CN116004923A - 一种检测血液病毒的rt-rap引物探针组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测血液病毒的RT‑RAP引物探针组及试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明所述引物探针组包括乙型肝炎病毒检测用引物探针组和/或丙型肝炎病毒检测用引物探针组和/或人类免疫缺陷病毒检测用引物探针组。本发明依次采用RT‑RAA和qPCR的检测手段，结合上述特异性引物探针组可同时快速检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，且特异性好。

Description

一种检测血液病毒的RT-RAP引物探针组及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测血液病毒的RT-RAP(ReverseTranscription Recombinase Aided Real-time PCR，RT-RAP)引物探针组及试剂盒。

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染导致的危及生命的一项全球公共卫生问题。急性肝炎患者会出现急性肝衰竭，导致死亡。一部分慢性感染者发展为肝硬化和肝癌等晚期肝病，发病率和死亡率较高。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的一种肝脏炎症。可造成急性或慢性肝炎，严重程度从轻微病症可到终身严重疾病。丙型肝炎急性期通常没有症状，且大都不会危及生命。但是约70％的感染者会发展为慢性丙肝，这些患者中约15％-30％发展为肝硬化。艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV)感染导致的一项危害性极大的全球性乙类传染病。HIV-1是艾滋病的全球主要流行株，在我国因艾滋病死亡人数占传染病致死人数的79.28％。以上三种病毒均可以通过血液传播，在全球呈较高流行状态，也是我国经输血传播疾病的主要病原体。这些病毒的快速及时检测诊断，可以降低输血性传染病传播，保证患者用血安全。

目前，对于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的检测多采用酶联免疫法进行抗原筛查检测，但其假阳性率较高，且易漏检，不作为最佳的筛选方法。核酸检测具有特异性和灵敏度均较高的优势，可缩短检测时间和血筛的“窗口期”，检测出血清学窗口期的漏检，是各级血站进行血筛的首推分子生物学方法，但是对于核酸检测方法众多，比如普通PCR、荧光定量PCR、等温扩增PCR、多重PCR、巢式PCR等，且核酸检测方法不同，灵敏度和特异性也相差较大。但是目前还没有关于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒快速灵敏检测的报道。

发明内容

本发明提供了一种检测血液病毒的RT-RAP引物探针组及试剂盒，该引物探针组可同时快速检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，且特异性好。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供一种检测血液病毒的RT-RAP引物探针组，包括乙型肝炎病毒(HBV)检测用引物探针组和/或丙型肝炎病毒(HCV)检测用引物探针组和/或人类免疫缺陷病毒(HIV)检测用引物探针组；所述乙型肝炎病毒检测用引物探针组包括：HBV-RAA-F、HBV-RAA-R、HBV-PCR-F、HBV-PCR-R和HBV-P；所述HBV-RAA-F、HBV-RAA-R、HBV-PCR-F、HBV-PCR-R和HBV-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示；所述丙型肝炎病毒检测用引物探针组包括：HCV-RAA-F、HCV-RAA-R、HCV-PCR-F、HCV-PCR-R和HCV-P；所述HCV-RAA-F、HCV-RAA-R、HCV-PCR-F、HCV-PCR-R和HCV-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～SEQ IDNO.10所示；所述人类免疫缺陷病毒检测用引物探针组包括：HIV-RAA-F1、HIV-RAA-R1、HIV-PCR-F1、HIV-PCR-R1、HIV-P1、HIV-RAA-F2、HIV-RAA-R2、HIV-PCR-F2、HIV-PCR-R2和HIV-P2；所述HIV-RAA-F1、HIV-RAA-R1、HIV-PCR-F1、HIV-PCR-R1、HIV-P1、HIV-RAA-F2、HIV-RAA-R2、HIV-PCR-F2、HIV-PCR-R2和HIV-P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示；所述HBV-P、HCV-P、HIV-P1和HIV-P2分别标记不同的荧光基团。

优选的，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC。

本发明提供一种非疾病诊断目的的检测血液病毒的试剂盒，包括所述引物探针组以及RT-RAA反应用试剂、qPCR反应用试剂。

优选的，所述试剂盒还包括正二十二烷。

优选的，所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和DEPC水；所述qPCR反应用试剂包括反应缓冲液、DEPC水、热启动Taq聚合酶。

本发明提供一种检测血液病毒的RT-RAP方法，包括如下步骤：1)提取待测样品的核酸；2)以所述核酸为模板，采用所述引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔；3)若乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒对应的荧光曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有对应的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒。

优选的，所述RT-RAA扩增的反应体系包括280mM的乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.2～0.8：0.5～1.5：6～12。

优选的，所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔，包括：在qPCR扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增体系。

优选的，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增于带盖的管内进行；在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增体系包括如下步骤：将除乙酸镁以外的RT-RAA扩增体系加入到凝固的正十二烷之上，将乙酸镁加到盖内，利用乙酸镁启动RT-RAA反应。

本发明提供所述引物探针组以及所述试剂盒在检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次采用RT-RAA和qPCR组合(Reverse Transcription RecombinaseAided Real-time PCR，RT-RAP)的检测手段单独或同时检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，且检测灵敏度明显优于qPCR。该检测手段高效快速，大大缩短了反应时间。

本发明设计的引物探针组灵敏度高、特异性好，可实现单独或同时检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的目的。

附图说明

图1为RT-RAP检测原理、流程示意图。

图2为HBV RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

图3为HCV RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

图4为HIV RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

图5为HBV三重RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

图6为HCV三重RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

图7为HIV三重RT-RAP和普通qPCR灵敏度图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测血液病毒的RT-RAP引物探针组，包括乙型肝炎病毒检测用引物探针组和/或丙型肝炎病毒检测用引物探针组和/或人类免疫缺陷病毒检测用引物探针组。本发明所述引物探针组见表1。

表1引物和探针信息

注：1代表的探针修饰：5’VIC荧光基团，3’BHQ-1淬灭剂；2代表的探针修饰：5’CY5荧光基团，3’BHQ-3淬灭剂；3代表的探针修饰：5’HEX荧光基团，3’BHQ-1淬灭剂；简并碱基：R＝A or G，Y＝C or T。

在本发明中，用于RAA扩增的引物是在现有的qPCR引物基础上，按照RT-RAA引物的设计原则，延长至30～35bp之间。

在本发明中，所述引物探针组中的每个引物的使用浓度优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。

在本发明中，所述人类免疫缺陷病毒优选为人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)。

本发明提供一种检测血液病毒的试剂盒，包括所述引物探针组、RT-RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。本发明所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和DEPC水；所述qPCR反应用试剂包括反应缓冲液、DEPC水、热启动Taq聚合酶。

在本发明中，所述试剂盒还包括正二十二烷。本发明所述正二十二烷是一种熔点为44℃的白色晶体，常温下为固体，密度为0.7944g/mL，随温度变化可拆解，不会影响核酸扩增反应。本发明由于所述RT-RAA和qPCR反应所需的温度不同，因此本发明利用正二十二烷将RT-RAA和qPCR两种反应体系分隔开。本发明通过加入正二十二烷作为分隔两种体系的特殊材料实现单管闭管两阶段的一步对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒进行快速、准确、高灵敏的检测。

本发明提供一种检测血液病毒的RT-RAP方法，包括如下步骤：1)提取待测样品的核酸；2)以所述核酸为模板，采用所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔；3)若乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒对应的荧光曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有对应的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒。本发明对提取待测样品的核酸的方法没有特殊限制；所述待测样品优选为血液；提取待测样品的核酸优选的采用病毒核酸提取试剂盒提取(西安天隆科技有限公司)。

在本发明中，所述RT-RAA扩增的反应体系包括乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.2～0.8：0.5～1.5：6～12，优选为0.5：1：9，所述RT-RAA反应混合液以40μl计，优选的包括以下组分：反应缓冲液29.4μl、DEPC水6μl、HBV-RAA-F0.7μl、HBV-RAA-R0.7μl、HCV-RAA-F0.8μl、HCV-RAA-R0.8μl、HIV-RAA-F10.4μl、HIV-RAA-R10.4μl、HIV-RAA-F20.4μl、HIV-RAA-R20.4μl，取9μl用于RT-RAP；所述RT-RAA扩增的反应程序包括39～42℃、15～20min。本发明所述反应缓冲液以Tris缓冲液为溶剂，优选的的包括以下浓度的组分：Tris缓冲液45mM、醋酸钾80mM、二硫苏糖醇4mM、质量体积浓度为7.28％的聚乙二醇、ATP5mM、dNTPs0.24mM、磷酸肌酸30μg/U、单链结合蛋白500ng/μL、重组酶400ng/μL、UvsY蛋白70ng/μL、DNA聚合酶90ng/μL和核酸外切酶85ng/μL。

在本发明中，所述qPCR扩增的反应体系以40μl计，优选的包括以下组分：反应缓冲液8μl、DEPC水12.8μl、热启动Taq聚合酶2μl、HBV-PCR-F1.4μl、HBV-PCR-R1.4μl、HBV-PCR-P0.7μl、HCV-PCR-F3.6μl、HCV-PCR-R3.6μl、HCV-PCR-P0.9μl、HIV-PCR-F11.2μl、HIV-PCR-R11.2μl、HIV-PCR-P10.4μl、HIV-PCR-F21.2μl、HIV-PCR-R21.2μl、HIV-PCR-P20.4μl；所述qPCR扩增的反应程序包括：95℃、3min；95℃、2s，60℃、13s，30个循环。

在本发明中，所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔，优选包括：在qPCR扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增体系。本发明所述静置的程序优选的包括：60℃、1min，4℃、30s。

在本发明中，作为一个实施例中，本发明将qPCR扩增体系分装入八联管中，加入液态的正二十二烷后，其在室温下迅速冷却凝固，浮于PCR体系之上。经过60℃条件下处理1min、4℃条件下处理30s后使正二十二烷重新熔化后均匀凝固在PCR体系上。本发明将RT-RAA扩增体系分装在凝固后的正二十二烷上层，使得在同一管中实现RT-RAA先反应，随后在第二阶段加热到95℃同时使重组酶酶失活并且正二十二烷熔化后浮于最上层，进而将第一阶段中RT-RAA反应中的大量目标产物与qPCR体系混合，进行下一步的PCR反应并检测。本发明在第一阶段可以在20min内对模板进行大量富集，再进行第二阶段的qPCR。整个扩增过程可以在50min以内完成，实现快速扩增。该方法具有超高灵敏度，可达单拷贝/反应，优于传统的的qPCR。本发明的引物探针组还具有高特异性的优势。

本发明提供所述的引物探针组以及所述的试剂盒在检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的应用。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1用于检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒单重RT-RAP的建立

1.样品来源及核酸提取

收集了2022年2月～2022年9月来自河北省人民医院的40份乙型肝炎病毒阳性血清、40份丙型肝炎病毒阳性血清以及本实验室留存的40份人类免疫缺陷病毒阳性核酸。

所收集阳性血清样本使用病毒核酸提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)提取核酸，存放于-80℃直至使用。

共120份核酸，分别使用广州达安基因乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒、丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒和人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸测定试剂盒进行平行检测。

2.利用表1中针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的引物探针组进行RT-RAP检测。

RT-RAA试剂盒为基础法RT-RAA扩增试剂盒(江苏齐天有限公司)，qPCR试剂盒为FastOne-StepprobeRT-qPCRKit试剂盒(ABclonal公司)，扩增仪器为鲲鹏ArchimedX6荧光定量PCR仪。按照表2～3分别配置对应扩增体系。

RT-RAP检测步骤：将qPCR体系分装入八联管后加入25μl的正二十二烷，置于LongGeneA300(60℃1min，4℃30s)，使正二十二烷均匀浮于qPCR体系之上。每个RT-RAA反应单元管加入RT-RAA反应体系40μl反应体系溶解干粉，将单元管在奇天B6100混匀仪中混匀两次。9μl的RT-RAA体系分装到凝固的正二十二烷上，加入1μl的样本核酸。八联管管盖上加入0.5μl的乙酸镁，封闭管盖。在掌上离心机Eastwin瞬时离心，使得乙酸镁掉落至RT-RAA体系，启动RT-RAA反应。放入PCR仪器中，反应程序按照表4进行。检测流程见图1。

表2 RT-RAA(基础法)试剂盒HBV/HCV/HIV反应体系

表3 qPCR试剂盒HBV/HCV/HIV反应体系

表4反应程序

实施例2用于检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒三重RT-RAP的建立

按照表6配置qPCR反应体系，按照表5配置RT-RAA反应体系。

三重RT-RAP检测步骤同实施1步骤2所述的RT-RAP检测步骤。反应程序按照表7进行。

表5 RT-RAA(基础法)试剂盒反应体系

表6 qPCR试剂盒反应体系

表7反应程序

实施例3乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒RT-RAP检测方法的灵敏度评价

1.单重RT-RAP灵敏度评价：将靶基因序列用pUC57作为载体合成含靶基因的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒阳性质粒DNA(由北京擎科生物有限公司合成)。将合成的三种病毒阳性质粒分别按10倍连续浓度梯度稀释，浓度范围为10⁰～10⁴拷贝/μL，将不同浓度的阳性质粒DNA作为模板，进行单重RT-RAP检测(检测方法同实施例1，当扩增模板为RNA时，需进行逆转录过程)。RT-RAA反应体系以及qPCR反应体系按照表2和表3分别配置，阳性质粒DNA的添加量为1μL，RT-RAA引物的终浓度为0.4μmol/L。检测结果见图2～4。

普通qPCR检测灵敏度评价：检测方法同实施例1中qPCR的引物探针和试验步骤。

如图2～4所示，图2A和图2B分别为用于乙型肝炎病毒的RT-RAP检测灵敏度(LOD)图和普通qPCR检测灵敏度图；由图2A和图2B所示，采用RT-RAP检测乙型肝炎病毒灵敏度为10⁰拷贝/反应，采用普通qPCR方法灵敏度为10¹拷贝/反应。图3A和图3B分别为用于丙型肝炎病毒的RT-RAP灵敏度图和普通qPCR检测灵敏度图；由图3A和图3B所示，RT-RAP检测丙型肝炎病毒灵敏度为10⁰拷贝/反应，采用普通qPCR方法灵敏度为10²拷贝/反应。图4A和图4B分别为检测人类免疫缺陷病毒-1的RT-RAP灵敏度图和普通qPCR检测灵敏度图；由图4A和图4B所示，RT-RAP检测人类免疫缺陷病毒灵敏度为10⁰拷贝/反应，采用普通qPCR方法灵敏度为10¹拷贝/反应。

2.三重RT-RAP灵敏度评价：将该实施例步骤1合成的三种病毒的阳性质粒按10倍连续浓度梯度分别稀释，浓度范围为10⁰～10⁴拷贝/μL，将不同浓度的阳性质粒DNA作为模板，进行三重RT-RAP实验(检测方法同实施例2)。RT-RAA反应体系以及qPCR反应体系按照表5和表6分别配置，三种病毒的阳性质粒DNA的总添加量为1μL。检测结果见图5～7。

三重普通qPCR灵敏度评价：检测方法同实施例2中qPCR的引物探针和试验步骤。

如图5～7所示，图5A、6A和7A为三重RT-RAP阳性质粒灵敏度扩增信号图，图5B、6B和7B为三重普通qPCR阳性质粒灵敏度扩增信号图，其中检测乙型肝炎病毒使用了VIC荧光信号，丙型肝炎病毒使用了CY5荧光信号，人类免疫缺陷病毒使用了FAM荧光信号。如图5A、6A和7A所示，三重RT-RAP检测乙肝病毒灵敏度为10⁰拷贝/反应，丙肝病毒灵敏度为10¹拷贝/反应，人类免疫缺陷病毒灵敏度为10⁰拷贝/反应。如图5B、6B和7B所示，三重普通qPCR检测乙肝病毒灵敏度为10¹拷贝/反应，丙肝病毒灵敏度为10²拷贝/反应，人类免疫缺陷病毒灵敏度为10¹拷贝/反应。

实施例4乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒RT-RAP检测方法的特异性评价

使用本实验室保存的8种血液相关病原体样本，包括EB病毒、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、梅毒螺旋体、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。用实施例1和2建立的RT-RAP方法平行鉴定，结果如表8。

表8特异性评价结果

注：N代表negative

如表8所示：上述实施例1建立的用于检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒单重RT-RAP方法，能特异性检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，并不与其他病原发生交叉反应。

用实施例2建立的用于检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒三重RT-RAP方法，能特异性检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，并不与其他病原发生交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测血液病毒的RT-RAP引物探针组，其特征在于，包括乙型肝炎病毒检测用引物探针组、丙型肝炎病毒检测用引物探针组和人类免疫缺陷病毒检测用引物探针组中的一种或多种；

所述乙型肝炎病毒检测用引物探针组包括：HBV-RAA-F、HBV-RAA-R、HBV-PCR-F、HBV-PCR-R和HBV-P；

所述HBV-RAA-F、HBV-RAA-R、HBV-PCR-F、HBV-PCR-R和HBV-P的核苷酸序列分别如SEQID NO.1～SEQ ID NO.5所示；

所述丙型肝炎病毒检测用引物探针组包括：HCV-RAA-F、HCV-RAA-R、HCV-PCR-F、HCV-PCR-R和HCV-P；

所述HCV-RAA-F、HCV-RAA-R、HCV-PCR-F、HCV-PCR-R和HCV-P的核苷酸序列分别如SEQID NO.6～SEQ ID NO.10所示；

所述人类免疫缺陷病毒检测用引物探针组包括：HIV-RAA-F1、HIV-RAA-R1、HIV-PCR-F1、HIV-PCR-R1、HIV-P1、HIV-RAA-F2、HIV-RAA-R2、HIV-PCR-F2、HIV-PCR-R2和HIV-P2；

所述HIV-RAA-F1、HIV-RAA-R1、HIV-PCR-F1、HIV-PCR-R1、HIV-P1、HIV-RAA-F2、HIV-RAA-R2、HIV-PCR-F2、HIV-PCR-R2和HIV-P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20所示；

所述HBV-P、HCV-P、HIV-P1和HIV-P2分别标记不同的荧光基团。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC。

3.一种检测血液病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组、RT-RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括正二十二烷。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和DEPC水；所述qPCR反应用试剂包括反应缓冲液、DEPC水、热启动Taq聚合酶。

6.一种非疾病诊断目的的检测血液病毒的RT-RAP方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品的核酸；

2)以所述核酸为模板，采用权利要求1或2所述的引物探针组，依次进行RT-RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔；

3)若乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒对应的荧光曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有对应的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA扩增的反应体系包括280mM乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液；所述乙酸镁、模板和RT-RAA反应混合液的体积比为0.2～0.8：0.5～1.5：6～12。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA和qPCR扩增体系采用正二十二烷进行间隔，包括：在qPCR扩增体系中加入熔融的正二十二烷进行静置，正二十二烷浮于qPCR扩增体系之上，待所述正二十二烷凝固后，在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增体系。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA扩增和qPCR扩增于带盖的管内进行；在凝固的正二十二烷上加入RT-RAA扩增体系包括如下步骤：将除乙酸镁以外的RT-RAA扩增体系加入到凝固的正十二烷之上，将乙酸镁加到盖内，利用乙酸镁启动RT-RAA反应。

10.如权利要求1或2所述的引物探针组或权利要求3～5任意一项所述的试剂盒在制备检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒产品中的应用。

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