CN116008419A - 一种五加皮配方颗粒质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种五加皮配方颗粒质量检测方法,包括通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及绿原酸含量测定,将五加皮配方颗粒含量标准限定为每1g含绿原酸为3.0‑20.0mg,其中,薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别;浸出物采用热浸法测定;特征图谱及绿原酸含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的五加皮配方颗粒质量检测方法,通过系统化的检测来评定五加皮配方颗粒的质量,能够全面反映配方颗粒的内在品质及更好的控制五加皮配方颗粒质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域,具体涉及一种五加皮配方颗粒质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性,对于中成药而言,需要采用多种手段进行检测,保证检测结果的可靠性和稳定性。配方颗粒由于具备易于携带服用方便疗效可靠的优点,受大众选择越来越多。配方颗粒是由单味药材经水提、浓缩、干燥、制粒等工序制得,与传统的药材相比,配方颗粒的形态特征发生明显改变,其产品真伪和质量无法用肉眼观察得到。因此,有必要建立中药配方颗粒质量评价体系,以此全面反映配方颗粒的内在品质。五加皮为五加科植物细柱五加(Acanthopanar gracilistμlusW.W.Smith)的干燥根皮,夏、秋二季采挖根部,洗净,剥取根皮,晒干,有祛风湿,补益肝肾,强筋壮骨,利水消肿的作用。目前,关于五加皮的配方颗粒还未形成一个系统的质量检测方法,仅采用现有的检测手段来检测五加皮配方颗粒是不够全面的,不能反映出五加皮配方颗粒的整体内在质量,无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此,建立一种用于药材质量控制的五加皮配方颗粒质量检测方法十分必要。
发明内容
本发明的目的就是要解决现有技术的不足,提供一种全面反映配方颗粒的内在品质及更好的控制五加皮配方颗粒质量的五加皮配方颗粒质量检测方法。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种五加皮配方颗粒质量检测方法,包括如下检测方法,
通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、特征图谱、浸出物及绿原酸含量测定,将配方颗粒含量标准限定为每1g含绿原酸为3.0-20.0mg,其中,薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别;特征图谱及绿原酸含量测定均采用液相色谱法测定;浸出物采用热浸法测定;
采用液相色谱法测定特征图谱包括:进行液相色谱仪分析,以五加皮对照药材制成的溶液作为对照药材参照物溶液b,以绿原酸对照品制成的溶液作为对照品参照物溶液b,以五加皮配方颗粒样品制成的溶液作为供试品溶液b,分别精密吸取对照药材参照物溶液b、对照品参照物溶液b和供试品溶液b,分别注入液相色谱仪,测定,即得;其中,采用的色谱条件为,色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸溶液为流动相B,按表a的规定进行梯度洗脱;
表a梯度洗脱程序
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~25 | 0→15 | 100→85 |
25~45 | 15→20 | 85→80 |
45~85 | 20→48 | 80→52 |
85~88 | 48→0 | 52→100 |
88~98 | 0 | 100 |
流速:1.0mL/min;柱温:20℃;进样量:10μL;检测波长:280nm。
在其中一实施例中,所述五加皮配方颗粒制法如下:取五加皮饮片5600g,加水煎煮,滤过,滤液浓缩成清膏,加入辅料适量,干燥或干燥粉碎,再加入辅料适量,混匀,制粒,制成1000g,即得。
在其中一实施例中,所述照薄层色谱法包括如下步骤:(1)制备供试品溶液a:取五加皮配方颗粒样品2.0g,加水30mL,超声处理30min,用二氯甲烷振摇提取2次,每次20ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,制得供试品溶液a;(2)制备对照药材溶液a:取五加皮对照药材1.0g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,滤液浓缩至约30ml,放冷,用二氯甲烷振摇提取2次,每次20ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,制得对照药材溶液a;(3)进行薄层色谱分析:薄层色谱条件为,薄层板:硅胶G薄层板;点样量:供试品溶液a为2uL,对照药材溶液a为3uL;展开剂:以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(10:3:0.1)为展开剂;显色剂:10%硫酸乙醇试液,在105℃加热,紫外光灯365nm下检视。
在其中一实施例中,所述热浸法以乙醇为溶剂,采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一实施例中,采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤:(1)制备对照药材参照物溶液b:取五加皮对照药材0.2g,加入50%甲醇50mL,超声处理20min,放冷,滤过,取续滤液,作为对照药材参照物溶液b;(2)制备对照品参照物溶液b:取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,制得浓度为20ug/mL的对照品参照物溶液b;(3)制备供试品溶液b:取五加皮配方颗粒适量,研细,取约0.2g,置具塞锥形瓶中,加入50%甲醇50mL,称定重量,超声30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液b。
在其中一实施例中,采用液相色谱法测定绿原酸含量包括:进行液相色谱仪分析,以绿原酸对照品制成的溶液作为对照品溶液c,以五加皮配方颗粒样品制成的溶液作为供试品溶液c,分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c,分别注入液相色谱仪,测定,即得;其中,采用的色谱条件为,色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸溶液为流动相B,按规定进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min;柱温:20℃;进样量:10μL;检测波长:325nm。
在其中一实施例中,采用液相色谱法测定绿原酸含量还包括如下步骤:(1)制备对照品溶液:取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成含绿原酸的浓度为20ug/ml的溶液,作为对照品溶液c;(2)制备供试品溶液:取五加皮配方颗粒适量,研细,取约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比,本发明提供的五加皮配方颗粒质量检测方法的有益效果是:通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及绿原酸含量测定进行研究,通过多方面测量,来评定五加皮配方颗粒的质量,为产品的质量稳定奠定坚实的基础,能够建立五加皮配方颗粒可行的质量标准,实现五加皮配方颗粒质量的有效控制,并且,采用本申请的色谱条件进行液相分析,可以得到分离度更好更清晰的特征图谱,方法稳定性较好,精密度高,重现性较好。五加皮饮片煎煮制得五加皮饮片配方颗粒,绿原酸平均含量为7.84mg/g,依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》,拟定了绿原酸含量范围为3.0mg/g~20.0mg/g。
附图说明
图1为本发明一实施例中五加皮饮片配方颗粒照薄层色谱法的3批生产样品薄层鉴别TLC图谱。
图2为本发明一实施例的特征图谱测定提取方法考察中不同提取方法的HPLC特征图谱;其中,S1为超声提取供试品溶液特征图谱;S2为回流提取供试品溶液特征图谱。
图3为本发明一实施例的特征图谱测定提取时间考察中不同提取时间的HPLC特征图谱;其中,S1为超声提取40min供试品溶液特征图谱;S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱;S3为超声提取20min供试品溶液特征图谱。
图4为本发明一实施例的特征图谱测定提取溶剂考察中不同提取溶剂的HPLC特征图谱;其中,S1为50%乙醇提取的供试品溶液特征图谱;S2为50%甲醇提取的供试品溶液特征图谱;S3为10%甲醇提取的供试品溶液特征图谱。
图5为本发明一实施例的特征图谱测定样品量考察中不同样品量的HPLC特征图谱;其中,S1为样品取用量0.3g的供试品溶液特征图谱;S2为样品取用量0.2g的供试品溶液特征图谱;S3为样品取用量0.1g的供试品溶液特征图谱
图6为本发明一实施例的特征图谱测定专属性考察中不同溶液的HPLC特征图谱;其中,S1为麦芽糊精空白对照溶液特征图谱,S2为五加皮供试品溶液特征图谱,S3为五加皮对照药材溶液特征图谱,S4为绿原酸对照品溶液特征图谱。
图7为本发明一实施例的特征图谱测定中重复性试验共有峰叠加图谱。
图8为本发明一实施例的特征图谱测定中精密度试验共有峰叠加图谱。
图9为本发明一实施例的特征图谱测定中稳定性试验共有峰叠加图谱。
图10为本发明一实施例的特征图谱测定不同柱温考察(±2℃)叠加特征图谱;其中,S1为柱温18℃的色谱柱,S2为柱温20℃的色谱柱,S3为柱温22℃的色谱柱。
图11为本发明一实施例的特征图谱测定不同柱温考察(±5℃)叠加特征图谱;其中,S1为柱温15℃的色谱柱,S2为柱温20℃的色谱柱,S3为柱温25℃的色谱柱。
图12为本发明一实施例的特征图谱测定流速试验(±0.02ml/min)共有峰叠加特征图谱;其中,S1为流速0.98ml/min的色谱柱,S2为流速1.0ml/min的色谱柱,S3为流速1.02ml/min的色谱柱。
图13为本发明一实施例的特征图谱测定流速试验(±0.2ml/min)共有峰叠加特征图谱;其中,S1为流速0.8ml/min的色谱柱,S2为流速1.0ml/min的色谱柱,S3为流速1.2ml/min的色谱柱。
图14为本发明一实施例中3批成品特征图谱叠加图;其中,S1的成品编号为ZS220601,S2的成品编号为ZS220602,S3的成品编号为ZS220603。
图15为本发明一实施例中五加皮成品、绿原酸对照品、五加皮对照药材叠加图,其中,S1为3种五加皮成品溶液拟合的特征图,S2为五加皮对照药材溶液的特征图,S3为绿原酸对照品溶液的特征图。
图16为本发明一实施例中五加皮成品溶液与五加皮对照药材溶液特征图谱拟合图。
图17为本发明一实施例的含量测定专属性考察中麦芽糊精空白对比图;其中,S1为麦芽糊精,S2为绿原酸对照品,S3为五加皮供试品。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种五加皮配方颗粒质量检测方法,包括如下检测方法,通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、特征图谱、浸出物及绿原酸含量测定,将配方颗粒含量标准限定为每1g含绿原酸为3.0-20.0mg,其中,薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别;特征图谱及绿原酸含量测定均采用液相色谱法测定;浸出物采用热浸法测定。
本实施例中:
制备五加皮配方颗粒:采用《中国药典》2020年版一部五加皮中药材项下来源及药用部位按照“技术要求”制成的配方颗粒,包括药材植物的科名、中文名、拉丁文和药用部位,即:本品为五加科植物细柱五加(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith)的根皮经炮制并按配方颗粒的主要质量指标加工制成的配方颗粒。具体制法是:取五加皮饮片5600g,加水煎煮,滤过,滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为9.0%~15.9%),加入辅料适量,干燥粉碎,再加入辅料适量,混匀,制粒,制成1000g,即得,每1g配方颗粒相当于饮片5.6g。干浸膏出膏率根据24批标准汤剂的出膏率,以其均值的70%~130%范围定为干浸膏出膏率,拟定五加皮饮片配方颗粒干浸膏出膏率允许范围为9.0%~15.9%。
1.性状考察
性状:取五加皮配方颗粒三批规模生产样品各一份,观察记录样品的形态、颜色和气味,同时结合标汤样品颜色和气味。本品为颗粒剂,黄棕色至棕褐色的颗粒;气微,味苦、微辛。
2.薄层鉴别
参考已公示的湖南省中药配方颗粒五加皮质量标准中的薄层鉴别方法,用五加皮对照药材作对照,建立了本品薄层鉴别方法,经方法学考察及24批次样品试验,供试品色谱斑点清晰,阴性对照样品无干扰,故将该法列入五加皮配方颗粒质量标准正文[鉴别]项。具体的,五加皮配方颗粒的薄层鉴别方法为:
供试品溶液制备:取本品2.0g,研细,加水30ml,超声处理30分钟,放冷,用二氯甲烷振摇提取2次,每次20ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为二氯甲烷供试品溶液。
对照药材溶液:另取五加皮对照药材1.0g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,滤液浓缩至约30ml,放冷,用二氯甲烷振摇提取2次,其余同上操作制成对照药材溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验,吸取供试品溶液2μl、对照药材溶液3μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(10:3:0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇试液,105℃加热至斑点显色清晰,紫外光灯365nm下检视。
按上述检测方法,取3批生产样品供试液、阴性样品(麦芽糊精)溶液及对照药材溶液,点样,进行薄层鉴别。如图1所示,结果表明,三批规模生产样品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
3.特征图谱
3.1特征图谱测定方法
3.1.1色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm,5μm));以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸溶液为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱;流速为1.0ml/min;柱温为20℃;检测波长为280nm,进样量为10μl。理论板数按绿原酸峰计算应不低于5000。
表1-梯度洗脱程序
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~25 | 0→15 | 100→85 |
25~45 | 15→20 | 85→80 |
45~85 | 20→48 | 80→52 |
85~88 | 48→0 | 52→100 |
88~98 | 0 | 100 |
3.1.2参照物溶液的制备
取五加皮对照药材0.2g,加50%甲醇50ml,称定重量,超声(功率300W,频率40kHz)20分钟,放冷,滤过,取续滤液,作为对照药材参照物溶液。
另取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每1ml含绿原酸20μg的溶液,作为对照品参照物溶液。
3.1.3供试品溶液的制备
取本品适量,研细,取约0.2g,置具塞锥形瓶中,加入50%甲醇50mL,称定重量,超声(功率300W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3.1.4测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
3.2特征图谱测定的方法学考察
3.2.1提取方法的考察
分别以不同的提取方法制备供试品溶液,按上述“3.1”项下方法进行测定。如图2和表2所示,结果表明,不同提取方式的供试品溶液色谱主峰个数一致,峰形差别不明显,但超声提取方式较简便,故选择超声为样品提取方式。
表2-提取方法的比较
3.2.2提取时间考察
分别以不同时间制备供试品溶液,按上述“3.1”项下方法进行测定。如图3和表3所示,结果表明,不同提取时间的供试品溶液色谱主峰个数一致,峰形差别不明显,为缩短检测时间,故确定样品的提取时间为20分钟。
表3-提取时间的比较
3.2.3提取溶剂的考察
分别以不同提取溶剂制备供试品溶液,按上述“3.1”项下方法进行测定。如图4和表4所示,结果表明,不同提取溶剂的供试品溶液色谱主峰个数一致,峰形差别不明显,但50%甲醇提取效果稍优于10%甲醇及50%乙醇,故选择50%甲醇为提取溶剂。
表4-提取溶剂的比较
3.2.4取样量的考察
分别以不同取样量制备供试品溶液,按上述“3.1”项下方法进行测定。如图5和表5所示,结果表明,不同取样量的供试品溶液色谱主峰个数一致,峰形差别较小,但取样量为0.2g时提取效果较好,故选择供试品溶液制备的取样量为0.2g。
表5-取样量的比较
综上所述,确定供试品溶液制备方法如下:取本品细粉适量,取约0.2g,置具塞锥形瓶中,加入50%甲醇50mL,称定重量,超声(功率300W,频率40kHz)20分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,滤过,取续滤液,即得。
3.3特征图谱分析方法验证
3.3.1专属性考察
取麦芽糊精,约0.2g,按以上“3.1”项下方法制备麦芽糊精空白对照液,并取五加皮供试品溶液、麦芽糊精空白对照液、五加皮对照药材溶液以及绿原酸对照品溶液进行测定。
结果表明:供试品色谱中各主要特征峰分离良好,麦芽糊精空白无干扰,该方法专属性良好,详见图6。
3.3.2重复性试验
取五加皮配方颗粒样品(批号:211103)约0.2g,共6份,按“3.1”项下方法进行测定。结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值,均小于3.0%,在合格范围内。试验表明该方法重复性良好,详见图7和表6-7。
表6-重复性试验特征图谱相对保留时间
峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(%) |
1 | 0.793 | 0.792 | 0.794 | 0.797 | 0.797 | 0.797 | 0.26 |
2(S) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.00 |
3 | 1.27 | 1.271 | 1.275 | 1.277 | 1.277 | 1.277 | 0.23 |
4 | 1.904 | 1.908 | 1.897 | 1.888 | 1.886 | 1.885 | 0.47 |
5 | 2.504 | 2.507 | 2.481 | 2.46 | 2.457 | 2.455 | 0.87 |
表7-重复性试验特征图谱相对峰面积
峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(%) |
1 | 0.274 | 0.281 | 0.274 | 0.273 | 0.273 | 0.269 | 1.34 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.058 | 1.054 | 1.048 | 1.040 | 1.039 | 1.036 | 0.79 |
4 | 0.463 | 0.451 | 0.488 | 0.475 | 0.481 | 0.484 | 2.75 |
5 | 0.732 | 0.733 | 0.728 | 0.719 | 0.717 | 0.715 | 1.01 |
3.3.3精密度试验
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,连续进样6针测定。测定结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值,均小于3.0%,在合格范围内。试验表明该方法精密度良好,详见图8和表8-9。
表8-精密度试验HPLC特征图谱相对保留时间
峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(%) |
1 | 0.805 | 0.804 | 0.804 | 0.804 | 0.803 | 0.802 | 0.12 |
2(S) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.00 |
3 | 1.278 | 1.278 | 1.279 | 1.278 | 1.278 | 1.277 | 0.05 |
4 | 1.887 | 1.887 | 1.887 | 1.889 | 1.892 | 1.893 | 0.13 |
5 | 2.456 | 2.456 | 2.456 | 2.458 | 2.464 | 2.468 | 0.19 |
表9-精密度试验HPLC特征图谱相对峰面积
峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(%) |
1 | 0.2959 | 0.2948 | 0.2942 | 0.2931 | 0.2944 | 0.2896 | 0.68 |
2(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00 |
3 | 0.9705 | 0.9858 | 0.9883 | 0.9773 | 0.9871 | 0.9838 | 0.64 |
4 | 0.5013 | 0.4848 | 0.5080 | 0.4863 | 0.4767 | 0.4819 | 2.26 |
5 | 0.7019 | 0.7028 | 0.7039 | 0.7019 | 0.7031 | 0.7052 | 0.17 |
3.3.4稳定性试验
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定。结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致,详见图9,特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值,均小于3.0%,在合格范围内,详见表10-11,表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表10-稳定性试验特征图谱相对保留时间
峰号 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 24h | RSD(%) |
1 | 0.79 | 0.792 | 0.792 | 0.792 | 0.79 | 0.789 | 0.15 |
2(S) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.00 |
3 | 1.314 | 1.314 | 1.314 | 1.312 | 1.314 | 1.314 | 0.06 |
4 | 1.822 | 1.818 | 1.814 | 1.816 | 1.821 | 1.832 | 0.32 |
5 | 2.347 | 2.342 | 2.336 | 2.34 | 2.347 | 2.364 | 0.38 |
表11-稳定性试验特征图谱相对峰面积
峰号 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 24h | RSD(%) |
1 | 0.2775 | 0.2800 | 0.2788 | 0.2797 | 0.2832 | 0.2834 | 0.78 |
2(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00 |
3 | 0.9682 | 0.9850 | 1.0340 | 1.0111 | 0.9877 | 0.9920 | 2.11 |
4 | 0.4947 | 0.5058 | 0.5057 | 0.5082 | 0.5043 | 0.4869 | 1.52 |
5 | 0.7281 | 0.7385 | 0.7393 | 0.7430 | 0.7395 | 0.7407 | 0.64 |
3.4耐用性考察
3.4.1不同柱温考察(±2℃)
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,以柱温为18℃、20℃、22℃分别进样测定。参见图10,测定结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对保留时间RSD%值、相对峰面积RSD%值,均小于3.0%,在合格范围内,详见表12-13。试验表明不同柱温变化对特征图谱测定影响较小,即不同柱温耐用性较好。
表12-柱温试验特征图谱相对保留时间(±2℃)
峰号 | 18℃ | 20℃ | 22℃ | RSD(%) |
1 | 0.802 | 0.804 | 0.803 | 0.12 |
2(S) | 1 | 1 | 1 | 0.00 |
3 | 1.28 | 1.278 | 1.271 | 0.37 |
4 | 1.891 | 1.887 | 1.89 | 0.11 |
5 | 2.461 | 2.457 | 2.471 | 0.29 |
表13-柱温试验特征图谱相对峰面积(±2℃)
峰号 | 18℃ | 20℃ | 22℃ | RSD(%) |
1 | 0.293 | 0.284 | 0.301 | 2.96 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.045 | 0.991 | 1.027 | 2.73 |
4 | 0.509 | 0.520 | 0.506 | 1.48 |
5 | 0.698 | 0.707 | 0.717 | 1.30 |
3.4.2不同柱温考察(±5℃)
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,以柱温为15℃、20℃、25℃分别进样测定。参见图11,测定结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对保留时间RSD%值小于3.0%、相对峰面积RSD%值大于3.0%,详见表14-15。试验表明不同柱温变化对特征图谱测定影响较大,即规定柱温为20℃。
表14-柱温试验特征图谱相对保留时间(±5℃)
峰号 | 15℃ | 20℃ | 25℃ | RSD(%) |
1 | 0.805 | 0.804 | 0.795 | 0.69 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.287 | 1.278 | 1.26 | 1.08 |
4 | 1.888 | 1.887 | 1.906 | 0.56 |
5 | 2.448 | 2.457 | 2.52 | 1.59 |
表15-柱温试验特征图谱相对峰面积(±5℃)
3.4.3不同流速的考察(±0.02ml/min)
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,以流速为0.98ml/min、1.0ml/min、1.02ml/min分别进样测定。参见图12,测定结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对保留时间RSD%值、相对峰面积RSD%值,均小于3.0%,在合格范围内,详见表16-17。试验表明细微的流速变化,对特征图谱测定影响较小,即不同流速耐用性较好。
表16-流速试验特征图谱相对保留时间(±0.02ml/min)
峰号 | 0.98ml/min | 1.0ml/min | 1.02ml/min | RSD(%) |
1 | 0.802 | 0.803 | 0.800 | 0.19 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.273 | 1.277 | 1.274 | 0.16 |
4 | 1.896 | 1.890 | 1.900 | 0.27 |
5 | 2.479 | 2.463 | 2.489 | 0.53 |
表17-流速试验特征图谱相对峰面积(±0.02ml/min)
峰号 | 0.98ml/min | 1.0ml/min | 1.02ml/min | RSD(%) |
1 | 0.287 | 0.284 | 0.290 | 0.98 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.012 | 0.979 | 0.962 | 2.58 |
4 | 0.458 | 0.449 | 0.435 | 2.63 |
5 | 0.717 | 0.716 | 0.688 | 2.31 |
3.4.4不同流速的考察(±0.2ml/min)
取五加皮配方颗粒(批号:211103)样品约0.2g,按“3.1”项下试验方法,以流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min分别进样测定。参见图13,测定结果显示,供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。计算结果显示,相对保留时间RSD%值、相对峰面积RSD%值,均大于3.0%,详见表18-19。试验表明细微的流速变化,对特征图谱测定影响较大,即流速规定为1.0ml/min。
表18-流速试验特征图谱相对保留时间(±0.2ml/min)
表19-流速试验特征图谱相对峰面积(±0.2ml/min)
峰号 | 0.8ml/min | 1.0ml/min | 1.2ml/min | RSD(%) |
1 | 0.247 | 0.284 | 0.274 | 7.20 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
3 | 1.105 | 0.979 | 1.127 | 7.46 |
4 | 0.529 | 0.449 | 0.477 | 8.31 |
5 | 0.760 | 0.716 | 0.703 | 4.14 |
3.5小结
该特征图谱方法经专属性、精密度、重复性、稳定性及耐用性考察,结果均符合要求,表明建立的方法能很好的用于五加皮配方颗粒的特征图谱测定。
3.6三批成品特征图谱表征分析
3.6.1 3批成品特征图谱测定
照上述拟定的特征图谱分析方法,测定3批成品特征图谱,通过绿原酸定位,结果显示,配方颗粒及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有5个共有峰,并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰保留时间相对应,其中与绿原酸对照品参照物相对应的峰为峰2,共有峰特征图谱,详见图14-16。
3.6.2 3批配方颗粒特征色谱图评价
按上述拟定的特征图谱分析方法,测定3批成品特征图谱。结果显示,特征图谱中有5个共有峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的其相对保留时间及范围,详见表20。
表20-3批成品共有峰相对保留时间
峰号 | S1 | S2 | S3 | 均值 | 相对保留时间范围±10% |
1 | 0.798 | 0.796 | 0.796 | 0.80 | 0.717-0.876 |
2(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.00 | / |
3 | 1.281 | 1.278 | 1.275 | 1.28 | 1.150-1.406 |
4 | 1.901 | 1.909 | 1.909 | 1.91 | 1.716-2.097 |
5 | 2.490 | 2.504 | 2.506 | 2.50 | 2.250-2.750- |
综上所述,采用高效液相色谱法建立的配方颗粒特征图谱测定方法,按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了稳定性考察,且符合要求。按上述拟定的特征图谱分析方法,对3批成品的特征图谱进行测定,结果分析,标定了5个共有特征峰,以绿原酸峰为参照峰S,计算峰1、峰3、峰4、峰5与S峰的相对保留时间,以3批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为:0.80(峰1)、1.28(峰3)、1.91(峰4)、2.50(峰5)。考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差,其相对保留时间允许范围拟定为±10%。
4浸出物
4.1试验方法
中药配方颗粒提取溶媒为制药用水,按照“技术要求”,以乙醇为溶剂,照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定。
4.2浸出物的考察
取3批规模生产样品各约2g,依法测定,结果见表21。
表21-浸出物考察结果
4.3-浸出物范围拟定
拟定方案一:
根据本品的规格及标准汤剂的出膏率与浸出物限度,结合三批规模化生产样品的浸出物测定结果,拟定浸出物限度。
本品规格为每1g配方颗粒相当于饮片5.6g,按本品标准汤剂的出膏率实测范围(10.4%~13.1%)的低限计算,则每1g颗粒含干膏量不少于5.6g×10.4%(即0.582g);在此基础上,再根据本品标准汤剂拟定的浸出物限度(20.2%),可计算每1g颗粒中浸出物不少于0.582g×20.2%(即0.118g),或者说本品(颗粒)中浸出物不少于11.8%(0.118×100%),取整,即不少于12.0%。
本品三批规模化生产样品的浸出物测定值分别为13.78%、17.28%、17.90%,均符合上述计算的颗粒浸出物限度(12.0%),为此,拟定本品醇溶性浸出物不得少于12.0%。
拟定方案二:
根据24批五加皮标准汤剂浸出物折算成颗粒含量,汇总如表22所示:
表22-24批五加皮标汤折算成颗粒浸出物汇总表
说明书
结合出膏率,按拟定产品规格“每1g配方颗粒相当于饮片5.6g”,24批标准汤剂样品浸出物折算成颗粒浸出物,浸出物平均为19.84%,实测值折算成颗粒浸出物范围为16.78%~23.37%,SD为2.01;按均值的70%~130%计算,浸出物允许范围为13.89%~25.79%。按均值-3SD~均值+3SD计算,浸出物允许范围为13.80%~25.88%。为此拟定浸出物允许范围为:本品醇溶性浸出物不得少于13.8%。
综述上述两种浸出物限度考虑方式,综合比较,同时结合三批规模化生产样品含量数据,最终拟定浸出物限度范围为不得少于13.8%。
5含量测定
5.1待测成份选择依据
五加皮为五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith的干燥根皮,多产于陕西、湖北、四川、贵州等地,含多糖、异秦皮定、绿原酸、芝麻素、β-谷甾醇、硬脂酸等成分。通过查阅文献及研究,绿原酸是五加皮的主要活性成分之一,在五加皮中具有较高的含量。五加皮具有祛风除湿、补益肝肾、强筋健骨、利水消肿等功效,常用于风湿痹症、筋骨痿软、小儿行迟、体虚乏力、水肿。现代药理研究表明,五加皮具有抗炎、镇痛、镇静、抗肿瘤、抗溃疡的作用,为此建立绿原酸的含量指标对于控制五加皮标准汤剂的质量更有参考价值。
5.2绿原酸含量测定方法
照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈-0.2%甲酸(15:85)为流动相;流速为每分钟1.0ml;柱温为20℃;检测波长为325nm。
对照品溶液的制备:取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取约0.2g,,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
5.3绿原酸含量测定方法学考察
5.3.1提取方法的考察
参照上述“5.2”项下方法,分别以不同方式提取样品制备供试品溶液,并依法进行测定。结果表明,超声提取方式更简便,故选择超声方式提取样品,详见表23。
表23-不同提取方法对比
5.3.2提取时间的考察
参照上述“5.2”项下方法,分别以不同的时间提取样品制备供试品溶液,并依法进行测定。结果表明,超声提取20分钟即可基本提取完全,故确定样品超声提取时间为20分钟,详见表24。
表24-不同提取时间对比
5.3.3提取溶剂的考察
参照上述“5.2”项下方法,分别以不同的溶剂提取样品制备供试品溶液,并依法进行测定。结果表明,以50%甲醇为溶剂提取效果最佳,故选择50%甲醇为溶剂提取样品,详见表25。
表25-不同提取溶剂对比
5.3.4取样量考察
参照上述“5.2”项下方法,分别以不同取样量制备供试品溶液,并依法进行测定。结果表明,取样量为0.2g时的提取效果要优于其他两组,故选择0.2g作为制备供试品溶液的取样量,详见表26。
表26-不同取样量对比
综上所述,确定五加皮供试品溶液制备方法的主要参数如下:取本品细粉适量,取约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,密塞,称定重量,超声20分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
5.4含量测定分析方法验证
5.4.1专属性考察
取麦芽糊精,约0.2g,按以上“5.2”项下方法制备麦芽糊精空白对照液,并取五加皮供试品溶液、麦芽糊精空白对照液以及绿原酸对照品溶液进行测定。参见图17,试验表明:麦芽糊精空白无干扰,该方法专属性良好。
5.4.2重复性试验取同批次成品颗粒样品(批号:211103)约0.2g,共6份,按上述“5.2”项下试验方法进行测定,测得样品中绿原酸含量平均值分别为4.9321mg/g,RSD值为1.41%,试验表明该方法重复性良好,详见表27。
表27-重复性试验
5.4.3精密度试验
取同批次成品颗粒样品(批号:211103)约0.2g,按照上述“5.2”项下方法连续进样6针,测定其峰面积,计算样品中绿原酸含量的RSD值为0.67%,试验表明仪器精密度良好,详见表28。
表28-精密度试验
5.4.4稳定性试验
取一批五加皮配方颗粒样品(211103)约0.2g,按上述“5.2”项下试验方法,分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样,测定其含量,计算样品中绿原酸含量的RSD值为1.11%,试验表明供试品溶液在24小时内较稳定,详见表29。
表29-稳定性试验
5.4.5加样回收率试验
精密称取三组样品约0.1g、0.1g、0.1g共9份,每组3份,各加入已知浓度的绿原酸对照品溶液(104μg/ml)4.6ml、5.7ml、6.9ml,按“5.2”项下方法制备供试品溶液,并进行测定,计算绿原酸平均加样回收率为107.3423%,RSD为0.28%,详见表30。
表30-加样回收率试验结果
5.4.6耐用性考察
5.4.6.1不同流动相比例考察
取一批样品约0.2g,按“5.2”项下试验方法,以乙腈-0.2%甲酸(15:85)、(14:86)、(16:84)分别进样测定。计算结果显示,测定含量RSD值为0.60%,小于2.0%,试验表明该方法对流动相比例较小变动的耐用性良好,详见表31。
表31-不同流动相比例对比
5.4.6.2波长考察
取一批样品约0.2g,按“5.2”项下试验方法,以波长330nm、325nm、300nm分别进样测定。计算结果显示,测定含量RSD值为1.22%,小于2.0%,试验表明该方法对波长细微变动的耐用性良好,详见表32。
表32-不同波长比例对比
5.5小结
综上,整个分析方法经专属性、峰纯度、精密度、重复性、稳定性、加样回收及耐用性考察,结果均符合要求,表明建立的方法能很好的用于绿原酸的含量测定。
6含量限度范围拟定
(1)含量范围拟定方案一:
根据本品的规格及标准汤剂的出膏率与含量控制范围,结合三批规模化生产样品的含测结果,拟定含量限度范围。
本品规格为每1g颗粒相当于饮片5.6g,按本品标准汤剂的出膏率允许范围(9.0%~15.9%)计算,则每1g颗粒含干膏量为5.6g×9.0%~5.6g×15.9%;在此基础上,再根据本品标准汤剂拟定的绿原酸含量允许范围(4.5mg/g~31.3mg/g),可计算每1g颗粒中绿原酸含量允许范围为5.6g×9.0%×4.5mg/g~5.6g×15.9%×31.3mg/g(即2.27mg~27.87mg)。
考虑此低限含量(2.27mg/g)过低,结合本品24批标准汤剂中含量最低批次标准汤剂(Y220612PT,出膏率11.9%,含测值4.8324mg/g)转换为颗粒的含量情况(即每1g颗粒中绿原酸含量为:5.6g×11.9%×4.8324mg/g=3.22mg),可初步拟定本品含量的低限值为3.0mg/g。本品三批规模化生产样品的含量分别为3.25mg/g、7.15mg/g、7.60mg/g,均在上述基于标准汤剂计算或拟定的颗粒含量范围内。
综上,拟定本品绿原酸含量范围为3.0mg/g~27.8mg/g。
(2)含量范围拟定方案二:
根据24批五加皮标准汤剂含量折算成颗粒含量,汇总如下:
表33-24批五加皮标准汤剂折算成颗粒含量汇总表
结合出膏率,按拟定产品规格“每1g配方颗粒相当于饮片5.6g”,24批标准汤剂样品含量折算成颗粒含量,绿原酸平均含量为7.84mg/g,实测含量折算成颗粒含量范围为3.22mg/g~19.97mg/g,SD为4.02;按均值的70%~130%计算,绿原酸含量允许范围为5.49mg/g~10.19mg/g。按均值-1.5SD~均值+3SD计算,绿原酸含量允许范围为1.82mg/g~19.89mg/g。为此,拟定绿原酸含量允许范围为1.8mg/g~19.9mg/g。
综述上述两种含量范围考虑方案,综合比较,同时结合三批规模化生产样品含量数据,最终拟定绿原酸含量范围为3.0mg/g~20.0mg/g。
7规格根据制法投料量与工艺研究制成量制定,即每1g配方颗粒相当于饮片5.6g。
8贮藏根据品种贮藏基本要求制定。
本发明提供的五加皮配方颗粒质量检测方法,通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及绿原酸含量测定进行研究,通过多方面测量,来评定五加皮配方颗粒的质量,为产品的质量稳定奠定坚实的基础,能够建立五加皮配方颗粒可行的质量标准,实现五加皮配方颗粒质量的有效控制,并且,采用本申请的色谱条件进行液相分析,可以得到分离度更好更清晰的特征图谱,方法稳定性较好,精密度高,重现性较好。五加皮饮片煎煮制得五加皮饮片配方颗粒,绿原酸平均含量为7.84mg/g,依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》,拟定了绿原酸含量范围为3.0mg/g~20.0mg/g。
所述领域技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子;凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,包括如下检测方法,
通过对五加皮配方颗粒的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、特征图谱、浸出物及绿原酸含量测定,将配方颗粒含量标准限定为每1g含绿原酸为3.0-20.0mg,其中,薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别;特征图谱及绿原酸含量测定均采用液相色谱法测定;浸出物采用热浸法测定;
采用液相色谱法测定特征图谱包括:进行液相色谱仪分析,以五加皮对照药材制成的溶液作为对照药材参照物溶液b,以绿原酸对照品制成的溶液作为对照品参照物溶液b,以五加皮配方颗粒样品制成的溶液作为供试品溶液b,分别精密吸取对照药材参照物溶液b、对照品参照物溶液b和供试品溶液b,分别注入液相色谱仪,测定,即得;其中,采用的色谱条件为,色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸溶液为流动相B,按表a的规定进行梯度洗脱;
表a梯度洗脱程序
流速:1.0mL/min;柱温:20℃;进样量:10μL;检测波长:280nm。
2.如权利要求1所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,所述五加皮配方颗粒制法如下:取五加皮饮片5600g,加水煎煮,滤过,滤液浓缩成清膏,加入辅料适量,干燥或干燥粉碎,再加入辅料适量,混匀,制粒,制成1000g,即得。
3.如权利要求1所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,所述照薄层色谱法包括如下步骤:
(1)制备供试品溶液a:取五加皮配方颗粒样品2.0g,加水30mL,超声处理30min,用二氯甲烷振摇提取2次,每次20ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,制得供试品溶液a;
(2)制备对照药材溶液a:取五加皮对照药材1.0g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,滤液浓缩至约30ml,放冷,用二氯甲烷振摇提取2次,每次20ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,制得对照药材溶液a;
(3)进行薄层色谱分析:薄层色谱条件为,薄层板:硅胶G薄层板;点样量:供试品溶液a为2uL,对照药材溶液a为3uL;展开剂:以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(10:3:0.1)为展开剂;显色剂:10%硫酸乙醇试液,在105℃加热,紫外光灯365nm下检视。
4.如权利要求1所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,所述热浸法以乙醇为溶剂,采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤:
(1)制备对照药材参照物溶液b:取五加皮对照药材0.2g,加入50%甲醇50mL,超声处理20min,放冷,滤过,取续滤液,作为对照药材参照物溶液b;
(2)制备对照品参照物溶液b:取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,制得浓度为20ug/mL的对照品参照物溶液b;
(3)制备供试品溶液b:取五加皮配方颗粒适量,研细,取约0.2g,置具塞锥形瓶中,加入50%甲醇50mL,称定重量,超声30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液b。
6.如权利要求1所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,采用液相色谱法测定绿原酸含量包括:进行液相色谱仪分析,以绿原酸对照品制成的溶液作为对照品溶液c,以五加皮配方颗粒样品制成的溶液作为供试品溶液c,分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c,分别注入液相色谱仪,测定,即得;其中,采用的色谱条件为,色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸溶液为流动相B,按规定进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min;柱温:20℃;进样量:10μL;检测波长:325nm。
7.如权利要求6所述的五加皮配方颗粒质量检测方法,其特征在于,采用液相色谱法测定绿原酸含量还包括如下步骤:
(1)制备对照品溶液:取绿原酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成含绿原酸的浓度为20ug/ml的溶液,作为对照品溶液c;
(2)制备供试品溶液:取五加皮配方颗粒适量,研细,取约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液c。
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