CN116033824A - 脂质体臭氧纳米溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适用于人、兽医、食品、农业和化学以及化妆品领域的具有抗病毒、抗真菌和抗细菌作用，创伤愈合、组织愈合特性的脂质体臭氧纳米溶液。本发明的脂质体臭氧纳米溶液可用作用于人和兽医卫生目的的鼻喷剂，口喷剂，耳滴剂，眼滴剂，手和脸消毒剂，阴道、膀胱内、直肠溶液剂，关节内、皮下、肌内、静脉内注射溶液剂，并且还可用作表面清洁剂。本发明的脂质体臭氧纳米溶液的有效性已经在病毒例如流感或冠状病毒(特别是Sars‑Cov‑2)和细菌(特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli))上得到证实。

Description

脂质体臭氧纳米溶液
技术领域
本发明涉及适用于人、兽医、食品、农业和化学的具有抗病毒、抗真菌和抗细菌作用的脂质体臭氧纳米溶液。
背景技术
近年来，纳米粒的使用在化学工业中变得广泛。纳米尺寸的效率通过更小的颗粒来实现，并且在这些技术的帮助下，对病毒和细菌的活性提高。同时，活性药物可以运输至细胞内的细胞器，例如线粒体，并且可以用较少的化学物质提供更有效的治疗。同时，在化学工业的其他部门中使用纳米尺寸的产品提供了优势。例如，由纳米粒制成的消毒剂产品在施加区域形成膜并覆盖环境，并且可以用少量的产品提供比较久的作用。为此目的制成的另一种颗粒系统是脂质体的形成。脂质体是通过用超声脂肪分解装置或类似的纳米技术方法分解脂质而制成的。药物和活性物质可以在这些脂质体中传递，并且将活性物质传递到细胞中变得更容易。通常，活性物质不可能进入癌细胞，但是可以将活性物质引入到脂质体中的癌细胞中。在有关由油产生的纳米载体和脂质体在医药、食品、农业、兽医、化妆品和消毒领域中的使用的技术领域中，发展在继续。
例如，专利EP1746976B1提供了包含经取代的铵和/或聚阴离子以及任选地所期望治疗或成像实体的脂质体组合物。TR97/01683国家专利申请涉及开发脂质体药物递送系统，用于环孢素A或类似疏水性药物在体液和/或组织中的生物分布。
使用气态臭氧的方法已经被广泛使用了许多年，例如医学领域、消毒、抗细菌活性、驱避作用、杀虫剂作用、美容作用、食品防腐作用、农业和兽医领域。然而，这些方法使得臭氧气体难以变得普遍，因为它不稳定并且半衰期为20分钟。近年来，臭氧与水的传输在方法(例如水的消毒)中开始变得普遍。然而，这些方法不足以普及臭氧的使用。为了解决这些问题，在不同领域进行了使用油作为臭氧载体的研究。然而，在当前的应用中遇到了这样的问题：例如油的稳定臭氧传输和释放能力以及缺乏根据应用领域的有效颗粒尺寸优化。
作为结果，由于上述缺点和关于该主题的当前解决方案的不足，需要在相关技术领域进行开发。
发明内容
本发明涉及脂质体臭氧纳米溶液，其满足上述要求，消除所有缺点并带来一些另外的优点。
本发明的另一个目的是产生适用于人、兽医、农业和化学领域的有效的抗病毒、抗细菌、抗真菌杀虫剂、杀螨剂，创伤愈合组织愈合剂，植物生长剂(plant developer)，植物保护剂，蜜蜂治疗剂的脂质体臭氧纳米溶液，以促进全球范围的公共健康。
本发明的另一个目的是提供具有已证实的稳定性的制剂形式的脂质体臭氧纳米溶液，该脂质体臭氧纳米溶液的纳米粒尺寸分布、有效臭氧剂量和臭氧释放谱可针对使用领域和应用类型来确定。
本发明的一个目的是提供脂质体臭氧纳米溶液，其具有抗病毒和抗细菌活性二者；无毒作用；对健康细胞的生存力没有负作用；对人呼吸系统(气管-支气管)细胞具有再生和增殖作用二者。
本发明的另一个目的是提供脂质体臭氧纳米溶液，其对细菌例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)或大肠杆菌(Escherichia coli)具有稳定的抗细菌活性，以及对病毒例如Sars-Cov-2具有稳定的抗病毒活性。
本发明的另一个目的是提供脂质体臭氧和纳米载体聚合物纳米溶液，其对皮肤、黏膜组织或眼、阴道、直肠区域没有刺激或过度反应作用。
本发明的另一个目的是提供在黏膜组织中没有细胞毒性作用的脂质体臭氧纳米溶液。
本发明的另一个目的是提供适合用作鼻喷剂、口喷剂、耳滴剂、眼滴剂、阴道溶液剂、直肠溶液剂、腹膜内溶液剂、膀胱溶液剂、手和脸消毒剂以及个人卫生表面清洁剂的产品，以用于预防和治愈病毒性、细菌性或真菌性疾病。
本发明的另一个目的是提供包含脂质体臭氧纳米溶液的在皮肤和表面上抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗真菌的有效屏障溶液，其适用于人、兽医、农业和化学领域。
本发明的另一个目的是提供包含脂质体臭氧纳米溶液的用于人、兽医用途的鼻喷剂、口喷剂、耳滴剂、眼滴剂、阴道溶液剂、直肠溶液剂、腹膜内溶液剂、膀胱内溶液剂、静脉内和关节内/皮下/肌内注射溶液剂，其具有抗病毒、抗细菌、抗真菌作用、创伤愈合组织愈合作用。
为了实现上述目的，本发明主要由从臭氧化乳化剂获得的纳米材料组成，并且还包含从臭氧化油获得的提供协同作用的纳米粒脂质体。
通过以下具体实施方式，将清楚地理解本发明的结构和特征，并因此应该通过考虑具体实施方式来进行评价。
附图说明
图1，根据密度给出了从臭氧化油获得的纳米溶液的尺寸分布图。[密度(百分比)×尺寸(d.nm)]
图2给出了根据从臭氧化乳化剂获得的纳米溶液的密度的尺寸分布图。[密度(百分比)×尺寸(d.nm)]
图3是臭氧化表面活性剂(乳化剂聚山梨酯)甘油和PEG 400的包被。[密度(百分比)×尺寸(d.nm)]
图4是用臭氧化表面活性剂和非臭氧表面活性剂的包被。[密度(百分比)×尺寸(d.nm)]
图5给出了番茄的果实高度和直径测量值。
图6示出了番茄的颜色测定图。
图7给出了番茄的SCKM值。
图8给出了番茄的TEA值。
图9给出了番茄的单株产量。
图10给出了叶莴苣的叶和根长度。
图11给出了叶莴苣的根湿重和干重。
图12给出了叶莴苣的叶湿重和干重。
图13给出了可销售叶和非可销售叶的数量。
图14给出了叶莴苣的叶比例水含量。
图15给出了叶莴苣的叶中叶绿素的总量。
图16给出了叶莴苣的叶色。
具体实施方式
在该具体实施方式中，描述本发明纳米溶液的一些优选实施方案仅仅是为了以使得不产生限制作用的方式阐明主题。
在现有技术中，在仅由油携带臭氧的系统中，获得将允许臭氧渗透到施加区域例如细胞中的尺寸的纳米粒以及由这些颗粒提供的臭氧释放速率受到限制。尽管在理论上这些纳米粒显示出覆盖了所有纳米尺寸以至微米尺寸，但在实践中，不可能获得将允许渗透到细胞中的纳米尺寸(例如低于50nm)的稳定颗粒。已经对本发明进行了研究，以提供包含能够携带臭氧的最小纳米粒的稳定系统，从而提高臭氧的施加效率。令人惊讶的是，这些研究已表明，乳化剂组中包含的物质例如聚山梨酯和PEG可以被臭氧化，并形成比载体油更小尺寸的稳定纳米粒。
在本发明范围内进行的研究中，仅在从臭氧化油中获得的纳米溶液中进行尺寸分布分析，并在图1给出了根据密度的尺寸分布图。可以形成用包含按重量计10％臭氧气体的臭氧化油制成的脂质体纳米溶液，范围为30nm至6000nm，并且最集中的溶液是200和1000纳米。量纲分析结果示于以下图表1中。
图表1.根据从臭氧化油获得的纳米溶液的密度得出的尺寸分布分析结果(分散剂RI 1.330样品RI 1，黏度0.8872cP，25C，)
Figure BDA0004097383960000041
在研究中，还对仅从臭氧化乳化剂中获得的纳米溶液进行了尺寸分布分析，图2给出了根据密度的尺寸分布图。在该实例中，聚山梨酯80乳化剂以按重量计3％臭氧化。已经观察到臭氧化的聚山梨酯80浓缩物可以形成尺寸高至16nm的纳米粒。已经观察到，在由臭氧化的聚山梨酯80与水获得的纳米溶液中，可以形成尺寸高至7nm的纳米粒。在尺寸分布分析中，获得了分布在7nm至50nm的纳米粒，如图2所示。例如，由于这种尺寸的纳米粒可以将臭氧传输到细胞中，因此它们将对病毒具有抗病毒作用。同时，它将通过进入细胞内的线粒体来提高细胞的能量产生潜力，并将通过诱导胞内生长因子来激活胞内修复机制。
图表2.根据从臭氧化乳化剂获得的纳米溶液的密度的尺寸分布分析结果(分散剂RI 1.330样品RI 1，黏度0.8872cP，25C,)
Figure BDA0004097383960000051
在本发明范围内进行的研究中，已经证明，根据臭氧化乳化剂和从臭氧化油获得的脂质体臭氧纳米溶液的应用领域，可以用适合含量的纳米技术方法开发其中纳米粒尺寸分布和臭氧散发速度分布可以确定的替代制剂。通过乳化剂的臭氧化获得的纳米粒提供向油中相对更小和更快的臭氧释放。通过纳米技术方法分解臭氧化油而形成的臭氧化脂质体纳米溶液，由于其稳定性和持久有效性而创造了许多使用领域。在用臭氧化油、臭氧化乳化剂和水制成的溶液中，测定油中的臭氧比率，并用相同的标准制备溶液。例如，具有高含油量的溶液可用于长效溶液，并且臭氧气体以按重量计1％至5％的比率保持在油中。为了产生短效产品，产生了包含按重量计6％至15％臭氧气体的溶液。以这种方式，根据该含量获得的脂质体臭氧纳米溶液的有效性已经被人、兽医、食品和农业领域中的科学研究所证明；其在用于这些领域的制剂中的用途也在本发明的范围内。
由于由臭氧乳化剂形成的纯结构是比脂质体小得多的颗粒，因此它们显示出更大的活性作用。这些结构具有活性抗细菌作用，并且同时，重要的是它们被包被以提供较慢的释放作用。通过用甘油和PEG包被臭氧乳化剂来产生较慢的释放特性。图3示出了乳化剂脂质体。
由用乳化剂包被乳化剂形成的最小脂质体结构称为类脂囊泡(niosome)。最小的类脂囊泡结构是通过用非臭氧乳化剂包被臭氧乳化剂来形成。以这种方式，可以获得具有活性和缓释臭氧的类脂囊泡。在图4中，臭氧化的聚山梨酯再次用聚山梨酯包被。
同时，这些类脂囊泡可以用聚合物(例如甘油、peg、壳聚糖、甘露醇和葡聚糖)包被。可以使用这些包衣中的一种或更多种(特别是在静脉内制剂和区域注射剂中)，以减少臭氧的燃烧效应并确保其更容易到达靶器官。
上述发明基本上是包含臭氧化乳化剂的脂质体臭氧纳米溶液。
本发明中提及的“乳化剂”是选自以下的个体或组合：卵磷脂、溶血磷脂、聚乙二醇(PEG)、磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、普朗尼克、聚山梨酯(聚山梨酯20、聚山梨酯80等)，或可药用乳化剂。
在本发明的一些优选实施方案中，提及的乳化剂是聚山梨酯或PEG。
本发明中提及的“臭氧气体”是氧的同素异形体(O3)，是具有由3个氧原子组成的分子的无色气体，并存在于自然界的大气上层。在正常情况下，大气更低部分中的臭氧量约为0.04ppm。
本发明的一个优选实施方案还包含水。本发明中提及的“水”是选自以下的个体或组合：蒸馏水、盐水(NaCl-H2O)、糖水、矿物质水、去离子水、去矿物质水、泉水、盐水溶液、生理盐水和厂用水。
本发明的一个优选实施方案还包括通过使臭氧气体经过载体油来获得的臭氧化油。本发明中提及的“载体油”是选自以下的个体或组合：大豆油、矢车菊油(centauryoil)、芝麻油、棕榈油、罂粟油、大豆卵磷脂、胆固醇、b-甾醇、甘油三酯、橄榄油、鱼油、葵花油、蓖麻油、藏花油、椰子油、甘油三酯衍生物、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯和石蜡、油酸乙酯、油酸甲酯。
本发明的优选应用还至少包含功能性油。本发明中提及的“功能性油”是选自不挥发油和/或植物精油的个体或组合。在此提及的不挥发油是植物不挥发油，例如椰子油、杏仁油、霍霍巴油、玫瑰果油、鳄梨油、芝麻油、杏籽油、椰子油、橄榄油、葵花油、大豆油。在此提及的精油是精油，例如鼠尾草油、茴香油、金盏花油、迷迭香油、松节油、柏树油、茶树油、月见草油、月桂叶油、罗勒油、玫瑰油、琉璃苣油、黑胡椒油、丁香油、百里香油、孜然油、芫荽油、薰衣草油、柠檬油、柠檬香蜂草油(lemon balmoil)、紫罗兰油、桃金娘油、薄荷油、桉叶油、洋甘菊油、橙油、葡萄柚油、荨麻油、茴香油、檀香油、大蒜油、柏树油、茉莉油、依兰油、天竺葵油、广藿香油、姜油。
本发明的优选应用还包含至少一种有机酸。本发明中提及的“有机酸”是选自以下的个体或组合：甲酸、磷酸、盐酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、草酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、苯酚、尿酸、牛磺酸、氨甲基膦酸。
本发明的优选应用还包含至少一种赋形剂。本发明中提及的“赋形剂”是选自以下的个体或组合：麻醉剂、药物、药物活性物质例如水和/或脂溶性维生素、矿物质、透明质酸、百里酚、薄荷醇、甘油、乙醇、鲸蜡醇、丁醇、苄醇、氨基酸、乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、草本提取物、利多卡因(lidocaine)、赛罗卡因(xylocaine)。
本发明的优选应用由包含臭氧化乳化剂和/或臭氧化载体油的纳米粒脂质体、甘油、透明质酸、薄荷醇、蒸馏水、NaCl组合物组成。
本发明的一些实施方案包括10储备ppm-60000储备ppm臭氧气体。
本发明的一些实施方案根据应用领域包含剂量为100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm、1600ppm、2000ppm、3000ppm的稳定活性臭氧气体。
本发明的一些优选实施方案包含尺寸小于1000nm，优选小于200nm，更优选小于50nm的脂质体臭氧纳米粒。
根据本发明的一个实施方案，形成脂质体臭氧纳米溶液的方法包括以下步骤：
-出于应用目的选择合适的乳化剂和/或载体油，
-称量乳化剂和/或载体油，
-通过使臭氧气体或纳米气泡臭氧化水经过乳化剂和/或载体油来对其进行臭氧化，
-再次称量臭氧化乳化剂和/或载体油并确定臭氧含量，
-用甘油和/或PEG包被臭氧化乳化剂和/或臭氧化/非臭氧油。
-通过用最小12000转的混合器破碎至少1小时，将臭氧化乳化剂和/或载体油降低至纳米尺寸，优选用水，
-优选添加选自至少一种赋形剂、至少一种功能性油、至少一种有机酸的组分并混合。
实施例1
本发明的一个实例由臭氧化乳化剂组成。称量选择用于产生该示例性组合物的乳化剂。它通过使臭氧气体经过量是确定的乳化剂而被臭氧化。臭氧化过程使用臭氧微/纳米气泡发生器进行。再次称量臭氧化乳化剂，并按重量测量其中吸收的臭氧气体量。包含臭氧纳米气泡的纳米粒尺寸可以通过纳米技术方法降低至5至50nm的范围。在表1中，给出了通过该方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得了包含10至50000储备ppm臭氧气体的乳化剂。本文中优选的臭氧化乳化剂是聚山梨酯或PEG。这些纳米溶液浓缩物优选包含10 000储备ppm的臭氧气体。
表1.本发明的样品内容物
内容物 按重量计的优选量(％) 按重量计的可用量(％)
乳化剂 99 95至99
臭氧气体 1 0.01至5
实施例2
本发明的另一个实例是从臭氧化乳化剂与水中获得的臭氧化纳米溶液。通过用叶片式混合器以至少12000rpm将臭氧化乳化剂(其臭氧量如上确定)与所需量的水混合来获得纳米溶液。包含臭氧纳米气泡的纳米粒尺寸可以通过纳米技术方法降低至5至50nm的范围。在替代方法中，首先将水臭氧化，并将乳化剂臭氧化水进行混合。在表2中，给出了通过所述方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得了包含100至35 000储备ppm臭氧气体的纳米溶液。本文中优选的臭氧化乳化剂是聚山梨酯或PEG。这些实例可优选包含至少一种上述赋形剂。这些纳米溶液浓缩物优选包含500储备ppm的臭氧气体。
表2.本发明的样品内容物
内容物 按重量计的优选量(％) 按重量计的可用量(％)
乳化剂 50 1至70
臭氧气体 0.5 0.01至3.5
水 49.5 23至98.9
实施例3
本发明的另一个实例是从臭氧化乳化剂与臭氧化载体油和水中获得的纳米溶液。在该实例中，首先确定乳化剂的量，将其臭氧化并称量以确定臭氧含量。另一方面，通过确定所选择载体油的量来将其臭氧化，并称量以确定臭氧含量。用叶片式混合器以至少12000转将获得的臭氧化乳化剂、臭氧化载体油与所需量的水混合来获得纳米溶液。可以使用超声空化通过纳米技术方法将包含臭氧纳米气泡的脂质体的尺寸降低至所期望的范围。包含臭氧纳米气泡的脂质体纳米粒尺寸可以通过纳米技术方法降低至5至50nm的范围。在表3中，给出了通过所述方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得了包含100至45000储备ppm臭氧气体的纳米溶液。本文中臭氧化乳化剂的优选实例是臭氧化聚山梨酯或PEG，并且臭氧化载体油是葵花油或橄榄油。优选地，可以添加百里酚、橙油、丁香油、柠檬油。这些实例可优选包含至少一种上述赋形剂。这些纳米溶液浓缩物优选包含1100储备ppm的臭氧气体。
表3.本发明的样品内容物
Figure BDA0004097383960000091
Figure BDA0004097383960000101
实施例4
本发明的另一个实例是从臭氧化乳化剂与臭氧化载体油和至少一种有机酸中获得的臭氧化脂质体纳米溶液。在该实例中，首先确定乳化剂的量，将其臭氧化并称量以确定臭氧含量。另一方面，通过确定所选择载体油的量来将其臭氧化，并称量以确定臭氧含量。通过用叶片式混合器以至少12000rpm将臭氧化乳化剂、臭氧化载体油与所需量的水和所选择有机酸混合来获得纳米溶液。可以使用超声空化来降低颗粒尺寸。在表4中，给出了通过所述方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得包含10 000至60 000储备ppm臭氧气体的纳米溶液。如果本文中优选的臭氧化聚山梨酯或PEG是臭氧化载体油，则它是植物油，优选葵花油、橄榄油、大豆油、百里酚、橙油、丁香油、薰衣草油、荨麻油、柠檬油，如果其是有机酸；则优选是100％乙酸。这些实例可以优选包含至少一种上述赋形剂。这些纳米溶液浓缩物优选包含30000储备ppm的臭氧气体。
表4.本发明的样品内容物
内容物 按重量计的优选量(％) 按重量计的可用量(％)
载体油 30 20至40
臭氧气体 3 1至6
乳化剂 33 20至40
有机酸 34 20至40
实施例5
本发明的另一个实例是从臭氧化乳化剂与臭氧化载体油、至少一种有机酸和至少一种功能性油原位获得的臭氧化脂质体纳米溶液。在本发明的一些示例性应用中，臭氧化油、臭氧化乳化剂以及有机酸和功能性油在不进行混合的情况下作为组合物存在。它们位于不同的层。在农业中，纳米粒是作为通过将其投入水锅炉中来用混合器将其与水进行混合的结果而形成的。此处目的是使携带更容易。例如，可以将1至6千克的储备组合物投入到1吨水中，并在田间进行喷洒。在表5中，给出了通过所述方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得包含10 000至60 000储备ppm臭氧气体的纳米溶液。如果本文中优选的臭氧化聚山梨酯或PEG是臭氧化载体油，则它是植物油，优选葵花油、橄榄油、大豆油，功能性油，优选百里酚、橙油、丁香油、薰衣草油、荨麻油，如果其是有机酸，则优选乙酸。这些样品优选包含至少一种上述赋形剂。这些纳米溶液优选包含30 000储备ppm的臭氧气体。
表5.本发明的样品内容物
内容物 按重量计的优选量(％) 按重量计的可用量(％)
载体油 27 20至40
臭氧气体 3 1至6
乳化剂 30 20至40
有机酸 30 20至40
功能性油 10 5至20
实施例6
本发明的另一个实例是从臭氧化乳化剂与臭氧化载体油、至少一种有机酸、至少一种功能性油和醇中获得的臭氧化脂质体纳米溶液。在该实例中，首先确定乳化剂的量，将其臭氧化并称量以确定臭氧含量。另一方面，通过确定所选择载体油的量来将其臭氧化，并称量以确定臭氧含量。通过用叶片式混合器以至少12000rpm将臭氧化乳化剂、臭氧化载体油与所需量的水、所选择的有机酸、功能性油和醇混合来获得纳米溶液。在表6中，给出了通过所述方法获得的本发明一个实例的内容物信息。因此，获得包含10 000至60 000储备ppm臭氧气体的纳米溶液。本文中优选的是臭氧化乳化剂聚山梨酯或PEG，臭氧化载体油优选葵花油、橄榄油和/或大豆油；优选的有机酸是100％乙酸，并且醇是100％纯植物醇；优选的功能性油是百里香油、橙油、丁香油、薰衣草油、荨麻油和/或柠檬油。这些实例可优选包含至少一种上述赋形剂。这些纳米溶液浓缩物优选包含30000储备ppm的臭氧气体。
表6.本发明一个实例的内容物
内容物 按重量计的优选量(％) 按重量计的可用量(％)
载体油 27 20至40
臭氧气体 3 1至6
乳化剂 20 10至40
有机酸 30 20至40
功能性油 10 5至15
醇 10 5至15
已经通过以下科学分析证实了上述脂质体臭氧纳米溶液的抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、创伤愈合和组织愈合特性。用于屏障形成和关节内/皮下/肌内注射应用的本发明的屏障溶液适用于人、兽医、食品、农业和化学领域，其实例如下：
-在食品行业中作为消毒剂、防腐剂或食品补充剂；
-在畜牧业中作为消毒剂、驱避剂和饲料添加剂；
-在健康领域，尤其是皮肤病学、耳鼻喉、眼病、口腔-牙科疾病、消化系统、泌尿学、妇科、矫形外科、循环系统疾病、胃肠病学的治疗药物组合物、臭氧治疗和中胚层治疗(mesotherapy)中使用，
-在相当于气体臭氧治疗的治疗领域中，
-在化妆品行业，尤其是用于皮肤、口腔和头发护理的个人护理产品的产生中；
-在化学工业中在洗涤剂和消毒剂的产生中以及作为石油产品的添加剂；
-在纺织工业中用作漂白剂、消毒剂、抗细菌纺织化学品；
-在农业领域中的最终产品中的防腐剂和驱避剂，耕作产品中的杀虫剂、农药、杀真菌剂、杀病毒剂、杀细菌剂、植物和土壤消毒剂；
本发明范围内提及的抗病毒活性可包含以下病毒种类，例如疱疹病毒科(Herpesviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、
Figure BDA0004097383960000131
披膜病毒科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒属(isavirus)、索戈托病毒(thogotovirus))、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(冠状病毒，特别是Sars-Cov-2)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)和逆转录病毒科(Retroviridae)。
在本发明范围内提及的抗细菌活性可以包含细菌种类，例如：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogene)、苏氏芽孢杆菌(Bacillus thurgiensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、腐败梭菌(Clostridium septicum)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、中间化脓链球菌(Streptococcus pyogenes intermedius)或霍乱弧菌(Vibrio cholera)。考虑的其他细菌感染是眼、耳、鼻、喉、阴道、直肠感染。
以其制剂形式用于上述领域的包含本发明脂质体臭氧纳米溶液的以下产品在本发明的范围内：
-配制成用于人或兽医用途的鼻、眼、耳、喉溶液剂，阴道、直肠溶液剂，滴剂或喷剂。500至3000ppm
-用于皮下、关节内、肌内、静脉内、关节内、膀胱内、腹膜内中胚层治疗应用，由于臭氧相互作用的现成玻璃注射器、硅胶盖、玻璃瓶、硅胶盖、安瓿、瓶子(带有阴道直肠装置)、在臭氧抗性血清瓶和塑料袋中递送的可注射溶液剂。500至3000ppm
-用于头发生长和新头发生长的包含复合维生素、矿物质和活性成分(例如米诺地尔和非那雄胺)的头发溶液剂。500至2000ppm
-用于养蜂治疗剂的蜜蜂溶液。(2000ppm脂质体臭氧纳米溶液+百里酚+糖水混合物)
-其是水果和蔬菜溶液剂，用于干果和干蔬菜、新鲜水果和蔬菜，以及肉类，以提高其保质期和含油量、长时间储存并降低农药的危害或减少农药的使用，使其看起来有光泽。脂质体臭氧纳米溶液剂，其包含甘油、臭氧化葵花和/或臭氧化聚山梨酯，包含1000至2000ppm臭氧作为杀虫剂、抗寄生虫剂和抗细菌剂。
-用于变应性疾病的皮炎治疗的合适皮肤溶液剂。臭氧乳化剂和油的混合物，或臭氧乳化剂水混合物，其包含500至10000ppm臭氧。
-用于肠胃外注射的血清溶液剂。臭氧乳化剂水混合物或臭氧乳化剂、臭氧化油和水，其包含1至6mg/kg 200ppm至2000ppm臭氧。
-用于皮下、肌内、关节内中胚层治疗的可注射溶液剂，其包含活性成分，例如组合脂溶性维生素、透明质酸、氨基酸和矿物质，麻醉剂例如利多卡因。其包含300至2000ppm的臭氧。
-腹部和其他腔道手术期间使用的冲洗液。其包含300至2000ppm的臭氧。
-与包含维生素、矿物质或碘、锌、聚维酮碘、银离子的消毒剂组合用于创伤治疗的以喷雾形式提供的溶液剂。臭氧乳化剂水或臭氧乳化剂和臭氧油水，其包含500至10000ppm臭氧。
-与其他皮肤保养和淡斑产品组合用于皮肤保养的以喷雾形式提供的溶液剂或乳膏剂。臭氧乳化剂水或臭氧乳化剂和臭氧油水，其包含500至40000ppm臭氧。
-在泌尿科中作为消毒探针的注射器或作为一次性硅胶中的润滑剂呈现的溶液剂。臭氧乳化剂水或臭氧乳化剂臭氧化油水，其包含100至2000ppm臭氧。
-用于泌尿科抗细菌膀胱的玻璃注射剂，以臭氧抗性普尔(puar)形式呈现的溶液剂。其包含300至2000ppm臭氧。
-以一次性包装、小袋或注射器形式提供的用于阴道消毒的溶液剂。其包含1000至4000ppm臭氧。
-以注射剂形式提供的用于不孕目的输卵管的可注射溶液剂。其包含300至2000ppm的臭氧。
-以消毒喷剂、安瓿、注射剂和小瓶的形式提供的用于牙齿健康中腔内和根管治疗的可注射溶液剂。其包含300至2000ppm的臭氧。
-其是溶液剂，包含臭氧乳化剂、臭氧乳化剂和油水，为胶囊剂或凝胶剂形式，在胃中溶解、在小肠中溶解、在大肠中融化，用于消化系统的健康。其包含10至200ppm臭氧。
-其是用于大肠疾病的一升或一次性直肠溶液剂。其包含100至2000ppm臭氧。
-用固体石蜡或witepsol固化的栓剂，其用于大肠疾病。该栓剂包含2000至10000ppm臭氧。
-其是用于口腔健康的牙膏、喷剂、漱口水和优选地锭剂，包含甜味剂。
-用作动物健康饲料添加剂的溶液剂。以注射器、小瓶、安瓿形式提供的可注射溶液剂，用于肌内、关节内、静脉内、皮下、阴道内、腹膜内注射以用于治疗感染，以保护动物健康。其包含300至3000ppm臭氧。
-以升或单次使用直肠溶液剂，以保护动物健康。其包含300至3000ppm臭氧。
-用固体石蜡或witepsol固化的栓剂，以保护动物健康。其包含2000至10000ppm臭氧。
-在环境(例如，鸡场、谷仓和围栏)中用作驱虫剂、杀虫剂和消毒剂的溶液剂。其包含500至10000ppm臭氧。
-以喷雾剂或溶液剂形式提供的用于创伤和皮肤护理、消毒、卫生以保护动物健康的卫生产品。其包含2000至10000ppm臭氧。
-以喷雾剂或溶液剂形式提供的用于创伤和皮肤护理、消毒、卫生以用于人健康的卫生产品。其包含2000至10000ppm臭氧。
-在食品工业中使用的食品溶液剂，其通过浸渍或喷洒来用于保存肉类、水果和蔬菜、农药去除和抗细菌作用。其包含300至3000ppm臭氧。
-食品溶液剂，其通过浸渍或喷洒方法来使用，以防止干燥食物和豆类变质，以提供杀虫剂和驱虫剂作用。其包含500至3000ppm臭氧。
-食品溶液剂，其用作食品补充剂、胶囊剂、单次使用饮料或与其他饮料和甜味剂组合。其包含100至1000ppm臭氧。
-一次性或多次性湿巾。其包含1000至10000ppm臭氧。
-环境、表面、装置清洁剂或洗涤剂。其包含1000至10000ppm臭氧。
-植物溶液剂，其对植物提供抗细菌、抗真菌、抗寄生虫和驱虫作用，并以适合于稀释的高剂量或喷雾形式提供。其包含500至2000ppm臭氧。
-其包含用于无土农业的抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫肥料溶液剂。其包含500至5000ppm臭氧。
-种子溶液剂，其用于发芽以使种子发育，在种子水培(aquaculture)中提供抗细菌作用，并去除土壤病原体。其包含500至5000ppm臭氧。
-既能提供亮度又能提高观赏植物的植物健康的植物溶液剂。其包含200至1000ppm臭氧。
-在化学工业中与石油产品混合以提高车辆性能的燃料添加剂溶液。其包含1000至20000ppm臭氧。
-设计为在无氧环境中使植物生长的溶液剂。其包含500至3000ppm臭氧。
-臭氧化乳化剂，优选聚山梨酯和水、百里酚、香芹酚和其他化学治疗剂，和与臭氧化油和纳米载体组合的脂质体中的溶液以及在癌症治疗中与静脉内或局部注射组合的癌症药物例如紫杉醇。其包含500至5000ppm臭氧。
本发明的示例性应用是中胚层治疗产品，其内容物说明如下：
用于皮肤修复的中胚层治疗产品包含臭氧化乳化剂、从臭氧化油获得的纳米粒脂质体、氨基酸复合物、矿物质复合物、泛酸；特别地，它们包含纳米粒臭氧脂质体、l-精氨酸、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、乙酸钠、甘油磷酸钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、泛酸、氯化钠、蒸馏水。
用于皮肤的抗衰老中胚层治疗产品包含臭氧化乳化剂、来自臭氧化油的纳米粒脂质体、维生素复合物、氨甲环酸、乙酰半胱氨酸；特别地，它们包含纳米粒臭氧脂质体、硫胺素焦磷酸酯、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酰胺、d泛醇、抗坏血酸、谷胱甘肽、氨甲环酸、乙酰半胱氨酸、氯化钠、蒸馏水。
用于头发护理的中胚层治疗产品包含臭氧化乳化剂、从臭氧化油获得的纳米粒脂质体、维生素复合物、生物素、乙酰半胱氨酸、泛酸；特别地，它们包含纳米粒臭氧脂质体、硫胺素焦磷酸酯、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酰胺、d泛醇、抗坏血酸、生物素、谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸、硫酸镁、氯化钠、蒸馏水。
-屏障溶液测试分析结果-
脂质体臭氧纳米溶液加速老化(稳定性)和抗细菌效力测试：
根据ASTM F1980标准对本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品进行加速老化(稳定性)测试，根据ISO 11737-2标准进行无菌测试，以及根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法进行抗细菌活性测试。根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法确定，1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液在2小时之后针对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性，并且在1小时之后针对大肠杆菌(ATCC 25922)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性。加速老化时间(Accelerated Aging Time，AAT)被计算为37天，其对应于根据ASTMF1980标准进行1.000ppm和1.600ppm施加纳米溶液的加速老化(稳定性)测试的365天(1年)的实时老化(Real Time，RT)。加速老化时间在37天之后，发现溶液是稳定的。在加速老化(稳定性)测试之后，根据ISO 11737-2标准，在1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液的无菌测试中，在溶液中未观察到细菌生长。根据ASTM F1980标准，1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液在365天加速老化(稳定性)之后，根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法，确定了其在2小时之后针对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性，并且在1小时之后针对大肠杆菌(ATCC 25922)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性。
根据改编自CLSI M07 A9标准测试方法的方法，确定了1.000ppm和1.600ppm施加的本发明纳米溶液的抗细菌活性。
将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 25922)细菌混悬液调节至1×105密度，并施加至1.000ppm和1.600ppm溶液。在2至360分钟结束时，将其转移至培养基，并随后评价培养基中是否有任何生长。测试结果在图表1和2中给出。
图表1.针对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的抗细菌效力值
Figure BDA0004097383960000181
图表2.针对大肠杆菌(ATCC 25922)的抗细菌值
Figure BDA0004097383960000182
根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法确定，1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液在2小时之后针对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性，并且在1小时之后针对大肠杆菌(ATCC25922)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性。
根据ASTM F1980标准确定1,000ppm和1,600ppm施加的本发明脂质体臭氧纳米溶液的加速老化(稳定性)测试。将1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液暴露于设置在55℃下的Nüve FN 120品牌烘箱中以用于加速老化(稳定性)，并使用Arrhenius方程[Q10(TAA-TRT)/10]计算加速老化(稳定性)时间。测试结果在图表3中给出。
图表3.加速老化(稳定性)时间
Figure BDA0004097383960000183
加速老化时间(AAT)计算为37天，其对应于根据ASTM F1980标准进行1.000ppm和1.600ppm施加纳米溶液的加速老化(稳定性)测试的365天(1年)的实时老化(RT)。加速老化时间在37天之后，发现溶液是稳定的。
在本发明的脂质体臭氧纳米溶液的加速老化(稳定性)测试后，根据ISO 11737-2标准确定1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液的无菌测试。在1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液中，观察好氧嗜温细菌是否在30±2℃的温度下在Triptone大豆肉汤培养基中生长并持续14天，厌氧嗜温细菌是否在30±2℃下在液体硫乙醇酸盐培养基中生长并持续14天，细菌是否在30±2℃下在Triptone大豆肉汤和液体硫乙醇酸盐培养基的阴性对照中生长并持续14天，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atropheus)是否在30±2℃下在Triptone大豆肉汤和液体硫乙醇酸盐培养基的阳性对照中生长并持续14天。测试结果在图表4中给出。
图表4.在加速老化(稳定性)测试之后，1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液的无菌值
参数 1.000ppm 1.600ppm
好氧嗜温细菌 无生长 无生长
好氧嗜温细菌 无生长 无生长
阴性对照 无生长 无生长
阳性对照萎缩芽孢杆菌 生长 生长
在加速老化(稳定性)测试之后，根据ISO 11737-2标准，在1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液的无菌测试中，在溶液中未观察到细菌生长。
根据ASTM F1980标准，1,000ppm和1,600ppm施加的本发明的脂质体臭氧纳米溶液在365天加速老化(稳定性)之后，根据改编自CLSI M07A9标准的测试方法确定抗细菌活性。根据ASTM F1980标准在365天加速老化(稳定性)之后，将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 25922)细菌混悬液调节至1×105密度，并施加至1.000ppm和1.600ppm溶液。在2至360分钟结束时，将其转移至培养基，并随后评价培养基中是否有任何生长。测试结果在图表5和图表6中给出。
图表5.针对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的抗细菌效力值
Figure BDA0004097383960000191
Figure BDA0004097383960000201
图表6.针对大肠杆菌(ATCC 25922)的抗细菌值
Figure BDA0004097383960000202
根据ASTM F1980标准，1.000ppm和1.600ppm施加的纳米溶液在365天加速老化(稳定性)之后，根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法，确定了其在2小时之后针对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)细菌和在1小时之后针对大肠杆菌(ATCC 25922)细菌具有抗细菌(杀细菌)活性。
根据改编自CLSI M07 A9标准测试方法的方法，确定2000ppm和3000ppm施加的本发明纳米溶液的抗细菌活性。将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC 25922)细菌混悬液调节至1×105密度，并施加至2000ppm和3000ppm溶液。在2至360分钟结束时，将其转移至培养基，并随后评价培养基中是否有任何生长。测试结果在图表6至14中给出。
图表6.脂质体臭氧纳米溶液+1％透明质酸大肠杆菌25922 2000ppm
Figure BDA0004097383960000203
Figure BDA0004097383960000211
图表7.脂质体臭氧纳米溶液+甘油喉喷剂大肠杆菌25922 3000ppm
Figure BDA0004097383960000212
Figure BDA0004097383960000221
图表2000ppm 1年大肠杆菌25922 2000ppm
Figure BDA0004097383960000231
Figure BDA0004097383960000241
图表9.臭氧化油和臭氧化乳化剂2000ppm大肠杆菌25922 2000ppm
Figure BDA0004097383960000242
Figure BDA0004097383960000251
图表10.脂质体臭氧纳米溶液2000ppm+0.5％百里酚大肠杆菌259222000ppm
Figure BDA0004097383960000252
Figure BDA0004097383960000261
图表11.臭氧化油+臭氧化乳化剂2000ppm金黄色葡萄球菌(S.auneus)65382000ppm
Figure BDA0004097383960000262
Figure BDA0004097383960000271
图表12.脂质体臭氧纳米溶液2000ppm+0.5％百里酚金黄色葡萄球菌65382000ppm
Figure BDA0004097383960000272
Figure BDA0004097383960000281
图表13.脂质体臭氧纳米溶液+甘油喉喷剂大肠杆菌(E.Coli)3000ppm
Figure BDA0004097383960000282
Figure BDA0004097383960000291
图表14.脂质体臭氧纳米溶液2000ppm 1年金黄色葡萄球菌6538 2000ppm
Figure BDA0004097383960000301
Figure BDA0004097383960000311
根据ASTM F1980标准，2000ppm和3000ppm施加的纳米溶液在365天加速老化(稳定性)之后，根据改编自CLSI M07 A9标准的测试方法已经确定该纳米溶液针对金黄色葡萄球菌细菌和大肠杆菌细菌具有提高比率的抗细菌(杀细菌)活性。
脂质体臭氧纳米溶液的皮肤刺激测试：
本发明的脂质体臭氧纳米溶液的刺激测试根据TS EN ISO10993-10:2010标准进行，测试中使用的实验动物根据TS EN ISO10993-2:2006标准考虑，材料制备根据TS ENISO 10993-12:2013标准指南进行。三只体重为2至3kg的健康幼龄新西兰白化兔(albinorabbit)被用作实验动物。
在TS EN ISO 10993-10:2010附录A A.2,2液体测试材料；液体(A A.2,2Liquidtest materials；Liquids)的标题下给出的测试材料在未经稀释的情况下或通过直接沉淀来施加，或者如果不适用的话，则以1600ppm的剂量(其是根据指南的使用剂量)来施加。月桂基硫酸钠(Sodium lauryl sulphate，SLS)用作阳性对照，并且蒸馏水用作阴性对照。用本发明的纳米溶液浸渍的海绵保持与样品施加区域直接接触。将SLS浸渍的海绵施加至阳性对照区。用纱布覆盖样品，用绷带固定，并与背部皮肤进行表面接触4小时。根据图表1中给出的皮肤反应评分，通过在第4小时施加之后评价施加区域(1±0.1)、(24±2)、(48±2)和(72±2)小时来确定原发性刺激指数。如在标准中所述，第1小时不包括在计算中。
图表1.皮肤反应的评分系统
Figure BDA0004097383960000312
Figure BDA0004097383960000321
图表2.原发性或累积性刺激指数类别的评价图表
平均评分 反应分类
0至0.4 无关紧要
0.5至1.9 轻度
2至4.9 中度
5至8 严重
在图表3和图表4给出了根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行的观察和其评价。
图表3.刺激评分
Figure BDA0004097383960000322
Figure BDA0004097383960000331
图表4.平均评分
Figure BDA0004097383960000332
TS EN ISO 10993-10:2010标准中的刺激测试结果
在基于在本发明纳米溶液的刺激测试中施加之后第24、48和72小时时的观察值进行的评价(图表3、4)中，确定了样品没有在任何对象中引起显著的红斑和水肿。根据按照TSEN ISO 10993-10:2010标准的指示进行的测试结果，已经确定本发明的纳米溶液没有任何刺激作用。
脂质体臭氧纳米溶液的体外细胞毒性测试：
细胞毒性是指对活细胞的毒性作用率。细胞毒性测试是通过考虑被认为有毒的物质在适当的细胞培养物中对细胞的毒性作用和细胞增殖率来评价的测试。进行这些测试系统以用于细胞损伤的形态学观察、通过多种测量方法确定细胞损伤、确定细胞生长、确定细胞代谢的任何变化。细胞毒性测试可以在体内或体外进行。在体外测试中，其细胞毒性被研究的物质以递增的浓度施用于细胞。研究了这种物质对细胞形态和细胞存活率的作用。
MTT法[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物]：在该方法中，MTT被还原为甲瓒，同时通过比色法测量形成的颜色。产生的甲瓒的量给出了活细胞的数量。MTT是被主动吸收到细胞中并通过线粒体依赖性反应还原成有色的、不溶于水的甲瓒的物质。细胞的MTT还原特性被视为细胞生存力的量度，并且作为MTT分析结果获得的染料密度与活细胞的数量相关。
本研究中使用的测试系统基于以下标准；
TS EN ISO 10993-5:2009，医疗器械生物学评价-第5部分：体外细胞毒性测试(TSEN ISO 10993-5:2009,Biological evaluation of medical devices-Part 5:Tests forin vitro cytotoxicity)。TS EN ISO 10993-1:2018，医学器械生物学评价-第1部分：评价和测试(TS EN ISO 10993-1:2018,Biological evaluation of medical devices-Part1:Evaluation and testing)。TS EN ISO10993-5:2009，医学器械生物学评价-第12部分：样品制备和参考材料(TS EN ISO 10993-5:2009,Biological evaluation of medicaldevices-Part 12:Sample preparation and reference materials)。USP 31,2008，第87章-体外生物反应性测试(USP 31,2008,Chapter 87-Biological reactivity tests,invitro)。
根据TS EN ISO 10993-12:2012标准，在37℃下用1600ppm脂质体臭氧纳米溶液进行测试材料、阴性和阳性组的提取，持续24小时。
来自ATCC的BALB/c 3T3(CCL-163)细胞系用于细胞毒性测试研究。细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)和2％谷氨酰胺的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基(dulbecco'smodified eagle medium))(ATCC目录号：30-2006)培养基中繁殖，并在37℃下在具有5％CO2的烘箱中孵育。如ATCC所建议的，对于细胞的胰蛋白酶，使用0.25％胰蛋白酶和0.03％EDTA的混合物。将细胞混悬在培养基中，并将100μl转移至96孔板，其中每个孔中有104个细胞。
在24小时的细胞培养条件之后，去除培养物上的培养基，并添加100μl来自阳性和阴性对照提取物的测试材料。所有剂量以至少5次重复来施用。在37℃和95％湿度的具有5％CO2的烘箱中等待48小时结束时，在检查板之后去除培养基。
阴性对照(Negative control，NC)：聚乙烯管
阳性对照(Positive Control，PK)：DMSO(二甲基亚砜)的系列稀释液(10-30v/v)
测试材料(Test Material，TM)浓度：100-30-10-3-v/v
在检查板之后，从孔中去除培养基。向每个测试孔添加50μl MTT溶液。将板在37℃孵育2小时。然后，从孔中去除MTT溶液，并向每个孔中添加100μl异丙醇。用包含570nm过滤器的微板读取仪进行吸光度测量并评价。
如果测试材料的生存力低于70％，则认为具有细胞毒性。
图表1.通过MTT测试定量测量细胞毒性作用的结果。
Figure BDA0004097383960000351
根据下式确定％生存力值。
生存力％＝100×OD570TM/OD570NK
OD570TM＝在去除空白之后测试材料的光密度值的平均值。
OD570NK＝在去除空白之后阴性对照的光密度值的平均值。
根据按照TS EN ISO 10993-5:2009标准的指示进行的测试结果，确定了测试材料—本发明的脂质体臭氧纳米溶液不具有细胞毒性作用。
脂质体臭氧纳米溶液体内急性眼部刺激测试：
该实验旨在测试可能引起眼部刺激的材料或产品。只对将与眼或眼睑接触的材料以及无法通过其他方式获得安全信息时的材料进行眼部刺激测试。按照TS EN ISO 10993-10:2010附录A中指定的说明进行测试材料。如果待测试材料为液体，则将0.1ml未稀释(1600ppm剂量)滴入到一只眼的下结膜囊。如果测试材料在喷雾泵中，则将其从泵中取出，并通过像液体形式一样滴入0.1mL来测试。使用来自单一品系的两种性别的3只健康的年轻成年白化兔(体重为2kg至3kg)。动物被饲养在TS EN ISO10993-2:2006中指定的环境条件下。对每只兔的双眼进行视觉检查直到在实验开始之前24小时，以便确定是否存在眼部异常。检查眼时，可使用2％荧光素钠BP(英国药典)来使任何角膜损伤显现。
在将测试样品滴入到结膜囊中之后，将眼睑保持在一起约1小时。为了观察动物和确定刺激指数，大约在(1±0.1)秒、(24±2)秒、(48±2)秒和(72±2)秒时进行检查。由于没有观察到损伤，因此没有必要将观察进展至更长的时间。观察结果根据图表1中给出的眼部病变分级量表进行分级。
图表1.眼部病变分级系统
Figure BDA0004097383960000361
Figure BDA0004097383960000371
将0.1ml本发明的纳米溶液产品滴注到兔的左眼中，在滴注之后约(1±0.1)小时检查并评价双眼。没有观察到由该施加引起的任何结膜刺激的迹象。由于在通过滴注2％荧光素钠进行的检查中没有观察到永久性或其他角膜刺激的迹象，因此没有必要延长观察期。根据表1对评价进行分级。在任何动物中均未观察到阳性反应。在动物中，未发现眼部变化，例如轻度或结膜脱皮和溃疡、角膜穿孔(穿孔)、眼的前房出血或流脓或者-血性或多毛(脓性)分泌物，或-严重的角膜溃疡。
图表2.眼部病变分级系统
反应 数值评定
1-角膜 0
2-虹膜 0
3.结膜
发红[(眼睑的)胸膜和球(眼下)结膜 0
结膜水肿 0
分泌物 0
当评价在本发明的脂质体臭氧纳米溶液的眼部刺激测试中用对照眼处理的眼时，确定没有差异，并且本发明的纳米溶液没有引起反映眼部结构(结膜、角膜、虹膜)中任何刺激的任何变化。根据按照TS EN ISO10993-10:2010标准的指示进行的“眼部刺激测试”的观察，已经确定本发明的脂质体臭氧纳米溶液没有眼部刺激作用。
脂质体臭氧纳米溶液的口腔黏膜刺激测试：
口腔黏膜刺激测试根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行，测试中使用的实验动物根据TS EN ISO 10993-2:2006标准考虑，材料制备根据TS EN ISO 10993-12:2012标准指南进行。针对旨在接触到口腔组织的材料以及无法通过其他方式获得安全性数据时的材料进行该测试。
通过如在TS EN ISO 10993-2:2006中所指定的来照看动物，使它们适应环境。将与单一品系无关的两种性别的健康年轻成年叙利亚仓鼠用于测试。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，将浸有产品样品的纱布置于每只动物的内颊囊。根据反映材料的实际预期使用时间的规则来评价暴露时间，并且将样品在内颊囊中保持1小时。
在ISO 10993-10:2010附录AA.2,2液体测试材料；液体的标题下给出的测试材料在未经稀释的情况下或通过直接沉淀来施加，或者如果不适用的话，则以1600ppm的剂量(其是根据指南的使用剂量)来施加。盐水溶液浸渍的脱脂纱布用作阴性对照。作为阳性对照，根据具有小于等于pH 2的液体被视为具有刺激性的原则，实验室使用了调节至pH 1.5的HCl酸溶液。
评价用于实验样品的每只动物的左内颊囊，并将对侧(右)内颊视为阴性对照。在右内颊囊中未放置材料，仅将其用生理盐水洗涤并在实验结束时解剖。
将浸渍有使用剂量为1600ppm的本发明纳米溶液的纱布置于处于氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下的叙利亚仓鼠的左内颊囊中，该仓鼠的内颊被清空并用盐水洗涤。在对象暴露于样品1小时之后，取出样品，并用盐水溶液冲洗内颊，注意不要污染另一个颊。根据图表1对实验(左)和对照(右)内颊囊进行宏观评价。在接触1小时之后终止实验。
图表1-口腔和阴茎反应的评定系统
Figure BDA0004097383960000391
根据标准的指示，暴露时间应反映材料的实际预期使用时间，但不应少于5分钟。将在长期慢性暴露下进行的重复观察评定(表1)求和并除以总重复施加4。由于这是亚急性使用的装置，因此以1小时为间隔进行了4次施加。将施加于左内颊的样品的观察结果与用盐水洗涤的右内颊(阴性对照)进行比较。
图表2-用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的分级系统
Figure BDA0004097383960000392
Figure BDA0004097383960000401
图表3–刺激指数
0 无
1至4 最低限度
5至8 轻度
9至11 中度
12至16 重度
根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行的观察及其评价在图表4 3中给出。在宏观检查中，在施加样品的内颊黏膜中没有观察到刺激外观(红斑或焦痂)，与对照相似。注意到在阳性对照中有黏膜糜烂区域。除阳性对照外，每只动物的平均刺激指数计算为零(0)。
图表3：宏观刺激评分
Figure BDA0004097383960000411
图表4：显微镜刺激评分
Figure BDA0004097383960000412
当在显微镜下检查从为测试产品施加组的组织病理学检查而获取的内颊样品制备的苏木精-伊红(HE)染色制剂时，没有黏膜、上皮的糜烂或溃疡，白细胞浸润和血管充血。
在显微镜下检查从为组织病理学检查而获取的内颊样品制备的苏木精-伊红(HE)染色制剂之后，评价是否有任何黏膜、上皮糜烂或溃疡、白细胞浸润和血管充血。在光镜组织病理学检查中，在对象中没有发现反映施加本发明纳米溶液的产品样品的口腔黏膜结构的刺激性外观的现象。根据对可能与口腔组织接触的材料施加的口腔黏膜刺激测试的宏观和组织病理学评价结果(TS EN ISO 10993-10)，确定了本发明的纳米溶液对口腔黏膜没有刺激作用。
脂质体臭氧纳米溶液的黏膜刺激测试：
鼻黏膜刺激测试根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行，测试中使用的实验动物根据TS EN ISO 10993-2:2006标准考虑，材料制备根据TS EN ISO 10993-12:2012标准指南进行。针对旨在与鼻组织接触的材料以及无法通过其他方式获得安全性数据时的材料进行该测试。
通过如在TS EN ISO 10993-2:2006中所指定的来照看动物，使它们适应环境。将十二只与单一品系无关的两种性别的健康年轻成年BalbC小鼠(6只实验，6只对照)用于测试。将单剂量(1ml)的1600ppm的本发明纳米溶液滴注到每只动物的鼻腔中，持续4天。
在ISO 10993-10:2010附录AA.2,2液体测试材料；液体的标题下给出的测试材料在未经稀释的情况下或通过直接沉淀来施加，或者如果不适用的话，则通过用合适的液体稀释以1600ppm的剂量(其是根据指南的使用剂量)来施加。与仅使用盐水的阴性对照组进行比较。没有施加阳性对照4天刺激施加，因为这就动物福利而言是不道德的。
实验组通过将单剂量(1ml)的1600ppm的本发明纳米溶液滴入到鼻腔4天来形成。对照组通过将相同量的盐水纳米溶液滴入到鼻腔4天来形成。
在4天的施加之后，解剖在高剂量氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下接受安乐死的对象的鼻子，并进行脱钙处理以在10％福尔马林固定之后软化骨骼。
图表1-鼻反应的评定系统
Figure BDA0004097383960000421
Figure BDA0004097383960000431
在施用测试样品的4天期间，对动物进行临床观察。在实验组和对照组对象中没有观察到鼻发红、流涕(discharge)或不安的迹象。这些动物表现出正常的进食和社会行为。
通过考虑在阴道、直肠和阴茎刺激测试中检查的参数来进行鼻黏膜刺激测试的显微镜评价(图表2)。
图表2-用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的分级系统
Figure BDA0004097383960000432
Figure BDA0004097383960000441
图表3–刺激指数
Figure BDA0004097383960000442
根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行的宏观观察和显微镜评价在图表1中给出。在宏观检查中，在施加样品的鼻黏膜中没有观察到刺激外观(红斑或焦痂)，与对照相似。注意到在阳性对照中有黏膜糜烂区域。除阳性对照外，每只动物的平均刺激指数计算为零(0)。
图表1：显微镜刺激评分
Figure BDA0004097383960000443
Figure BDA0004097383960000451
在显微镜下检查从为组织病理学检查而获取的鼻样品制备的苏木精-伊红(HE)染色制剂之后，评价是否有任何黏膜、上皮糜烂或溃疡、白细胞浸润和血管充血。在光镜组织病理学检查中，在对象中没有发现反映应施加本发明纳米溶液的产品样品的鼻黏膜结构的刺激作用的现象。根据对可能与鼻组织接触的材料施加的鼻黏膜刺激测试的宏观和组织病理学评价结果(TS EN ISO 10993-10)，确定了本发明的纳米溶液对鼻黏膜没有刺激作用。
脂质体臭氧纳米溶液的致敏测试：
致敏测试根据TS EN ISO 10993-10:2010标准，通过封闭斑贴-Buehler测试(Closed Patch-Buehler Test)方法进行，测试中使用的实验动物根据TS EN ISO 10993-2:2006标准来考虑，材料制备根据附录A标准指南来进行。
在实验开始时，使用10只体重为300g至500g的来自单一品系的两种性别的无关健康年轻成年白化豚鼠(5只雄性，5只雌性)。在刺激之前24小时将动物脱毛后，将待处理的区域剃毛。用温水彻底洗涤无毛区域并用毛巾擦干，然后将动物置于笼子中。修剪毛发2小时之后，根据图表1中给出的马格努松和克利格曼评定(Magnusson and Kligman rating)对测试部位进行分级。
图表1-马格努松和克利格曼评定量表
Figure BDA0004097383960000452
Figure BDA0004097383960000461
在ISO 10993-10:2010附录AA.2,2液体测试材料；液体的标题下给出的测试材料在未经稀释的情况下或通过直接沉淀来施加，或者如果不适用的话，则通过用合适的液体稀释以1600ppm的剂量(其是根据指南的使用剂量)来施加。盐水溶液浸渍的脱脂纱布用作阴性对照。作为阳性对照，实验室使用0.8％多聚甲醛溶液。
用本发明的纳米溶液浸渍的纱布以与剃毛区域的左上和右下区域直接接触来施加。样品由此保持与动物剃毛的背部皮肤接触6小时。施加于剃毛区域的样品用纱布覆盖并用石膏从外部保护。该施加每周进行三次，持续三周。
在诱导三周之后，在休息两周之后，将样品施加于先前诱导区域的相对侧以进行刺激实验，并保持6小时。在刺激施加之后24和48小时进行评价。
在诱导阶段，在每周三次施加之后的24±2小时和48±2小时，根据马格努松和克利格曼分级进行观察，持续三周。在两周间隔之后移除刺激斑贴之后的24±2小时和48±2小时进行再分级。
根据马格努松和克利格曼分级的测试和对照动物观察记录在下图表2中给出。
图表2.按组的马格努松和克利格曼评定
Figure BDA0004097383960000462
Figure BDA0004097383960000471
在使用封闭斑贴-Buehler测试方法的本发明纳米溶液产品的致敏测试中，确定了样品在进行了5周的施加和观察中在任何对象中都没有引起任何作为敏感性/敏感性的指示的红斑和水肿的出现。
根据TS EN ISO 10993-10:2010标准的指示，作为使用封闭斑贴-Buehler实验方法的测试观察的评价结果，确定了本发明的脂质体臭氧纳米溶液不具有延迟的致敏作用。
脂质体臭氧纳米溶液的抗病毒效力测试：
为了研究本发明脂质体臭氧纳米溶液的生物作用和可能的毒性作用，首先进行上皮细胞培养。因此，将从生物库获得的上皮组织块在解冻后放入盐水(0.09％NaCl)中，并在无菌培养皿中分成小片。培养包含10％胎牛血清和1％抗生素的预先制备的培养基。在细胞培养皿中达到足够的成熟度和饱和度之后，用不同剂量的产品将它们培养不同的时间。
通过生物反应器系统在其基础设施中提供器官型培养基来对所提供的并通常由人呼吸系统病毒靶向的气管-支气管上皮细胞进行细胞培养过程。在此过程中，在用包含10％胎牛血清和1％抗生素的预先制备的培养基(DMEM)在包含37℃和5％CO2的3维密闭系统生物反应器中孵育48小时之后，通过用现成的培养基洗涤来使细胞培养再继续进行48小时。在该阶段结束时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化，并传代至生物反应器系统的允许传代至相同培养基中的其他单元中。通过基于颜色和pH变化更新培养基来维持培养，直到接种在这些区域的细胞覆盖80％的表面积。当细胞在其环境中达到饱和水平时，将单个室中的细胞暴露于胰蛋白酶介导的处理，然后将3维细胞培养物从表面分离并洗涤。在其余室中，活性物质研究在时间和剂量调整的情况下继续进行。作为研究的结果，确定了其对细胞增殖的积极作用。这项研究是使用具有模仿人性的能力的培养基和生物反应器进行的。
在进行洗涤之后，对细胞进行计数，并通过流式细胞术进行生存力测试。在3-激光流式细胞仪中读取重悬的细胞，直到有10000个细胞，并且通过用活性染料(7AAD)染色来确定从培养物中获得的细胞的生存力百分比。另外，将处于待收获水平的培养细胞进行洗涤并置于500μL的eppendorf中。将100μL的0.4％台盼蓝溶液添加至该细胞混悬液中，并在室温下孵育5分钟，然后从中取出10μL。通过将该体积放在细胞计数载片上并在细胞成像和计数装置中读取来确定细胞生存力百分比。
如从图表中可以看出，在健康的宿主细胞上既没有观察到增殖也没有观察到生存力的事实被认为是该产品不会引起毒性作用的表现。
Figure BDA0004097383960000481
Figure BDA0004097383960000491
活性物质对冠状病毒SARS COV-2病毒裂解物的作用，就其对初始体积的作用和其对cDNA转换的作用二者而言，以剂量和时间依赖性方式通过荧光测定来测量，在下图表中给出。在用学生t检验(Student's t-test)进行的统计分析中，在5分钟的孵育期内以1000ppm的统计显著活性的测定也与先前的细菌活性研究一致，已揭示了经受研究的产品可以具有病毒和细菌活性二者。
Figure BDA0004097383960000492
作为以上详细研究的结果，本发明的脂质体臭氧纳米溶液被认为具有发现的病毒和细菌活性二者；不会引起毒性作用；对健康细胞的生存力没有负作用；对人呼吸系统(气管-支气管)细胞具有再生作用和增殖作用二者。
-注射溶液的测试分析结果-
脂质体臭氧纳米溶液的体外遗传毒性细菌Ames测试：
对用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液的样品进行了遗传毒性测试，并且已经显示出没有诱变潜力。
遗传毒性(细菌Ames测试)(OECD 471)信息：用于开发多种测试系统以阐明诱变作用和检测诱变剂并降低由诱变对人引起的遗传性疾病和癌症的风险的研究构成了遗传毒理学的最重要研究领域之一。由Bruce Ames于1972年开发并作为确定化学物质的诱变作用的筛选测试应用的Ames测试被广泛并可靠地用作短时间细菌测试系统。
用于在细胞水平上确定由化学物质引起的突变的一个短时间测试系统是Ames测试。Ames测试被认为是检查旨在用作药物原料的测试物质的毒性、诱变-致癌作用的可靠方法之一。
测试物质和对照物质的制备：
A.对于固体测试材料：根据OECD 471指南，将0.5g测试产品溶解在10mLDMSO中，涡旋，并进行2倍系列稀释。将测试的最终浓度调整为5mg/板、2.5mg/板、1.25mg/板、0.625mg/板和0.3125mg/板。
B.对于液体测试材料：根据OECD 471指南，将50μL测试产品溶解在1mL DMSO中，涡旋，并进行2倍系列稀释。将测定的最终浓度调整为5μL/板、2.5μL/板、1.25μL/板、0.625μL/板和0.3125μL/板。
研究中使用的菌株：所有菌株均购自MOLECULAR TOXICOLOGY,INC。菌株编号如下所示：
a.鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA98：#71-098L
b.鼠伤寒沙门氏菌TA100：#71-100L
阳性对照：根据不同细菌菌株使用不同的阳性对照产品。细菌菌株和诱变剂的个体浓度的描述如下所示：
Figure BDA0004097383960000501
Figure BDA0004097383960000511
阴性对照：DMSO
对于代谢激活系统(S9 mix)，使用了Arachlor 1254诱导的冻干大鼠肝S9微粒体部分。在存在和不存在S9混合物的情况下，评价提取物的诱变潜力。测试中使用了30％的S9混合物。
将细菌孵育1夜，然后接种到氨苄青霉素培养基上。在对照图表中指定的1ml适当溶剂(DMSO或无菌蒸馏水)中，为每种细菌单独制备对照溶液。确定了用于测试材料的六个浓度。
将制备的培养溶液添加至384孔板。根据测试方案，将其在37度的烘箱中孵育48小时。在该阶段结束时，对每个浓度的64个孔进行计数，并根据阳性[(黄色-回复突变体)]和阴性[(紫色-非回复突变体)]孔进行评价，如果在含S9和不含S9的测试菌株中观察到为阴性对照组的两倍更多的突变，则该测试被视为阳性(突变作用)。
遗传毒性(细菌Ames测试)结果
图表1.在测试材料的S9培养基和无S9培养基中细菌菌株的突变菌落数的展示
Figure BDA0004097383960000512
Figure BDA0004097383960000521
注释：观察到“关节内/皮下/肌内注射溶液”测试产品的菌落，鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100显示出并没有阴性对照组的菌落的2倍高。
作为结果，根据测试操作(OECD 471)的结果，确定测试材料在2种不同的细菌菌株的所有较低浓度下均无诱变性。
脂质体臭氧纳米溶液急性全身毒性测试(TS EN ISO 10993-11:2018)：
对本发明的用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液样品进行急性全身毒性测试，并确定没有急性毒性作用。
急性全身毒性测试根据TS EN ISO 10993-11:2018标准进行，测试中使用的实验动物根据S EN ISO 10993-2:2006标准进行考虑，材料制备根据TS EN ISO 10993-12:2012标准指南来进行。
测试材料根据TS EN ISO 10993-12:2012样品制备指南来进行。关节内/皮下/肌内注射纳米溶液以2ml/kg体重的量进行肌内注射(TS EN ISO10993-11:2018-4，附录B)。
将脂质体臭氧纳米溶液以2ml/kg体重的量肌内注射到对象的臀区。作为对照组，给6只(3♀/3♂)BalbC小鼠以2ml/kg体重的量注射盐水，并形成对照组。对照组对象与实验组保持在相同的环境中，并以相同的方式饲养。将对象保持在临床观察下持续3天(图表1)。
临床观察：
体重：对象的体重范围为23至33g，并且体重没有显著变化。
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Figure BDA0004097383960000531
图表1：常见临床体征、观察结果。
Figure BDA0004097383960000532
Figure BDA0004097383960000541
活动：没有观察到对象的能动性和日常活动的变化。没有观察到嗜睡、疲劳、颤抖、抽搐行为的增加和减少。
应激：在对象的行为中，没有观察到神经质的行为，例如应激指征、持续巡视、攻击性或聚于角落(cornering)。它们在笼子里表现出正常活动。
死亡：在任何组中都没有观察到死亡。
疼痛：没有观察到作为疼痛指标的钝化、爬行、间歇性活动和嚎叫行为。
呼吸：没有观察到呼吸行为的差异，以及发绀、流鼻涕、呼吸急促。
食物和水的消耗：监测到食物和水的消耗与对照相似。
视力：在眼中未观察到结膜充血、流泪、结膜炎、混浊、虹膜炎症。
心脏观察：未观察到心动过速、心动过缓。
体温：在正常水平下观察到36.5℃。
胃肠道观察：未观察到过度流涎、腹泻、软便。
根据TS EN ISO 10993-11:2018文件中指定的方案和评价标准，在急性施加关节内/皮下/肌内注射脂质体臭氧纳米溶液(通过临床观察和测量对其进行了测试)的实验期间未发现毒性证据。作为结果，确定了用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液没有任何急性毒性作用。
脂质体臭氧纳米溶液的体外细胞毒性测试(TS EN ISO 10993-5:2009)：
对用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品进行体外细胞毒性测试，并且该测试显示其不具有细胞毒性潜力。
根据ISO 10993-12标准进行测试材料、阴性和阳性组的提取。提取物通过在37±1℃下将0.2克/ml的测试材料在DMEM 10％FBS中在振荡培养箱中以200rpm保持72±2小时来制备(指定的标准是基于不规则形状的固体装置。这种情况被选为最坏情况)。通过0.22μm无菌过滤器进行过滤，并定义为100％提取物。通过稀释DMEM 10％FBS来形成其他提取物的百分比。没有观察到颜色变化(实验室测试方法)。
使用用于细胞毒性测试研究的来自ATCC的L-929小鼠成纤维细胞系(NCTC克隆929：CCL1，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)[ATCC])。细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)和2％谷氨酰胺的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)(ATCC目录号：30-2006)培养基中繁殖，并在37℃下在具有5％CO2的烘箱中孵育。如ATCC所建议的，对于细胞的胰蛋白酶，使用0.25％胰蛋白酶和0.03％EDTA的混合物。将细胞混悬在培养基中，并将100μl转移至96孔板，其中每个孔中有104个细胞。
在24小时的细胞培养条件之后，去除培养物上的培养基，并添加100μl来自阳性和阴性对照提取物的测试材料。所有剂量以至少5次重复来施用。在37℃和95％湿度的具有5％CO2的烘箱中等待48小时结束时，在检查板之后去除培养基。
阴性对照(NC)：细胞培养基(DMEM+10％FBS)在与提取物相同的条件下孵育72小时。
阳性对照(PC)：用DMEM+10％FBS对DMSO(二甲基亚砜)进行系列稀释(10-30v/v)。
测试材料(TM)浓度：用DMEM+10％FBS稀释为100-30-10-3-v/v。
在对板进行显微镜检查之后，从孔中去除培养基。将50μl MTT溶液添加至其中一个测试孔中。将板在37℃下孵育2小时。然后，从孔中去除MTT溶液，并向每个孔添加100μl异丙醇。用包含570nm过滤器的微板读取仪进行吸光度测量并评价。吸光度大于0.2被接受为测试的一般有效性标准。如果测试材料的生存力低于70％，则认为具有细胞毒性。
图表1.通过MTT测试定量测量细胞毒性作用的结果。
Figure BDA0004097383960000551
Figure BDA0004097383960000561
根据按照TS EN ISO 10993-5标准的指示进行的测试结果，已经确定测试材料不具有细胞毒性作用。
TS EN ISO 10993-10:2010标准中脂质体臭氧纳米溶液的刺激性测试结果
对用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品的刺激测试根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行，测试中使用的实验动物根据TS EN ISO 10993-2:2006标准考虑，材料制备根据TS EN ISO10993-12:2013标准指南进行。
三只体重为2至3kg的健康幼龄新西兰白化兔被用作实验动物。
在TS EN ISO 10993-10:2010附录AA.2,2液体测试材料；液体的标题下给出的测试材料应在未经稀释的情况下进行测试，或通过直接沉淀进行测试，或者如果不适用的话，则通过用生理盐水稀释至1/4剂量(其是根据应通过用合适的液体稀释进行测试的指示的使用剂量)进行测试。
月桂基硫酸钠(SLS)用作阳性对照，并且蒸馏水用作阴性对照。
如图2所示，使浸渍有脂质体臭氧纳米溶液的海绵保持与2号样品施加区直接接触。将SLS浸渍的海绵施加于阳性对照区(3号区域)。用纱布覆盖样品，用绷带固定，并与背部皮肤进行表面接触4小时。
根据在图表1中给出的皮肤反应评分，通过在第4小时施加之后评价施加区域(1±0.1)、(24±2)、(48±2)和(72±2)小时来确定原发性刺激指数。如在标准中所述，第1小时不包括在计算中。
在图表1和图表2中给出了根据TS EN ISO 10993-10:2010标准进行的观察及其评价。
图表1：刺激评分
Figure BDA0004097383960000571
图表2.平均评分
Figure BDA0004097383960000572
Figure BDA0004097383960000581
根据按照TS EN ISO 10993-10:2010标准的指示进行的测试结果，确定了用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液没有任何刺激作用。
脂质体臭氧纳米溶液的皮下植入7至14天测试(TS EN ISO 10993-6:2016)
对用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品进行了皮下植入测试，并且已经表明其不会引起任何炎性反应。
测试方法的目的是确定组织响应的历程和过程，其包括医学装置/生物材料植入之后材料的最终融合或再吸收/降解。特别地，对于可降解/可吸收材料，确定材料的降解特性和纹理响应。
通过将植入物放置在成年小鼠、大鼠、豚鼠或兔的背部皮下组织中来测试植入物。
在测试研究中使用两种性别的健康Wistar大鼠，体重为200至300g，并且为10周龄。在测试期间，对象被保持在60％湿度和22℃恒温的避光区域。给予对象正常的大鼠饲料和自来水。无尘蒸压刨花用作基板。实验结束时，所有动物都被实施了安乐死。
脂质体臭氧纳米溶液样品不能直接施加于皮肤下(植入)。在手术室条件下，通过置于以氯胺酮85mg/kg、甲苯噻嗪15mg/kg体重的剂量麻醉的大鼠的脊柱两侧背部皮肤下来进行产品植入。在通过剃除手术区域的毛发来去除毛发之后，通过用消毒溶液擦拭来清洁手术区域。植入期确定为2周，并在该过程结束时，使用深度麻醉对对象实施安乐死，并打开植入区域并进行宏观观察。获取从植入区域解剖的组织样品以用于显微镜检查。
经处理的动物在其日常行为和活动中没有表现出任何异常。在其运动和行走中没有观察到异常。它们在笼子里的饮食习惯和社会行为均是正常的。
在14天植入期结束时，在植入区域的宏观检查中观察到关节内/皮下/肌内注射纳米溶液产品在皮肤下被吸收并且在皮下组织中消失。在植入病灶周围没有观察到淋巴结形成和炎性结构。在组织病理学检查中，在皮下组织中的植入部位处没有观察到淋巴病灶或另外的淋巴细胞浸润和化生变化。
根据TS EN ISO 10993-6:2016文件中指定的方案和评价标准，作为通过观察和测量测试的关节内/皮下/肌内注射纳米溶液产品的植入实验的结果，观察到关节内/皮下/肌内注射纳米溶液被完全吸收和消失，并且在14天的皮下植入施加中，没有引起任何与植入区域中皮下紧密结缔组织协调的炎性或化生变化。
因此，在皮下植入关节内/皮下/肌内注射纳米溶液的14天之后，确定其在植入区域被完全吸收而没有留下任何残余物，并且与周围组织融合并且没有引起任何炎性反应。
脂质体臭氧纳米溶液的肌内植入测试(TS EN ISO 10993-6:2016)：
进行了用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品的肌内植入测试，并且已经显示其不会在肌肉组织中引起任何变形或炎性作用。
测试方法的目的是确定组织响应的日期和过程，其包括在植入医学装置/生物材料之后的最终融合或再吸收/降解。特别地，对于可降解/可吸收材料，确定材料的降解特性和纹理响应。植入物应插入到成年小鼠、大鼠、豚鼠或兔的肌膜或臀区肌肉。植入样本应无菌地、且在植入前或植入期间没有任何损伤的情况下植入。对于每种材料和植入期，使用最少三只动物和足够的空间来获得总共10个测试样本和10个对照样本。当从单个植入部位采集多个组织样品时，组织学切片应至少相隔1cm。
在测试研究中，6只(3只雌性/3只雄性)体重为17至20g的BALB/c小鼠被用作对象。在测试期间，对象被保持在60％湿度和22℃恒温下的避光区域。给予对象正常的大鼠饲料和自来水。无尘蒸压刨花用作基板。在实验结束时，所有动物都被实施了安乐死。
将2ml关节内/皮下/肌内注射溶液注射到对象的右臀肌和左臀肌中。在注射之后14天，解剖来自用氯胺酮85mg/kg和甲苯噻嗪15mg/kg麻醉的对象的右腿和左腿的臀肌并进行显微镜检查。
经处理的动物在其日常行为和活动中没有表现出任何异常。在其运动和行走中没有观察到异常。它们在笼子里的饮食习惯和社会行为均是正常的。
在14天植入期结束时，在乙醚麻醉之后，对对象施加颈椎脱臼，并在后肢的臀肌中打开注射部位。宏观检查注射区域。未发现与关节内/皮下/肌内注射纳米溶液相关的残余物。另外，没有观察到由肌肉中炎症而引起的淋巴病灶形成。
当检查注射了脂质体臭氧纳米溶液的臀区时；宏观观察到肌肉结构具有正常的外观。在肌肉解剖期间观察到，在肌肉内没有不同的组织块或淋巴病灶。观察到注射到肌肉组织中的脂质体臭氧纳米溶液被组织完全吸收并且没有留下任何残余物。观察到在肌肉组织中注射脂质体臭氧纳米溶液没有引起组织中任何负面的结构变化。
在显微镜检查期间确定了用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液样品不会导致肌肉组织的任何退化或变形，并且不会导致肌肉中的淋巴细胞浸润。
脂质体臭氧纳米溶液产品的肌内植入测试根据TS EN ISO10993-6:2016文件中指定的方案和评价标准进行。关节内/皮下/肌内注射产品在2周的臀实验期结束时，在观察和评价中确定样品被完全吸收并且没有残余物留下。通过宏观和显微镜确定，该注射与肌肉组织相协调，并且没有引起肌肉结构的变形和炎性反应。
作为结果，确定了用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液产品的肌内植入施加不会对肌肉组织造成任何变形或炎性作用。
脂质体臭氧纳米溶液活检+组织病理学/苏木精伊红染色测试：
在用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品中，在对大鼠进行的实验研究中，对来自在实验结束时实施安乐死的2个月大的斯普拉格-唐尼品种(Sprague downey breed)的56只雌性大鼠的280份皮肤活检材料，对肺、肝和肾的组织进行显微镜检查，以便观察“局部皮下施加的愈合作用”。
将生理盐水10ppm、50ppm、100ppm、500ppm、1000ppm、5000ppm皮下施加于由56只动物组成的实验组，随后在第1、第2、第3、第4和第30天检查来自每组动物的背部区域的总共280份皮肤活检。对损伤进行评分，并获得组平均评分。
在检查的皮肤活检中；观察到在前4天的皮肤与表皮的比率(％)平均值中；在10ppm的剂量下为28.6，第30天为48.3；当其在50ppm的剂量下为29.4时，其在第30天为42.8；当其在100ppm的剂量下为28.6时，其在第30天为33；当其在500ppm的剂量下为30.1时，其在第30天为455.6；当其在1000ppm的剂量下为26时，其在第30天为31.7；当其在5000ppm的剂量下为34.1时，其在第30天为27.1。
前4天的血管形成数(按条计)平均值观察如下：当其在10ppm的剂量下为7时，其在第30天为8.57；当其在50ppm的剂量下为6.83时，其在第30天为6.83；当其在100ppm的剂量下为5.33时，其在第30天为3.83；当其在500ppm的剂量下为6.12时，其在第30天为6.25；当其在1000ppm的剂量下为4.84时，其在第30天为4.57；当其在5000ppm剂量下为5.12时，其在第30天为6.87。
前4天的毛囊(按数量计)平均值观察如下：当其在10ppm的剂量下为16.5时，其在第30天为31.25；当其在50ppm的剂量下为12时，其在第30天时为21.33；当其在100ppm的剂量下为25.17时，其在第30天为35.5；当其在500ppm的剂量下为24，其在第30天时为55.5；当其在1000ppm的剂量下为13.43时，其在第30天为32.28；当其在5000ppm的剂量下为24.75时，其在第30天为38.38。
一般而言，在全天和各组中均没有观察到皮肤中嗜中性粒细胞计数的提高。在肺、肝或肾中未发现病理学表现。
在用本发明的用于关节内/皮下/肌内注射的脂质体臭氧纳米溶液样品对大鼠进行的“从临床和组织病理学方面对注射到剖腹手术切口线中之后的创伤效应的研究”的实验研究中，对属于72只2个月大的斯普拉格-唐尼品种雌性大鼠的72份皮肤活检材料的组织进行显微镜检查。
在对产生切口的皮肤线上的伤唇的应用中，实验组中检查了72只动物的来自腹部的总共72份皮肤活检；生理盐水(FTS)、1％利多卡因、无臭氧纳米溶液、250ppm臭氧纳米溶液、500ppm臭氧纳米溶液、500ppm臭氧纳米溶液+2％利多卡因(50％共混物)、1000ppm臭氧纳米溶液+2％利多卡因(50％共混物)和2000ppm臭氧纳米溶液+2％利多卡因(50％共混物)。对损伤进行评分，并获得组平均评分。
显微镜检查结果：*在检查的皮肤活检中，3以外的评分值在下图表中给出。
*0：阴性，1：轻度。2.中度，3：重度
Figure BDA0004097383960000611
Figure BDA0004097383960000621
在本发明的关节内/皮下/肌内注射纳米溶液样品中，为了观察“局部皮下施加的全身作用”，作为6只白化实验兔安乐死的结果，在对兔进行的研究中进行了肺、肝、心肌和肾的组织以及外周血涂片的显微镜检查，并且结果如下所示。
宏观发现：在静脉内重复100ml含200ppm(6mg/kg)臭氧纳米溶液的血清10天之后，对动物实施安乐死。
显微镜发现：在同一动物的外周血涂片中、红细胞的膜结构和形态中，以及肺、肝、心肌和肾组织中均未发现病理学表现。
在用于关节内/皮下/肌内注射的本发明的脂质体臭氧纳米溶液样品中，对于“局部膝内注射的治愈作用的临床和组织病理学研究；使用透明质酸和纳米粒维生素注射的膝盖的比较”，在对大鼠进行的实验研究中，对64只2个月大的斯普拉格-唐尼品种的雌性大鼠的骨和软骨组织进行了显微镜检查，并在以下提供报告。
宏观发现：在先前用250微米塞眼手术刀对内侧髁进行缺损后，在第6周时的关节断离术导致膝关节插入，从8只动物的关节区域检查了透明质酸(HA)、500ppm关节内的、1000ppm关节内的、2000ppm关节内的、1000ppm+HA(1/2比例混合物)关节内的、2000ppm+HA(1/2比例混合物)关节内的、4000ppm+HA(1/2比例混合物)即总共64个组织的血清生理学。
Figure BDA0004097383960000631
显微镜发现：半定量地，使用Pineda等.(1992)*和Wakitani等.(1994)**的研究评分的修改形式。
-草药溶液的测试分析结果-
脂质体臭氧纳米溶液对于对杏干有害的乳果螨(L.)(Carpoglyphus lactis)(蜱 螨亚纲：果螨科(Carpoglyphidae))的生物活性影响的实验室测试；
乳果螨(L.)(无气门亚目(Astigmata)：果螨科)，是干果的重要螨类害虫，当其以杏干的果糖为食时，导致产品变质、释放令人不快的气味并最终失去其市场价值。先前的研究表明，由于臭氧气体对螨虫的毒性，臭氧气体可以用于干果的防治目的。然而，由于臭氧气体快速分解成O2和O-，其短暂的持久性限制了这种气体在螨防治中的使用。在本发明范围内进行的研究中，研究了本发明的脂质体臭氧纳米溶液对这种有害螨的生物活性。研究中评价了该制剂对螨虫的致死率[致死浓度(lethal concentration，LC)、致死时间(lethal time，LT)]、驱避剂和产卵抑制剂效果以及持久性。该研究表明，0.27％浓度的制剂在48小时内杀死了90％的雌性螨虫。根据概率单位分析的结果，在本发明的脂质体臭氧纳米溶液以0.1、0.2和0.4％的比率用于抗螨的情况下，致死时间(LT90)分别确定为121、81.5和66小时。持久性测试表明，在最初的7天期间，该制剂的致死作用没有显著的统计学变化。然而，在10天之后，检测到其致死作用下降了12％至17％。根据Pearson关于规避效应的卡方检验，从喷洒浓度高于0.1％制剂的杏中观察到乳酸乳球菌(C.lactis)雌性的强烈逃避。总之，本研究确定了确定剂量的本发明纳米溶液对乳酸乳球菌雌性具有毒性和驱避作用。由该研究表明，如果将杏干暴露于在此确定的剂量，则该制剂可用于防治乳酸乳球菌(其中制剂的持续性为10天)。
脂质体臭氧纳米溶液对细菌性冠瘿线虫(根结线虫属(Meloidogynesp.))毒性作 用的实验室测试：
用包含臭氧(1)、臭氧+乙酸(2)、臭氧+乙酸+百里酚(3)的三种不同样品研究了本发明的脂质体纳米溶液在植物保护领域中的用途，以便研究在农业中使用的可能性。在所进行的研究中已经讨论了在农业中引起作物损失并具有有限斗争手段的细菌性冠瘿线虫，测试了本发明的纳米溶液对细菌性冠瘿线虫(根结线虫属)的作用，并调查了是否有机会对抗这种害虫。纳米溶液在使用前储存在+4℃下。用作目标害虫的细菌性冠瘿线虫作为雌性个体是从Bursa Karacabey番茄田地中受感染植物根上的瘿中收集的。由于在土壤中自由移动并感染植物的时期是第二时期，所以从收集的雌性个体中获得第二时期幼虫，并对第二时期幼虫进行实验。然而，没有进行细菌性冠瘿线虫的种属鉴定，该细菌性冠瘿线虫以属(根结线虫属)表示。
将溶液在无菌蒸馏水中稀释以获得以下剂量：溶液#1:(2000ppm脂质体臭氧纳米溶液)50％、25％和12.5％，2溶液2和3：0.1％、0.2％、0.3％和0.4％。
将每种溶液以上述剂量(约为20ml)置于直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，并之后立即向每个培养皿添加约100(±10)只2期线虫幼虫。之后，将培养皿在涡旋中摇动1分钟并实现均质化。然后，盖上培养皿，并留在室温下孵育直到实验结束。作为对照组，线虫仅在无菌蒸馏水中保持特定的时间。
纳米溶液的效率(毒性)通过在6、12和24小时的每个溶液试验结束时计数死亡的线虫来确定。每个实验以3个重复进行。
溶液1，即其内容物中仅包含“臭氧”的纳米溶液，随着对线虫暴露时间的提高，其毒性作用趋于提高。然而，在12小时与24小时之间效力没有差异。在6小时之后并且以12.5％、25％的最低剂量检测到最低作用，确定在12和24小时之后其在50％剂量下对几乎所有线虫有效，即具有毒性作用。这3种结果表明溶液1在对抗根结线虫属方面具有有希望的作用。
溶液2，即包含“臭氧+乙酸”的纳米溶液，随着对线虫暴露时间的提高，其毒性作用趋于提高。然而，在12小时与24小时之间效力没有差异。虽然在6小时之后以0.1％的最低剂量、以35％的比率检测到最低作用，但确定其在12小时和24小时之后以0.3％和0.4％的剂量对几乎所有线虫具有毒性作用。该结果表明溶液2在对抗根结线虫方面具有有希望的作用。
溶液3，即包含“臭氧+乙酸+百里酚”的纳米溶液，随着对线虫暴露时间的提高，其毒性作用趋于提高。然而，在12小时与24小时之间效力没有差异。虽然在6小时之后以0.1％的最低剂量以42％的比率检测到最低作用，但确定其在12小时和24小时之后以0.3％和0.4％的剂量对几乎所有线虫具有毒性作用。该结果表明溶液3在对抗根结线虫方面具有有希望的作用。
因此，已显示具有3种不同成分的纳米溶液对细菌性冠瘿根结线虫属线虫具有提高的协同毒性作用。已证明，本发明的脂质体臭氧纳米溶液具有高的抑制有害线虫的潜力，特别是在温室中对抗该线虫中具有高的抑制有害线虫的潜力。
脂质体臭氧纳米溶液对二斑叶螨(二斑叶螨(Tetranychus Urticae)(Koch) (Scary：叶螨科(Tetranychidae))毒性作用的实验室测试：
在该测试中，将茄子(Pala品种)[茄子(Solanum melongena L)(茄科(Solanaceae))]植物的10周大的幼苗用作测试材料，所述茄子是受叶螨损害最大的植物物种。在27℃±1和60±5％相对湿度下，在具有人工照明(16小时光照：8小时黑暗)的无菌气候室中从种子长成幼苗。
实验中使用的二斑叶螨(二斑叶螨Koch)(蜱螨亚纲：叶螨科)个体是从8年前从Bursa采集的敏感种群中募集的，并在无农药的情况下连续生长。在受控条件下，使害虫的群体在相同的茄子幼苗上繁殖。
在这些测试中使用了本发明的脂质体臭氧纳米溶液。在第一个实验中使用了两种不同制剂(N和S)的两种不同(I和II)浓度。在第二个实验中，测试了组合制剂，其中将不同浓度的乙酸(S+AA)、橙油(S+P)、百里香油(S+K)或薰衣草油(S+L)混合至S编码制剂的I浓度。
使用手动喷雾器将相同体积的脂质体臭氧纳米溶液喷洒在茄子幼苗的叶上和叶下。作为对照组，只有一组用水喷洒。之后，将植物在实验室条件下保持30分钟以使施加到叶上的水和溶液干燥。借助刷子将5只成年雌性(根据为茄子确定的经济损害阈值)逐一放在每片叶上。每个实验以3个重复进行。将植物保持在27℃±1和60±5％相对湿度下，在具有人工照明(16小时光照：8小时黑暗)的无菌气候室中持续7天。在第三、第4和第7天结束时，在立体显微镜下逐一计数并记录叶螨的活体生物阶段(卵、幼虫和若虫、成虫)。
Abbott公式(Abbott，1925年)中包括了仅水对照组中在茄子中看到的存活叶螨的数量以及施加了不同制剂的茄子叶上存活个体的数量。
根据第三天在实验室条件下进行的测试的结果，浓度I和II的N制剂分别表现出如下毒性作用：对卵为80％和93％；对幼虫为100％和47％；对若虫为55％和0％，以及对成虫为46％和53％。相同浓度的S制剂分别表现出如下毒性作用：对卵为30％和93％；对幼虫为66％和94％；对若虫为0％和0％，以及对成虫为8％和69％。
根据第7天在实验室条件下进行的测试的结果，浓度I和II的N制剂分别显示出如下毒性作用：对卵为46％和73％；对幼虫为23％和60％；对若虫为68％和95％，以及对成虫为14％和71％。相同浓度的S制剂分别显示出如下毒性作用：对卵为5％和0％；对幼虫为0％和30％；对若虫为76％和19％，以及对成虫为15％和29％。
根据第3天在实验室条件下进行的测试的结果，其中单一制剂与百里香油(S+K)、薰衣草油(S+L)、橙油(S+P)和乙酸(S+AA)组合至1000mg/L的浓度的制剂分别显示出如下毒性作用：对卵为97％、99％、99％和100％；对幼虫为95％、100％、100％和100％；对若虫为0％，以及对成虫为100％、100％、100％和100％。
根据在实验室条件下对茄子植物的测试结果，在三天之后，本发明的脂质体臭氧纳米溶液以30％至93％和47％至100％的比率杀死二斑叶螨的卵和幼虫，以8％至69％的比率杀死成虫。由于若虫在前3天没有出现，故不考虑结果。随着若虫群体在测试的第7天自然增加，影响范围为19％至76％。因此，本发明的不同制剂和浓度对所有生物阶段的叶螨表现出不同程度的毒性作用。根据最佳结果，观察到对多至93％的卵、100％的幼虫、76％的若虫和69％的成虫具有致死性(毒性作用)。向制剂添加基于植物的油大大提高了对叶螨的毒性作用，并显示出协同作用。甚至与百里香、熏衣草、橙油或乙酸组合的最低浓度(浓度编号I)的本发明的纳米溶液在三天内对卵显示出97％至100％的毒性作用，对幼虫显示出95％至100％的毒性作用；对成虫显示出100％的毒性作用。由于这些混合物在3天内显示出快速效果，它们在不允许若虫形成的情况下导致了非常高的叶螨死亡率。作为结果，显示出对二斑叶螨的毒性(有毒)作用依赖于本发明的制剂和浓度。通过本研究证明了在农业植物产生阶段使用本发明的脂质体臭氧纳米溶液制剂作为植物保护产品的潜力。
脂质体臭氧纳米溶液对红蜘蛛的毒性作用的田间测试：
在5月1日，将
Figure BDA0004097383960000671
Biga地区的
Figure BDA0004097383960000672
村的4公顷土地(农民Halil
Figure BDA0004097383960000673
在此种植了番茄幼苗，其处于80至85天收获期的早期)划分成100平方米的地块，上表已以制备和施加的药物的剂量和混合物试验形式得出。
截至5月4日，对表中剂量和混合物形式的地块从幼苗期开始检查红蜘蛛、早期叶枯病。以10至12天的间隔对地块进行喷洒，并以10至11天的间隔通过添加针对花期的白粉病和坐果期之后的绿虫(green worm)的λ-氯氟氰菊酯进行对照。
在5月15日星期五进行的观察中，在幼苗期没有遇到红蜘蛛害虫、早期叶枯病、白粉病和绿虫。
在5月26日星期二进行的观察中，已经观察到，当药物A(33％臭氧乳化剂、34％臭氧油、33％乙酸)和药物B(30％臭氧乳化剂、30％臭氧油、30％乙酸、10％功能性油百里酚)以75至100ml的剂量使用时，地块中的红蜘蛛群体为每m2 2至3只，在以50ml的剂量施加的药物A和药物B地块中，每m2观察到7至8只活的红蜘蛛，并且这还是在低群体中发现的。早期叶枯病、白粉病、绿虫从苗期开始就没有遇到过。当检查绿色部分时，没有发现绿虫卵和幼虫。
在5月5日星期二进行的观察中，已经观察到，当药物A(33％臭氧乳化剂、34％臭氧油、33％乙酸)和药物B(30％臭氧乳化剂、30％臭氧油、30％乙酸、10％功能性油百里酚)以75至100ml的剂量使用时，地块中的红蜘蛛群体为每m2 4至5只，在以50ml的剂量使用的药物A和药物B地块中，每m2看到8至9只活的红蜘蛛，并且这还是在低群体中发现的。观察到，当与针对早期叶枯病和白粉病使用的其他药物相比时，药物A和药物B在地块中单独使用的所有剂量下都没有作用。当观察所有地块时，当检查绿色部分时，观察到有绿虫卵和幼虫主导的污染，平均每100株植物有1个。当针对绿虫有5％的污染时，将进行喷洒。
在6月16日星期二进行的观察中，观察到在持续有利的天气条件下，在以75至100ml剂量使用的药物A和药物B地块中红蜘蛛群体为每m2 4至5只活的红蜘蛛。确定了以50ml剂量施加的药物A和药物B地块中的红蜘蛛为每m2 9至10只。根据地块中的观察，当在单独使用药物A和B的所有剂量下与针对早期叶枯病和白粉病使用的其他药物相比时，再次观察到没有效果。检查了整个地块中植物的绿色部分，并到处都发现死的绿虫幼虫。在死的绿虫幼虫的药物A和药物B地块中，在50m的剂量下出现平均1％至2％的死亡，观察到在以75至100ml的剂量施加药物A和药物B的地块中的死亡率为3％至4％。观察到与单独使用的药物A和药物B相比，含有λ-氯氟氰菊酯的混合物在性能方面更好。
在6月26日星期五进行的观察中，观察到在持续有利的天气条件下，在以75至100ml剂量使用的药物A和药物B地块中红蜘蛛群体为每m2 3至4只活的红蜘蛛，确定了在以50ml剂量施加的药物A和药物B地块中的红蜘蛛为每m2 7至8只。作为检查绿色部分的结果，在100株植物中发现2只活的绿虫卵和幼虫。
Figure BDA0004097383960000681
Figure BDA0004097383960000691
内容物A：臭氧化油+臭氧化聚山梨酯80和乙酸B含臭氧化油+臭氧化聚山梨酯80+乙酸+百里香油。
作为在
Figure BDA0004097383960000692
Biga地区
Figure BDA0004097383960000693
村中农民Halil
Figure BDA0004097383960000694
的田地中进行的试验地块中的一般观察的结果，药物A和药物B显示出在红蜘蛛方面的性能为：在单独的50ml中为35％至40％，以及在75至100ml中7为0％至75％。观察到，在向药物A和药物B添加阿维菌素的情况下观察到的实验地块中，预期性能甚至更好。在试验地块中，确定了在所观察的日期之间，与所观察的其他药物相比，药物A和药物B针对早期叶枯病和白粉病没有效果。确定了在实验地块中使用的药物A和药物B针对绿虫在50ml中表现出10％至15％的成功，并且在75至100ml中表现出30％至35％的成功。观察到在向药物A和药物B中添加λ-氯氟氰菊酯的情况下观察到的实验地块中针对绿虫的性能更好。还观察到在表中的药物混合物中没有问题。
脂质体臭氧纳米溶液针对成年蜜蜂中蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微 孢子虫(Nosema cerenae)感染的效力研究：
蜜蜂微孢子虫和东方蜜蜂微孢子虫在成年蜜蜂(意大利蜜蜂)中引起微孢子虫病(nosemosis)，并且这些因子存在于成年蜜蜂的消化系统中。微孢子虫病是最常见的蜜蜂疾病之一，并在全世界造成重大的蜜蜂损失。这种疾病导致消化系统紊乱、蜜蜂平均寿命缩短、蜂群数量减少、蜂蜜产量减少、花粉采集减少以及严重的蜂群冬季损失。微孢子虫病可随着细菌、原生动物和病毒疾病而发展，这不利地影响蜂群健康、蜂产品和产量。直到今天，多种活性物质一直用于治疗微孢子虫病，其中最广泛使用的是烟曲霉素(商品名：Fumidil-B)。然而，这种活性成分现今被禁止，因为它在蜂蜜中造成了残留问题。为此，近年来已经进行了使用有机酸、天然植物提取物和类似物质的治疗试验。在本研究中，研究了精油例如细花牛至(Origanum minutiflorum)(百里酚)和中亚苦蒿(Artemisia absinthium)(苦艾(Wormwood))提取物以及脂质体臭氧纳米溶液针对微孢子虫病的效力。在施加本研究中创建的组合之前，对第0天进行计数，在田间试验中将用于喂养蜜蜂的糖浆给予对照组。在实验中，将这些组合与果子露(用于喂养蜜蜂)混合，并通过喷洒施加于在蜂箱内的果子露上或框架上。从蜂房的每个蜂箱中取出50个蜜蜂样品，并在开始实验之前给出方案编号。样品在冰箱中保存一天之后，应用消化法来控制就微孢子虫孢子而言的阳性和阴性。在该方法中，从每个蜂箱中取出10个蜜蜂样品，并借助于解剖刀将蜜蜂的腹部从其身体上分离下来。每腹部1ml，添加总共10ml蒸馏水。在合适的烧杯中压碎腹部，将一滴腹部液体转移至Neubauer Toma载片上，并在40×10放大率下研究微孢子虫孢子。为了通过上述消化方法确定阳性蜂箱中微孢子虫真菌的孢子载量，取20个蜜蜂样品，并在显微镜下计数微孢子虫物质。虽然每个组合的实验组都由一定数量的蜂箱形成，但注意到实验组之间的微孢子虫孢子数平均值接近相等。组合通过喷洒到蜂箱中或通过将组合置于蜂箱内的果子露中而经口施用。每隔一天从每个蜂箱收集20个蜜蜂样品，并通过消化法进行微孢子虫孢子计数。在5种不同的浓度和剂量下测试臭氧(脂质体臭氧纳米溶液)、百里酚和中亚苦蒿提取物及其组合。根据在这五个田间试验中发现最有效的三种组合的有效率；分别给予臭氧+百里酚(喷雾)：2000ppm 200ml臭氧+100ml3％百里酚+700ml糖浆89.47％、百里酚+艾(经口)：250ml2％百里酚+200ml 2％中亚苦蒿+550ml糖浆85.95％、臭氧(经口)：100ml 1000ppm臭氧+400ml糖浆75.08％。这一结果支持了先前用百里酚进行的研究，并且当该组合富含纳米粒臭氧时，发现该结果针对微孢子虫病更有效。施加没有引起死亡或副作用。
已经确定，臭氧在纳米载体系统中的抗氧化作用高于具有较大分子的油，并且在本发明范围内进行的生物相容性测试中，其在较低剂量下显示出其抗细菌作用，应当理解，臭氧化乳化剂在这些剂量下进行的细胞毒性测试中显示出毒性作用。因此，在本发明的一个不同的实施方案中，臭氧化的乳化剂用生物相容性材料包被。以这种方式，除了通过用油或含油乳化剂运输臭氧而产生的溶液以及通过添加物质例如油、酸、维生素和矿物质而多样化的溶液之外，可以获得提供高稳定性的新的纳米载体结构。
臭氧化乳化剂的包被对于降低活性臭氧的侵蚀性行为、提供缓慢释放、获得小粒径和符合灭菌方法是重要的。臭氧不能通过加热来灭菌，并且除了过滤没有其他灭菌方法。从这个意义上说，有必要实现适用于过滤的包衣并选择合适的包衣材料。
在本发明最基本的应用中，使用了至少一种乳化剂和臭氧。聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚山梨酯85可以单独或以组合用作乳化剂。在本发明的另一个实施方案中，可以通过向提及的臭氧化乳化剂添加水(混合或不混合)来制备剂量。
在本发明的一个优选实施方案中，臭氧化乳化剂用至少一种乳化剂和/或聚合物包被。臭氧化乳化剂和包被在臭氧化乳化剂上的乳化剂可优选为聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚山梨酯85或其组合。臭氧化乳化剂和包被在臭氧化乳化剂上的乳化剂可以是相同或不同的聚山梨酯。例如，用聚山梨酯80和臭氧获得的结构可以用聚山梨酯20包被。这种结构可包含水。根据应用的目的和领域，可以使用不同的聚合物作为聚合物。
不同的聚山梨酯可用于本发明，但不限于本文中提及的那些。聚山梨酯80在尾部包含不饱和脂肪酸。臭氧化的聚山梨酯80通过这种脂肪酸的臭氧化来形成。聚山梨酯85在其尾部携带3种不饱和脂肪酸。因此，可以装载更多的臭氧。
在本发明的另一个实施方案中，聚乙二醇(PEG)和甘油可以用作用于包被的生物相容性材料。臭氧乳化剂可以用单独的甘油、用单独的PEG或用甘油和PEG的组合来包被。用甘油和PEG包被臭氧化乳化剂减缓了快速抗氧化作用。用除PEG和/或甘油之外的聚合物包被臭氧化乳化剂有助于提高稳定性。纳米载体形式的臭氧化结构具有两年的稳定性，并已被发现保持其抗细菌活性。在本发明的范围内，用甘油和/或PEG包被臭氧化乳化剂提供了稳定性增强作用。然而，用甘露醇和/或葡聚糖包被也是可能的。用甘油和/或PEG包被的臭氧乳化剂在没有臭氧气化的情况下到达靶器官/组织，并在到达之后，可以去除所述包被并在组织中使用它。例如，在用于癌症治疗的情况下，癌症靶蛋白或其他癌症药物与臭氧乳化剂结合，并且这种新形成物用甘油和/或PEG包被。包被迅速溶解，并且靶蛋白与靶组织中的癌细胞结合。以这种方式，臭氧被溶解，并且癌细胞被分解。这适用于所有其他化学品。
臭氧化乳化剂的尺寸为约20纳米。小的包被的纳米脂质体通过简单地用PEG包被该分子而形成。通过用甘油包被来获得稍大的纳米脂质体。当向这些纳米脂质体中添加其他化学物质时，颗粒尺寸增大。在药物形成中重要的是在这些测量中产品保持在低于200纳米。包衣的量以及甘油和/或PEG的比例在预期用途和尺寸方面也是重要的。如果仅用少量的PEG进行包被，则颗粒生长最小。如果该比例提高或甘油量提高，则颗粒尺寸增大。
当臭氧化的聚山梨酯80首先用甘油包被，并随后用PEG包被时，当新的混合物与水混合时，获得13纳米的溶液。在测量中还看到一些没有添加至完全混合物中的甘油和PEG。其确保在不引起组织损伤的情况下将脂质体送至靶器官，并通过以这种形式使用它而具有较慢的效果。
为了提高臭氧乳化剂的有效性，可以将脂蛋白(其中一些是脂质结构)与表面活性剂结合，以便将它们送至适当的靶器官。脂蛋白偶联结构用甘油和PEG包被。类似地，磷脂、鞘脂、神经酰胺、蛋白脂质、糖脂、类异戊二烯、磷酸甘油酯、脂质和萜烯、矿物质、蛋白质、癌症靶蛋白、DMSO、乙酰半胱氨酸、透明质酸、薄荷醇、酸、醇、酶例如ogenase、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、链烷可以单独或以组合与臭氧乳化剂结合。
以下说明了可用于本发明的不同应用中的替代方案以及由它们提供的技术效果。获得的溶液的最小形式在文献中被称为类脂囊泡。这些是仅在较小形式的脂质体中用表面活性剂制成的最小脂质体结构。
在获得最小结构之后，本发明的目的是通过使用不同的组分来开发具有提高的稳定性和降低的毒性的产品。因此，在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含臭氧或非臭氧磷脂的结构用甘油和/或PEG包被。其尤其存在于鞘磷脂神经细胞中。这种结构的目的；当被给予身体时，它被用于制备神经细胞的选择性药物。所述结构附着于神经细胞，并具有用臭氧修复神经细胞的功能。以这种方式，可以在神经细胞的修复中发挥作用，例如在创伤愈合中使用臭氧。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含臭氧或非臭氧鞘脂的结构用甘油和/或PEG包被。以这种方式，获得了选择性黏附于同样是神经细胞靶器官的纳米脂质体。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含臭氧或非臭氧蛋白脂质的结构用甘油和/或PEG包被。以这种方式，获得了选择性黏附于神经细胞靶器官的纳米脂质体。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含具有或不具有臭氧的结构的糖脂用甘油和/或PEG包被。这种结构起到纳米脂质体的作用，其选择性地黏附于神经细胞的靶器官。脑苷脂、神经酰胺寡糖、硫苷脂、神经节苷脂可组合用于适合根据其靶器官使用的臭氧载体纳米脂质体。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含具有或不具有臭氧的脂蛋白的结构用甘油和/或PEG包被。纳米脂质体HDL胆固醇靶器官是肝，其通过组合脂质，例如胆固醇附着于靶器官。血液中循环的胆固醇最后到达肝。它与臭氧化乳化剂和HDL胆固醇组合用于治疗肝病和肝癌。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含类异戊二烯的结构用甘油和/或PEG包被。例如，可以给予维生素例如脂溶性维生素、维生素A的组合。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含臭氧或非臭氧磷酸甘油酯的结构用甘油和/或PEG包被。例如，可以给予磷脂酰乙醇胺(脑磷脂(kephalin)，脑磷脂)。脑磷脂是在脑中起作用的磷脂酸的酯。由于脑磷脂在作为靶器官的脑中含量丰富，因此其在臭氧的传递中起着积极的作用。卵磷脂是许多组织的主要成分。磷脂酰丝氨酸存在于血液凝固中；磷脂酰肌醇是胞内信使；磷脂酰甘油存在于心脏细胞中的心磷脂中；恶性磷脂存在于恶性细胞中。可以用这些脂质衍生物的组合进行靶器官治疗。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含矿物质的结构用甘油和/或PEG包被。获得由该组中形成的金属臭氧的组合而形成的纳米脂质体。在该组中形成的组合被再次导向靶器官。该组合在癌症治疗中通过使用镁打开通道来促进臭氧渗透到癌细胞中，以便打开细胞的钙通道。元素例如锌、铜、硫和银也提高了组合的抗细菌特性，并用于不同的靶器官。例如，在农业中，叶健康可以用作纳米脂质体来提高植物健康。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含DMSO的结构用甘油和/或PEG包被。DMSO在其组合使用下对癌细胞具有选择性。以这种方式，臭氧被输送至靶器官。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含臭氧或非臭氧植物油的结构用甘油和/或PEG包被。以这种方式，获得了为将臭氧输送至组织而形成的纳米脂质体和脂质体结构。
在本发明的另一个应用中，除了臭氧和乳化剂之外，包含萜烯的结构在有或没有臭氧的情况下用甘油和/或PEG包被。其用于形成从植物分泌的活性油的脂质体和纳米脂质体。萜烯的作用以及同时臭氧作为纳米脂质体的使用可能与它们的组合使用有关。
上述不同应用中的形式或这些形式的组合可用于本发明。抗氧化剂例如维生素、矿物质、葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、PLL和PEI聚合物、蛋白质、氨基酸、糖、甜味剂、醇、酸、薄荷醇、透明质酸、氨甲环酸、N乙酰半胱氨酸、抗癌药物的一种或更多种组合可添加至组合中。
在本发明的不同应用中，在用甘油包被臭氧乳化剂和油之后，可以通过添加薄荷醇和三氯蔗糖并最终用透明质酸包被来获得溶液。多种病毒(包括SARS Cov 2)都可以通过手(皮肤)来传播。然而，也有眼污染的可能性。因此，对眼和皮肤进行了生物相容性测试，确定了本发明范围内的溶液的抗细菌作用。在适合用作鼻喷剂的溶液中，除了臭氧乳化剂之外，锌也与透明质酸甘油一起用于脂质体中。
在本发明的不同应用中，将臭氧化或未臭氧化的磷脂、胆固醇、鞘脂、神经酰胺、蛋白脂质、糖脂、类异戊二烯、磷酸甘油酯、脂质和萜烯、矿物质、蛋白质、癌靶蛋白、二氧化硅、有机硅、DMSO、乙酰半胱氨酸、维生素、透明质酸、薄荷醇、酸、醇、酶例如胶原酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、烷烃、蛋白质、氨基酸、糖、甜味剂和/或氨甲环酸(tranemic acid)添加至臭氧乳化剂中，以形成主要结构。为了包被所述主要结构，包衣由甘油、甘露醇、葡聚糖和/或PEG和聚合物制成。
本发明有两个优选的主要应用。这些是注射制剂和喷雾制剂。胆固醇可以添加至注射制剂中的臭氧化聚山梨酯中。在该制剂中，单独或组合的聚山梨酯包衣和甘露醇、甘油、葡聚糖、PEG、透明质酸可被包被在其上。在喷雾制剂中，臭氧化的葵花油、甘油、薄荷醇、透明质酸和锌可添加至臭氧化聚山梨酯中。还可以对该制剂进行不同的变化。鼻喷剂和口喷剂包含所有提及的成分。然而，创伤喷剂和眼滴剂仅包含臭氧化聚山梨酯、甘油、透明质酸和锌。
本发明的使用领域和使用形式如下列出：
·在医学和兽医领域，其可以通过静脉内、动脉内、关节内、皮下、肌内、腹膜内、膀胱内、子宫内、直肠、吸入器、耳道、鼻道、经口途径、眼滴剂、体外受精和卵母细胞精子发育的方式使用，并可用于培养增强治疗。
·其可用于化学领域的消毒剂、抗细菌涂料、抗细菌织物、创伤敷料。
·其可用来提高燃料的性能。
·其可以在农业中用于植物健康增强、植物增强的消毒剂、杀虫剂、驱虫剂、种子改良和灌溉。
·其可以通过动脉内、关节内、皮下、肌内、腹膜内、膀胱、子宫内、直肠、耳道、鼻道、经口的方式用作牲畜消毒剂、皮肤保护剂，也可以用作眼滴剂。
·其可用于纺织物漂白和抗细菌织物。
·其可以用作汽油添加剂。
·其可用作食品原料、食品防腐剂和食品添加剂。
·其可以在化妆品中用作皮肤保养和毛发生长剂(hair developer)。
·产品可用于安瓿、小瓶、喷雾剂、面霜和溶液剂。
以下给出了确定在本发明范围内进行的研究中产生的三种不同溶液(Farmoxyn1、2和3)施加对莴苣和番茄植物的产量和品质的影响的测试结果。实验的目的是确定三种不同溶液(Farmoxyn 1、2和3)对植物产量和品质的影响，同时研究在农业中使用它们的可能性。在该实验中，研究了在地区广泛种植的莴苣和番茄植物的种植期间进行的命名为Farmoxyn 1、2和3的溶液剂施加是否与对照植株进行了比较，以及它们在产量和质量标准上是否有效。这项研究于2021年2月至2021年6月在Bursa
Figure BDA0004097383960000761
大学农学院、园艺系、应用和研究温室以及最终收获生理学实验室中进行。
1.材料
在这项研究中，2个不同的番茄品种(Nazl1F1和Atakan F1)和属于番茄(普通番茄(Lycopersicon esculentum L.))种的莴苣(Lactuca sativa)被用作植物材料。
2.方法
在试验中，使用了由Biopharma Pharmaceuticals Chemistry Health IndustryTrade.Ltd.制备的三种不同的溶液(Farmoxyn 1、2和3)。这些剂量分组如下：Farmoxyn 1(1)，0.2％；Farmoxyn 2(2)分组为0.2％，以及Farmoxyn 3(3)分组为10％。未经处理的幼苗被视为对照组。在施加其他处理的同时，对对照组植株施加水处理。
2.1臭氧施加
将番茄和莴苣幼苗在将要在温室里种植之前浸入到分组的溶液1(％0.2)中；2(％0.2)和3(％10)中。对番茄植株从种植到开始收获进行5次施加。另一方面，对叶莴苣植株进行了2次施加。在两个植物组中以15天的间隔继续施加。在番茄中制备为100mL(对每个品种，每个施加剂量)，在从坐果到收获的过程中，对于每次施加，施加200mL(每个品种，每个施加剂量)叶面喷洒。另一方面，在叶莴苣中，在每次施加中以叶面喷洒施加100mL(每次施加剂量)。
2.2.对番茄进行的分析和测量
分析和测量从开始收获时获取的样品的果实长度(cm)、果实直径(cm)、颜色测定、水溶性干物质(SSCM)、可滴定酸(titratable acid，TEA)和单株产量(kg)。
2.3.对叶莴苣进行的分析和测量
测量叶莴苣收获之后获取的样品的叶长、根长、可销售叶数、不可销售叶数、根长、根鲜重、根干重、叶鲜重、叶干重、叶比例水含量、颜色测定、叶绿素测定。
3.1.番茄结果
3.1.1.果实长度和直径
Nazl1品种的最佳结果是从1号施加中获得的，并且它与其他组具有统计学差异。
当评价Atakan品种的数据时，从施加组1和组2获得了就果实大小而言的最佳结果，并且它们在统计学上属于同一组。就果实直径而言，所有施加组都比对照组给出了更好的结果，并且在统计学上被包括在同一组中。
3.1.2.果实颜色的测定
当检查Nazl1F1和Atakan F1品种的亮度值时，施加组与其他组具有统计学差异，并且给出最佳结果的是1号施加。番茄果实的红色的强度是决定品质的最重要标准之一。当评价值时，与其他施加组相比，施加1和3中的Nazl1品种获得了更好的结果，并且确定了具有统计学差异。1号施加提供了Atakan品种的最佳结果。在此施加之后是施加组2和组3，并且两者都在同一统计学组中。Nazl1和Atakan品种二者的最低a值均从对照组中获得。当检查b值时，Nazl1品种的最低值是从1号施加中获得的。该值代表黄色。虽然对照组具有最高值，但是施加2和3落入到同一统计学组中，尽管从施加组1号获得了Atakan品种的最低数值，但是确定了不具有统计学差异。
3.1.3.WSDM量
从Nazl1品种中的1号施加中获得了统计学上不同且就WSDM(水溶性干物质)而言的最佳结果，Atakan品种中的施加组1和3给出了最佳结果，并进入同一统计学组。
3.1.4.TEA量
当根据品种评价TEA(可滴定酸)值时，确定了最佳结果出现在3号施加中，并且最低结果出现在1号施加中。Atakan品种间无统计学差异。3.1.5.单株产量(kg)
平均产量是通过除以每株植株的果实数量得到的。Nazl1品种的最佳结果从施加组1中获得，其中平均值为7.84kg，并确定了具有统计学差异。对照组和施加组2在同一统计学组中，并且确定了获得的产率低于从1号中获得的产率。在Atakan品种中，尽管1号施加显示为在数量上占优势，为6.68kg，但施加2在同一统计学组中，为6.48kg。对照组和3号施加组给出了低于1号和2号施加组的结果。
3.2.叶莴苣结果
3.2.1.叶和根长度
当比较所有施加组时，在叶和根长度方面给出最佳结果的施加组是1号，并且与其他组具有统计学差异。编号为2和3的施加包含在同一统计学组中。另一方面，对照组给出了最低的施加结果。
3.2.2.湿重和干重
考虑到所有重量参数，1号施加组与所有组具有统计学差异，并且获得了最佳结果。
3.2.3.可销售叶和非可销售叶的数量
在研究中给出最佳结果的施加是1(33.55单位)，并且与其他组具有统计学差异。考虑到非可销售叶的数量，从1号施加中再次获得最低结果(3.04单位)。因此，与其他施加组相比，1号施加中的可销售叶更多且不可销售叶更少。
3.2.4.叶比例水含量(％)
当检查LPWC(％)时，施加组1和3给出了最佳结果，并进入同一统计学组。2号施加和对照组包括在与1号和3号施加组不同的施加组中，并且从对照组获得最低结果。因此，观察到施加组1和3对胁迫条件更具抗性。
3.2.5.叶的总叶绿素(μmol/m2)量
当在研究中评价叶的叶绿素量的结果时，确定了最佳施加是1号，随后是2号、3号和对照组施加。
3.2.6.叶颜色
作为施加的结果，确定了就亮度而言的最佳施加是1号施加，并且发现具有统计学差异。在该研究中，确定了数值上的最佳结果是数值为-19.14的1号施加，然而，确定了它与3号施加在同一统计学组中。确定了这些处理组中的沙拉比其他处理组的更绿。考虑到b值，虽然1号施加给出了数值方面的最佳结果，但是除了对照组之外，它们全部都在同一统计学组中。
在最后一种情况下，将实验中包含的三种不同溶液施加于番茄和叶莴苣中的植株，并收获获得的植株，并检查它们的质量参数。在测量和分析之后，确定了0.2％浓度的Farmoxyn 1制剂对两种类型的蔬菜都有积极作用。

Claims (22)

1.脂质体臭氧纳米溶液，其包含臭氧化乳化剂。
2.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于，纳米溶液是选自以下的个体或组合：卵磷脂、溶血磷脂、聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺、普朗尼克、聚山梨酯或可药用乳化剂。
3.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含选自以下的个体或组合：蒸馏水、盐水、糖水、矿物质水、去离子水、去矿物质水、泉水、盐水溶液、生理盐水和厂用水。
4.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含选自以下的个体或组合：大豆油、矢车菊油、芝麻油、棕榈油、罂粟油、大豆卵磷脂、胆固醇、b-甾醇、甘油三酯、橄榄油、鱼油、葵花油、蓖麻油、藏花油、椰子油、甘油三酯衍生物、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯和石蜡、油酸乙酯、油酸甲酯。
5.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含选自不挥发油和/或植物精油的个体或组合。
6.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含选自以下的个体或组合：甲酸、磷酸、盐酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、草酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、苯酚、尿酸、牛磺酸、氨甲基膦酸。
7.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含选自以下的个体或组合：麻醉剂、药物、药物活性物质例如水和/或脂溶性维生素、矿物质、透明质酸、百里酚、薄荷醇、甘油、乙醇、鲸蜡醇、丁醇、苄醇、氨基酸、乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、草本提取物、利多卡因、赛罗卡因。
8.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含100储备ppm至60 000储备ppm臭氧气体。
9.根据权利要求8所述的纳米溶液，其特征在于，根据应用领域包含剂量为1ppm、200ppm、500ppm、1000ppm、1600ppm、2000ppm、3000ppm的稳定活性臭氧气体。
10.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含尺寸小于1000nm、优选小于200nm、更优选小于50nm的脂质体臭氧纳米粒。
11.根据前述权利要求中任一项所述的脂质体臭氧纳米溶液的产生方法，其特征在于包括以下过程步骤：
·出于应用目的选择合适的乳化剂和/或载体油，
·称量所述乳化剂和/或载体油，
·通过使臭氧气体或纳米气泡臭氧化水经过乳化剂和/或载体油来对其进行臭氧化，
·再次称量臭氧化乳化剂和/或载体油，并确定臭氧含量，
·将臭氧化乳化剂和/或载体油降低至纳米尺寸，
·优选地将选自至少一种赋形剂、至少一种功能性油、至少一种有机酸的组分添加到纳米溶液中并混合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的脂质体臭氧纳米溶液在人、兽医、食品、农业和化学领域中的产品制剂中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述脂质体臭氧纳米溶液用于人和兽医应用的抗病毒、抗真菌和抗细菌有效制剂中，用于皮肤屏障形成或关节内/皮下/肌内注射。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，针对乳果螨(Carpoglyphus lactis)(L.)害虫的制剂用于干燥食品中。
15.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，细菌性冠瘿线虫制剂用于农业中。
16.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，抗二斑叶螨制剂用于农业中。
17.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，针对微孢子虫感染的制剂用于养蜂业中。
18.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含至少一种乳化剂、臭氧和水。
19.根据权利要求1所述的纳米溶液，其特征在于包含：
·一种或多种臭氧乳化剂，
·覆盖所述臭氧乳化剂的至少一种含乳化剂和/或聚合物的包衣。
20.根据权利要求19所述的纳米溶液，其特征在于包含选自聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚山梨酯85的个体或组合作为乳化剂。
21.根据权利要求18所述的纳米溶液，其特征在于包含甘油、甘露醇、葡聚糖和/或PEG包衣。
22.根据权利要求18所述的纳米溶液，其特征在于包含：
·一种或更多种臭氧乳化剂，
·臭氧化或未臭氧化的磷脂、胆固醇、鞘脂、神经酰胺、蛋白脂质、糖脂、类异戊二烯、磷酸甘油酯、脂质和萜烯、矿物质、蛋白质、癌靶蛋白、二氧化硅、有机硅、DMSO、乙酰半胱氨酸、维生素、透明质酸、薄荷醇、酸、醇、酶例如胶原酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、烷烃、蛋白质、氨基酸、糖、甜味剂和/或氨甲环酸，以通过将其添加至所述臭氧乳化剂来形成主要结构，
·用于包被所述主要结构的甘油、甘露醇、葡聚糖和/或PEG和聚合物的包衣。
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