其他肝癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第八方面，提供一种治疗肝癌的方法，为向对象施用有效量的WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂以及向对象施用有效量的其他肝癌治疗药物和/或向对象实施其他肝癌治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂和至少一种有效量的其他肝癌治疗药物。
基于WISP1蛋白为本发明首次发现的肝癌治疗靶点，在与WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂以外的其他肝癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肝癌的治疗效果。
其他肝癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂以是胃肠道给药或者胃肠外给药。其他的肝癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。
本发明的第九方面，提供一种WISP1蛋白或WISP1蛋白促进剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：
(1)抑制肝癌细胞的增殖；(2)阻滞细胞周期在肝癌细胞的G1期表达；(3)降低肝癌组织体积；(4)降低肝癌组织重量；(5)延长肝癌患者的存活时间。
本发明的第十方面，提供WISP1蛋白在制备或筛选肝癌治疗药物中的用途。
在一种实施方式中，WISP1蛋白作为作用靶标。
所述用途具体是指：将WISP1蛋白作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到WISP1蛋白促进剂，作为备选的肝癌治疗药物。
本发明的第十一方面，提供WISP1用于制备或筛选肝癌检测试剂的用途。
在一种实施方式中，WISP1作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
需要说明的是，肝癌检测试剂包括但不限于液体形式。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂选自特异性识别WISP1蛋白的试剂或特异性识别WISP1mRNA的试剂。
本发明首次研究发现，肝癌中WISP1蛋白表达显著下调且与肝癌患者的总体生存期相关。WISP1mRNA在肝癌中表达上调，与肝癌患者的生存率呈负相关。
在一种实施方式中，特异性识别WISP1蛋白的试剂为WISP1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，特异性识别WISP1mRNA的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增WISP1mRNA的引物；(2)特异性识别WISP1mRNA的探针。
本发明的第十二方面，提供特异性识别WISP1的试剂在制备肝癌检测试剂盒中的用途。
在一种实施方式中，WISP1作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂盒用于肝癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
需要说明的是，特异性识别WISP1蛋白的试剂包括但不限于液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别WISP1蛋白的试剂选自特异性识别WISP1蛋白的试剂或特异性识别WISP1mRNA的试剂。
本发明首次研究发现，肝癌中WISP1蛋白表达显著下调且与肝癌患者的总体生存期相关。WISP1mRNA在肝癌中表达上调，与肝癌患者的生存率呈负相关。
在一种实施方式中，特异性识别WISP1蛋白的试剂为WISP1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，特异性识别WISP1mRNA的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增WISP1mRNA的引物；(2)特异性识别WISP1mRNA的探针。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，发现了FAT10与WISP1之间的关系，并首次发现，为肝癌治疗的全新靶点，WISP1蛋白以及WISP1蛋白促进剂可用于制备肝癌治疗药物，特异性识别WISP1的试剂可用于肝癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估，为肝癌的研究与治疗提出了新思路。
附图说明
图1A：肝癌组织与非肿瘤组织中WISP1蛋白的表达情况。
图1B：WISP1蛋白在肝癌组织中低表达。
图1C：WISP1蛋白在肝癌组织中低表达。
图1D：Kaplan-Meier分析显示相比高WISP1蛋白表达患者，低WISP1蛋白表达的患者有显着更短的总生存时间。
图2A：EdU实验结果显示，过表达WISP1降低HCCLM3肝癌细胞的细胞增殖能力。
图2B：流式细胞仪检测显示WISP1明显阻滞细胞周期在肝癌细胞的G1期表达。
图2C：通过肝癌成瘤实验表明，过表达WISP1组肿瘤有较对照组组体积和重量显著低。
图2D：通过肝癌成瘤实验表明，过表达WISP1组小鼠存活显著长于对照组。
图3A：过表达WISP1蛋白明显抑制了FAT10过表达导致的WISP1蛋白表达下降。
图3B：过表达WISP1明显抑制肝癌细胞的增殖，过表达FAT10明显增加肝癌细胞的增殖能力。
图3C：过表达WISP1可以逆转FAT10介导的促进肝癌细胞的增殖。
图3D：在肝癌细胞SMCC7721细胞中，过表达WISP1明显抑制瘤体的体积。
图3E：在肝癌细胞SMCC7721细胞中，过表达WISP1明显抑制瘤体的重量。
图4A：免疫共沉淀(Co-IP)结果表明HCCLM3肝癌细胞有FAT10和WISP1之间直接的相互作用。
图4B：共聚焦显微镜结果表明HCCLM3肝癌细胞有FAT10和WISP1之间直接的相互作用。
图4C：在E1和E2分别减少后，FAT10-WISP1复合物均显著降低，而WISP1蛋白表达增加。
图4D：野生型FAT10可与WISP1结合并降低WISP1蛋白的表达。FAT10ΔGG没有结合到WISP1，但令人惊讶的是，却导致WISP1蛋白表达增加。
图4E：5种肝癌细胞系中，结果表明，FAT10表达确实降低WISP1蛋白表达，但同时上调了WISP1mRNA的表达。
图5A：实时荧光定量PCR结果显示，下调β-catenin蛋白导致降低WISP1mRNA和蛋白的表达。
图5B：Western blotting结果显示，下调β-catenin蛋白导致降低WISP1mRNA和蛋白的表达。
图5C：下调β-catenin蛋白导致荧光素酶活性水平显著降低。
图5D：降低β-catenin表达对WISP1启动子TCF/LEF和CREB区域突变的荧光素酶报的活性水平没有影响。
图5E：Western blot结果显示过表达FAT10，β-catenin蛋白表达增加，WISP1蛋白下降。
图5F：在稳定低表达β-catenin肝癌细胞中过表达FAT10，实时荧光定量PCR结果表明，WISP1基因表达没有影响。
图5G：在稳定低表达FAT10细胞中的过表达β-catenin，WISP1的mRNA表达也增加。
图5H：过表达FAT10对WISP1mRNA的表达无影响。
图6A：Western blot和荧光定量PCR结果显示，不加β-catenin蛋白抑制剂，过表达FAT10导致在WISP1蛋白下降和mRNA增加不一致现象，然而，在β-catenin抑制剂，过表达FAT10导致在WISP1蛋白减少，但WISP1mRNA保持不变，未出现WISP1蛋白下降和mRNA表达不一致现象。
图6B：在HCCLM3-FAT10–/–细胞株中转染不同的剂量FAT10ΔGG质粒，随着FAT10△GG逐渐增加表达，WISP1mRNA的表达逐渐升高，与蛋白表达一致，也未出现WISP1蛋白/基因表达不一致现象。
图6C：免疫组化和原位杂交(ISH)进一步证明过表达FAT10ΔGG导致增加β-catenin蛋白的表达，而WISP1mRNA和蛋白表达均增加。
图7A：Western blot和荧光定量PCR结果显示，FAT10和β-catenin蛋白和WISP1mRNA在肝癌组织中高表达，而相比相应癌旁组织WISP1蛋白在肝癌组织中低表达。
图7B：Western blot和荧光定量PCR结果显示，FAT10和β-catenin蛋白和WISP1mRNA在肝癌组织中高表达，而相比相应癌旁组织WISP1蛋白在肝癌组织中低表达。
图7C：FAT10蛋白，β-catenin蛋白和WISP1mRNA表达均呈正相关，而FAT10蛋白与WISP1蛋白表达，β-catenin蛋白和WISP1蛋白表达呈负相关。
图7D：免疫组化和原位杂交中，FAT10蛋白，β-catenin蛋白和WISP1mRNA表达均呈正相关，而FAT10蛋白与WISP1蛋白表达，β-catenin蛋白和WISP1蛋白表达呈负相关。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
一、材料和方法
(1)病人和标本
收集了从2008年1月到2010年12月之间在南昌大学第二附属医院住院的132例肝癌标本，知情同意书已签署。
(2)细胞培养
Huh7、HCCLM3、SMCC7721、MHCC97H、Hep3B肝癌细胞以及正常肝细胞HL7702和HEK293T细胞自上海科学院典藏细胞库购买。细胞培养在含10％血清的DMEM和MEM的培养基中。
二、LC-MS/MS分析
3对肝癌和癌旁组织用TMT标签和LC-MS/MS分析(由公司完成)。
三、Immunohistochemistry(IHC)
用二甲苯和分级酒精处理HCC和邻近组织的切片，然后在0.01M柠檬酸缓冲液中进行抗原修复。用过氧化氢作阻断物。切片在山羊血清孵育30min后再4℃孵育fat10、wisp1、β-catenin多克隆抗体(Abcam、1:250稀释)过夜。2步法免疫组化方法被用于(目录号：PV-9000；zsgb-bio有限公司，北京，中国)免疫组化染色。3名临床病理学在不知道临床参数的情况下通过半定量进行了的染色强度和阳性细胞百分比的测定。
四、In-situ hybridization(ISH)
应用原位杂交方法通过地高辛标记的正义和反义FAT10和WISP1探针检测组织芯片中FAT10与WISP1的表达(上海bioligo生物科技有限公司)。切片在与Proteinase K 37℃孵育15分钟前需要被脱蜡和复水。然后，切片用0.1M TBS/焦碳酸二乙酯溶液洗三遍。在5×SSC溶液25℃孵育15min后，FAT10与WISP1探针分别加入杂交在50℃过夜。接下来，切片用梯度稀释的SSC溶液在50℃洗30分钟，然后用地高辛标记的抗体(1:500，罗氏)在室温下孵育2小时。最后，杂交信号用NBT/BCIP显化。该反应是通过水洗5分钟终止。切片用核固红染色，使用水溶液固定，并拍照。
五、荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、免疫共聚焦
可参考我们之前的文章(Liu X#,Chen L#,Ge J#,Yan C,Huang Z,Hu J,Wen C,LiM,Huang D,Qiu Y,Hao H,Yuan R,Lei J,Yu X,Shao J*.The Ubiquitin-like ProteinFAT10Stabilizes eEF1A1Expression to Promote Tumor Proliferation in a ComplexManner.Cancer Res.76(2016)4897-4907.)。
六、Plate Colony Formation Assay平板集落形成试验
简而言之，细胞培养好后，5×102肝癌细胞稳定表达WISP1接种到六孔板的各孔。菌落形成试验按先前描述的方式进行。
七、EdU试验
肝癌细胞在5-ethynyl-20-deoxyuridine(EDU)(锐博生物科技、广州、中国)孵中育5小时，随后的处理根据试剂说明进行。
八、Real-time proliferation assay实时细胞分析
实时细胞动力学分析xcelligence RTCA(ACEA Biosciences)被用于监测细胞增殖动力学。数据通过使用RTCA控制单元和软件进行分析。细胞被直接种植在16孔板中。在基线阻抗从细胞数量增加产生的变化是由位于16孔板底部的金微电极来监测。阻抗的比例变化连续记录，以细胞指数表示。改变细胞指数被监控36小时。
九、Luciferase reporter gene assay荧光素酶报告基因
细胞以1×105为密度接种在六孔培养板中，培养24小时后用脂质体3000根据试剂说明转染WISP1基因启动子荧光素酶质粒(wisp1-wt，2mg)或突变型wisp1启动子荧光素酶质粒(wisp1-mu，2mg)。细胞共转染50ng的pRLTK质粒的作为对照。48小时后，用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性(Promega公司)，并与Renilla荧光素酶活性的比较。
十、Cell-cycle analysis细胞周期分析
将肝癌细胞接种于6孔板中，培养48h后用胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的PBS清洗细胞，离心收集细胞，再加入预冷的70％的乙醇溶液固定过夜；再预冷的PBS清洗细胞；加入0.5mL的PI溶液(包含100μL RNase A和400μL的PI)，37℃避光孵育30min。BDFACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期的变化。每组实验重复三次。
十一、Tumorigenicity assay and bioluminescence imaging成瘤实验和活体动物成像实验
体内成瘤实验，1×106细胞稀释在100毫升PBS中被皮下注射入裸鼠腹腔中(雄性BALB/C/nu，6～8周，上海斯莱克实验动物有限公司)。每天记录裸鼠的存活情况。裸鼠的成瘤情况被监控，肿瘤体积每5天测量一次，并被按这个公式计算：1/2(最大直径)×(最小直径)2。裸鼠被麻醉后处死，取肿瘤标本，称重、拍照。
被注射用的肝癌细胞已经被萤火虫荧光素酶基因稳定转染，并能够用活体动物成像仪定期监控肿瘤在体内的生长。体内信号检测，小鼠被异氟烷麻醉，然后用成像仪成像(活体成像系统)仪(PerkinElmer)。
另外，在HCCLM3FAT10基因敲除(HCCLM3FAT10-/-)细胞株中稳定表达对照质粒、FAT10过表达和FAT10△gg(缺少C端的两个甘氨酸)过表达质粒。稀释在100ul PBS中的1×106HCCLM3-FAT10-/-细胞被皮下注射进入裸鼠腹腔(上海斯莱克实验动物有限公司)。28天后麻醉裸鼠提取肿瘤用于荧光实时定量PCR，Western印迹，原位杂交和免疫组化分析。
十二、CRISPR-Cas9敲除细胞株的建立
FAT10敲除细胞株按我们之前文章的方法建立。(Liu X#,Chen L#,Ge J#,Yan C,Huang Z,Hu J,Wen C,Li M,Huang D,Qiu Y,Hao H,Yuan R,Lei J,Yu X,Shao J*.TheUbiquitin-like Protein FAT10Stabilizes eEF1A1Expression to Promote TumorProliferation in a Complex Manner.Cancer Res.76(2016)4897-4907.)
十三、FAT10ΔGG质粒构建
对于FAT10的C端两个甘氨酸的缺失，一个缺乏C端两个甘氨酸的FAT10DNA序列被合成。PCR扩增后，正确的产物被验证并连接到表达载体中，最后通过测序验证序列的正确性。
十四、统计分析
使用SPSS 16.0版本进行统计学分析。生存曲线用Kaplan–Meier方法计算。进行单因素和多变量Cox比例风险回归分析，去评估原始风险比例、调整风险比例(HR)和HR 95％的置信区间。比较两组或两组比较时，采用学生t-检验分析组间差异，比较两组时的方差分析。
十五、结果
1.肝癌中WISP1蛋白表达显著下调且与肝癌患者的总体生存期相关
通过质谱分析三对肝癌组织与非肿瘤组织，我们发现β-catenin是异常激活的，而且下游的一些靶基因也异常增加，但WISP1蛋白的表达明显下调(如图1A所示)。为了验证这个结果，我们首先检查132例肝癌组织及相应癌旁组织标本WISP1蛋白的表达，免疫组化结果表明：WISP1蛋白在肝癌组织中低表达(如图1B和1C所示)。这些结果表明WISP1蛋白表达在肝癌组织中的低表达。我们进一步在132例肝细胞癌中分析WISP1蛋白表达与临床患者病理特征之间的关系。结果表明：低WISP1蛋白表达与肿瘤大小、临床分期有显著相关性(如表1所示)。重要的是，Kaplan-Meier分析显示相比高WISP1蛋白表达患者，低WISP1蛋白表达的患者有显着更短的总生存时间(如图1D所示)。此外，单因素和多因素Logistic回归分析表明，WISP1是肝癌患者预后不良的独立预测因素(如表2所示)。总之，这些数据提示WISP1蛋白低表达与肝癌预后不良密切相关。
表1
Figure BDA0001665137950000121
Figure BDA0001665137950000131
表2
Table 2.Univariate and multivariate analyses of overall survival inHCC patients (Cox proportional hazards regression model)
Figure BDA0001665137950000132
2.体内和体外实验显示WISP1抑制肝癌增殖
低WISP1蛋白表达与肝癌大小显著相关，我们推测WISP1可能影响肝癌的增殖功能。为此，我们对WISP1蛋白表达与肝癌细胞增殖之间的关系进行了研究。EdU实验结果显示，过表达WISP1降低HCCLM3肝癌细胞的细胞增殖能力(如图2A所示)。流式细胞仪检测显示WISP1明显阻滞细胞周期在肝癌细胞的G1期表达(如图2B所示)。进一步通过肝癌成瘤实验表明，过表达WISP1组肿瘤有较对照组组体积和重量显著低(如图2C所示)。此外，该组小鼠存活显著长于对照组(如图2D所示)。体内和体外的研究表明，WISP1可以抑制肝癌细胞的增殖。
3.FAT10调控WISP1蛋白表达影响肝癌细胞增殖
我们进一步探讨WISP1蛋白在肝癌呈现低表达的原因。我们以前的研究和其他的研究表明，FAT10过表达促进肝癌的增殖。因此，我们推测低WISP1蛋白表达可能与FAT10的表达有关。Western blot结果显示过表达FAT10明显降低WISP1蛋白表达。这些结果表明，WISP1蛋白的低表达与FAT10过表达相关，WISP1可能受FAT10的调控。过表达WISP1蛋白明显抑制了FAT10过表达导致的WISP1蛋白表达下降(如图3A所示)。我们通过EdU实验发现：过表达WISP1明显抑制肝癌细胞的增殖，过表达FAT10明显增加肝癌细胞的增殖能力(如图3B所示)。进一步发现过表达WISP1可以逆转FAT10介导的促进肝癌细胞的增殖(如图3C所示)。最后，为了证实这一结果，如图3D和3E所示，我们通过裸鼠成瘤实验发现：在肝癌细胞SMCC7721细胞中，过表达WISP1明显抑制瘤体的体积和重量，过表达FAT10明显增加瘤体的体积和重量。过表达WISP1可以逆转FAT10导致瘤体的体积和重量的增加。这些结果表明，FAT10调节WISP1蛋白的表达影响肝癌细胞增殖。
4、WISP1蛋白经FAT10化降解
研究表明，FAT10在E1(UbE1)酶和E2(uba6)酶的催化作用下结合底物，底物蛋白经FAT10化修饰形成FAT10-底物复合物，然后进入蛋白酶体降解。我们以上的研究表明，过表达FAT10可导致WISP1蛋白下降。为了阐明过表达FAT10导致WISP1蛋白下降是由于FAT10化降解WISP1蛋白导致的。我们首先研究FAT10是否与WISP1存在相互结果。免疫共沉淀(Co-IP)和共聚焦显微镜结果表明HCCLM3肝癌细胞有FAT10和WISP1之间直接的相互作用(如图4A和4B所示)。进一步，我们降低肝癌细胞E1和E2酶的表达，检测FAT10-WISP1复合物的变化。结果表明，在E1和E2分别减少后，FAT10-WISP1复合物均显著降低，而WISP1蛋白表达增加(如图4C所示)。这些结果表明，WISP1蛋白被FAT10化修饰，进而经蛋白酶体降解。另外，研究发现FAT10与底物作用通过两个甘氨酸残基(GG)在其C-末端结合和降解。当基因GG突变，FAT10不能与底物结合，从而失去降解底物的功能和不影响底物蛋白的表达。为了证实这一现象，我们构建了野生型(WT)和双甘氨酸突变FAT10ΔGG基因的质粒，分别转染入HCCLM3细胞株。正如预期的那样，野生型FAT10可与WISP1结合并降低WISP1蛋白的表达。FAT10ΔGG没有结合到WISP1，但令人惊讶的是，却导致WISP1蛋白表达增加(如图4D)。为了进一步证实这一现象，我们质粒转染5种肝癌细胞系中；结果表明，FAT10表达确实降低WISP1蛋白表达，但同时上调了WISP1mRNA的表达(如图4E)。综合这些结果表明，FAT10经FAT10化降解导致WISP1蛋白下降，且过表达FAT10导致WISP1mRNA表达的增加。
5.FAT10通过稳定β-catenin蛋白表达增加WISP1mRNA的表达
研究证实FAT10并不直接影响底物mRNA的表达，因此，我们推测，FAT10可能通过调节转录因子影响WISP1mRNA的表达。研究证实WISP1是β-catenin下游的靶基因，β-catenin蛋白通过结合WISP1启动子区域的TCF/LEF和CREB结合元件从而促进WISP1mRNA的表达。此外，我们以往的研究表明，FAT10能稳定β-catenin蛋白的表达，从而激活β-catenin信号。因此，我们推测，FAT10可能通过调节β-catenin蛋白表达影响WISP1mRNA的表达。首先，我们想观察在肝癌中WISP1是否被β-catenin蛋白调控。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，下调β-catenin蛋白导致降低WISP1mRNA和蛋白的表达(如图5A和5B所示)。此外，下调β-catenin蛋白导致荧光素酶活性水平显著降低(如图5C所示)。进一步，我们在肝癌细胞中转染了WISP1启动子TCF/LEF和CREB区域突变的荧光素酶报告基因质粒，结果发现降低β-catenin表达对WISP1启动子TCF/LEF和CREB区域突变的荧光素酶报的活性水平没有影响(如图5D所示)。这些研究结果表明，在肝癌细胞中β-catenin蛋白直接结合到WISP1启动子和调控WISP1基因的表达。进一步，我们想观察FAT10是否通过β-catenin蛋白影响WISP1mRNA的表达。首先在Hep3B细胞中过表达FAT10，qRT-PCR结果发现，β-catenin的mRNA表达无明显变化，而WISP1mRNA表达增加。Western blot结果显示过表达FAT10，β-catenin蛋白表达增加，WISP1蛋白下降(如图5E所示)。最后，确认FAT10调控WISP1mRNA表达取决于FAT10稳定β-catenin蛋白，我们在稳定低表达β-catenin肝癌细胞中过表达FAT10。实时荧光定量PCR结果表明，WISP1基因表达没有影响(如图5F所示)。相反，在稳定低表达FAT10细胞中的过表达β-catenin，WISP1的mRNA表达也增加(如图5G所示)。此外，我们在肝癌细胞中逐渐增加FAT10表达，通过XAV-939(一种β-catenin特异性抑制剂，选择性地抑制β-catenin介导转录通过促进β-catenin降解)处理细胞，结果显示，过表达FAT10对WISP1mRNA的表达无影响(如图5H所示)。这些结果证实了FAT10通过稳定β-catenin蛋白表达增加WISP1mRNA的表达。
6.FAT10同时发挥稳定和降解底物功能，导致WISP1蛋白/mRNA表达的不一致
基于以上研究结果，我们推测FAT10的过表达导致WISP1蛋白/mRNA表达不一致是由于FAT10同时发挥稳定和降解底物的功能。一方面，过度表达基因导致稳定β-catenin增加WISP1mRNA表达。另一方面，FAT10直接降低WISP1蛋白。为了验证这个假设，我们在HCCLM3-FAT10–/–细胞株中转染不同剂量的FAT10基因质粒和不同剂量β-catenin的抑制剂。Western blot和荧光定量PCR结果显示，不加β-catenin蛋白抑制剂，过表达FAT10导致在WISP1蛋白下降和mRNA增加不一致现象。然而，在β-catenin抑制剂，过表达FAT10导致在WISP1蛋白减少，但WISP1mRNA保持不变，未出现WISP1蛋白下降和mRNA表达不一致现象(如图6A所示)。此外，在HCCLM3-FAT10–/–细胞株中转染不同的剂量FAT10ΔGG质粒，随着FAT10△GG逐渐增加表达，WISP1mRNA的表达逐渐升高，与蛋白表达一致，也未出现WISP1蛋白/基因表达不一致现象(如图6B所示)。这些结果证实了过表达FAT10导致WISP1蛋白和mRNA表达不一致是因为FAT10同时发挥降解和稳定功能。
最后，我们要在体内证明上述现象。Western blot和qRT-PCR肿瘤组织显示，过表达野生型FAT10导致β-catenin蛋白增加和WISP1蛋白表达降低，而WISP1mRNA表达增加。免疫组化和原位杂交(ISH)进一步证明过表达FAT10ΔGG导致增加β-catenin蛋白的表达，而WISP1mRNA和蛋白表达均增加(如图6C所示)。
7.WISP1mRNA在肝癌中表达上调，与肝癌患者的生存率呈负相关
为了验证是否在肝癌组织中也存在上述现象，我们在60新鲜肝癌组织中检测FAT10表达，β-catenin蛋白表达及WISP1表达并分析其相关性。Western blot和荧光定量PCR结果显示，FAT10和β-catenin蛋白和WISP1mRNA在肝癌组织中高表达，而相比相应癌旁组织WISP1蛋白在肝癌组织中低表达(如图7A和7B所示)。此外，我们发现，FAT10蛋白，β-catenin蛋白和WISP1mRNA表达均呈正相关，而FAT10蛋白与WISP1蛋白表达，β-catenin蛋白和WISP1蛋白表达呈负相关(如图7C所示)。这一现象也在免疫组化和原位杂交中得到证实(如图7D所示)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.FAT10在制备WISP1蛋白表达抑制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，过表达FAT10降低肝癌细胞中WISP1蛋白表达。
3.FAT10在制备WISP1 mRNA表达促进剂中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，过表达FAT10增加肝癌细胞中WISP1 mRNA表达。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Expression of CCN family members correlates with the clinical features of hepatocellular carcinoma;HEYuN ZHANG，et al;《ONCOLOGY REPORTS》;20151231;第33卷;摘要，第1482页左栏第2段，第1483页右栏第3段，第1485页左栏第2段至右栏第1段，表III，第1490页右栏第2段，第1491页左栏第2段 *
Wisp1 as an early stage marker of human hepatocellular carcinoma (HCC)?;A Dropmann，et al;《 Z Gastroenterol》;20151231;摘要 *
Wisp1 is associated with hepatitis B related human hepatocellular carcinoma and promotes proliferation or migration of HCC derived cell lines;Sonja Lukowski;《http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/14401/1/Wisp1%20is%20associated%20with%20hepatitis%20B%20related%20human%20hepatocellular%20carcinoma%20and%20promotes%20proliferation%20or%20migration%20of%20HCC%20derived%20cell%20lines.pdf》;20131231;正文第90页结论部分 *
肝癌组织中Cyr 61和 WISP-1基因表达及意义;王群 等;《中国实用医刊》;20080831;第35卷(第15期);第12页右栏第2行至第13页左栏第7行，右栏第4-9行 *

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