CN116008437A - 一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法 - Google Patents

一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法 Download PDF

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CN116008437A CN202310109504.6A CN202310109504A CN116008437A CN 116008437 A CN116008437 A CN 116008437A CN 202310109504 A CN202310109504 A CN 202310109504A CN 116008437 A CN116008437 A CN 116008437A
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周豪
尹怡
张媚玉
郑光明
单奇
马丽莎
林嘉薇
李丽春
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Abstract

本发明提供了一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，涉及分析化学领域和兽药残留检测技术领域，包括以下步骤：S1.水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯混合，振荡提取，上清液，氮吹干，用乙腈水溶液复溶；S2：采用固相萃取柱，进行净化，收集洗脱液，氮吹干，用乙腈水溶液复溶，滤膜过滤，得待测液；S3：对所述待测液进行手性液相色谱‑串联质谱分析检测，测得水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留。基于液液萃取和阴离子交换固相萃取净化，以及手性LC‑MS/MS技术的高选择性和高灵敏度特性，建立了提取方便、简单，可操作性强，重现好和具有通用性的检测方法。

Description

一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域和兽药残留检测技术领域，尤其涉及一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法。
背景技术
甲霜灵是一种广谱、高效、低毒的内吸性酰胺类杀菌剂，通常作为农药用于防治谷物、蔬菜和水果的枯萎病、晚疫病和霜霉病等疾病。研究发现低浓度甲霜灵可抑制水霉菌丝的生长，高浓度时可杀死水霉菌。水霉病是水产养殖中危害较严重的疾病之一，从鱼卵到成鱼均可发生，严重影响水产养殖业的发展。甲霜灵作为禁用药物孔雀石绿的替代药物，在水产养殖实践应用中显示极好的抗水霉效果和安全性，用于预防和治疗水霉菌等真菌感染引起的淡水鱼类疾病。
甲霜灵结构中存在立体中心，是由一对对映体组成的手性化合物。甲霜灵的杀菌活性主要来自R-对映体，其活性大约是S-对映体的1000倍。目前，在许多国家和地区高活性的R-甲霜灵已经取代了外消旋体的使用。甲霜灵在生物体内很容易通过酯水解生成羧酸代谢物(即甲霜灵酸)，甲霜灵酸也是一种手性化合物。手性药物对映体在生物体内的代谢、转化等生命活动过程往往存在较大差异。因此，在对映体水平上研究手性兽药的代谢和残留消除，可以对手性兽药的生态风险和食品安全风险进行更准确地评价，而建立可靠的分离分析方法成为研究手性兽药代谢行为的基础和关键。
目前，尚未制定水产品中甲霜灵的最大残留限量标准，关于水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体的残留分析方法也未见报道。为防止不规范用药可能导致的水产品质量安全等问题，加强水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体的监测和残留分析是重要和紧迫的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，基于液液萃取和阴离子交换固相萃取净化，以及手性LC-MS/MS技术的高选择性和高灵敏度特性，建立了提取方便、简单，可操作性强，灵敏度高，重现好和具有通用性的检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，包括以下步骤：
S1.水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯按照1～3g：10mL混合，振荡提取1～3次，合并上清液，氮吹干所述上清液后，用乙腈水溶液复溶，得待净化液；
S2：采用固相萃取柱，对所述待净化液进行净化，收集洗脱液，氮吹干所述洗脱液后，用乙腈水溶液复溶，滤膜过滤，得待测液；
S3：对所述待测液进行手性液相色谱-串联质谱分析检测，测得水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
其中，液相色谱所用色谱柱为多糖类手性色谱柱；所述质谱采用电喷雾电离正离子多反应检测模式进行。
优选的，所述水产品为草鱼、鲫鱼、鲤鱼、乌鳢、罗非鱼和大口黑鲈中的一种。
优选的，S1中所述水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯混合为涡旋混匀，涡旋时间为0.5～2min；S1中所述每次振荡提取时间为10～20min；S1中振荡提取后，离心获得上清液，离心转速为4500～5500r/min，离心时间为3～7min；S1中氮吹在35～45℃水浴中进行，S1中所述乙腈水溶液的体积浓度为5～20％，乙腈水溶液用量为2～4mL。
优选的，S2中所述净化具体为：依次用甲醇、水、氨水溶液活化固相萃取柱，将待净化液上样，氨水溶液和甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，甲酸甲醇溶液洗脱。
优选的，S2所述淋洗用氨水溶液用量为2～4mL，体积浓度为0.1～1％，淋洗用甲醇水溶液用量为2～4mL，体积浓度为5～20％；S2中所述甲酸甲醇溶液用量为2～4mL，体积浓度为0.1～5％；S2中所述氮吹在35～45℃水浴中进行；S2中所述乙腈水溶液的体积浓度为20～70％，乙腈水溶液用量为0.3～0.7mL。
优选的，S2中所用固相萃取柱为MAX小柱，型号为3cc/60mg，60μm。
优选的，S3中所述多糖类手性色谱柱内径为2.1～4.6mm，柱长为100～250mm，填料粒径为3～10μm；固定相为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；流动相为甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液，体积比为1：(1～5)；水溶液和乙腈溶液中甲酸的体积浓度分别为0.05～0.2％；流速为0.2～0.6mL/min，柱温为20～35℃，进样体积为1～10μL。
优选的，S3中所述电喷雾电离正离子多反应监测模式，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析；电喷雾电压为3500～5500V，滞留时间为20～100ms，氮气流速为6～12L/min，离子源温度为300～500℃，甲霜灵的定量离子对为280.2/220.1、定性离子对为280.2/192.1，甲霜灵酸的定量离子对为266.1/220.1、定性离子对为266.1/192.1；所用内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，内标甲霜灵氘代物离子对为286.2/226.2。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明建立了一种手性LC-MS/MS方法分离分析甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体；所建立的方法在较短时间内实现了两对对映异构体的完全分离。
2.本发明将阴离子交换固相萃取净化和手性LC-MS/MS相结合，建立了水产品中甲霜灵单一对映体和甲霜灵酸单一对映体的残留分析方法；对样品提取条件、固相萃取的上样、淋洗和洗脱程序分别进行了优化，所建立的方法具有较高的灵敏度和回收率。
3.本发明具有简单、灵敏、稳定、可靠，方便和可操作性强等特点，适用于水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体的残留确证和定量分析检测，这将为手性药物残留分析检测研究提供新思路、新手段和技术支持。
附图说明
图1为甲霜灵和甲霜灵酸结构式，其中*为手性中心；
图2为甲霜灵和甲霜灵酸对映体在(A)
Figure BDA0004078760250000031
(B)
Figure BDA0004078760250000032
(C)TeicoShell和(D)VancoShell手性色谱柱上的对映体分离效果，其中(1)为S-甲霜灵酸；(2)为R-甲霜灵酸；(3)为S-甲霜灵；(4)为R-甲霜灵；
图3为不同提取溶剂对甲霜灵和甲霜灵酸回收率的影响；
图4为不同类型固相萃取柱对甲霜灵和甲霜灵酸的萃取效果；
图5为不同淋洗溶剂对甲霜灵和甲霜灵酸回收率的影响；
图6为不同洗脱溶剂对甲霜灵和甲霜灵酸回收率的影响；
图7为洗脱溶剂体积对甲霜灵和甲霜灵酸回收率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，包括以下步骤：
S1.水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯按照1～3g：10mL混合，振荡提取1～3次，合并上清液，氮吹干所述上清液后，用乙腈水溶液复溶，得待净化液；
S2：采用固相萃取柱，对所述待净化液进行净化，收集洗脱液，氮吹干所述洗脱液后，用乙腈水溶液复溶，滤膜过滤，得待测液；
S3：对所述待测液进行手性液相色谱-串联质谱分析检测，测得水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
其中，液相色谱所用色谱柱为多糖类手性色谱柱；所述质谱采用电喷雾电离正离子多反应检测模式进行。
在本发明中，水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯混合，振荡提取，取上清液。在本发明中，所述水产品优选为草鱼、鲫鱼、鲤鱼、乌鳢、罗非鱼和大口黑鲈中的一种，所述水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯的混合比例优选为1～3g：10mL，进一步优选为2g：10mL，所述水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯混合优选为涡旋混匀，涡旋时间优选为0.5～2min，进一步优选为1min，所述振荡提取次数优选为1～3次，进一步优选为2次，所述每次振荡提取时间优选为10～20min，进一步优选为12～18min，再进一步优选为14～16min，所述振荡提取后，优选为离心获得上清液，离心转速优选为4500～5500r/min，进一步优选为4800～5200r/min，再进一步优选为4900～5100r/min，离心时间优选为3～7min，进一步优选为4～6min，再进一步优选为5min。
在本发明中，氮吹干所述上清液后，用乙腈水溶液复溶，得待净化液；所述氮吹优选为在35～45℃水浴中进行，进一步优选为38～42℃水浴，再进一步优选为39～41℃水浴，所述乙腈水溶液的体积浓度优选为5～20％，进一步优选为8～18％，再进一步优选为10～16％，所述乙腈水溶液用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL。
在本发明中，采用固相萃取柱，对所述待净化液进行净化，收集洗脱液。在本发明中，所述净化具体优选为：依次用甲醇、水、氨水溶液活化固相萃取柱，将待净化液上样，氨水溶液和甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，甲酸甲醇溶液洗脱。在本发明中，所述甲醇用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，所述水用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，所述活化用氨水溶液用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，活化用氨水溶液体积浓度优选为0.1～1％，进一步优选为0.2～0.8％，再进一步优选为0.4～0.6％，所述固相萃取柱优选为MAX小柱，进一步优选为型号为3cc/60mg，60μm的MAX小柱，所述淋洗用氨水溶液用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，淋洗用氨水溶液体积浓度优选为0.1～1％，进一步优选为0.2～0.8％，再进一步优选为0.4～0.6％，所述淋洗用甲醇水溶液用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，所述淋洗用甲醇水溶液体积浓度优选为5～20％，进一步优选为8～18％，再进一步优选为12～14％，所述甲酸甲醇溶液用量优选为2～4mL，进一步优选为3mL，甲酸甲醇溶液体积浓度优选为0.1～5％，进一步优选为1～4％，再进一步优选为2～3％，所述氮吹优选为在35～45℃水浴中进行，进一步优选为38～42℃水浴，再进一步优选为39～41℃水浴，所述乙腈水溶液的体积浓度优选为20～70％，进一步优选为30～60％，再进一步优选为40～50％，所述乙腈水溶液用量优选为0.3～0.7mL，进一步优选为0.4～0.6mL，再进一步优选为0.5mL。
在本发明中，对所述待测液进行液相色谱-串联质谱分析检测，测得水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；液相色谱用色谱柱优选为多糖类手性色谱柱，进一步优选为多糖类手性色谱柱内径为2.1～4.6mm，柱长为100～250mm，填料粒径为3～10μm；固定相优选为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；流动相优选为甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液，体积比为1：(1～5)，水溶液和乙腈溶液中甲酸的体积浓度分别优选为0.05～0.2％；流速优选为0.2～0.6mL/min，柱温优选为20～35℃，进一步优选为24～31℃，再进一步优选为26～29℃，进样体积优选为1～10μL，进一步优选为2～8μL，再进一步优选为4～6μL；所述质谱采用电喷雾电离正离子多反应检测模式进行，所述电喷雾电离正离子多反应监测模式，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析；电喷雾电压为3500～5500V，滞留时间为20～100ms，氮气流速为6～12L/min，离子源温度为300～500℃，甲霜灵的定量离子对为280.2/220.1、定性离子对为280.2/192.1，甲霜灵酸的定量离子对为266.1/220.1、定性离子对为266.1/192.1；所用内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，内标甲霜灵氘代物离子对为286.2/226.2。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
在实施例中采用的仪器和药品如下：
所述高效液相色谱-串联质谱仪型号为1290-6470(美国Agilent公司)；反相多糖类手性色谱柱
Figure BDA0004078760250000061
(广州研创生物技术发展有限公司)；电子分析天平AL204型，感量为0.001g(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；电子分析天平AB135-S型，感量为0.0001g(瑞士Mettler Toledo公司)；微量移液器(德国Brand公司)；微孔滤膜孔径为0.22μm(天津市腾达过滤器件厂)；超纯水(香港屈臣氏公司)。
所述乙腈、甲醇均为色谱纯，购自德国Honeywell公司，质谱纯甲酸购自德国Sigma-Aldrich公司，分析纯氨水购自广州化学试剂厂。
所述甲霜灵标准品(纯度99.3％)购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，甲霜灵酸标准品购于上海甄准生物科技公司，R-甲霜灵标准品购于湖北速普尔化工有限公司；内标物甲霜灵-D6(纯度98.9％)购于天津阿尔塔科技有限公司。
所述空白试样由农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(广州)提供。
标准储备液及工作液的配制：分别称取适量的标准品于10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的单个标准储备溶液，在-20℃条件下保存。各取0.1mL的标准储备溶液于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为10μg/mL的相应标准工作液，在4℃条件下保存。
取适量的甲霜灵和甲霜灵酸标准工作液，用乙腈配制成浓度为1μg/mL的混合标准工作液。将上述混合标准工作液与本发明提供的方法处理的空白基质溶液混合，配制成浓度为1、2、5、10、20和50ng/mL系列浓度的基质匹配标准溶液。从广东汉渔生态科技有限公司采购500g大小的草鱼若干条，随机挑选10条，按照农业农村部第2505号公告中“复方甲霜灵粉”的推荐剂量(9mg/L)进行药浴2小时。给药3天后，采集草鱼带皮肌肉组织，称取2g，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min混匀，在室温下振荡提取15min，5000r/min离心5min后，转移上清液至50mL玻璃管中；下层沉淀中加入10mL乙酸乙酯，重复振荡提取15min，1次，合并2次上清液，40℃水浴中氮吹至干，用3mL的体积浓度10％乙腈水溶液复溶，得待净化液；
依次用3mL甲醇，3mL水和3mL的体积浓度0.5％氨水溶液活化并调节MAX柱(小柱型号为3cc/60mg，60μm)，将待净化液上样，用3mL的体积浓度0.5％氨水溶液和3mL的体积浓度10％甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，用3mL的体积浓度0.5％甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴中氮吹至干，加入0.5mL的体积浓度50％乙腈水溶液复溶，复溶液经0.22μm滤膜过滤，得待测液；
将制备所得系列浓度的标准工作溶液进行液相色谱-串联质谱分析检测，以分析物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归，结果见表1，R-甲霜灵、S-甲霜灵、R-甲霜灵酸和S-甲霜灵酸在1～50ng/mL范围内均线性良好，相关系数r＞0.999，以信噪比(S/N)≥10计算方法的定量限，得到R-甲霜灵和S-甲霜灵的LOQ均为0.2μg/kg；R-甲霜灵酸和S-甲霜灵酸的LOQ均为1.0μg/kg。
待测液经反相多糖类手性色谱柱分离，以甲酸水和甲酸乙腈溶液为流动相进行等度洗脱，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析，基质匹配内标法进行定性定量，内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，可检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
色谱条件：
反相多糖类手性色谱柱
Figure BDA0004078760250000081
规格为(150mm×4.6mmi.d.,5μm)；
柱温为28℃；
固定相为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；
流动相为甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液的体积比为1：3；
流速为0.4mL/min；
进样量为5μL；
等度洗脱时间为12min；
质谱条件：
电喷雾电离正离子(ESI+)多反应监测模式(MRM)；
电喷雾电压为3500～4500V；
滞留时间(Dwell time)为20～100毫秒；
氮气流速为8～12L/min；
离子源温度为300～500℃；
目标药物和内标物的质谱参数见表2。
表1R-甲霜灵、S-甲霜灵、R-甲霜灵酸和S-甲霜灵酸的定量限、基质匹配标准曲线、线性范围及相关系数
Figure BDA0004078760250000082
Figure BDA0004078760250000091
表2目标药物和内标物的质谱参数和离子比
Figure BDA0004078760250000092
注：*第一个子离子为定量离子，第二个子离子为定性离子。
表2中可知，甲霜灵和甲霜灵酸在纯溶剂和待测草鱼肌肉基质溶液中定性离子与定量离子的比率都在合理的范围内，满足分析要求。
实施例1所述方法测得S-甲霜灵、R-甲霜灵、S-甲霜灵酸和R-甲霜灵酸在草鱼体内的残留水平分别为19.2～36.7μg/kg，15.3～22.6μg/kg，16.64～30.2μg/kg，3.49～7.51μg/kg。不同个体中4种对映单体的残留量不同，但都获得了良好的精密度，满足残留分析的相关规定要求。
实施例2
标准储备液及工作液的配制：分别称取适量的标准品于10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的单个标准储备溶液，在-20℃条件下保存。各取0.1mL的标准储备溶液于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为10μg/mL的相应标准工作液，在4℃条件下保存。
取适量的甲霜灵和甲霜灵酸标准工作液，用乙腈配制成浓度为1μg/mL的混合标准工作液。将上述混合标准工作液与本发明提供的方法处理的空白基质溶液混合，配制成浓度为1、2、5、10、20和50ng/mL系列浓度的基质匹配标准溶液。
从广东汉渔生态科技有限公司采购500g大小的草鱼若干条，随机挑选10条，按照农业农村部第2505号公告中“复方甲霜灵粉”的推荐剂量(9mg/L)进行药浴2小时。给药3天后，采集草鱼带皮肌肉组织，称取1g，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，涡旋0.5min混匀，在室温下振荡提取10min，4500r/min离心3min后，转移上清液至50mL玻璃管中，35℃水浴中氮吹至干，用2mL的体积浓度5％乙腈水溶液复溶，得待净化液；
依次用2mL甲醇，2mL水和2mL的体积浓度1％氨水溶液活化并调节MAX柱(小柱型号为3cc/60mg，60μm)，将待净化液上样，用2mL的体积浓度1％氨水溶液和2mL的体积浓度20％甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，用2mL的体积浓度1％甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于35℃水浴中氮吹至干，加入0.3mL的体积浓度70％乙腈水溶液复溶，复溶液经0.22μm滤膜过滤，得待测液；
将制备所得系列浓度的标准工作溶液进行液相色谱-串联质谱分析检测，以分析物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归；
待测液经反相多糖类手性色谱柱分离，以甲酸水和甲酸乙腈溶液为流动相进行等度洗脱，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析，基质匹配内标法进行定性定量，内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，可检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
色谱条件：
反相多糖类手性色谱柱
Figure BDA0004078760250000101
规格为(250mm×4.6mmi.d.,3μm)；
柱温为20℃；
固定相为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；
流动相为甲酸水溶液和甲酸乙腈，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液中甲酸的浓度为0.05％，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液的体积比为1：1；
流速为0.3mL/min；
进样量为1μL；
等度洗脱时间为20min；
质谱条件：
电喷雾电离正离子(ESI+)多反应监测模式(MRM)；
电喷雾电压为3500～4500V；
滞留时间(Dwelltime)为20～100毫秒；
氮气流速为8～12L/min；
离子源温度为300～500℃；
目标药物和内标物的质谱参数见表2。
实施例3
标准储备液及工作液的配制：分别称取适量的标准品于10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的单个标准储备溶液，在-20℃条件下保存。各取0.1mL的标准储备溶液于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为10μg/mL的相应标准工作液，在4℃条件下保存。
取适量的甲霜灵和甲霜灵酸标准工作液，用乙腈配制成浓度为1μg/mL的混合标准工作液。将上述混合标准工作液与本发明提供的方法处理的空白基质溶液混合，配制成浓度为1、2、5、10、20和50ng/mL系列浓度的基质匹配标准溶液。
从广东汉渔生态科技有限公司采购500g大小的草鱼若干条，随机挑选10条，按照农业农村部第2505号公告中“复方甲霜灵粉”的推荐剂量(9mg/L)进行药浴2小时。给药3天后，采集草鱼带皮肌肉组织，称取3g，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，涡旋2min混匀，在室温下振荡提取20min，5500r/min离心7min后，转移上清液至50mL玻璃管中，45℃水浴中氮吹至干，用4mL的体积浓度20％乙腈水溶液复溶，得待净化液；
依次用4mL甲醇，4mL水和4mL的体积浓度0.1％氨水溶液活化并调节MAX柱(小柱型号为3cc/60mg，60μm)，将待净化液上样，用4mL的体积浓度0.1％氨水溶液和4mL的体积浓度5％甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，用4mL的体积浓度0.25％甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于45℃水浴中氮吹至干，加入0.7mL的体积浓度30％乙腈水溶液复溶，复溶液经0.22μm滤膜过滤，得待测液；
将制备所得系列浓度的标准工作溶液进行液相色谱-串联质谱分析检测，以分析物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归；
待测液经反相多糖类手性色谱柱分离，以甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液为流动相进行等度洗脱，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析，基质匹配内标法进行定性定量，内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，可检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
色谱条件：
反相多糖类手性色谱柱
Figure BDA0004078760250000121
规格为(250mm×4.6mmi.d.,10μm)；
柱温为35℃；
固定相为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；
流动相为甲酸水溶液和甲酸乙腈，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液中甲酸的体积浓度为0.2％，甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液的体积比为1：5；
流速为0.6mL/min；
进样量为10μL；
等度洗脱时间为25min；
质谱条件：
电喷雾电离正离子(ESI+)多反应监测模式(MRM)；
电喷雾电压为3500～4500V；
滞留时间(Dwell time)为20～100毫秒；
氮气流速为8～12L/min；
离子源温度为300～500℃；
目标药物和内标物的质谱参数见表2。
实验例1
色谱柱的优化
基于纤维素衍生物和大环糖肽抗生素的手性固定相是应用较为广泛的两类色谱分离固定相，具有良好的手性识别能力和拆分能力。本实验选择了基于纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)的反相多糖类手性色谱柱
Figure BDA0004078760250000131
和
Figure BDA0004078760250000132
以及硅胶表面接枝替考拉宁和万古霉素的大环糖肽类手性色谱柱TeicoShell和VancoShell共4种手性色谱柱，对甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体的拆分效果进行考察。
结果如图2所示，采用TeicoShell和VancoShell进行分离时，甲霜灵和甲霜灵酸对映体都达不到分离效果；采用
Figure BDA0004078760250000133
进行分离时，甲霜灵酸对映体的分离度较差，无法实现基线完全分离；而采用
Figure BDA0004078760250000134
进行分离时，分离度良好，甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体均实现了基线分离，且峰形尖锐对称。
实验例2
对映体构型的确证
用纯乙腈溶液将R-甲霜灵标准品配制成相应浓度的标准工作液，根据优化后的色谱分析方法，对比甲霜灵标准工作溶液的色谱图，确认最先洗脱的色谱峰为S-甲霜灵对映异构体，依此推断，甲霜灵酸最先洗脱的色谱峰为S-甲霜灵酸对映异构体。
实验例3
提取溶剂的选择
实验比较了甲醇、乙腈和乙酸乙酯三种常用的提取溶剂对目标分析物的提取效率。
结果如图3表明，甲醇和乙腈作为提取溶剂时，甲霜灵和甲霜灵酸的回收率较差；而乙酸乙酯作为提取溶剂时，甲霜灵和甲霜灵酸的回收率均在80％以上，能满足残留分析的要求。因此，选用乙酸乙酯作为提取溶剂。
实验例4
净化程序的优化
固相萃取柱的选择
实验对比了HLB、C18和MAX三种不同类型固相萃取柱的萃取效果，以回收率作为评价指标。
结果如图4表明，甲霜灵酸在HLB和C18柱上的保留效果较差，回收率较低；而甲霜灵和甲霜灵酸都属于酸性化合物，适合阴离子交换，在MAX柱上保留效果较好，回收率均大于90％。因此，选择实验MAX固相萃取柱进行净化。
上样和淋洗溶剂的选择
实验对比了不同比例的甲醇和乙腈溶剂(10％、20％、30％、40％和50％)进行淋洗时，甲霜灵和甲霜灵酸回收率的变化。
结果如图5表明，淋洗溶剂中有机相比例超过20％时，甲霜灵会出现明显的泄漏情况，导致回收率偏低。因此，淋洗溶剂选用了20％的甲醇水。同样的，复溶液选用了20％的乙腈水溶液，以避免上样过程中甲霜灵的泄漏。
洗脱溶剂的选择
实验对比了不同溶剂的洗脱效果，以达到最佳的回收率。首先比较了洗脱溶剂中甲酸浓度(0、0.5％、1％、2％和3％)对分析物回收率的影响。
结果如图6表明，纯甲醇进行洗脱时，不利于阴离子交换的进行，导致分析物回收率较低；而甲酸比例超过0.5％时，分析物的回收率无明显增加。因此，选择0.5％甲酸甲醇作为洗脱溶剂。实验还对不同用量(1、2、3、4和5mL)的洗脱溶剂进行了评价。结果如图7表明，1～2mL的洗脱溶剂不能将分析物完全洗脱下来；洗脱溶剂用量在3～5mL时，分析物的回收率无明显变化；为节约成本，减少有机溶剂的用量，最终选择3mL 0.5％甲酸甲醇进行洗脱。
实验例5
方法学考察
线性范围和定量限
选择1、2、5、10、20和50ng/mL系列浓度的基质匹配标准溶液，按照优化后的色谱条件进行测定，以分析物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归。
结果见表1，R-甲霜灵、S-甲霜灵、R-甲霜灵酸和S-甲霜灵酸在1～50ng/mL范围内均线性良好，相关系数r大于0.999。以信噪比(S/N)≥10计算方法的定量限，得到R-甲霜灵和S-甲霜灵的LOQ均为0.2μg/kg；R-甲霜灵酸和S-甲霜灵酸的LOQ均为1.0μg/kg。
表1目标分析物的定量限、基质匹配标准曲线、线性范围及相关系数
Figure BDA0004078760250000151
回收率和精密度
分别在空白草鱼肌肉样品中添加标准溶液进行添加回收率和方法的精密度测试，甲霜灵和甲霜灵酸的添加水平分别为1、5、10μg/kg，每个浓度水平设置6个平行样品，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。
结果见表3，4种目标化合物的回收率范围为86.5～106.3％，RSD范围为1.3～11.8％。该回收率和精密度符合(EU)2021/808的要求，能够满足水产品的分析要求，可用于日常分析的检测。
表3样品加标回收率、批内和批间精密度
Figure BDA0004078760250000152
Figure BDA0004078760250000161
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的分析方法，使用乙酸乙酯对鱼肉样品进行提取，通过MAX柱对样品进行净化后，采用反相多糖类手性柱进行分离，以甲酸水和甲酸乙腈为流动相等度洗脱，内标法定量，甲霜灵和甲霜灵酸的定量限分别为0.2μg/kg和1.0μg/kg，加标回收率范围为86.5～106.3％，RSD小于12％，采用该方法对实际样品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体的残留量进行了测定，显示出较好的准确性和实用性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯按照1～3g：10mL混合，振荡提取1～3次，合并上清液，氮吹干所述上清液后，用乙腈水溶液复溶，得待净化液；
S2：采用固相萃取柱，对所述待净化液进行净化，收集洗脱液，氮吹干所述洗脱液后，用乙腈水溶液复溶，滤膜过滤，得待测液；
S3：对所述待测液进行手性液相色谱-串联质谱分析检测，测得水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留；
其中，液相色谱所用色谱柱为多糖类手性色谱柱；所述质谱采用电喷雾电离正离子多反应检测模式进行。
2.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，所述水产品为草鱼、鲫鱼、鲤鱼、乌鳢、罗非鱼和大口黑鲈中的一种。
3.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S1中所述水产品的带皮肌肉组织与乙酸乙酯混合为涡旋混匀，涡旋时间为0.5～2min；S1中所述每次振荡提取时间为10～20min；S1中振荡提取后，离心获得上清液，离心转速为4500～5500r/min，离心时间为3～7min；S1中氮吹在35～45℃水浴中进行，S1中所述乙腈水溶液的体积浓度为5～20％，乙腈水溶液用量为2～4mL。
4.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S2中所述净化具体为：依次用甲醇、水、氨水溶液活化固相萃取柱，将待净化液上样，氨水溶液和甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，低真空抽干，用甲酸甲醇溶液洗脱。
5.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S2所述淋洗用氨水溶液用量为2～4mL，体积浓度为0.1～1％，淋洗用甲醇水溶液用量为2～4mL，体积浓度为5～20％；S2中所述甲酸甲醇溶液用量为2～4mL，体积浓度为0.1～5％；S2中所述氮吹在35～45℃水浴中进行；S2中所述乙腈水溶液的体积浓度为20～70％，乙腈水溶液用量为0.3～0.7mL。
6.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S2中所用固相萃取柱为MAX小柱，型号为3cc/60mg，60μm。
7.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S3中所述多糖类手性色谱柱内径为2.1～4.6mm，柱长为100～250mm，填料粒径为3～10μm；固定相为硅胶表面涂覆或接枝纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；流动相为甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液，体积比为1：(1～5)；水溶液和乙腈溶液中甲酸的体积浓度分别为0.05～0.2％；流速为0.2～0.6mL/min，柱温为20～35℃，进样体积为1～10μL。
8.如权利要求1所述检测水产品中甲霜灵对映体和甲霜灵酸对映体残留的方法，其特征在于，S3中所述电喷雾电离正离子多反应监测模式，采用电喷雾离子源电离，正离子在m/z 100～1000扫描，利用三重四极杆质谱仪进行选择反应监测分析；电喷雾电压为3500～5500V，滞留时间为20～100ms，氮气流速为6～12L/min，离子源温度为300～500℃，甲霜灵的定量离子对为280.2/220.1、定性离子对为280.2/192.1，甲霜灵酸的定量离子对为266.1/220.1、定性离子对为266.1/192.1；所用内标为甲霜灵氘代物甲霜灵-D6，内标甲霜灵氘代物离子对为286.2/226.2。
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