CN116024099A - 草酸青霉菌株、生防剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草酸青霉菌株、生防剂及应用。从土壤中分离筛选得到一株真菌，结合形态学特征及分子鉴定将该菌株鉴定为草酸青霉，并命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)PO14，保藏号为CGMCC No.22461。所述草酸青霉PO14对藤仓镰刀菌孢子萌发和菌丝生长均有较强的抑制作用，可用于水稻恶苗病的防治。草酸青霉PO14菌株可用于生防剂或生物农药的开发，在水稻恶苗病生物防冶上有较好的应用前景。

Description

草酸青霉菌株、生防剂及其应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别是涉及草酸青霉菌株、生防剂及其应用。

背景技术

水稻是世界三大粮食作物之一，其种植面积广泛，产量丰富。据统计，全世界有一半的人口食用稻，主要在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区。因此，保障水稻的产量和质量，对我国的粮食生产与国民经济都具有重大意义。

水稻在生产过程中受到许多真菌病害的危害，特别是水稻恶苗病，该病害自1898年在日本首次报道以来，几乎在世界所有水稻种植区均有发生，并造成严重的产量损失。此外，水稻恶苗病病原菌藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)还会产生伏马菌素等水溶性代谢产物，该类毒素会污染粮食及其制品，并能引起人畜中毒，严重危害粮食安全以及人畜的生命健康。

由于藤仓镰刀菌能产生多种赤霉素，很难培育出高水平的抗病品种，因此，水稻恶苗病的防治仍以化学药剂种子处理为主。在中国，目前有152个药剂产品(包括单剂和复配剂)登记用于水稻恶苗病防治，常用药剂产品有效成分包括多菌灵，咪鲜胺，氰烯菌酯，戊唑醇等。但由于化学杀菌剂的长期使用，水稻恶苗病菌对多菌灵和咪鲜胺均已产生明显抗性，对氰烯菌酯的抗性也在迅速扩展，抗药性问题日益严峻。这使得水稻恶苗病病害难以控制，并且还造成环境污染等问题。因此，植物病害防治的重点应由化学防治逐步转向绿色安全的生物防治上。

生物防治具有持效期长、低污染、低残留、不易产生抗药性、利于人畜安全和环境保护等优点。利用生防菌株及其代谢物防治水稻恶苗病病害有助于保障水稻的安全，减少生态污染问题，具有经济和生态双重效益。目前，水稻恶苗病病害的生防研究主要集中在放线菌(Actinomycetesspp.)芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和木霉菌(Trichoderma spp.)等微生物。

发明内容

本发明旨在解决水稻恶苗病防治困难的问题，提供了一株草酸青霉菌株、该菌株制备的生防剂及应用。所述草酸青霉PO14对藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)孢子萌发和菌丝生长均有较强的抑制作用，可用于水稻恶苗病的防治。草酸青霉PO14可为生防剂或生物农药开发提供优良的菌株，在水稻恶苗病生物防冶上有较好的应用前景。

本发明提供的草酸青霉菌株，分离于安徽省淮溪县五铺农场的田间土壤，分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)PO14，保藏时间为2021年6月21日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22461。

所述草酸青霉菌株对藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)菌丝生长和孢子萌发均有较强的抑制作用，在拮抗藤仓镰刀菌中具有良好的应用。

此外，所述草酸青霉菌株能够抑制核盘菌、灰霉菌、禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌、坎诺单孢菌、假禾谷镰刀菌和禾顶囊壳菌菌丝生长，具有良好的拮抗效果。

基于所述草酸青霉菌株对藤仓镰刀菌良好的拮抗效果，所述草酸青霉菌株在防治水稻恶苗病中具有良好的应用前景。

本发明还提供了所述草酸青霉菌株在制备防治水稻恶苗病的生防产品中的应用。

可选的，所述生防产品为生防剂或生物农药。

例如本发明提供的一种生防剂，包含所述草酸青霉菌株的孢子悬浮液。

可选的，所述孢子悬浮液的制备方法为：

将活化的草酸青霉菌株接种至PDA固体培养基中培养5～7天，使用无菌水冲洗，得到所述孢子悬浮液。

所述生防剂可应用于防治由藤仓镰刀菌引起的水稻恶苗病。

例如本发明提供的一种防治水稻恶苗病的方法，包括：

将水稻种子浸泡于所述生防剂；

或在水稻苗期，将所述生防剂喷施于水稻苗的茎基部。

可选的，所述生防剂的浓度为1×10⁶～1×10⁷cfu/mL。

可选的，所述水稻种子的浸泡时间为3～5h。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

(1)本发明提供的草酸青霉PO14对藤仓镰刀菌具有显著的抑制效果，在平板对峙试验中，能有效抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长；其孢子悬液能有效抑制藤仓镰刀菌孢子的萌发。

(2)本发明提供的草酸青霉PO14在盆栽试验条件下能显著抑制有藤仓镰刀菌引起的徒长，可用其开发出生防产品，应用于对水稻恶苗病的生物防治。

附图说明

图1为菌株4C17的菌落形态；

图2为草酸青霉PO14的系统发育树；

图3为草酸青霉PO14与藤仓镰刀菌的平板对峙试验的结果，A：藤仓镰刀菌，B：B1为藤仓镰刀菌，B2为草酸青霉；

图4为草酸青霉PO14孢子悬液对藤仓镰刀菌孢子萌发的影响结果，A：藤仓镰刀菌孢子，B为藤仓镰刀菌和草酸青霉孢子混合液；

图5A为草酸青霉PO14对水稻恶苗病的防治效果图，A：清水对照组，B：草酸青霉PO14处理组，C：藤仓镰刀菌对照组，D：咯菌腈处理组；

图5B为草酸青霉PO14对水稻株高的影响图，A：清水对照组，B：草酸青霉PO14处理组，C：藤仓镰刀菌对照组，D：咯菌腈处理组；

图6为草酸青霉PO14与其他七种病原菌的平板对峙试验结果，A：六种病原菌，其中A1为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，A2为灰霉菌(Botrytis cinerea)，A3为禾谷丝核菌(Rhizoctonia zeae)，A4为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，A5为坎诺单孢菌(Monosporascus cannonballu)，A6为假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)，A7为禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)；B：草酸青霉PO14与七种病原菌的对峙。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。

以下实施例涉及的培养基和试剂组分包括：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉12g，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min，自然pH。

0.7mol/L NaCl溶液：NaCl 40.9g，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min，自然pH。

CMC培养液：CMC-Na 15.0g，酵母膏1g，NH₄NO₃ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min。

实施例1土壤样品的采集和生防菌的分离

土壤样品于2020年9月在安徽省淮北市淮溪县五铺农场采集。称取1g田间土壤加入到10mL氯化钠溶液(浓度为0.7mol/L)中，将溶液震荡处理1min，混匀后制成土壤悬液，再将土壤悬液用0.7mol/L的氯化钠溶液稀释至10^-1、10^-2、10^-3三个梯度。分别吸取100μL不同浓度梯度的土壤悬液，涂布于含抗生素的PDA培养基上，每个梯度三个重复。平板倒置于25℃恒温培养箱中培养。每天观察平板，并挑取平板上的单菌落进行分离纯化，得到的纯化菌株在4℃无菌环境中进行保存备用，并根据采集地区进行分类、编号。

将纯化的菌株接种于PDA平板上培养3d，随后用内径为6mm的打孔器在菌落边缘打孔，挑取菌碟接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm藤仓镰刀菌菌碟。菌株与藤仓镰刀菌之间的间隔约为6cm。将PDA平板放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察菌株是否抑制藤仓镰刀菌菌丝生长，并计算菌株对藤仓镰刀菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组藤仓镰刀菌菌落直径×100％。其中，一株编号为4C17的菌株在平板对峙试验中对藤仓镰刀菌菌丝生长有显著的抑制效果。

实施例2菌株4C17的形态学观察和鉴定

将菌株4C17接种于PDA平板上，25℃培养恒温培养。菌落初始为白色，近圆形，7d后逐渐变为青绿色，边缘齐整，菌落表面呈粉末状，产生大量分子孢子并伴随菌丝绒毛，无渗出液参见图1。

提取菌株DNA，使用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGT AGGTGAACCTG CGG-3’)(SEQ IDNO：1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(SEQ ID NO：2)对其进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：上下游引物(10μmol/L)ITSl和ITS4各1μL，DNA模板2.5μL，Taq Mix 12.5μL，ddH₂O 8μL。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，53℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物送至杭州擎科生物科技公司进行序列分析，序列结果如下：

CCTCACTCCATAAATAACCCTTCCGTTAGGGGGACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAAGGAAATTTAAGTAAA(SEQ ID NO：3)

测序结果在NCBI上进行Blast比对分析并构建系统发育树(图2)，结合形态学分析，鉴定该菌株为草酸青霉，分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)PO14，并将其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No：22461。

实施例3草酸青霉PO14抑制藤仓镰刀菌菌丝生长

用内径为6mm的打孔器在已活化好的草酸青霉PO14外圈打孔，接种至直径为9cmPDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm藤仓镰刀菌菌碟。两菌之间的间隔约为6cm。以仅在PDA平板一侧接种藤仓镰刀菌菌碟做为阴性对照，试验重复3次。将平板放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌效果。菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。

参见图3，相比于对照组A，处理组B中藤仓镰刀菌(B1)受到草酸青霉PO14(B2)明显的抑制，藤仓镰刀菌的菌丝生长抑制率为48.4％。

实施例4草酸青霉PO14对藤仓镰刀菌孢子萌发的影响

在藤仓镰刀菌平板的边缘部位打三个直径为6mm的菌碟，将其放入装有100mLCMC培养液的锥形瓶中，在25℃，180rpm条件下震荡培养3d后，用3层滤纸进行过滤。滤液经5000rpm离心10min，得到藤仓镰刀菌的孢子。将草酸青霉PO14活化至PDA平板上，在25℃条件下培养7d，随后用10mL无菌水洗涤草酸青霉PO14平板，得到一定浓度的草酸青霉孢子。将1mL 10⁵CFU/mL草酸青霉PO14孢子与1mL 10⁵CFU/mL藤仓镰刀菌孢子混合，置于180rpm摇床中培养4h。以1mL 10⁵CFU/mL藤仓镰刀菌孢子作为阴性对照。4h之后，将直径为7mm的滤纸片放置于PDA平板中心，分别取10μL混合液和藤仓镰刀菌孢子液点样于滤纸片上。平板放置于25℃恒温培养箱中培养，3d后观察孢子萌发情况。结果如图4所示，对照组平板上藤仓镰刀菌孢子正常萌发，菌丝快速生长至平板边缘(图4A)；处理组中(图4B)，平板上仅有草酸青霉PO14的孢子萌发并生长，说明PO14孢子显著抑制藤仓镰刀菌孢子的萌发。

实施例5水稻恶苗病防治试验

将水稻种子用3％的次氯酸钠溶液浸泡3h进行消毒，随后用无菌水将水稻种子清洗3次。取无菌的种子于25℃浸种24h，34℃催芽24h。当芽长达到谷长一半时，选择芽长整齐一致的芽谷，分成4组,每组30颗,将芽谷放入100ml锥形瓶中。其中A组为空白对照组，B组为PO14+藤仓镰刀菌处理组，C组为藤仓镰刀菌处理组，D组为藤仓镰刀菌+咯菌腈处理组。分别在处理组的锥形瓶中加入19mL的蒸馏水、1mL藤仓镰刀菌孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)；在对照组的锥形瓶中加入20mL蒸馏水。在28℃、90rpm条件下震荡培养12h后，在B组加入1mL草酸青霉PO14孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)，在D组中加入1mL咯菌腈，相同条件下继续摇培12h，实验重复三次。挑选30颗长势一致的芽谷播种在穴盘上，于28℃，12h光照，相对湿度70-80％条件下培养。幼苗培养14d左右，徒长和倒生根现象出现后，进行数据统计分析。病株率(％)＝病苗数/调查总苗数×100。

参见图5A、B，空白对照组(A)中，水稻植株正常生长，平均株高为14.3cm；藤仓镰刀菌处理组(C)水稻恶苗病发生严重，病苗徒长，叶片叶鞘细长，叶色发黄，病株率达100％，平均株高约为23.8cm；经过草酸青霉PO14和咯菌腈处理后，水稻恶苗病得到明显抑制，B组水稻病株率为25.0％，平均株高仅为16.6cm；D组水稻病株率为9.8％，平均株高仅为15.0cm。经分析可知，草酸青霉PO14对水稻恶苗病有显著抑制作用，可用其开发出生防产品，应用于对水稻恶苗病的生物防治。

实施例6草酸青霉PO14对其他病原菌的抑制效果

用内径为6mm的打孔器在已活化好的草酸青霉PO14外圈打孔，接种至直径为9cmPDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia zeae)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、坎诺单孢菌(Monosporascus cannonballu)、假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)和禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)七种病原菌菌碟。两菌之间的间隔约为6cm。以仅在PDA平板一侧接种病原菌菌碟为阴性对照，重复3次。将平板放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌效果。

参见图6，草酸青霉PO14对核盘菌(A1)，灰霉菌(A2)，禾谷丝核菌(A3)，尖孢镰刀菌(A4)，坎诺单孢菌(A5)，假禾谷镰刀菌(A6)以及禾顶囊壳菌(A7)七种病原菌菌丝生长均具有明显的抑制作用。其中，草酸青霉PO14对假禾谷镰刀菌的抑制率最低，对禾顶囊壳菌的抑制率最高。

本发明筛选出一株对藤仓镰刀菌具有良好的拮抗作用的草酸青霉PO14，为解决水稻恶苗病防治困难问题提供一条有效的途径。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.草酸青霉菌株，其特征在于，分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)PO14，保藏号为CGMCC No.22461。

2.根据权利要求1所述的草酸青霉菌株在拮抗藤仓镰刀菌、核盘菌、灰霉菌、禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌、坎诺单孢菌、假禾谷镰刀菌和禾顶囊壳菌中的应用。

3.根据权利要求1所述的草酸青霉菌株在防治水稻恶苗病中的应用。

4.根据权利要求1所述的草酸青霉菌株在制备防治水稻恶苗病的生防产品中的应用。

5.一种生防剂，其特征在于，包含如权利要求1所述草酸青霉菌株的孢子悬浮液。

6.根据权利要求5所述的生防剂，其特征在于，所述孢子悬浮液的制备方法为：

将活化的草酸青霉菌株接种至PDA固体培养基中培养5～7天，使用无菌水冲洗，得到所述孢子悬浮液。

7.根据权利要求5所述的生防剂在防治由藤仓镰刀菌引起的水稻恶苗病中的应用。

8.防治水稻恶苗病的方法，其特征在于，将水稻种子浸泡于如权利要求5所述的生防剂；

或在水稻苗期，将如权利要求5所述的生防剂喷施于水稻苗的茎基部。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生防剂的浓度为1×10⁶～1×10⁷cfu/mL；

所述水稻种子的浸泡时间为3～5h。

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