CN113234737A

CN113234737A - 茶树myb类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用

Info

Publication number: CN113234737A
Application number: CN202110733620.6A
Authority: CN
Inventors: 赵剑; 李鹏辉; 富嘉敏; 叶志立
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-08-10

Abstract

本发明公开了茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用。其中茶树MYB类转录因子基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；茶树MYB类转录因子基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明不仅将有利于理解茶树叶片中咖啡碱的生物合成调控机制，而且为培育极高、极低咖啡碱含量的茶树品种的育种工作提供理论依据，加快特定茶树品种育种进程，具有很大的实际应用价值。

Description

茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物。茶叶富含氨基酸、生物碱、茶多糖、多酚类和挥发类等物质，这些内含物赋予了茶叶极高的健康价值。其中咖啡碱是一种嘌呤类生物碱，具有极强的中枢神经兴奋作用，在茶叶中被认为是提神以及苦味来源的重要物质，此外也被广泛地用于药物开发、饮料添加剂等方面。

咖啡碱最早被认为是一种化感物质，能够分泌到土壤中扰乱相邻植物种子的萌发。随后大量实验也表明，在多种生态互作中，咖啡碱都可以为植物本身提供防御作用。如多种鳞翅目昆虫取食咖啡碱处理过后的叶片，会导致其产卵数量及幼卵成活率显著下降；咖啡碱能刺激植食动物加速移动，从而减少叶片损害；茶树中咖啡碱合成受到炭疽菌侵染的显著诱导，表现出强于多酚类化合物的炭疽菌抑制活性；咖啡碱合成途径能响应多种激素，如水杨酸等，进而参与茶树多种逆境胁迫响应等。此外，咖啡碱不仅存在于植物幼嫩茎叶、果实等组织当中，在花中也有一定量的分布，如茶树、咖啡、柑橘等植物的花粉中都检测到咖啡碱的存在。研究表明咖啡碱能改善蜜蜂等授粉昆虫的记忆行为，吸引这些昆虫持续、高效地为自己授粉。

咖啡碱单独呈现苦味，但与茶黄素等物质以氢键缔合后形成的复杂络合物，则呈现鲜爽味；此外咖啡碱与多酚类物质形成的大分子络合物，使茶汤呈现特殊的“冷后浑”现象，这也成为衡量红茶品质优劣的指标之一。大量医学实验已经证实，咖啡碱具有广泛的生理活性，适量的咖啡碱摄入对人体健康有一定保护作用，如刺激中枢神经系统，加速肾上腺素和多巴胺的释放，保持环磷酸腺苷(cAMP)水平从而提高认知、反应、记忆，促进心血管收缩、加速脂肪降解以及抗氧化和衰老等。因此，咖啡碱对茶叶滋味形成和人体健康具有双重贡献，是茶叶品质形成的重要影响因素。然而，人体长期大量摄入咖啡碱会诱发咖啡碱中毒，表现为咖啡碱上瘾、焦虑、烦躁、易怒、睡眠障碍等生理和心理问题。过量的咖啡碱还会造成人体肠胃不适、肾脏负担加重、心率和心跳加速等。因此，高咖啡碱含量的茶叶不适于儿童、孕妇、老人或神经衰弱等疾病患者长期饮用。当前，低(无)咖啡碱已经成为茶树育种和茶叶市场发展的新方向，这将有助于进一步扩大茶叶消费群体，从而加大茶叶消费量，缓解我国茶叶产能过剩问题。目前低咖啡碱含量茶叶主要来源于人工脱咖啡碱工艺和低咖啡碱茶树品种选育两种途径。采用热水脱除、溶剂萃取、柱层析、超临界二氧化碳萃取等方法的人工脱咖啡碱工艺常面临产品安全性低、耗能高、污染环境和茶叶风味流失等不足。选育低咖啡碱茶树品种是解决茶叶脱(低)咖啡碱最经济、有效和安全的方法之一。然而茶树常规育种周期长，需要20～30年时间，时间成本和人工成本极高。

因此，采用基因工程育种手段培育适用于不同人群茶树特异性品种是应对咖啡碱个性化需求增长的根本解决途径。然而在茶树以及其它富含咖啡碱的植物中，咖啡碱合成调控机制尚不清楚，严重阻碍了我们对茶叶品质形成机理的认识和个性化茶树分子育种进程。随着茶树基因组数据的公布，为我们从分子水平解析咖啡碱合成调控机制提供了理论基础。通过解析咖啡碱合成的调控机制，构建咖啡碱合成代谢的精细调控网络，为理解茶树重要农艺性状以及茶叶品质形成提供理论依据，为极低、极高咖啡碱茶树精准育种提供理论参考。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用，其中茶树MYB类转录因子基因以下简称为CsMYB184基因或转录因子。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是，CsMYB184基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用，CsMYB184基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

作为优选，CsMYB184基因编码的蛋白序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

本发明的有益效果是：

首次发现茶树中咖啡碱生物合成调控机制，为实现茶树选择性农艺性状育种提供了理论和实际参考基础。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例的茶树不同组织咖啡碱含量分布差异和CsMYB184基因编码蛋白的表达差异。以舒茶早品种为研究材料，不同组织中咖啡碱含量分布和CsMYB184表达模式高度正相关。

图2是本发明实施例的CsMYB184基因调控茶树叶片中咖啡碱合成积累。a，寡核苷酸反义抑制实验中，CsMYB184的表达受到抑制，一芽一叶材料取自于福鼎大白品种，SenseODN，正义链对照；CsMYB184-KD，CsMYB184寡核苷酸反义链抑制处理。b，对照和CsMYB184寡核苷酸反义链抑制处理材料中咖啡碱含量变化。c，对照和CsMYB184寡核苷酸反义链抑制处理材料中咖啡碱合成酶1(TCS1，Tea caffeine synthase1)的表达变化。

图3是本发明实施例的在茶树发根中过量表达CsMYB184基因能显著增加咖啡碱生物合成。a，定量分析CsMYB184在对照(GFP)和过量表达(MYB184OE)的发根中的表达水平。b，HPLC分析对照和过表达CsMYB184的转基因茶树发根中咖啡碱的含量变化。c，对照和过表达CsMYB184茶树发根中咖啡碱含量变化。d，对照和过表达CsMYB184茶树发根中咖啡碱合成酶1的表达水平变化。

图4是本发明实施例的CsMYB184基因调控茶树叶片中咖啡碱生物合成的分子机制。a，CsMYB184能结合到咖啡碱合成酶TCS1的启动子的-828至-1670区域。b,凝胶迁移实验(EMSA)验证CsMYB184结合TCS1启动子区(-1596至-1670区域)的MYB结合位点。c，启动子激活实验验证CsMYB184对TCS1不同区段的启动子的激活活性。实验表明CsMYB184能结合到TCS1启动子(-1596至-1670区域)的MYB结合位点，并激活TCS1的表达。

具体实施方式

实施例1.CsMYB184基因的克隆与序列结构分析

茶树国家级良种舒茶早种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，取幼嫩叶片用于RNA的提取。总RNA的抽提采用Trizol试剂(Invi trogen，USA)按照说明操作。反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，根据Invi trogen公司M-MLV反转录酶配套试剂使用说明合成第一链cDNA。经过优化后，取适量的反转录产物用于随后基因全长扩增。以cDNA作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增CsMYB184基因。上游引物如SEQ ID NO.3所示：5’-atggctccgaagagcagtga-3’，下游引物如SEQ ID NO.4所示：5’-ttaccatttatcggtaagtgcc-3’。25μL PCR反应体系为：10×Ex taq buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，Mg2+1.5μL，上、下游引物各1μL，Ex taq 0.2μL，模板1μL，ddH2015.8μL。反应程序如下为95℃5min，95℃50sec，58℃50sec，72℃1min，72℃10min，35个循环。PCR产物CsMYB184基因经纯化回收后，连接到pMDTM19-T Simple Vector载体(Takara，Japan)上得到pMDTM19-T-CsMYB184质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送去测序公司进行测序，得到如SEQ ID NO.1所示的以下核苷酸序列：

CsMYB184基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示：

实施例2.CsMYB184基因的表达差异与咖啡碱含量差异相关性：

茶树舒茶早品种种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，8个组织器官用来分析咖啡碱含量分布和基因表达。这8个组织器官包括嫩芽、幼叶、成熟叶、老叶、茎、花、果实、根。采用安捷伦高效液相色谱仪(HPLC)对样品的咖啡碱含量进行分析。取新鲜研磨的样品粉末约0.05g，加入1ml提取液(80％甲醇)匀混，室温超声仪处理1～2h。12000r/min离心10min，取上清液再用0.2μm滤膜过滤，然后分装到进样瓶中准备进样分析。HPLC参数设置如下：C18色谱柱(5um 4.6×250mm)，柱温39℃，进样量为10μl，检测波长为280nm，采用二元流动相，流速为1.0mL/min，梯度洗脱(A 0.1％冰醋酸，B 100％甲醇：0.1～5min95％A 5％B；5min～8min 75％A 25％B；8min～15min 70％A 30％B；15min～25min 60％A40％B；25min～45min 55％A 45％B；45min～60min 45％A 55％B；60min～65min 30％A70％B；65min～70min 100％B；70min～75min 95％A 5％B)。同时这些样品用于总RNA的提取以及cDNA第一链合成。反转录产物(cDNA第一条链)稀释80倍作为模板，使用SYBRRealtime Mix(TOYOBO,Osaka,Japan)，配制20μl反应体系：8.4μl稀释80倍的逆转录产物，上下游引物各0.8μl(10pmol/μl)，10μl 2×SYBR Green PCR Master Mix，每个反应配3个重复。然后在bio-rad CFX-96上以程序：①95℃3min②95℃10s，60℃15s，72℃30s运行45个循环③从65℃到95℃，以0.1℃/s绘制熔解曲线。上游引物如SEQ ID NO.5所示：5’-ccgaatatcaagcgaggcaaca-3’，下游引物如SEQ ID NO.6所示：5’-atcggttcgtccaggaagtctc-3’，以茶树ACTIN基因为内参，上游引物如SEQ ID NO.7所示：5’-gccatatttgattggaatgg-3’，下游引物如SEQ ID NO.8所示：5’-ggtgccacaaccttgatctt-3’。通过仪器自带分析软件，计算出CsMYB184在不同组织中的相对表达数值。

在图1中，可以看到舒茶早8个不同组织中咖啡碱含量分布差异显著，其中幼嫩叶片中咖啡碱含量较高，随着叶片成熟含量逐渐减少。基因表达检测结果显示CsMYB184表达量与咖啡碱含量分布高度正相关。CsMYB184高表达在咖啡碱含量丰富的幼嫩叶片当中，其它组织表达较低。结合蛋白序列基因注释，暗示CsMYB184可能与茶树咖啡碱的生物合成调控有关系。

实施例3.CsMYB184基因在茶树体内功能验证

1、体外寡核苷酸反义抑制实验

根据CsMYB184预测序列设计合成寡核苷酸反义的引物，设计在网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl上完成，引物序列如所示：

P1如SEQ ID NO.9所示：5’-ttgtcgtcatttttcccttc-3’；

P2如SEQ ID NO.10所示：5’-agttgtcgtcatttttccct-3’；

P3如SEQ ID NO.11所示：5’-gaagttgtcgtcatttttcc-3’。

用80mM蔗糖溶液溶解，配制并获得体外寡核苷酸反义抑制缓冲液，空白为正义链蔗糖溶液。用剪刀剪下大小基本一致，颜色鲜艳，色泽健康，无虫无病的一芽一叶，插入装有缓冲液的96孔板中，要确保一芽一叶尾部没入缓冲液中。将96孔板放入光照培养箱中按光照16h/黑暗8h进行光照培养，培养箱温度为28℃。处理后3d引物处理样和对照样分别取样进行代谢和基因表达分析。

2，体外寡核苷酸反义抑制样品的咖啡碱含量的测定

咖啡碱含量的测定采用安捷伦高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。方法参照上文。结果表明，CsMYB184体外寡核苷酸反义抑制能显著咖啡碱生物合成。

3、体外寡核苷酸反义抑制影响茶树基因表达分析

对处理样品和对照样品分别提取总mRNA，然后进行反转录，合成第一链cDNA，用定量PCR检测相关基因表达。首先对对照和处理样品中CsMYB184的基因表达水平进行了检测，结果显示CsMYB184体外寡核苷酸反义抑制能显著干扰目的基因表达水平，以及咖啡碱合成关键基因TCS1的表达水平。

在图2中，可以看到体外寡核苷酸反义抑制实验中CsMYB184的表达量和对照相比显著被抑制，从代谢物质测定结果可以看到抑制CsMYB184的表达可以显著抑制咖啡碱合成积累，以及咖啡碱合成酶TCS1的表达水平。

实施例4.CsMYB184基因在茶树发根中过量表达的功能验证

1、CsMYB184-pB2GW7载体构建

以pMDTM 19-T Simple::CsMYB184质粒为模板，利用引物进行PCR扩增，上游引物如SEQ ID NO.12所示：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggctccgaagag cagtga-3’，下游引物如SEQ ID NO.13所示：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaccatttatcggtaagtgcc-3’。PCR产物用1％的琼脂糖胶电泳条带进行回收。利用Gateway克隆技术，加入1μl PCR回收产物，与其质量相当的pDONR221中间载体，最后加入1μL BP Clonase Mix，室温过夜后转化DH5α，送上海生工公司测序。测序正确的阳性克隆的质粒，取1μL质粒并加入等量pB2GW7过表达载体，最后加入1μL LR Clonase Mix，室温过夜后转化DH5α，送上海生工公司测序验证。

2，茶树转基因发根遗传转化和化合物含量以及基因表达分析

取适量的舒茶早健壮茶籽播种于土壤中，置于合适条件(湿度60％；温度25℃；光周期16h光/8h暗)下等待发芽。约1～2个月之后，茶籽开始发芽，取长势一致的茶籽苗进行发根实验。把CsMYB184-pB2GW7载体电激法转化到15834农杆菌当中，并通过常规PCR方法鉴定阳性克隆。挑取含有目的基因的阳性菌落，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养约24h；吸取培养过的菌液2ml，加入到50mL新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD600约为1.0，离心收集菌体，用适量转化液(MS+0.3mg/L6-BA+150g/L蔗糖+15g/LEMS，PH＝5.7)重悬菌体，终浓度OD600约为0.8。转化之前，用手术刀把茶籽苗已有根系，全部切除，并在靠近茎部，用手术刀划出伤口，方便侵染。然后把茶籽苗的根部放在菌液中，共培养1～3天，然后把茶籽苗再移栽到土壤中，正常生长。约1～2个月之后，取新长出来的白色的根系进行鉴定。提取根系的RNA，利用基因特异引物进行PCR，检测目的基因表达水平。并通过HPLC等方法检测转基因茶树发根中咖啡碱的含量变化，以及荧光定量PCR的方法，检测相关基因的表达水平变异。TCS1定量PCR的上游引物如SEQ ID NO.14所示：5’-gatgggagtagcggggtctt-3’，下游引物如SEQ ID NO.15所示：5’-tggtgcctgagtaagccaat-3’，以茶树ACTIN基因为内参，通过仪器自带分析软件，计算相关基因的相对表达数值。

在图3中，在茶树发根中过量表达CsMYB184能显著提升CsMYB184在根中的表达水平，同时代谢物含量测定表明过量表达CsMYB184能显著提高咖啡碱在茶树根中合成和积累，同时也观察到咖啡碱合成酶TCS1的表达水平也显著提高。

实施例5.CsMYB184基因调控咖啡碱合成酶TCS1的分子机制验证

1、咖啡碱合成酶TCS1启动子克隆

以舒茶早的幼嫩叶片为材料，利用天根植物专用DNA提取试剂盒进行DNA提取，其方法严格参照试剂盒说明书。总DNA浓度的测量使用GeneQuantII分光光度计(FisherScientific,CA,USA)测量，然后用TE(10mM Tris,1mM EDTA PH 8.0)溶液调至50ng/μl储存在-20℃备用。然后以DNA作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增TCS1启动子序列。上游引物如SEQ ID NO.16所示：5’-gtgaatcctgaaaattcaaacc-3’，下游引物如SEQ ID NO.17所示：5’-caccttccccgtagtagcta-3’。25μL PCR反应体系为：10×Ex taq buffer 2.5μL，dNTP2.0μL，Mg2+1.5μL，上、下游引物各1μL，Ex taq 0.2μL，模板1μL，ddH2015.8μL。反应程序如下为95℃5min，95℃50sec，58℃50sec，72℃2min，72℃10min，35个循环。PCR产物经纯化回收后，连接到pMDTM19-TSimple Vector载体(Takara，Japan)上得到pMDTM19-T-CsTCS1 proP1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送去测序公司进行序列确认。

2、酵母单杂交实验

把TCS1启动子片段截短为4部分，分别是CsTCS1 pro P1，CsTCS1 pro P2，CsTCS1pro P3，CsTCS1 pro P4。然后分别把这四个片段通过同源重组的方式重组到酵母单杂交载体pHIS2.1中。CsTCS1 pro P1上游引物如SEQ ID NO.18所示：5’-gactcactatagggcgaattcgtgaatcctgaaaattcaaacc-3’；CsTCS1 pro P2上游引物如SEQ ID NO.19所示：5’-gactcactatagggcgaattcgggtcggatttggaaatgct-3’；CsTCS1 pro P3上游引物如SEQ ID NO.20所示：5’-gactcactatagggcgaattccatccgtgtaattcacccac-3’；CsTCS1 pro P4上游引物如SEQID NO.21所示：5’-gactcactatagggcgaattctaacttaggcgtacccgagc-3’；P1-P4共用下游引物如SEQ ID NO.22所示：5’-tgataatgccaggaattactagtcaccttccccgtagtagcta-3’。然后把CsMYB184克隆到酵母载体pGADT7中，所用上游引物如SEQ ID NO.23所示：5’-catatggccatggaggccgaattcacatatggctccgaagagcagtga-3’，下游引物如SEQ ID NO.24所示：5’-ctgcagctcgagctcgatggatccaggatccttaccatttatcggtaagtgcc-3’。然后pGADT7-CsMYB184分别与pHIS-CsTCS1 pro P1，pHIS-CsTCS1 pro P2，pHIS-CsTCS1pro P3，pHIS-CsTCS1 pro P4共同转化到酵母菌株Y187中。具体方法如下：酵母感受态细胞的制备：(1)挑取Y187酵母菌，加3mLYPDA液体培养基置于30℃摇床230r/min过夜震荡培养；(2)摇混后吸取5μL上述菌液至250mL锥形瓶中，并加入50mL的YPDA，230r/min摇动16～20h，直到OD600为0.15～0.3；(3)室温2500r/min离心5min，弃上清，再用100mL的YPDA重悬浮，继续培养直到OD600为0.4～0.5(3～5h)；(4)用2个50mL离心管分装，室温2500r/min离心5min，弃上清，用30mL ddH2O重悬浮；(5)再次离心弃上清，重悬浮于1.5mL1.1×TE/LiAc，转入1.5mL离心管中，高速离心15s；(6)弃上清，重悬浮于600μL 1.1×TE/LiAc，备用。质粒转化：(1)加入含有目的基因片段的AD、pHIS2.1质粒各1ug，变性鲑鱼精DNA 10μL(鲑鱼精DNA在95～100℃加热5min，后迅速置于冰上冷却)；(2)加入600μL酵母感受态细胞，温和混匀；(3)加入2.5mL50％PEG，温和混匀；(4)30℃恒温培养箱培养45min，每10～15min摇动混合细胞；(5)加入160μL DMSO并温和混匀；(6)42℃热激20min，每5～10min摇动混匀细胞；(7)室温2500r/min离心5min，弃上清；(8)用3mL YPDA重悬浮，30℃摇床低速培养90min；(9)室温2500r/min离心5min，弃上清，用10mL 0.9％NaCl溶液重悬浮；(10)稀释一定倍数后均匀涂布在SD/-leu-trp的培养基上，30℃恒温培养箱培养2～3天；(11)挑取单克隆用无菌水稀释1000倍，然后均匀打点于SD/-leu-trp-His培养基上，30℃恒温培养箱培养2～3天，观察酵母生长情况。

3、EMSA实验

通过同源重组的方法把CsMYB184构建到原核表达载体pGEX-4T1中。上游引物如SEQ ID NO.25所示：5’-aaatcggatctggttccgcgtggatccatggctccgaagagcagtga-3’，下游引物如SEQ ID NO.26所示：5’-cggccgctcgagtcgacccgggaattcttaccatttatcggtaagtgcc-3’。将重组载体转化入Rossata表达菌株中,于含有氯霉素和氨苄固体培养基LB中37℃过夜培养，划线培养进行菌落PCR。挑取阳性克隆菌株到10ml LB培养基(Cl-+Amp+)经37℃、180rpm过夜培养，后取1％的过夜菌至1L的LB液体培养基(Cl-+Amp+)，18℃、180rpm、1m MIPTG诱导20h后，超声破碎离心(加入0.2mg/ml溶菌酶，1mM PMSF(终浓度)，收集上清。将经诱导得到的上清于GST-resin树脂(4:1)混匀，在4度摇1h，3000rpm，4℃离心10min倒掉上清；加入5-10倍柱体积的GST washing buffer冲洗树脂，3000rpm，4℃离心5min倒掉上清，重复5次；加入1倍柱体积GST Elution buffer，冰上放置15min，3000rpm，4℃离心5min，吸出上清即为纯化的蛋白用于Western blotting检测和EMSA分析。

Western blotting检测具体步骤如下：制备10％分离胶、5％浓缩胶的SDS-PAGE凝胶，采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式。蛋白质溶液10ng，5×SDS凝胶上样缓冲溶液50μL，混匀沸水加热5min。装置凝胶电泳，凝胶电泳缓冲液，将待测蛋白质样品加入点样孔中，恒压85V电泳30min，当溴酚蓝前沿进入分离胶，把电压提高到120V，1.5h后到溴酚蓝到达分离胶底部停止电泳。湿转恒压60v，1h，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。封闭液4℃封闭2h。用以1:5000稀释GST抗体，慢速摇床孵育过夜。1:5000稀释二抗，孵育1h，可视化增强化学发光(ECL)试剂显影，Bio-Rad凝胶成像仪成像。

EMSA检测具体步骤如下：通过TCS1启动子序列如SEQ ID NO.27所示：aatcctgaaaattcaaaccaaacaaactaaatttgttg，在5’端添加生物素标记，交上海生工合成双链探针，并以无生物素标记的双链探针为竞争抑制剂。EMSA检测由碧云天公司的化学发光法EMSA试剂盒完成。具体步骤如下：(1)配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶(TBE buffer(10X)1.0ml，重蒸水16.2ml，39:1acrylamide/bisacrylamide(40％,w/v)2ml，80％甘油625μl，10％过硫酸铵(ammonium persulfate)150μl，TEMED 10μl)；(2)EMSA结合反应：分别设置阴性对照反应(Nuclease-FreeWater 7μl，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μl，细胞核蛋白或纯化的转录因子0μl，标记好的探针1μl)，样品反应(Nuclease-Free Water 5μl，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μl，细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl，标记好的探针1μl)，探针竞争反应(Nuclease-Free Water4μl，EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2μl，细胞核蛋白或纯化的转录因子2μl，未标记的探针1μl，标记好的探针1μl)三组，加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。(3)电泳步骤：用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行；把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况；按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。(4)转膜：取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处；取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿；把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡；非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡；再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡；采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30～60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明；转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。(5)交联：用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45～60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5～10厘米左右照射3～10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5～10厘米左右照射3～15分钟。(6)化学发光法检测生物素标记的探针：37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液；取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟；取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用；去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRPConjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟；取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液；将尼龙膜转移至另一装有15～20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟；去除洗涤液，加入15～20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟；重复步骤G三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟；将尼龙膜转移至另一装有20～25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟；取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECLMoon工作液；取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上；在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECLMoon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2～3分钟；取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内；用X光片压片1～5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。

4、启动子激活实验

分别把CsTCS1 pro P1，CsTCS1 pro P2，CsTCS1 pro P3，CsTCS1 pro P4四个启动子片段重组到启动子激活载体pGreen0800上。CsTCS1 pro P1上游引物如SEQ ID NO.28所示：5’-ccgggccccccctcgaggtcgacgtgaatcctgaaaattcaaacc-3’；CsTCS1 pro P2上游引物如SEQ ID NO.29所示：5’-ccgggccccccctcgaggtcgacgggtcggatttggaaatgct-3’；CsTCS1pro P3上游引物如SEQ ID NO.30所示：5’-ccgggccccccctcgaggtcgaccatccgtgtaattcacccac-3’；CsTCS1 pro P4上游引物如SEQ ID NO.31所示：5’-ccgggccccccctcgaggtcgactaacttaggcgtacccgagc-3’；共用下游引物如SEQ ID NO.32所示：5’-gccgctctagaactagtggatcccaccttccccgtagtagcta-3’，然后把CsMYB184通过同源重组的方法克隆到启动子激活载体pGreen0800-Sk中，所用上游引物如SEQ ID NO.33所示：5’-gccgctctagaactagtggatccatggctccgaagagcagtga-3’，下游引物如SEQ ID NO.34所示：5’-tcgataagcttgatatcgaattcttaccatttatcggtaagtgcc-3’。然后分别转化拟南芥原生质体中，验证启动子激活活性。具体方法如下：(1)配制酶解液(一般10mL酶解液需要20个叶片，可以做20～30个转化)。(2)将处理好的酶解液倒入一个干净干燥的平皿中。(3)选取生长状况良好，开花之前的拟南芥叶片，切成0.5～1mm宽的细丝，用镊子放入酶解液中，两面都要浸入。(4)用真空泵于黑暗中抽真空30min。(5)暗处静置酶解3h，轻轻摇动以释放原生质体，此时酶解液应该变绿。(6)加入等体积预冷的W5溶液终止酶解反应，用注射器吸取酶解产物，用30～75μm的尼龙网过滤到圆底离心管中。(7)100g离心1～2min，小心吸弃上清，再用10mL预冷的W5溶液重悬原生质体(至原生质体数目大致为2×105mL-1)。(8)冰浴30min。100g离心8～10min，尽可能去除W5溶液，再用适量MMG溶液重悬浮原生质体(原生质体数目大致为2×105mL-1)。质粒转化步骤：(1)将质粒浓度调至1～1.5μg/μL，在一个2mL离心管中加入10μL质粒和100μL原生质体，轻叩管壁混匀，再加入110μL PEG，轻柔混匀。(2)室温放置15min左右。(3)用440μL W5溶液稀释，轻柔颠倒混匀。(4)室温100g离心1～2min，小心吸弃上清。(5)用1mL W5重悬原生质体，室温避光诱导原生质体12h左右。酶活测定方法如下：(1)取诱导转化的原生质体，100g离心2min，弃上清，收集原生质体沉淀。(2)加入140μL 1×PLB裂解液，震荡混匀，室温裂解15min左右。(3)4℃高速离心10min，吸取上清至另一干净离心管中备用。(4)酶标仪的设定：将测定延迟时间设为2s，将测定时间设为10～20s。(5)转移40μL的PLB裂解液到检测管中，每个样品设3个重复。(6)向检测管中加入40μL LAR II，混合均匀，检测萤火虫荧光素酶的活性，读数为RLU1。(7)立即向检测管中加入40μL的

Reagent，检测海肾萤光素酶的活性，读数为RLU2。(8)计算萤火虫和海肾荧光素酶的反应强度比率Rat io＝RLU1/RLU2。

在图4中，通过酵母单杂交和凝胶迁移实验(EMSA)实验表明CsMYB184可以直接结合咖啡碱合成酶TCS1的启动子区，并通过启动子激活实验表明CsMYB184可以直接激活TCS1的表达，正向调控咖啡碱的合成。

综上所述，CsMYB184蛋白及其编码基因与茶树咖啡碱的生物合成调控相关，能显著改善茶叶中咖啡碱的含量和茶叶内在品质形成，对培育低咖啡碱、高咖啡碱的茶树品种具有重大经济应用潜力。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用

<130> NO

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 1

atggctccga agagcagtga gggactggct aaaaaagttt acaataaagg agcatggaca 60

tctgaggagg atagaaagct ggctcagtat gttgaagttc atggagcaaa gaagtggaag 120

actatcgcta ccaagtcagg tttgaaccga tgcgggaaga gttgtagatt gagatggttg 180

aattatctta gaccgaatat caagcgaggc aacattactg atgaagaaga ggacttgata 240

cttaggcttc ataagctatt agggaacagg tggtccttga ttgctgggag acttcctgga 300

cgaaccgata atgagattaa gaactattgg aattctcatt tgagcaggaa aataaatcag 360

aagggaaaaa tgacgacaac ttcgccggaa caagaaagca cgcctgagaa aactgcagac 420

tctgacgtca aaagagaagg caccaaagga agtggagacg gagagtttat gcttgatgtg 480

aatgaattct tcgatttctc taccggaggt acctacgggt tagattgggt taataaattt 540

cttgaactcg atgatgatca ggcacttacc gataaatggt aa 582

<210> 2

<211> 193

<212> PRT

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 2

Met Ala Pro Lys Ser Ser Glu Gly Leu Ala Lys Lys Val Tyr Asn Lys

1 5 10 15

Gly Ala Trp Thr Ser Glu Glu Asp Arg Lys Leu Ala Gln Tyr Val Glu

20 25 30

Val His Gly Ala Lys Lys Trp Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Gly Leu

35 40 45

Asn Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg

50 55 60

Pro Asn Ile Lys Arg Gly Asn Ile Thr Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile

65 70 75 80

Leu Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly

85 90 95

Arg Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser

100 105 110

His Leu Ser Arg Lys Ile Asn Gln Lys Gly Lys Met Thr Thr Thr Ser

115 120 125

Pro Glu Gln Glu Ser Thr Pro Glu Lys Thr Ala Asp Ser Asp Val Lys

130 135 140

Arg Glu Gly Thr Lys Gly Ser Gly Asp Gly Glu Phe Met Leu Asp Val

145 150 155 160

Asn Glu Phe Phe Asp Phe Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Gly Leu Asp Trp

165 170 175

Val Asn Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Asp Gln Ala Leu Thr Asp Lys

180 185 190

Trp

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atggctccga agagcagtga 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ttaccattta tcggtaagtg cc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ccgaatatca agcgaggcaa ca 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

atcggttcgt ccaggaagtc tc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gccatatttg attggaatgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ggtgccacaa ccttgatctt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ttgtcgtcat ttttcccttc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

agttgtcgtc atttttccct 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gaagttgtcg tcatttttcc 20

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggctccg aagagcagtg a 51

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt taccatttat cggtaagtgc c 51

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gatgggagta gcggggtctt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

tggtgcctga gtaagccaat 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gtgaatcctg aaaattcaaa cc 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

caccttcccc gtagtagcta 20

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

gactcactat agggcgaatt cgtgaatcct gaaaattcaa acc 43

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

gactcactat agggcgaatt cgggtcggat ttggaaatgc t 41

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

gactcactat agggcgaatt ccatccgtgt aattcaccca c 41

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gactcactat agggcgaatt ctaacttagg cgtacccgag c 41

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

tgataatgcc aggaattact agtcaccttc cccgtagtag cta 43

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

catatggcca tggaggccga attcacatat ggctccgaag agcagtga 48

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

ctgcagctcg agctcgatgg atccaggatc cttaccattt atcggtaagt gcc 53

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

aaatcggatc tggttccgcg tggatccatg gctccgaaga gcagtga 47

<210> 26

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

cggccgctcg agtcgacccg ggaattctta ccatttatcg gtaagtgcc 49

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

aatcctgaaa attcaaacca aacaaactaa atttgttg 38

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

ccgggccccc cctcgaggtc gacgtgaatc ctgaaaattc aaacc 45

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ccgggccccc cctcgaggtc gacgggtcgg atttggaaat gct 43

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

ccgggccccc cctcgaggtc gaccatccgt gtaattcacc cac 43

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

ccgggccccc cctcgaggtc gactaactta ggcgtacccg agc 43

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

gccgctctag aactagtgga tcccaccttc cccgtagtag cta 43

<210> 33

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

gccgctctag aactagtgga tccatggctc cgaagagcag tga 43

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

tcgataagct tgatatcgaa ttcttaccat ttatcggtaa gtgcc 45

Claims

1.茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用，其特征在于：所述茶树MYB类转录因子基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的茶树MYB类转录因子基因在调控茶树咖啡碱生物合成方面的应用，其特征在于：所述茶树MYB类转录因子基因编码的蛋白序列如序列表SEQ ID NO.2所示。