CN116024227B - 茶树CsMYB206基因以及在调控茶叶咖啡碱合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茶树CsMYB206基因以及在调控茶叶咖啡碱合成中的应用，其中CsMYB206基因的核苷酸序列如序列表中Seq_1所示；CsMYB206基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中Seq_2所示。CsMYB206的表达模式与茶树叶片中咖啡碱合成显著负相关，通过反义寡核苷酸技术抑制CsMYB206的表达，使茶树叶片中咖啡碱含量显著升高，咖啡碱合成相关基因表达也显著升高，启动子结合实验表明CsMYB206能与咖啡碱合成酶基因TCS1启动子互作，启动子激活/抑制实验说明CsMYB206能显著抑制咖啡碱合成酶基因TCS1的启动子活性。该基因的克隆将不仅有利于解析茶树叶片咖啡碱合成的精细调控机制，而且有助于培育低咖啡碱含量的茶树品种，提高茶叶品质，具有很大的应用价值。

Description

茶树CsMYB206基因以及在调控茶叶咖啡碱合成中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及茶树CsMYB206基因以及在调控茶叶咖啡碱合成中的应用。

背景技术

嘌呤类生物碱是一类广泛存在自然界中、含有嘌呤环结构的杂环类化合物。植物中该类化合物一般来源于嘌呤核苷酸代谢途径，对植物的生殖生长和对外部环境响应都具有重要作用。此外，生物碱类化合物一般都具有抑菌活性，具有丰富的营养价值和药理价值，已有多种生物碱类化合物被开发为食品和药物添加剂。咖啡碱是世界上消费量最大的一类嘌呤生物碱化合物，广泛被应用于饮料加工、神经临床药物等方面。世界上至少有100种植物含有咖啡碱，含量较高的植物有茶(2％-5％)、咖啡(1％-2％)、可可(0.03％)等。咖啡碱被誉为现代软饮料文化的灵魂，世界三大无酒精饮料茶、咖啡和可可的流行均得益于咖啡碱的存在。

咖啡碱最早被认为是一种化感物质，能够分泌到土壤中扰乱相邻植物种子的萌发。在多种生态互作中，咖啡碱都可以为植物本身提供防御作用。多种鳞翅目昆虫取食咖啡碱处理过后的叶片，会导致其产卵数量及幼卵成活率显著下降；咖啡碱能够刺激植食动物加速移动，从而减少叶片损害；外源咖啡碱对多种细菌、真菌以及昆虫等都具有显著抑制生长的作用；茶树中咖啡碱合成受到炭疽菌侵染的显著诱导，表现出强于多酚类化合物的炭疽病菌抑制活性。此外，在茶树群体水平上，抗虫茶树品种新稍中咖啡碱含量均显著高于感虫品种，虫口密度与咖啡碱含量呈显著负相关。而在含有咖啡碱的转基因烟草和菊花中，咖啡碱显著增强了转基因烟草和菊花的抗虫抑菌能力。咖啡碱作为一种广谱性天然抗虫抑菌物质，广泛参与茶树生物胁迫防御过程，在茶叶绿色生产中具有重要应用前景。

在茶叶品质形成过程中，咖啡碱对茶叶风味也具有重要贡献。咖啡碱本身呈现苦味，但与茶黄素等多酚类物质以氢键缔合后形成的复杂络合物，则呈现鲜爽味，这已经成为红茶品质优劣的指标之一。此外，在动物模型以及流行病学调查方面都证实咖啡碱具有广泛的生理活性，适量的咖啡碱摄入对人体健康有重要保护作用，包括保护神经系统，加速机体代谢进程，提高人体认知、反应和记忆，以及促进心脑血管收缩、促进脂肪降解和抗氧化等。然而，人体长期过量摄入咖啡碱会诱发一系列健康隐患，表现为咖啡碱上瘾、易怒、睡眠障碍等生理和心理问题。此外，咖啡碱还会造成神经衰弱人群，包括儿童、孕妇、老人等神经发育受损、肠胃不适、加重心脏负担等。因此，低(无)咖啡碱已经成为茶树育种和茶叶市场发展的新方向，这将有助于进一步扩大茶叶消费群体，从而加大茶叶消费量，缓解我国茶叶产能过剩问题。

在植物中咖啡碱生物合成途径已经被解析清楚，其核心部分为黄嘌呤核苷(xanthosine)经3步甲基化和1步核苷水解作用最终生成咖啡碱，中间产物依次为7-甲基黄嘌呤核苷(7-methylxanthosine)、7-甲基黄嘌呤(7-methylxanthine)、可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤，theobromine)和咖啡碱。茶树咖啡碱合成酶1(TCS1、TEA015791)在幼嫩叶片中表达最高，它催化最后一步由可可碱合成咖啡碱的1-N位甲基化反应，是咖啡碱合成的限速酶基因。咖啡碱的合成也受一系列转录因子调控，如CsNAC07能直接结合yhNMT基因启动子区，正向调控咖啡碱的合成；CsMYB184能直接结合TCS1启动子，激活TCS1的表达正向调控咖啡碱的合成。然而在茶树以及其它富含咖啡碱的植物中，负调控咖啡碱合成的转录因子尚未被报道，这阻碍了我们对茶叶品质形成机理的认识和低咖啡碱等个性化茶树分子育种进程。进一步对咖啡碱合成以及调节机制的研究，将能更好地为基因工程育种提供优秀的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供茶树CsMYB206基因以及在调控茶叶咖啡碱合成中的应用，其可以调控茶树咖啡碱合成和茶叶品质。

在本发明的一个方面，本发明提出了茶树CsMYB206基因。根据本发明的实施例，所述茶树CsMYB206基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示。

另外，根据本发明上述实施例的茶树CsMYB206基因，还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述基因编码的蛋白序列如序列表Seq_2所示。

在本发明的另一方面，本发明提出了茶树表达载体pMDTM19-T-CsMYB206，根据本发明的实施例，所述表达载体通过将SEQ ID NO：1所示的片段酶切至载体pMDTM19-TSimpleVector获得。

在本发明的另一方面，本发明提出了茶树CsMYB206基因用于调控茶叶咖啡碱合成。

在本发明的另一方面，本发明提出了茶树CsMYB206基因用于调控茶叶咖啡碱合成的方法，根据本发明的实施例，包括以下步骤：

(1)克隆权利要求1所述的茶树CsMYB206基因；

(2)构建茶树表达载体；

(3)将茶树表达载体转入茶树叶片中。

另外，根据本发明上述实施例的茶树CsMYB206基因用于调控茶叶咖啡碱合成的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述所述茶树表达载体为pMDTM19-T-CsMYB206。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次克隆并验证了负调控茶树咖啡碱合成的关键转录因子CsMYB206。该转录因子在茶树叶片中抑制咖啡碱的合成，影响茶叶品质形成，本发明还提供了含有CsMYB206基因的重组质粒、转基因工程菌等。本发明丰富了茶树咖啡碱合成调控网络的认知，以及茶叶品质形成特别是茶叶苦味形成的遗传机制。本发明为实现茶树选择性农艺性状育种提供了理论和实际参考基础。

附图说明

图1是本发明实施例的CsMYB206蛋白序列与其它植物中已知的转录抑制子的蛋白序列比对图。

图2是本发明实施例的茶树不同发育时期叶片中CsMYB206以及咖啡碱合成基因TCS1的表达差异图。

图3中，A为CsMYB206基因在处理样品中基因表达变化图，B为咖啡碱代谢途径关键基因表达变化图；C为茶树叶片中咖啡碱含量变化，其中，Sense ODN为对照组，CsMYB206-KD为CsMYB206寡核苷酸反义链抑制处理。

图4是本发明实施例的CsMYB206基因调控茶树叶片中咖啡碱生物合成的分子机制图。具体的，A为CsMYB206蛋白纯化示意图，B为TCS1启动子区可能的MYB结合位点，C为凝胶迁移实验(EMSA)验证CsMYB206结合TCS1启动子区的MYB结合位点图，D为启动子激活和抑制载体示意图，E为启动子激活/抑制实验验证CsMYB206对TCS1启动子的抑制活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1CsMYB206基因的克隆与序列结构分析

茶树国家级良种舒茶早种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，取幼嫩叶片用于RNA的提取。总RNA的抽提采用Trizol试剂(Invitrogen，USA)按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，根据Promega公司M-MLV1反转录酶配套试剂使用说明，分别加入下游引物0.5μg，定容至15μL，70℃变性5min，立即在冰上放置5min。然后分别加入M-MLV 5×buffer 5μL，dNTP(25mM)5μL，rRNasinRibonuclease Inhibitor 25U，M-MLV反转录酶200U，DEPC水补足25μL。42℃温育1h，95℃5min灭活反转录酶。经过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。以cDNA第一链作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增CsMYB206基因。上游引物：(5’-ATGAGGAAGCCATGCTGTGAAAAG-3’)，下游引物：(5’-TCATCTAAAGAGAACAAGGGTGCGA-3’)。25μLPCR反应体系为：10×Ex taqbuffer2.5μL，dNTP 2.0μL，Mg2+1.5μL，上、下游引物各1μL，Extaq 0.2μL，模板1μL，ddH2015.8μL。反应程序如下为95℃5min，95℃50sec，58℃50sec，72℃1min，72℃10min，35个循环。PCR产物CsMYB206基因经纯化回收后，连接到pMDTM19-TSimpleVector载体(Takara，Japan)上得到pMDTM19-T-CsMYB206质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送上海生工公司测序，得到如下的核苷酸序列：

ATGAGGAAGCCATGCTGTGAAAAGCAAGACACCAACAAAGGAGCATGGTCCAAACAAGAAGATCAGAAGCTCATAGAGTACATTCAGAGAAACGGTACTGGTTGTTGGAGAACCCTACCTCAGGCTGCAGGCTTACTTCGTTGCGGTAAAAGTTGTAGACTTAGATGGAACAATTATTTAAGGCCAGACCTCAAAAGAGGCAACTTTGCTGAAGATGAAGAAGATCTCATTATCAAGCTTCATGCACTCCTAGGCAACCGGTGGTCACTAATAGCTGGGAGATTGCCAGGACGAACGGATAATGAAGTGAAAAACTATTGGAACTCTCATTTGAGAAGAAAGCTTATAAACATGGGTATTGATCCAACCAAGCATAGGTTAAGTCAGAATCTTACTCACCCTCAAATTATCGGTGCCACTGGCAGTGCAACCTCATCTGCTTCTAGAGACCATGCATGTCAACCATTAAAAACCAAAGGCGATCATGATCAAGTCTCTGATGCTGCAAGTTGTTTAGAGGATGCGACGTGGGGATTGCCCGATTTAAACCTTGATCTTAGATTGACTGCACCTCAATCAATTGCCATTGTTGAGGAGGAGAGTAAACAAAATGAGTCCACAATGTCTAGAAAAGTTGAATCTACCCCGCCTCGCACCCTTGTTCTCTTTAGATGA

CsMYB206基因编码的蛋白序列如下：

MRKPCCEKQDTNKGAWSKQEDQKLIEYIQRNGTGCWRTLPQAAGLLRCGKSCRLRWNNYLRPDLKRGNFAEDEEDLIIKLHALLGNRWSLIAGRLPGRTDNEVKNYWNSHLRRKLINMGIDPTKHRLSQNLTHPQIIGATGSATSSASRDHACQPLKTKGDHDQVSDAASCLEDATWGLPDLNLDLRLTAPQSIAIVEEESKQNESTMSRKVESTPPRTLVLFR

把CsMYB206以及其它物种中已知功能的同源基因蛋白序列在SMART数据库中(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白结构域分析，并利用GeneDoc软件进行多序列比对。

在图1中，通过与其它植物中已知的MYB抑制子蛋白序列比对表明，茶树CsMYB206也具有典型的R2和R3类型保守结构域以及LxLxL类型抑制结构域。这暗示了茶树CsMYB206也是一类MYB抑制子，负调控下游代谢途径。

实施例2茶树不同发育时期叶片中CsMYB206基因表达分析

茶树国家级良种舒茶早品种种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，4个不同发育时期叶片用来分析相关基因表达。这4个组织器官包括顶芽、第一叶、第二叶、第三叶。样品分别用于总RNA的提取以及cDNA第一链合成。反转录产物(cDNA第一条链)稀释80倍作为模板，使用SYBR Realtime Mix(TOYOBO，Osaka，Japan)，配制20μL反应体系：8.4μL稀释80倍的逆转录产物，上下游引物各0.8μL(10pmol/μL)，10μL 2×SYBR Green PCRMaster Mix，每个反应配3个重复。然后在bio-rad CFX-96上以程序：①95℃3min②95℃10s，60℃15s，72℃30s运行45个循环③从65℃到95℃，以0.1℃/s绘制熔解曲线。上游引物：(5’-GGCTGCAGGCTTACTTCGTT-3’)，下游引物：(5’-CCGTTCGTCCTGGCAATCT-3’)，以茶树ACTIN基因为内参，上游引物：(5’-GCCATATTTGATTGGAATGG-3’)，下游引物：(5’-GGTGCCACAACCTTGATCTT-3’)通过仪器自带分析软件，计算出CsMYB206的相对表达数值。同理，计算咖啡碱合成酶基因TCS1(上游引物5’-GATGGGAGTAGCGGGGTCTT-3’，下游引物：5’-TGGTGCCTGAGTAAGCCAAT-3’)的相对表达量。结果显示咖啡碱合成关键基因TCS1表达水平随叶片发育而降低，而CsMYB206表达水平水叶片发育而升高。因此，CsMYB206和TCS1的表达水平在叶片发育过程中呈现显著负相关。

在图2中，通过茶树不同组织的基因表达分析表明，CsMYB206与咖啡碱代谢途径关键结构基因TCS1具有完全相反的表达趋势。这暗示了CsMYB206负调控茶树咖啡碱的合成过程。Apcial bud，芽；1st-leaf，第一叶；2nd-leaf，第二叶；3rd-leaf，第三叶。

实施例3CsMYB206基因在茶树体内功能验证

1、体外寡核苷酸反义抑制实验

根据CsMYB206预测序列设计合成寡核苷酸反义的引物，设计在网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl上完成，引物序列如所示：(5’-TCGCCTTTGGTTTTTAATGG-3’)；用80mM蔗糖溶液溶解，配制并获得体外寡核苷酸反义抑制缓冲液，空白为蔗糖或正义链溶液；用剪刀剪下大小基本一致，颜色鲜艳，色泽健康，无虫无病的一芽一叶，插入装有缓冲液的96孔板中，要确保一芽一叶尾部没入缓冲液中。将96孔板放入光照培养箱中按光照16h/黑暗8h进行光照培养，培养箱温度为28℃。处理后3d引物处理样和对照样分别取样进行代谢和基因表达分析。

2、体外寡核苷酸反义抑制样品的代谢物和相关基因表达分析

处理和对照样品分别用于总RNA的提取以及cDNA第一链合成。反转录产物(cDNA第一条链)稀释80倍作为模板，使用SYBR Realtime Mix(TOYOBO，Osaka，Japan)，配制20μL反应体系，且每个反应配3个重复。然后利用bio-rad CFX-96检测CsMYB206和TCS1的相对表达量。结果显示在茶树叶片中抑制CsMYB206基因表达，能显著提高咖啡碱合成关键基因TCS1的表达水平，此外代谢物含量分析表明咖啡碱含量显著升高。采用安捷伦高效液相色谱仪(HPLC)对样品的咖啡碱含量进行分析。取新鲜研磨的样品粉末约0.05g，加入1ml提取液(80％甲醇)匀混，室温超声仪处理1-2h。12000r/min离心10min，取上清液再用0.2μm滤膜过滤，然后分装到进样瓶中准备进样分析。HPLC参数设置如下：C18色谱柱(5um 4.6×250mm)，柱温39℃，进样量为5μL，检测波长为280nm，采用二元流动相，流速为0.8mL/min，梯度洗脱(A 0.1％冰醋酸，B 100％甲醇：0.1-5min 95％A5％B；5min-8min 75％A 25％B；8min-15min 70％A 30％B；15min-25min 60％A 40％B；25min-45min 55％A 45％B；45min-60min45％A 55％B；60min-65min 30％A 70％B；65min-70min 100％B；70min-75min 95％A 5％B)。所检测物质均采用内标法进行定性和定量。

在图3中，可以看到通过体外寡核苷酸反义抑制实验可以使得CsMYB206的表达量和对照相比显著被抑制，通过体外寡核苷酸反义抑制CsMYB206基因表达3d后代谢物质测定结果可以看到，抑制CsMYB206的表达可以显著提高茶树叶片咖啡碱的合成积累，咖啡碱合成途径中的关键结构基因的表达量也显著升高。

实施例4CsMYB206调控咖啡碱合成的分子机制验证

1、CsMYB206与TCS1启动子互作验证

通过同源重组的方法把CsMYB206构建到原核表达载体pGEX-4T1中。上游引物：5’-TCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGAGGAAGCCATGCTGTGAAAAG-3’，下游引物：5’-CCGCTCGAGTCGACCCGGGAATTCTCATCTAAAGAGAACAAGGGTGCGA-3’。将重组载体转化入Rossata表达菌株中，于含有氯霉素和氨苄固体培养基LB中37℃过夜培养，划线培养进行菌落PCR。挑取阳性克隆菌株到10ml LB培养基(Cl-+Amp+)经37℃、180rpm过夜培养，后取1％的过夜菌至1L的LB液体培养基(Cl-+Amp+)，18℃、180rpm、1m MIPTG诱导20h后，超声破碎离心(加入0.2mg/ml溶菌酶，1mM PMSF(终浓度)，收集上清。将经诱导得到的上清于GST-resin树脂(4:1)混匀，在4℃摇1h，3000rpm，4℃离心10min倒掉上清；加入5-10倍柱体积的GST washing buffer冲洗树脂，3000rpm，4℃离心5min倒掉上清，重复5次；加入1倍柱体积GST Elution buffer，冰上放置15min，3000rpm，4℃离心5min，吸出上清即为纯化的蛋白用于Western blotting检测和EMSA分析。

Western blotting检测具体步骤如下：制备10％分离胶、5％浓缩胶的SDS-PAGE凝胶，采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式。蛋白质溶液10ng，5×SDS凝胶上样缓冲溶液50μL，混匀沸水加热5min。装置凝胶电泳，凝胶电泳缓冲液，将待测蛋白质样品加入点样孔中，恒压85V电泳30min，当溴酚蓝前沿进入分离胶，把电压提高到120V，1.5h后到溴酚蓝到达分离胶底部停止电泳。湿转恒压60v，1h，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。封闭液4℃封闭2h。用以1:5000稀释GST抗体，慢速摇床孵育过夜。1:5000稀释二抗，孵育1h，可视化增强化学发光(ECL)试剂显影，Bio-Rad凝胶成像仪成像。

EMSA检测具体步骤如下：通过TCS1启动子序列：TCTGGTTATT，在5’端添加生物素标记，交上海生工合成双链探针，并以无生物素标记的双链探针为竞争抑制剂。EMSA检测由碧云天公司的化学发光法EMSA试剂盒完成。

具体步骤如下：

(1)配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶(TBE buffer(10X)1.0ml，重蒸水16.2ml，39:1acrylamide/bisacrylamide(40％,w/v)2ml，80％甘油625μL，10％过硫酸铵(ammoniumpersulfate)150μL，TEMED 10μL)；

(2)EMSA结合反应：分别设置阴性对照反应(Nuclease-Free Water 7μL，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μL，细胞核蛋白或纯化的转录因子0μL，标记好的探针1μL)，样品反应(Nuclease-Free Water 5μL，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μL，细胞核蛋白或纯化的转录因子2μL，标记好的探针1μL)，探针竞争反应(Nuclease-Free Water 4μL，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μL，细胞核蛋白或纯化的转录因子2μL，未标记的探针1μL，标记好的探针1μL)三组，加入1μLEMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。

(3)电泳步骤：用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行；把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μL稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况；按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

(4)转膜：取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处；取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿；把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡；非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡；再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡；采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30～60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明；转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

(5)交联：用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm²，交联45～60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5～10厘米左右照射3～10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5～10厘米左右照射3～15分钟。

(6)化学发光法检测生物素标记的探针：37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液；取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟；取7.5μL Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用；去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟；取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液；将尼龙膜转移至另一装有15～20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟；去除洗涤液，加入15～20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟；重复步骤G三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟；将尼龙膜转移至另一装有20～25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟；取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液；取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上；在尼龙膜的表面小心加上配制好的共10mlBeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2～3分钟；取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内；用X光片压片1～5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。

2、咖啡碱合成酶TCS1启动子克隆

以舒茶早的幼嫩叶片为材料，利用天根植物专用DNA提取试剂盒进行DNA提取，其方法严格参照试剂盒说明书。总DNA浓度的测量使用GeneQuantII分光光度计(FisherScientific，CA，USA)测量，然后用TE(10mM Tris,1mM EDTA PH 8.0)溶液调至50ng/μL储存在-20℃备用。然后以DNA作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增TCS1启动子序列。上游引物：(5’-CCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGTGAATCCTGAAAATTCAAACC-3’)，下游引物：(5’-GCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCACCTTCCCCGTAGTAGCTA-3’)。25μL PCR反应体系为：10×Ex taqbuffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，Mg2+1.5μL，上、下游引物各1μL，Ex taq 0.2μL，模板1μL，ddH2015.8μL。反应程序如下为95℃5min，95℃50sec，58℃50sec，72℃2min，72℃10min，35个循环。PCR产物经纯化回收后，连接到pMDTM19-T Simple Vector载体(Takara，Japan)上得到pMDTM19-T-CsTCS1 pro质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送去测序公司进行序列确认。

3、启动子激活/抑制实验

把CsTCS1 pro启动子片段重组到启动子激活载体pGreen0800上。CsTCS1 pro上游引物：(5’-CCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGTGAATCCTGAAAATTCAAACC-3’)；CsTCS1 pro下游引物：(5’-GCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCACCTTCCCCGTAGTAGCTA-3’)。然后把咖啡碱正调控因子CsMYB184通过同源重组的方法克隆到启动子激活载体pGreen0800-Sk中，所用上游引物：(5’-GCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGGCTCCGAAGAGCAGTGA-3’)，下游引物：(5’-TCGATAAGCTTGATATCGAATTCTTACCATTTATCGGTAAGTGCC-3’)；把CsMYB206通过同源重组的方法克隆到启动子激活载体pGreen0800-Sk中，所用上游引物：(5’-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGAGGAAGCCATGCTGTGAAAAG-3’)，下游引物：(5’-GATAAGCTTGATATCGAATTCTCATCTAAAGAGAACAAGGGTGCGA-3’)。然后分别转化拟南芥原生质体中，验证启动子激活活性。

具体方法如下：

(1)配制酶解液(一般10mL酶解液需要20个叶片，可以做20-30个转化)。

(2)将处理好的酶解液倒入一个干净干燥的平皿中。

(3)选取生长状况良好，开花之前的拟南芥叶片，切成0.5-1mm宽的细丝，用镊子放入酶解液中，两面都要浸入。

(4)用真空泵于黑暗中抽真空30min。

(5)暗处静置酶解3h，轻轻摇动以释放原生质体，此时酶解液应该变绿。

(6)加入等体积预冷的W5溶液终止酶解反应，用注射器吸取酶解产物，用30-75μm的尼龙网过滤到圆底离心管中。

(7)100g离心1-2min，小心吸弃上清，再用10mL预冷的W5溶液重悬原生质体(至原生质体数目大致为2×105mL-1)。

(8)冰浴30min。100g离心8-10min，尽可能去除W5溶液，再用适量MMG溶液重悬浮原生质体(原生质体数目大致为2×105mL-1)。

质粒转化步骤：

(1)将质粒浓度调至1-1.5μg/μL，在一个2mL离心管中加入10μL质粒和100μL原生质体，轻叩管壁混匀，再加入110μL PEG，轻柔混匀。

(2)室温放置15min左右。

(3)用440μL W5溶液稀释，轻柔颠倒混匀。

(4)室温100g离心1-2min，小心吸弃上清。

(5)用1mL W5重悬原生质体，室温避光诱导原生质体12h左右。

酶活测定方法如下：

(1)取诱导转化的原生质体，100g离心2min，弃上清，收集原生质体沉淀。

(2)加入140μL 1×PLB裂解液，震荡混匀，室温裂解15min左右。

(3)4℃高速离心10min，吸取上清至另一干净离心管中备用。

(4)酶标仪的设定：将测定延迟时间设为2s，将测定时间设为10-20s。

(5)转移40μL的PLB裂解液到检测管中，每个样品设3个重复。

(6)向检测管中加入40μL LAR II，混合均匀，检测萤火虫荧光素酶的活性，读数为RLU1。

(7)立即向检测管中加入40μL的检测海肾萤光素酶的活性，读数为RLU2。

(8)计算萤火虫和海肾荧光素酶的反应强度比率Ratio＝RLU1/RLU2。

在图4中，通过EMSA实验表明CsMYB206能与咖啡碱合成酶TCS1启动子区结合。启动子激活实验表明，CsMYB206能显著抑制TCS1启动子自身激活活性，以及抑制CsMYB184对TCS1基因的激活活性。

综上所述，CsMYB206蛋白及其编码基因与茶树叶片咖啡碱合成代谢调控相关，负调控茶树咖啡碱生物合成，能显著提高茶叶品质形成，在培育低咖啡碱茶树品种具有重要应用。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种茶树CsMYB206基因在负调控茶树叶片咖啡碱合成中的应用，其特征在于：所述茶树CsMYB206基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示，抑制茶叶CsMYB206的表达可以提高茶树叶片咖啡碱的合成积累。