CN116024105A - 香菇液体菌种发酵培养基、其制备方法及发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香菇液体菌种发酵培养基、其制备方法及发酵培养方法，涉及香菇栽培技术领域。利用糖蜜和麸皮为主要原料，配合加入pH调节剂和镁盐，配方原材料成本低廉，来源广泛，经济效益显著；该培养基能为香菇液体菌种生长提供充足的营养物质和适宜的环境，明显提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。此外，本发明所提供的培养基不仅适用于实验室小规模科研实验，同样适用于工厂化生产，并且在工厂化实际生产中得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及香菇栽培技术领域，具体而言，涉及香菇液体菌种发酵培养基、其制备方法及发酵培养方法。
背景技术
香菇(Lentinula edodes)又名香信、花菇，素有“菇中皇后”之称，一直以来深受广大消费者的喜爱。香菇不仅具有很高的营养价值，含有18种氨基酸及丰富的维生素D原。香菇同时也是著名的药用菌，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇等功效，也是我国生产区域最广、总产量最高、影响最大的食用菌。
菌种生产作为食用菌产业的首道工序，关系着产业成败，其重要性不言而喻。目前传统菇农和香菇生产企业仍主要采用固体菌种逐级扩繁生产母种、原种和栽培种；固体菌种具有制种周期长、用种量大、劳动强度高、工艺繁琐、污染率高、菌龄不一致等弊端，导致经济效益下降。而液体菌种制种快、成本低、污染率低、接种效率高、发菌周期短、菌龄整齐一致，已成为食用菌制种产业的发展趋势。
目前，金针菇、杏鲍菇等食用菌的液体菌种技术已比较成熟，配方主要使用葡萄糖、白糖、豆粉和酵母膏等营养物质。使用现有配方，香菇液体菌种发酵时间较长，是金针菇等品种的一倍，而且菌丝生物量低，极大的限制了香菇液体菌种的产业化应用。因此创制经济适用的新型高效液体培养基配方，是实现香菇液体菌种产业化应用的前提，同时也是带动香菇产业发展壮大的基础。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供香菇液体菌种发酵培养基、其制备方法及发酵培养方法，旨在明显提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种香菇液体菌种发酵培养基，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份。
在可选的实施方式中，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂1.0-2.0份、镁盐1.0-2.0份和水1000份。
在可选的实施方式中，pH调节剂为磷酸二氢钾、柠檬酸、酒石酸、草酸和磷酸中的至少一种。
在可选的实施方式中，镁盐为硫酸镁和氯化镁中至少一种。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式中任一项香菇液体菌种发酵培养基的制备方法，包括：将香菇液体菌种发酵培养基中的各组分混合；
优选地，麸皮是粉碎至80-120目后，直接与其他原料混合；
优选地，还包括：将各原料混合之后进行灭菌；
更优选地，灭菌是在110-130℃下灭菌30-60min。
第三方面，本发明提供一种发酵培养方法，利用前述实施方式中任一项的香菇液体菌种发酵培养基对香菇种子液进行发酵培养。
在可选的实施方式中，将培养好的香菇种子液经过磁力搅拌打碎后接种至香菇液体菌种发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养时间为5-7d；
优选地，控制香菇种子液的接种量为0.1％-5％(v/v)。
在可选的实施方式中，香菇种子液的制备过程包括：将PDA母种接种于种子液培养基中，进行避光培养，培养时间为11-13d；其中，PDA母种是由香菇母种接种于PDA培养基中培养而得；
优选地，PDA母种的接种量为0.5-2％；
优选地，PDA母种经过直径4-6mm的打孔器取样后再进行接种。
在可选的实施方式中，在香菇液体菌种发酵培养基和种子液培养基中培养的条件均为：在23-27℃、避光的条件下利用恒温摇床进行培养，控制转速为110-150r/min。
在可选的实施方式中，按质量份数计，种子液培养基包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份；
优选地，pH调节剂为磷酸二氢钾；
优选地，镁盐为硫酸镁。
本发明具有以下有益效果：利用糖蜜和麸皮为主要原料，配合加入pH调节剂和镁盐，配方原材料成本低廉，来源广泛，经济效益显著；该培养基能为香菇液体菌种生长提供充足的营养物质和适宜的环境，明显提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
此外，本发明所提供的培养基不仅适用于实验室小规模科研实验，同样适用于工厂化生产，并且在工厂化实际生产中得到广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1液体菌种生长情况及菌球形态；
图2为实施例2液体菌种生长情况及菌球形态；
图3为实施例3液体菌种生长情况及菌球形态；
图4为对比例1液体菌种生长情况及菌球形态；
图5为对比例2液体菌种生长情况及菌球形态；
图6为对比例3液体菌种生长情况及菌球形态；
图7为对比例4液体菌种生长情况及菌球形态；
图8为对比例5液体菌种生长情况及菌球形态；
图9为不同液体培养基配方的菌丝生物量；
图10为不同液体培养基配方的菌丝发酵固形物体积比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种香菇液体菌种发酵培养基，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份。
需要说明的是，利用糖蜜和麸皮为主要原料，配合加入pH调节剂和镁盐，配方原材料成本低廉，来源广泛，经济效益显著；该培养基能为香菇液体菌种生长提供充足的营养物质和适宜的环境，明显提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
具体地，在水用量为1000份的条件下，糖蜜的用量可以为15份、16份、17份、18份、19份、20份等，麸皮的用量可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份等，pH调节剂的用量可以为0.5份、1.0份、1.5份、2.0份、3.0份、4.0份、5.0份等，镁盐的用量可以为0.5份、1.0份、1.5份、2.0份、3.0份、4.0份、5.0份等。
糖蜜是制糖工业的副产品，含有大量可发酵糖、泛酸、生物素和矿物质，是很好的发酵原料，来源丰富且价格低廉。
麦麸是小麦粉、大麦粉和燕麦粉等加工的主要副产物，富含膳食纤维、酚类、B族维生素和矿物质等，相对常用氮源豆粕、蛋白胨、酵母膏和酵母粉等，价格低，效果好。
在优选的实施例中，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂1.0-2.0份、镁盐1.0-2.0份和水1000份。通过进一步调控原料的用量，有利于进一步提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
在一些实施例中，pH调节剂为磷酸二氢钾，镁盐为硫酸镁，但不限于此。
本发明实施例还提供一种香菇液体菌种发酵培养基的制备方法，包括：将香菇液体菌种发酵培养基中的各组分混合，通过培养基配方组成的改进使制备得到的培养基能够为香菇液体菌种生长提供充足的营养物质和适宜的环境，明显提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
在一些实施例中，麸皮是粉碎至80-120目后，直接与其他原料混合。麸皮粉碎过筛后直接添加，无需水煮过滤，既操作简单，又保留了麸皮所有的营养，菌种后劲足，不容易老化，而且操作简便。
在实际操作过程中，混料的过程包括：根据培养基配方准确称量各种原材料加入容器中，加水搅拌均匀，定容至所需体积。
在一些实施例中，还包括：将各原料混合之后进行灭菌，以避免培养过程引入其他菌种，干扰香菇菌种的生长。灭菌的方式不限，可以是在110-130℃下灭菌30-60min，以充分灭菌，冷却后待接种。
具体地，灭菌温度可以为110℃、115℃、120℃、121℃、125℃、130℃等，灭菌时间可以为30min、40min、50min、60min等。
本发明实施例还提供一种发酵培养方法，利用上述香菇液体菌种发酵培养基对香菇种子液进行发酵培养，通过培养基的优化，可以显著提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。具体而言包括如下步骤：
S1、香菇种子液制备
香菇种子液的制备过程包括：将PDA母种接种于种子液培养基中，进行避光培养，培养时间为11-13d(天)；其中，PDA母种是由香菇母种接种于PDA培养基中培养而得。
具体地，培养时间可以为11d、12d、13d等。若在培养之前进行打碎，则培养时间可以缩短至5-7d。打碎处理时使三角瓶等容器位于搅拌装置的边缘，这样磁力转子就位于三角瓶的边缘(这样，磁转子在三角瓶的边缘，磁转子在旋转的过程中，和三角瓶的瓶壁不断的摩擦，在这个过程中把母种块打碎)。
具体地，PDA母种可以是自主培养，也可以是市购。示例性地，PDA培养基组成可以是：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克和蒸馏水1000毫升。PDA母种是将香菇母种接种于PDA培养基中培养，培养时间可以为10-12d。
在一些实施例中，PDA母种的接种量为0.5-2％(0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％等)，也就是说100质量份的种子液培养基接种0.5-2质量份的PDA母种。在实际操作过程中，每500g种子液培养基对应PDA母种的接种量为12-24片，如可以为12片、13片、14片、15片、16片、17片、18片、19片、20片、21片、22片、23片、24片等，每片直径为4mm-6mm。PDA母种经过直径4-6mm的打孔器取样后再进行接种，以得到均一的种子液。打孔器的直径可以为4mm、5mm、6mm等。
在一些实施例中，培养的条件为：在23-27℃、避光的条件下利用恒温摇床进行培养，控制转速为110-150r/min。在实际操作过程中，可以利用恒温摇床避光培养，将接种后的三角瓶放入恒温摇床避光培养。
具体地，培养温度为常温，如可以为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃等，转速可以为110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min等。
在一些实施例中，按质量份数计，种子液培养基包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份。但不限于此，利用本发明实施例提供的香菇液体菌种发酵培养基制备种子液，较为适宜。
具体地，pH调节剂为磷酸二氢钾、柠檬酸、酒石酸、草酸和磷酸中的至少一种，镁盐为硫酸镁和氯化镁中至少一种，但不限于此。
S2、香菇液体菌种培养
将培养好的香菇种子液经过磁力搅拌打碎后接种至香菇液体菌种发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养时间为5-7d，打碎之后可以显著降低发酵培养的时间。利用本发明实施例提供的香菇液体菌种发酵培养基进行发酵，可以提高香菇制种效率，提高液体菌种的菌丝生物量和菌丝生长速度。
进一步地，控制香菇种子液的接种量为0.1％-5％(v/v)，如可以为0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％等，在实际生产时可以控制接种量为0.1％-0.5％，在实验室操作时可以将接种量扩大至5％。
在一些实施例中，在香菇液体菌种发酵培养基的培养条件为：在23-27℃、避光的条件下利用恒温摇床进行培养，控制转速为110-150r/min。具体地，培养温度为常温，如可以为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃等，转速可以为110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min等。
需要补充的是，本发明实施例所提供的液体菌种的制作方法具有以下优点：
(1)液体菌种制作方法简单，生产成本低廉。相比固体菌种生产，不仅所需原料便宜，而且由于不使用传统的菌种瓶或菌种袋，可省去装瓶/袋、挖瓶、接种等很多繁杂工艺，同时由于采取配套的高效率接种机和接种枪等接种工具接种，可节省大量的劳动力、能耗和空间等，降低生产成本。
(2)采用液体菌种，加快生长速度，生产周期短。采用传统的固体菌种生产方式，需要经过斜面母种→固体原种→固体栽培种等工序，制种周期87-98天左右，而采用液体菌种，经斜面母种→摇瓶菌种→发酵罐液体菌种，制种周期只要23-26天左右，制种周期缩短了70％以上，节约时间成本。
(3)液体菌种接种出菇整齐，管理方便。液体菌种的菌龄一致、流动性好、活性强、萌发点多，接种香菇菌棒后菌丝萌发快，生长速度一致，原基和出菇的时间一致，成品率高，便于采收、管理和加工，减少人力物力，提高栽培效益。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种香菇的发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)香菇种子液制备
种子液培养基组成及制备：糖蜜20g、麸皮10g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
接种培养：使用1000mL三角瓶每瓶装约500mL的液体培养基，121℃下灭菌30min，冷却后接种；用直径5mm打孔器取12块培养好的PDA母种块接种于种子液培养基中。将接种后的三角瓶放入恒温摇床，140r/min，25℃避光培养12d。
(2)液体菌种培养
香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法为：糖蜜15g，麸皮10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。根据培养基配方，准确称量各种原材料，加入容器中，加水搅拌均匀，定容至所需体积，然后121℃灭菌30min，冷却后待接种。
发酵培养：将步骤(1)中的制备得到的香菇种子液磁力搅拌打碎后，接种至香菇液体菌种发酵培养基中，接种量控制在5％。放入恒温摇床，140r/min，25℃避光培养6d。
测试方法：整个液体菌种发酵培养过程中观察菌丝生长情况及菌丝形态，摇瓶培养结束后，将装有菌丝的菌液倒入到量筒中，统一静置15min后，记录菌丝体积与总体积，测定计算菌丝发酵固形物体积比。摇瓶培养结束后，用无纺布过滤滤液，用无菌水洗涤3次，收集菌丝球置于50℃恒温烘箱中烘干至恒重，计算菌丝生物量。
实施例2
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：糖蜜20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
实施例3
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：糖蜜20g，麸皮15g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：白砂糖20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：葡萄糖20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：糖蜜20g，豆粉3.55g(与10g麸皮的含氮量相等)，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：糖蜜20g，酵母膏3.69g(与10g麸皮的含氮量相等)，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
对比例5
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)中香菇液体菌种发酵培养基的组成及制备方法，具体如下：白砂糖20g，豆粉3.55g(与10g麸皮的含氮量相等)，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，加蒸馏水定容至1000mL。
试验例1
实施例的新型液体培养基和对比例液体培养基接种同一生长状态的香菇种子液，并放置在同一环境条件下进行培养。对培养过程进行实时监测，观察其生长情况及菌球形态，结果见图1-图8和表1。
表1不同液体菌种配方发酵培养结果
注：表中不同小写字母表示在α＝0.05水平上的差异显著，不同大写字母表示在α＝0.01水平上的差异极显著。摇瓶培养结束后，收集菌丝烘干至恒重，记录实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5的菌丝生物量，做成柱状图，将常用配方(对比例5)作为对照，SPSS处理数据使用邓肯进行显著性分析，**表示具有极显著性差异，*表示具有显著性差异，结果如图9。实施例生物量均比对比例极显著提高，其中实施例3比对比例5提高336％。
将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4中菌丝发酵固形物体积比做成柱状图，结果如图10。实施例生物量均比对比例显著提高，其中实施例3比对比例5提高207％。
如图9和图10所示，与对比例相比，实施例菌丝发酵固形物体积比更高，菌丝生物量显著高于对比例。实施例的菌球密集，悬浮在液体培养基中，活力旺盛，培养液澄清。糖蜜作为碳源时，菌丝发酵固形物体积比和菌丝生物量显著高于常用的葡萄糖作为碳源。可能是由于糖蜜属于复合碳源，提供的营养物质更为丰富，有利于香菇菌丝生长，而且糖蜜为制糖工艺的废弃品，价格相对低廉，同时利于环保，是制作香菇液体菌种中一种经济适用的原材料。本发明选用麸皮作为氮源，单一氮源即可满足香菇液体菌种的生长，麸皮来源广，成本低，简化液体菌种的制作方法，易于操作。
以上实验充分证明，相比于目前现有的香菇液体培养基，首次将糖蜜与麸皮有机组合，本发明的新型液体培养基中含有的营养成分更能满足香菇液体菌种的生长，糖蜜属于复合碳源含有多种糖类，同时含有生物活性物质等促生长因子，麸皮高温处理可溶性蛋白含量高，同时含有多种纤维素，适宜香菇菌丝生长。碳源氮源的来源广泛，价格低廉，制作方法简单。本发明的香菇液体培养基不仅促进菌丝生长延长菌种寿命，而且提高适应新环境的能力，同时相比于固体菌种，液体培养繁殖扩大菌种，降低菌种成本。
需要补充的是，本新型高效香菇液体菌种培养基，不仅适用于三角瓶阶段，还可以应用于大型发酵罐，并得以大规模应用，实现了香菇液体菌种的产业化。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种香菇液体菌种发酵培养基，其特征在于，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份。
2.根据权利要求1所述的香菇液体菌种发酵培养基，其特征在于，按质量份数计，包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂1.0-2.0份、镁盐1.0-2.0份和水1000份。
3.根据权利要求1或2所述的香菇液体菌种发酵培养基，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸二氢钾、柠檬酸、酒石酸、草酸和磷酸中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的香菇液体菌种发酵培养基，其特征在于，所述镁盐为硫酸镁和氯化镁中至少一种。
5.一种权利要求1-4中任一项所述香菇液体菌种发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括：将所述香菇液体菌种发酵培养基中的各组分混合；
优选地，麸皮是粉碎至80-120目后，直接与其他原料混合；
优选地，还包括：将各原料混合之后进行灭菌；
更优选地，所述灭菌是在110-130℃下灭菌30-60min。
6.一种发酵培养方法，其特征在于，利用权利要求1-4中任一项所述的香菇液体菌种发酵培养基对香菇种子液进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于，将培养好的香菇种子液经过磁力搅拌打碎后接种至所述香菇液体菌种发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养时间为5-7d；
优选地，控制所述香菇种子液的接种量为0.1％-5％(v/v)。
8.根据权利要求7所述的发酵培养方法，其特征在于，所述香菇种子液的制备过程包括：将PDA母种接种于种子液培养基中，进行避光培养，培养时间为11-13d；其中，所述PDA母种是由香菇母种接种于PDA培养基中培养而得；
优选地，所述PDA母种的接种量为0.5-2％；
优选地，所述PDA母种经过直径4-6mm的打孔器取样后再进行接种。
9.根据权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于，在所述香菇液体菌种发酵培养基和所述种子液培养基中培养的条件均为：在23-27℃、避光的条件下利用恒温摇床进行培养，控制转速为110-150r/min。
10.根据权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于，按质量份数计，所述种子液培养基包括糖蜜15-20份、麸皮10-15份、pH调节剂0.5-5份、镁盐0.5-5份和水1000份；
优选地，所述pH调节剂为磷酸二氢钾；
优选地，所述镁盐为硫酸镁。
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