CN116024235A - 一种用于预防蜱虫病的mRNA疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于预防蜱虫病的mRNA疫苗及其制备方法与应用，涉及核酸疫苗技术领域。本发明的mRNA分子至少含有编码SFTSV病毒的抗原性多肽、免疫原性片段或变体的序列，所述抗原性多肽、免疫原性片段或变体包括SFTSV包膜表面糖蛋白Gn或蛋白的片段。本发明提供的mRNA分子递送至体内后能够在机体内表达Gn蛋白或Gn蛋白的一个片段，有效触发机体的免疫反应，可用于制备预防蜱虫病的mRNA疫苗。

Description

一种用于预防蜱虫病的mRNA疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及核酸疫苗技术领域，尤其是涉及一种用于预防蜱虫病的mRNA疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

蜱虫病又名发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome，SFTS)是主要通过蜱虫叮咬传播的新发传染病。该病临床症状以发热、血小板减小、胃肠道症状以及多功能脏器损害等为主，致死率高达10％。2010年，蜱虫病的病原体从患者血清样品和流行地区的蜱虫中分离获得，被命名为“发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒”(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)。SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的新型病毒，布尼亚病毒是一种具有包膜的单股负链RNA病毒，具有三个RNA片段。SFTSV基因组由L片段(6368nt)、M片段(3378nt)、S片段(1744nt)组成。SFTSV基因组的M片段编码包膜蛋白Gn(Glycoprotein N)和Gc(Glycoprotein C)，在病毒侵入宿主细胞的过程中起重要作用。研究显示SFTSV的Gn蛋白在病毒表面以二聚体形式存在，在病毒侵入宿主细胞过程中起识别受体的作用。Gn蛋白是I型跨膜蛋白，全长476aa，N端的膜外域负责结合细胞表面受体，C端跨膜螺旋固定在病毒膜上。膜外域可分为头部结构域和柄状结构域。

mRNA疫苗是通过将编码目的抗原的mRNA接种到体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答的新型疫苗。mRNA疫苗创新性地利用动物本身细胞产生抗原，且本身具有佐剂的效果，因此能够激活固有免疫和特异性免疫，增强免疫效果。由于其仅在细胞质进行翻译，并不进入细胞核，mRNA相较于其他创新型疫苗(如DNA疫苗、病毒载体疫苗)具有更高的安全性。此外，mRNA疫苗通过大肠杆菌表达纯化质粒，体外转录生产mRNA，不涉及动物源成分可能造成的污染，纯化方式也简单并且具有通用性。

研究并开发用于预防蜱虫病的mRNA疫苗，对于蜱虫病的防控具有积极的意义。然而，目前尚未有上市的蜱虫病疫苗。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于预防蜱虫病的mRNA疫苗及其制备方法与应用。本发明提供的mRNA分子递送至体内后能够在机体内表达Gn蛋白或Gn蛋白的一个片段，有效触发机体的免疫反应，可用于制备预防蜱虫病的mRNA疫苗。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种mRNA分子，所述mRNA分子至少含有编码SFTSV病毒的抗原性多肽、免疫原性片段或变体的序列，所述抗原性多肽、免疫原性片段或变体包括SFTSV包膜表面糖蛋白Gn或蛋白的片段；

所述抗原性多肽或免疫原性片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或与SEQ IDNo.1所示氨基酸序列具有至少90％以上的同一性且功能相同的序列。

本发明的mRNA编码发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever withthrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)主要抗原Gn蛋白或Gn蛋白的一个片段(例如蛋白的受体结合结构域)。

具体地，SEQ ID No.1所示的为Gn蛋白全长氨基酸序列。所述抗原性多肽或免疫原性片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示氨基酸序列具有例如但不限于90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。Gn蛋白的片段可以为但不限于为蛋白的亚基、功能区域或提供稳定抗原功能的片段。本发明mRNA递送至体内后能够在机体内表达Gn蛋白或Gn蛋白的一个片段，有效触发机体对SFTSV病毒的免疫反应。

在一个实施方案中，所述mRNA分子编码区对应的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，或与SEQ ID No.3所示核苷酸序列具有至少90％以上的同一性且功能相同的序列。本发明不仅涉及所述mRNA分子，还保护编码所述mRNA的DNA分子。

具体地，所述mRNA分子编码区对应的核苷酸序列与SEQ ID No.3所示核苷酸序列具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。

在本发明中，对于所述SFTSV病毒的抗原性多肽编码序列进行了密码子优化，优化后的的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明将编码Gn蛋白抗原性多肽或其免疫原性片段序列的开放阅读框(ORF)进行了密码子优化，所得到的特异性DNA分子可用于转录制备mRNA疫苗，引起人体或其他动物(优选地，所述动物为哺乳动物，例如小鼠或大鼠)对SFTSV病毒的免疫应答。通过优化编码蛋白的mRNA序列，能够实现取得更换的免疫原性和稳定性，提升了转染效率。

在一个实施方案中，本发明还涵盖与SEQ ID No.3所示核酸分子或其编码蛋白相关的生物材料，例如所述生物材料包括但不限于以下任一种：

(a)SEQ ID No.3所示核酸分子或其变体；

(b)含有SEQ ID No.3所述核酸分子的表达盒；

(c)含有SEQ ID No.3所述核酸分子的重组载体，或含有所述表达盒的重组载体；

(d)含有SEQ ID No.3所述核酸分子的重组质粒，或含有所述表达盒的重组质粒；

(e)含有SEQ ID No.3所述核酸分子的重组微生物，或含有所述表达盒的重组微生物，或含有所述重组载体的重组微生物。

在一个实施方案中，所述mRNA分子还包括5’-帽结构、3’-端聚腺苷酸序列(PolyA)、5’-UTR和3’-UTR中的至少一种。所述mRNA按照从5’到3’的方向可以依次包括：5’-帽结构、5’UTR序列、编码的所述Gn蛋白的序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。

在一个实施方案中，所述5’-帽结构包括_m7G(5)_ppp(5)(2’OMeA)_pG、_m7G(5)_ppp(5)(2’OMeG)_pG、_m7(3’OMeG)(5’)_ppp(5’)(2’OMeG)_pG或_m7(3’OMeG)(5’)_ppp(5’)(2’OMeA)_pG中的一种；更优选的，所述5’-帽结构为_m7G(5’)_ppp(5’)(2’OMeA)_pG。

在一个实施方案中，所述5’UTR元件选取人α珠蛋白(humanα-globin)mRNA的5’UTR，并且将起始密码子ATG的原始背景序列(ACCATG)替换为Kozak保守序列(GCCACCATG)，序列如SEQ ID No.4所示序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体；

在一个实施方案中，所述3’UTR元件选自人血红蛋白亚基α1(HBA1)的mRNA 3’UTR，如SEQ ID No.5所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体。

在一个实施方案中，所述3’-端聚腺苷酸序列包含约25至约200个腺苷酸的序列，优选75至150个腺苷酸的序列；例如约80个核苷酸，约90个核苷酸，约100个核苷酸，约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸或约150个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly A尾的长度可以为约120个核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述3’-端聚腺苷酸序列中间含有2段间隔序列GCAUAU将整个聚腺苷酸序列分成3段；更优选的，所述3’-端聚腺苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在一个实施方案中，所述mRNA分子包含至少一种化学修饰核苷酸，所述化学修饰核苷酸选自假尿嘧啶、N1-甲基尿嘧啶。

在一个优选的实施方案中，所述mRNA分子中的尿嘧啶全部为N1-甲基尿嘧啶。

在本发明的优选方案中，所述mRNA的编码区核苷酸序列中的尿嘧啶经过化学修饰，优选为N1-甲基假尿嘧啶修饰。修饰的核苷酸位于编码区、5’-UTR区、3’-UTR区和帽子区中至少一种。5’端非翻译区(5’-UTR)、3’端非编码区(3’-UTR)和多聚腺苷酸(polyA)使得最终合成的mRNA保持完整结构，有利于其稳定性，延长其半衰期并提高mRNA的表达能力。

在另一个方面，本发明提供了一种预防蜱虫病的mRNA疫苗，所述疫苗包括前述的mRNA分子以及药学上可接受的递送载体；优选地，所述递送载体包括脂质纳米颗粒，优选为阳离子脂质纳米颗粒。

在一个实施方案中，所述阳离子脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰脂质、胆固醇和/或中性脂质；

优选地，所述阳离子脂质选自以下一种或多种：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、(4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯、十七烷-9-基-8-(2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)(SM-102)；

所述PEG修饰脂质为PEG2000-DMG；

所述中性脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

在一个实施方案中，所述阳离子脂质纳米颗粒中，所述阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰脂质的摩尔百分比分别为4～60％、5～20％、30～50％和1～5％。

在一个实施方案中，所述阳离子脂质纳米颗粒中，所述阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰脂质的摩尔比为48：10：40.5：1.5。

在一个实施方案中，包括以下步骤：由线性化质粒转录制备mRNA，将所述mRNA与所述递送载体包封为纳米颗粒；

优选地，所述mRNA与所述递送载体的质量比为0.1：1～0.5：1；

更优选地，使用微流控技术或碰撞混合技术进行所述包封。

在本发明中，微流控技术或碰撞混合技术为本领域常规技术，可参考本领域常见方法进行操作，本发明不作具体限定。

在一个实施方案中，包括使用线性化质粒如pcDNA3.1载体作为mRNA转录模板制备mRNA。

在一个优选实施方案中，在一个实施方案中，在mRNA转录合成中引入化学改性的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，纳米颗粒的平均直径为50-200nm。

在一个实施方案中，包封过程中使用的水相为mRNA，浓度50-100μg/mL，乙醇相为脂质混合液，水相和乙醇相的体积比为1:1，mRNA与脂质的质量比为0.1：1至0.5：1。

在一个实施方案中，所述脂质米颗粒溶解于缓冲液中，所述缓冲液包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种。其中优选Tris缓冲液。在一个优选的方案中，所述缓冲液中含有蔗糖作为冷冻保护剂。

在一个实施方案中，制备mRNA的步骤包括：

(a)合成抗原表达基因的目的DNA片段，利用体外转录试剂盒进行转录；优选地，替换修饰性核苷酸；

(b)利用DNA酶消化以去除反应中DNA，纯化RNA，去除RNA中的蛋白和盐等杂质；

(c)分别进行加帽和加尾，获得相应的mRNA；优选地，加帽和加尾可以使用商品化的试剂盒进行；

优选地；在步骤(a)中将表达基因克隆到质粒载体中获得重组质粒以制备mRNA。包括目的基因片段的获得、重组质粒的构建、重组质粒线性化酶切及回收、转录获得mRNA并mRNA包装。

在一个实施方案中，mRNA质粒模板是以pUC3.1载体为基础改造获得，按照5’到3’顺序依次包括：T7启动子、5’UTR序列、编码Gn蛋白全长或部分片段的ORF、3’UTR序列、多聚腺苷酸序列和线性化酶切位点。

在一个实施方案中，改造的质粒由大肠发酵，经碱裂解提取质粒，多步层析制备得到纯化质粒。质粒经酶切回收得到线性化片段，经体外转录生成mRNA。mRNA经进一步纯化得到mRNA原液。

在一个实施方案中，包封得到mRNA-LNP经超滤去除乙醇并置换到缓冲液中。

在一个优选的方案中，还包括将获得的mRNA转染至293T细胞中，通过Western-Blot检测蛋白表达，分析mRNA表达蛋白的水平，未转染的细胞作为阴性对照。

在一个实施方案中，所述制备方法包括按比例将所述阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰脂质溶于有机溶剂中，将mRNA溶于无机溶剂(例如水)中，将得到的有机溶剂和无机溶剂混合，得到用于蜱虫病的核酸疫苗。

在一个实施中，所述有机溶剂为乙醇，利用乙醇溶解所述阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰脂质，并将其按比例混合，制备脂质混合物。

在一个实施方案中，将脂质体混合物与mRNA(如溶解在柠檬酸缓冲液中)加入TRIS缓冲液，充分混匀，合成LNP/mRNA疫苗颗粒，制得疫苗，将LNP/mRNA疫苗颗粒在TRIS缓冲液溶液中透析，浓缩、过滤得到疫苗。

在一个实施方案中，所述疫苗还包括佐剂；所述佐剂包括药学上可接受的用于提高免疫刺激的核酸、蛋白和小分子化合物中的至少一种。

一个实施方案中，所述mRNA疫苗为液体制剂或冻干粉剂。

一个实施方案中，所述mRNA疫苗为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂或吸入制剂，优选为肌肉注射制剂。

在另一个方面，本发明提供了所述mRNA分子或所述的疫苗在制备治疗或预防蜱虫病或预防SFTSV病毒感染的药物中的应用。

本发明还提供了预防和/或治疗受试者中与SFTSV感染相关的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的mRNA、疫苗或含有其的组合物。

在本发明中，“预防”是指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。“治疗”是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

有益效果：

本发明提供的mRNA为经过密码子优化的mRNA，其可编码SFTSV病毒的Gn蛋白。经优化，使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。

用该mRNA分子制备的预防蜱虫病mRNA疫苗的制剂组分简单，热稳定性好，给药后，可检测到高水平蛋白表达，免疫小鼠后可产生针对SFTSV病毒的特异性免疫应答。

本发明提供的预防蜱虫病mRNA疫苗安全性好，无明显毒性，可用于治疗或预防SFTSV病毒感染。

本发明疫苗制备方法简单，可以大规模进行生产，降低了生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的mRNA转染293T细胞后检测Gn表达的Western blot图；

图2为本发明实施例提供的mRNA疫苗免疫BALB/c小鼠血清抗原特异性抗体滴度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：mRNA的体外合成、加帽与纯化

(1)体外转录模板的制备：

设计好的序列(SEQ ID No.7或SEQ ID No.8，其中SEQ ID No.8包含5’UTR-SEQ IDNO.3Gn蛋白优化编码序列-终止密码子-3’UTR-PolyA的全长DNA序列)由基因合成公司合成至质粒模板，质粒模板通过转化感受态细胞、克隆筛选得到菌种，菌种放大培养、经碱裂解法提取模板DNA，通过限制性内切酶酶切回收线性化质粒。

(2)体外转录体系配制：

线性化DNA模板2μL(1μg)，T7转录酶2μL，10×转录Buffer 2μL，NTPs mix 6μL，10mM DTT 2μL，RNase抑制剂0.5μL，RNase Free Water 5.5μL，共计20μL。

(3)体外转录程序：

37℃孵育3小时，反应结束后，在体系中加入1μL DNase I，37℃孵育15min，以消化DNA模板。

(4)mRNA纯化：

20μL体积加入30μL LiCl沉淀溶液(7.5M)和30μL RNase free Water，混匀后放入-20℃45min；12000rpm离心15min，去上清，收集沉淀；用预冷的70％的乙醇洗3次；用RNase free Water复溶。

(5)mRNA的加帽：

取50μg RNA用RNase free Water稀释至67μL，65℃加热10min，结束后冰上放置5min；加入10×加帽Buffer 10μL，10mM GTP 10μL，20mM SAM 2.5μL，RNA酶抑制剂2.5μL，牛痘病毒加帽酶4μL，2’-O-核糖甲基转移酶4μL，37℃反应45min。

(6)mRNA纯化：

20μL体积加入30μL LiCl沉淀溶液(7.5M)和30μL RNase free Water；混匀后放入-20℃45min；12000rpm离心15min，去上清，收集沉淀；用预冷的70％的乙醇洗3次；用RNase free Water复溶后检测，备用。

SEQ ID No.7包含5’UTR-SEQ ID NO.2Gn蛋白天然编码序列-终止密码子-3’UTR-PolyA的全长DNA序列：GAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGATGAAAGTCATCTGGTTCTCCTCTCTGATCTGCTTAGTCATTCAATGCGGTGGGGACACGGGCCCAATCATTTGCGCAGGACCCATCCACTCAAACAAGAGTGCTGACATACCCCACCTGCTTGGCTACTCTGAGAAGATTTGTCAGATAGATCGGCTGATACATGTTTCGTCTTGGCTTAGAAACCACTCACAATTTCAGGGCTACGTAGGGCAGCGAGGTGGACGCTCTCAGGTGAGCTACTACCCAGCTGAAAATTCTTACTCAAGGTGGAGTGGGCTTCTAAGCCCCTGTGATGCTGATTGGCTTGGGATGCTTGTCGTGAAGAAGGCCAAGGGGTCTGATATGATAGTTCCTGGGCCTTCATACAAGGGGAAAGTCTTTTTTGAACGGCCAACTTTTGATGGATACGTAGGCTGGGGCTGTGGTAGTGGGAAGTCTAGGACTGAGTCAGGTGAGCTCTGCAGTTCAGACTCCGGGACTAGTTCTGGTCTTCTGCCCTCGGATAGGGTTCTCTGGATAGGTGATGTTGCTTGTCAGCCAATGACACCCATCCCTGAGGAGACATTTCTGGAGCTGAAGAGCTTTAGCCAAAGTGAATTCCCAGACATATGCAAAATTGATGGCATTGTGTTCAACCAGTGTGAGGGTGAGAGTCTACCCCAGCCCTTTGATGTTGCATGGATGGATGTTGGCCACTCTCATAAAATCATCATGAGGGAGCACAAGACCAAATGGGTACAAGAGAGCTCATCCAAGGATTTTGTGTGCTATAAGGAAGGGACTGGGCCGTGTTCTGAATCAGAAGAAAAGGCTTGCAAGGCCAGTGGATCATGCAGGGGGGACATGCAGTTTTGCAAGGTGGCAGGTTGTGAACATGGGGAAGAGGCATCTGAAGCCAAGTGTAGATGCTCACTTGTGCACAAGCCAGGGGAAGTCGTTGTGTCATATGGAGGGATGCGTGTCAGACCAAAGTGCTATGGTTTCTCCAGAATGATGGCAACACTGGAGGTGAGCCAGCCAGAGCAAAGGATTGGTCAATGCACTGGCTGCCATCTAGAATGCATAAATGGGGGTGTGAGGCTGATCACTCTAACCAGTGAGCTCAAGTCAGCTACTGTCTGCGCTTCTCACTTTTGCAGTTCTGCCACAAGTGGTAAGAAAAGCACGGAGATTCAATTCCACTCAGGATCATTGGTTGGAAAAACAGCAATCCACGTCAAAGGGGCATTGGTAGATGGAACTGAATTCACATTTGAGGGTAGTTGCATGTTCCCAGATGGTTGTGATGCAGTGGACTGCACATTCTGTCGTGAGTTTCTAAAAAATCCCCAGTGCTACCCTGCAAAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTGTCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTTATGCTGCTCACCAATGTTCTTAAGGCATAGTAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAA。

SEQ ID NO.8包含5’UTR-SEQ ID NO.3Gn蛋白优化编码序列-终止密码子-3’UTR-PolyA的全长DNA序列：GAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGATGAAGGTGATATGGTTTAGCACTCTTATCTGCTTTGTGATCCAGTGTTCGGGTGATTCGGGCCCGATCATCTGTGCGGGCCCGATTCACTCGAACAAGAGCGCCGACATTCCGCATCTTCTCGGATATTCCGAGAAGATCTGTCAGATCGACAGGCTCATTCACGTCTCGAGCTGGCTGCGCAACCACTCTCAGTTCCAGGGGTATGTCGGCCAGCGGGGTGGCAGGAGCCAAGTGAGCTACTACCCCGCCGAGAATTCCTATTCTCGGTGGAGTGGCTTACTTAGCCCCTGCGACGCCGACTGGCTTGGCATGCTCGTGGTTAAGAAGGCCAAGGGGAGCGATATGATCGTTCCCGGGCCTTCTTATAAGGGCAAGGTCTTCTTCGAGCGCCCCACATTCGACGGCTACGTCGGATGGGGGTGCGGTTCGGGGAAGAGCCGTACTGAGAGTGGTGAGCTGTGCAGCTCAGACTCGGGTACGTCGAGTGGCCTGTTGCCGTCTGACAGGGTCTTGTGGATCGGGGACGTCGCCTGTCAGCCGATGACTCCAATTCCGGAAGAGACCTTCCTGGAGTTGAAGTCATTCTCTCAGAGCGAGTTCCCCGACATCTGCAAGATCGACGGGATTGTCTTCAACCAGTGCGAGGGCGAGTCCCTTCCTCAGCCATTCGATGTCGCTTGGATGGACGTCGGGCACTCACACAAGATCATTATGCGGGAGCATAAGACTAAGTGGGTGCAAGAGAGTTCATCCAAGGACTTCGTGTGCTACAAGGAAGGGACTGGCCCTTGCAGTGAGTCTGAAGAGAAGACCTGTAAGACTTCGGGGTCTTGTCGCGGTGACATGCAATTCTGCAAGGTTGCAGGATGCGAGCACGGCGAGGAGGCCTCGGAGGCGAAGTGTCGGTGCTCTCTGGTCCATAAGCCGGGGGAAGTCGTAGTATCTTACGGGGGGATGCGGGTCCGCCCGAAGTGCTACGGCTTCCCCCGGATGATGGCCACGCTCGAGGTGAACCAGCCGGAGCAGCGCATCGGCCAATGCACCGGCTGTCACCTCGAGTGCATAAACGGTGGCGTTCGACTGATAACTCTGACCTCAGAGTTACGGTCGGCCACCGTTTGTGCGAGTCACTTCTGTAGCTCGGCGACTTCTGGCAAGAAGTCGACCGAGATACAGTTCCACTCTGGATCACTAGTAGGTAAGACTGCTATCCATGTCAAAGGAGCCCTTGTTGATGGCACGGAGTTTACATTTGAGGGTTCTTGTATGTTTCCCGACGGATGCGATGCAGTGGACTGCACGTTCTGTCGGGAATTCCTCAAGAACCCTCAGTGTTATCCGGCCAAGAAGTGGCTCCTTATCATCATCGTGATCCTGCTTGGATACGCGGGCCTTATGCTGTTGACAAACGTGCTTAAGGCCTAGTAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAA。

实施例2：LNP的制备

(1)脂质混合液的配制：

使用乙醇溶解四种脂质(阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇修饰磷脂)，将阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇修饰磷脂按摩尔比48：10：40.5：1.5比例配制。

(2)包封：

使用微流控技术进行包封mRNA浓度为100μg/mL(50mM醋酸钠缓冲溶液，pH4.0)，包装时，水相和乙醇相的总流速为20mL/min，水相和乙醇相体积比为1：1，mRNA与脂质的质量比为0.1：1。

(3)超滤换液：

使用超滤浓缩管将缓冲液置换成Tris缓冲液，pH7.5。置于4℃保存待用。

经测定，本实施例中得到的包封的mRNA浓度为0.2mg/mL，本实施例中得到的mRNA-LNP纳米颗粒的粒径大小在100nm左右。

实施例3：疫苗的抗原蛋白表达和免疫原性测定

(1)抗原表达检测：

将制得的mRNA-LNP加入到293细胞中，转染24小时后收集细胞提取蛋白，使用Gn蛋白抗体进行WB检测，结果如图1所示。

(2)免疫原性测定：

使用疫苗免疫BALB/c小鼠(雌性)，免疫方式为肌肉注射，剂量为5μg mRNA，注射位置为股直肌。将首次免疫日作为第1日。在首次免疫后的第3周(即第21日)进行加强免疫，各组的加强免疫方式及剂量均与首次免疫时相同。然后在第28日从小鼠尾部取血。按常规方法从血中分离血清56℃灭活30分钟后保存于-80℃待用。通过中和法检测小鼠体内所产生抗体效价，结果如图2所示。

实验结果显示，含有Gn蛋白的mRNA的疫苗能够使小鼠体内产生较好的抗体。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子至少含有编码SFTSV病毒的抗原性多肽、免疫原性片段或变体的序列，所述抗原性多肽、免疫原性片段或变体包括SFTSV包膜表面糖蛋白Gn或Gn蛋白的部分片段；

所述抗原性多肽或免疫原性片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或与SEQ ID No.1所示氨基酸序列具有至少90％以上的同源性且功能相同的序列。

2.根据权利要求1所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子编码区对应的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，或与SEQ ID No.3所示核苷酸序列具有至少90％以上的同源性且功能相同的序列。

3.根据权利要求2所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子还包括5'-帽结构、3’-端聚腺苷酸序列、5’-UTR和3’-UTR中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的mRNA分子，其特征在于，所述5’-帽结构包括_m7G(5)_ppp(5)(2’OMeA)_pG、_m7G(5)_ppp(5)(2’OMeG)_pG、_m7(3’OMeG)(5’)_ppp(5’)(2’OMeG)_pG或_m7(3’OMeG)(5’)_ppp(5’)(2’OMeA)_pG中的一种；更优选的，所述5’-帽结构为_m7G(5’)_ppp(5’)(2’OMeA)_pG；

进一步地，所述5’UTR元件选自SEQ ID No.4所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体；

进一步地，所述3’UTR元件选自SEQ ID No.5所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体；

进一步地，所述3’-端聚腺苷酸序列包含约25至约200个腺苷酸的序列，优选75至150个腺苷酸的序列；更优选的，所述3’-端聚腺苷酸序列中间含有2段间隔序列GCAUAU将整个聚腺苷酸序列分成3段；更优选的，所述3’-端聚腺苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求3所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子包含至少一种化学修饰核苷酸，所述化学修饰核苷酸选自假尿嘧啶、N1-甲基尿嘧啶，优选为N1-甲基尿嘧啶。

6.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1-5中任一项所述的mRNA分子以及药学上可接受的递送载体；优选地，所述递送载体包括脂质纳米颗粒，优选为阳离子脂质纳米颗粒。

7.根据权利要求6所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰脂质、胆固醇和/或中性脂质；

优选地，所述阳离子脂质选自以下一种或多种：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环、(4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯、十七烷-9-基-8-(2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)；

所述PEG修饰脂质为PEG2000-DMG；

所述中性脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒中，所述阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰脂质的摩尔百分比为：4～60％：5～20％：30～50％：1～5％。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：由线性化质粒转录制备mRNA，将所述mRNA与所述递送载体包封为纳米颗粒；

优选地，所述mRNA与所述递送载体的质量比为0.1：1～0.5：1；

更优选地，使用微流控技术或碰撞混合技术进行所述包封。

10.权利要求1-5中任一项所述的mRNA分子或权利要求6-8中任一项所述的mRNA疫苗在制备治疗或预防蜱虫病或预防SFTSV病毒感染的药物中的应用。

Images