CN116004591A - 一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂 - Google Patents

Abstract

一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，属于肿瘤治疗技术领域。本发明通过构建嗜热精氨酸酶和嗜热天冬酰胺酶(核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示)与金纳米棒和透明质酸共价耦合的纳米复合物，利用纳米金的光热效应，实现近红外激光激发的局域能量传递而激活嗜热酶活性，催化肿瘤细胞内部精氨酸/天冬酰胺的水解，产生“氨基酸饥饿”状态，协同饥饿疗法与光热治疗，提升肿瘤杀伤能力。最终结果显示该纳米体系具备靶向CD44高表达的乳腺癌细胞系MCF‑7的优异的细胞摄取能力以及抑制肿瘤细胞增殖、迁移、浸润能力，在裸鼠皮下移植瘤模型中显示出显著的抑瘤能力。

Description

一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，该纳米制剂可以在肿瘤的酶法治疗中得到应用。

背景技术

近年来，酶制剂已被开发用作如代谢紊乱、炎症、心血管疾病、癌症等多种病症的有效治疗药物。常规酶疗法是应用异源酶、同源酶或工程化酶制剂参与体内相关代谢过程，基于酶的催化活性已实现多种目标分子的转化，通过抑制恶性细胞的分化增殖或恢复正常细胞的生理代谢水平以实现诊治的目的。由此开发的基于恶性肿瘤细胞的代谢异常的酶促营养消耗治疗策略也充分展示了其治疗优势。肿瘤细胞的生长环境和生存需求不同于正常细胞，为了快速分裂和增殖，肿瘤细胞需要大量能量和氨基酸的供应满足蛋白质复制的需求。然而，某些恶性肿瘤细胞对于特定的氨基酸是营养缺陷的，这表明肿瘤饥饿是一种可行的潜在治疗方法。针对天冬酰胺水解的饥饿疗法已成功证明了这一点，FDA首个批准临床应用的异源酶——大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶Ⅱ，对于儿童急性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤都具备较好的治疗效果。除此以外，靶细胞毒性的应用概念也被发展至精氨酸、蛋氨酸的靶向饥饿治疗中。由于肿瘤细胞缺乏相应氨基酸合酶，此时治疗性酶制剂的介入会导致肿瘤细胞呈现“氨基酸饥饿”状态。细胞内环境稳态的打破必然引起整个细胞氨基酸、蛋白质和核酸代谢的紊乱，使肿瘤细胞生长受到抑制。与已建立的其他治疗方法相比，酶疗法具有高亲和力和特异性强的优势。然而，常温酶制剂在生物医学中的应用也常面临如体内半衰期短、脱靶毒性作用、热稳定性差、酶活性无法控制以及免疫原性反应等挑战。从生长在极端环境的嗜热菌中分离获得的嗜热酶具备更好的热稳定性和较长的半衰期，克服了中温酶以及低温酶在生物应用中的不稳定性，但由于嗜热酶在常温时催化活性低的特点，使其在酶疗法中很难被进一步应用。

酶的活性具有可调控性，酶活性的调控是酶学应用领域的关键问题。传统的调控方式，如调整催化反应体系参数或酶分子改造修饰，均为间接地调控酶的活性，是不可逆的激活策略。值得注意的是，近红外(Near-infrared，NIR)、微波(Microwave)、超声(Ultrasound)或交变磁场(Alternating Magnetic Field，AMF)作为新兴的实时催化和精确激活的策略，以其低侵入性、组织渗透性和持续性的特点，解除了许多应用限制，已被应用于多项领域。这种将酶固定在纳米材料上进行时空调控的策略通过向酶蛋白传递能量，而导致优势构型变化来提升酶的催化性能、热稳定性和动力学特性。调控策略的核心是具有超强光热转换效率材料的开发。金纳米棒(Gold Nanorod，GNR)的局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)特性使其能够实现快速的光吸收和高效的光热转换，通过改变粒子长径比调谐到近红外波段(700-1300nm)，使GNR成为NIR调控的极佳候选材料。文献“Real-time regulation of catalysis by remote-controlledenzyme-conjugated gold nanorod composites for aldol reaction-basedapplications”^[1]中考察了GNR对中温酶、嗜热酶和超嗜热酶的NIR远程实时激活催化效果，并证明了NIR激光辐射下能量的转换与传递具备嗜热酶激活与催化反应的实时控制的优势。文献“Using near-infrared enhanced thermozyme and scFv dual-conjugated Aunanorods for detection and targeted photothermal treatment of Alzheimer’sdisease”^[2]考察了嗜热酰基氨肽酶在阿尔兹海默症治疗中的潜在优势。

利用靶向识别技术将GNR聚集于肿瘤细胞，能够最大限度地降低激光能量产生的组织损伤，并靠热能加热杀死肿瘤细胞，这种治疗方式被称为光热疗法(Photothermaltherapy，PTT)。肿瘤的主动靶向效果可以通过透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)的修饰，实现配体-受体结合的靶向肿瘤细胞内部富集的效果。许多肿瘤细胞膜上都异常高表达一种糖蛋白CD44，作为HA的高亲和性受体，由于其处于高度活化状态，可以作为肿瘤标志物和靶向受体。通过配体-受体的特异性结合，即可完成内吞作用介导的肿瘤靶向传递药物的目的。

嗜热酶的特性使其在生物医用应用中受限，本发明引出此项近红外驱动型靶向酶疗模型概念，旨在开发一种高效、智能、具有发展潜力的肿瘤靶向酶疗体系，拓展嗜热酶在肿瘤酶疗中的应用。

参考文献：

[1]Li W,Liu D,Geng X,et al.Real-time regulation of catalysis byremote-controlled enzyme-conjugated gold nanorod composites for aldolreaction-based applications[J].Catalysis Science&Technology,2019,9(9):2221-2230.

[2]Liu D,Li W,Jiang X,et al.Using near-infrared enhanced thermozymeand scFv dual-conjugated Au nanorods for detection and targeted photothermaltreatment of Alzheimer's disease[J].Theranostics,2019,9(8):2268.

发明内容

本发明的目的是提供一种基于嗜热精氨酸酶或嗜热天冬酰胺酶(核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示)构建的近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，使嗜热酶发挥酶学性质优势并拓展其在生物医学中的应用。

本发明创造性地构建了由嗜热酶及靶向分子透明质酸(HA)修饰搭载金纳米棒(GNR)的近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂。表层修饰的HA可以特异性识别人乳腺癌MCF-7细胞膜上高表达的CD44分子，实现肿瘤细胞的主动靶向作用。作为光热转换剂的GNR可吸收808nm的NIR激光并实现高效的光热转换，能量传递并激发与其共价锚定的嗜热酶的催化活性，水解肿瘤细胞内的氨基酸，使肿瘤细胞呈现“氨基酸饥饿”状态，大幅提高对肿瘤细胞的杀伤能力。该纳米制剂可联合肿瘤细胞饥饿疗法和光热疗法，协同抑制肿瘤的生长，进一步提高嗜热酶的肿瘤治疗效果。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种嗜热精氨酸酶OCC08105和一种嗜热天冬酰胺酶OCC10209，是由以下步骤制备而获得的：

(1)通过NCBI Genbank搜索得到来自嗜热细菌Thermococcus litoralis NS-C的嗜热精氨酸酶OCC08105基因序列(837bp，编码278aa，SEQ ID No.1)和嗜热天冬酰胺酶OCC10209基因序列(1038bp，编码345aa，SEQ ID No.2)；

(2)根据酶的核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2设计引物，利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增嗜热精氨酸酶OCC08105基因和嗜热天冬酰胺酶OCC10209基因；

(3)利用DNA重组技术将扩增的嗜热精氨酸酶OCC08105基因和嗜热天冬酰胺酶OCC10209基因分别与大肠杆菌表达载体pET28a连接以构建重组质粒，再转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中构建重组酶表达菌，利用蛋白质表达诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导嗜热酶的表达，表达产物为细胞内可溶性蛋白；最后通过细胞超声破碎，Ni²⁺-NTA亲和层析分离纯化获得嗜热精氨酸酶和嗜热天冬酰胺酶。

本发明的第二个方面，研究上述嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209催化氨基酸水解反应的最适温度、最适pH、热稳定性及pH稳定性的酶学特征参数。

本发明的第三个方面，提供一种基于嗜热精氨酸酶或嗜热天冬酰胺酶构建的近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂的制备方法，其步骤如下：

(1)晶种生长法合成金纳米棒(GNR)溶液：将5mL、0.5mM四水合氯金酸水溶液和5mL、0.2M CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)水溶液混合均匀，25～30℃下加入到0～4℃的500～600μL、0.01M硼氢化钠水溶液反应1～2h得到金晶种浓度9～10μg/mL的棕黄色金晶种溶液；再将5mL、0.2M CTAB水溶液，5mL、1mM四水合氯金酸水溶液，200～350μL、4mM硝酸银水溶液和70μL、0.0788M抗坏血酸水溶液混合均匀，得到混合生长溶液；在27～30℃条件下，将12μL金晶种溶液添加到10mL混合生长溶液中生长16～24小时，制得长径比为3.3～3.8：1、长度为42～46nm、宽度为12～14nm的具有高效光热转换效率的金纳米棒浓度0.2～0.5mg/mL的金纳米棒溶液；

(2)巯基标记的透明质酸(HA)的合成：在100mL、3mM透明质酸水溶液中添加4mmolEDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和4mmol NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，持续搅拌1.5～3.0h以活化透明质酸上的羧基；然后向其中加入2mmol半胱氨酸进行巯基标记，再使用透析管(8000～14000Da)透析标记物3～5天后，冷冻干燥后得到巯基标记的透明质酸；

(3)GNR-HA-Enzyme的合成：将步骤(2)制得的巯基标记的透明质酸和纯化的酶嗜热精氨酸酶OCC08105或嗜热天冬酰胺酶OCC10209加入到步骤(1)的金纳米棒溶液中，低温剧烈(400～500rpm)搅拌9～12小时，得到Au-S键共价耦合的纳米颗粒(GNR-HA-Enzyme(GHE))，再通过高速离心的方式去除未结合的酶蛋白，去除上清后得到本发明所述的近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂。

所述步骤(1)中制备的金纳米棒可在近红外激光辐照下发生光热转换效应，作为纳米制剂的纳米载体和光热效应材料。

所述步骤(2)中制备的巯基标记的透明质酸为靶向分子，可特异性结合到肿瘤细胞膜表面高表达的CD44分子上；靶向分子通过Au与-SH的共价键方式连接到纳米载体上。

所述步骤(3)中的嗜热精氨酸酶OCC08105或嗜热天冬酰胺酶OCC10209为酶法治疗的关键效应因子。

作为优选，所述步骤(3)金纳米棒溶液中，金纳米棒的浓度为0.1～0.2mg/mL，利用0.2M碳酸钾溶液将体系pH值调节至8.0～10.0。

作为优选，所述步骤(3)金纳米棒溶液中，巯基标记的HA的浓度为0.1～0.2mg/mL。

作为优选，所述步骤(3)金纳米棒溶液中，嗜热精氨酸酶OCC08105或嗜热天冬酰胺酶OCC10209的浓度为0.4～0.5mg/mL。

作为优选，所述步骤(3)的低温搅拌进行共价耦合的温度为4～8℃。

作为优选，所述步骤(3)高速离心的转速为10,000～14000rpm，离心时间为8～15min，去除上清以获取完整的纳米颗粒，即近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂。

本发明中，所述纳米制剂通过金-硫共价键作用相结合，形成键合稳定的纳米级粒子。

所述制备获得的金纳米棒-透明质酸-嗜热酶纳米制剂，具有显著的NIR激活嗜热酶催化水解氨基酸能力，在肿瘤治疗领域具有一定的应用前景。

通过尾静脉注射的方式给药，将所述纳米制剂导入移植瘤裸鼠模型体内，并且在肿瘤部位定点808nm近红外激光辐照诱导嗜热酶活性的激发，杀伤肿瘤细胞，产生协同抑瘤效果。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明创造性地将嗜热酶、透明质酸及金纳米棒组合在一起，从体外培养的肿瘤细胞增殖抑制和裸鼠移植瘤模型抑瘤效应两个方面共同说明治疗效果，拓宽嗜热酶的生物医学应用范围；

(2)从技术方案效果而言，本发明的近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂的制备过程，反应条件温和、工艺简单、易于操作；

(3)从近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤纳米治疗体系的效果而言，本发明制备了基于嗜热精氨酸酶和嗜热天冬酰胺酶的两种氨基酸饥饿治疗模型，分别激活嗜热酶对精氨酸和天冬酰胺的水解，产生不同氨基酸的耗竭，达成肿瘤细胞内稳态失衡的饥饿状态，验证了两种嗜热酶模型激活催化的抑瘤效果，研究确切说明本发明模型的普适性；

(4)近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤纳米制剂具有良好的靶向性。通过将HA修饰到纳米制剂表面，利用HA与肿瘤细胞膜表面高表达的CD44分子结合的特点，实现纳米药物的靶向递送，利于体系在肿瘤部位的局部富集，具有高效、全身副作用小的特点。

(5)近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤纳米制剂的生物安全性高。嗜热酶在体温环境为低催化活性，只有靶向到达肿瘤细胞内环境时，受到定点辐照的近红外激光驱动下才会发挥高催化活性，促成肿瘤细胞“氨基酸饥饿”状态。而不会对非靶向部位产生损伤，避免非靶向部位的生物毒性；且由于正常细胞具备完整的氨基酸合酶系统，对正常组织的毒副作用小。

(6)本发明制备的多功能纳米治疗体系，所采用的纳米材料自身具备近红外区良好的光热转换能力，能够增强局部光热治疗，将嗜热酶法治疗与热疗结合，相辅相成，协同提升肿瘤杀伤能力；

(7)本发明制备的多功能纳米治疗体系具有产业化实施的前景，是有潜力的新型高效肿瘤靶向酶疗方法。

附图说明

图1：实施例1中嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209的基因片段扩增琼脂糖凝胶电泳图(A)和重组酶蛋白表达SDS-PAGE检测图(B)；(A)M为分子量2000bp的DNA marker；1为OCC08105基因(837bp)；2为OCC10209基因(1028bp)，结果表明PCR获得了嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209基因片段；(B)M为预染蛋白质marker(14～100kDa)；1、3分别为重组酶OCC08105和OCC10209的粗提取物；2、4分别OCC08105(31.3kDa)和OCC10209(38.5kDa)为经Ni²⁺-NTA亲和层析纯化酶，结果表明获得了纯化的嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209蛋白。

图2：实施例2中嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209的酶学性质表征曲线。OCC08105的最适反应温度曲线(A)、热稳定曲线(B)、最适反应pH曲线(C)以及pH稳定性曲线(D)；OCC10209的(E)最适反应温度曲线、(F)热稳定曲线、(G)最适反应pH曲线以及(H)pH稳定性曲线。纵坐标为相对活力，横坐标分别为温度(℃)、时间(h)和pH，以最高活力为100％。结果表明，嗜热精氨酸酶OCC08105的最适反应温度为70℃，在60～80℃温育3天时相对活力仍在67～80％；最适pH为10.0，在pH5.0～8.0相对活力接近最大活力的90％；在pH7.0条件下24h后酶的活力损失约40％。嗜热天冬酰胺酶OCC10209最适反应温度为60℃，在50～60℃时的半衰期约为3天；在pH 5.0～12.0酶活力维持在很高水平，在pH 7.0条件下24h酶活力损失小于5％。说明两个酶都有很好的稳定性。

图3：GNR的表征结果(对应实施例3)。(A)GNR的TEM表征谱图；(B)不同浓度GNR在2W/cm²的808nm NIR激光辐照下光热作用曲线；(C)50μg/mL GNR在不同功率808nm NIR激光辐照下光热作用曲线。结果表明，合成的长径比为3.5的GNR具备与浓度和NIR功率正相关的光热转换能力。

图4：实施例3中GHE的表征结果。(A)GH5(GNR/HA/OCC08105)的SEM表征谱图；(B)OCC08105、G5(GNR/OCC08105)、GH5(GNR/HA/OCC08105)、GH及GNR紫外吸收光谱；(C)OCC10209、G9(GNR/OCC10209)、GH9(GNR/HA/OCC10209)、GH及GNR紫外吸收光谱。结果表明GH5纳米制剂仍保持了棒状结构，且GH5和GH9的紫外吸收光谱中280nm蛋白特征峰的出现也证明了嗜热酶的成功偶联。

图5：实施例3中GHE的酶学性质曲线。(A)OCC08105、G5和GH5在有/无2W/cm² NIR介导下的酶活性变化曲线；(B)OCC10209、G9和GH9在有/无2W/cm² NIR介导下的酶活性变化曲线；(C)OCC08105、G5和GH5的储存稳定性曲线；(D)OCC10209、G9和GH9的储存稳定性曲线；(E)G5和GH5的生物稳定性曲线；(F)G9和GH9的生物稳定性曲线。结果表明GE和GHE可在生理温度下高效地被NIR激发，很好地发挥水解活力；同时，GE和GHE的储存稳定性均优于游离酶，在模拟的细胞培养液中也表现出较好的生物稳定性。

图6：实施例4中MTT法检测对MCF-7细胞的杀伤作用图。(A)不同浓度OCC08105对MCF-7细胞的杀伤作用图；(B)不同浓度OCC10209对MCF-7细胞的杀伤作用图；(C)不同浓度G5受/无2W/cm² NIR激光诱导对MCF-7细胞的杀伤作用图；(D)不同浓度G9受/无2W/cm² NIR激光诱导对MCF-7细胞的杀伤作用图；(E)OCC08105基纳米制剂对MCF-7细胞的杀伤作用图；(F)OCC10209基纳米制剂对MCF-7细胞的杀伤作用图。设定未经处理的肿瘤细胞存活率为100％。结果表明，0～100μg/mL游离嗜热酶与MCF-7细胞孵育24h后，均显示细胞存活率高于70％，表明嗜热酶在不超过100μg/mL时对细胞活性无明显影响。辅助NIR照射的25μg/mL G5和G9纳米制剂处理的肿瘤细胞仅分别保持了49.6％和50.4％的细胞存活率。并且，在不同治疗方案下的细胞存活率柱状图显示，808nm NIR激发的嗜热酶协同光热治疗对MCF-7细胞的杀伤效果最好，而单独游离嗜热酶的治疗组对肿瘤细胞几乎没有杀伤。

图7：实施例4中靶向入胞能力表征图。FITC-OCC08105基及FITC-OCC10209基纳米制剂的(A、C)荧光显微镜结果及(B、D)流式细胞术检测结果。结果表明经过HA修饰的GHE的入胞效率高于游离酶和GE，具备针对乳腺癌MCF-7细胞更精准和快速的靶向能力。

图8：实施例4中OCC08105基及OCC10209基纳米制剂集落形成抑制的显微镜结果(A、C)及定量结果(B、D)。结果表明，对比经游离嗜热酶和单独光热治疗的肿瘤细胞，GHE和GE处理组协同光驱动酶疗和光热治疗能够更有效地抑制细胞集落的形成，具备更强的细胞增殖抑制效果。Control为未被处理的细胞阴性对照组，GH+NIR为GNR-HA辅助NIR照射组。

图9：实施例4中OCC08105基及OCC10209基纳米制剂的Transwell检测肿瘤细胞侵袭显微照片(A、C)及定量结果(B、D)。结果表明未经处理的肿瘤细胞能通过Transwell聚碳酸酯膜的小孔，转移到膜的另一侧，而经过GE和GHE处理过的肿瘤细胞仅有少量细胞能够透过Transwell膜，表明细胞的侵袭能力被削弱，抑制了肿瘤细胞的转移能力。

图10：实施例4中OCC08105基及OCC10209基纳米制剂划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力显微照片(A、C)及定量结果(B、D)。结果表明当肿瘤细胞经过GE和GHE纳米制剂处理后，细胞划痕处无法得到有效的愈合，表明本发明构建的光驱动酶疗纳米体系能够有效发挥抑制肿瘤细胞迁移的能力。

图11：实施例5中NIR光驱动嗜热精氨酸酶OCC08105催化引发饥饿治疗协同光热治疗MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤照片(A)，肿瘤体积生长曲线(B)及裸鼠体重曲线(C)。结果表明GH5和G5给药治疗组联合了嗜热精氨酸酶OCC08105在808nm NIR触发下所发挥的酶疗和光热治疗，产生了良好的协同抑瘤生长的效果。在给药期间，裸鼠体重均未发生显著降低，表明本发明所采用的复合物对裸鼠没有明显的毒性。

图12：实施例5中NIR光驱动嗜热精氨酸酶OCC08105治疗荷瘤裸鼠的主要器官及肿瘤组织的H&E染色照片(A)，以及血清内丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、肌酐(Cre)和尿素(Urea)水平检测柱形图(B)。结果显示阴性对照组(注射生理盐水)的肿瘤切片显示细胞排列较为紧密，细胞核饱满，形态正常，而GNR、GH、G5以及GH5治疗组呈现不同程度的细胞核缩小或变形情况，细胞膜皱缩或破裂，细胞质分布不均匀，且GH5的破裂程度更大，与抑瘤效果一致。所有治疗组的裸鼠的心、肝、脾、肺、肾的H&E染色均未发生明显的形态学改变，无明显器官副作用。且血清的五项生化指标均位于正常范围内，表明本发明的纳米制剂具备生物安全性，未引发肝脏及肾脏的损伤。

图13：实施例5中NIR光驱动嗜热天冬酰胺酶OCC10209催化引发饥饿治疗协同光热治疗MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤照片(A)，肿瘤体积生长曲线(B)及裸鼠体重曲线(C)。结果表明荷瘤裸鼠经GH9和G9的尾静脉注射治疗后，由NIR驱动激发的天冬酰胺饥饿疗法协同光热治疗的组合应用产生了显著的抑瘤效果，移植瘤体积最小，具有最强的体内肿瘤抑制能力。在给药周期内，裸鼠体重均缓慢上升，符合裸鼠体重增长趋势，表明各治疗组毒副作用较弱。

图14：实施例5中NIR光驱动嗜热天冬酰胺酶OCC10209治疗荷瘤裸鼠的主要器官及肿瘤组织的H&E染色照片(A)，以及血清主要指标水平检测柱形图(B)。结果表明经G9和GH9治疗的荷瘤裸鼠，其皮下移植瘤的H&E结果显示出明显的细胞核皱缩和核密度降低的现象，呈现更松散的排列，出现细胞间空泡化的形态，这说明移植瘤的增长受到了抑制。裸鼠主要器官的H&E的病理学结果与阴性对照组基本保持一致，说明各个治疗组对主要脏器没有显著毒副作用，生物安全性良好。裸鼠血清生化指标均处于正常水平范围内，说明本发明阐述的纳米制剂具备良好的生物安全性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步说明。

实施例1：OCC08105和OCC10209工程菌的构建及蛋白表达纯化，包括以下步骤：

1.嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209基因的扩增

两种嗜热酶基因扩增的引物序列如下：

(1)嗜热精氨酸酶OCC08105：

上游引物：TGAGCCCATATGCTTTTTGGAATC，横线处为限制酶NdeⅠ识别位点；

下游引物：GGCTGGGAATTCTCATTTGGTTTT，横线处为限制酶EcoRⅠ识别位点；

(2)嗜热天冬酰胺酶OCC10209：

上游引物：ATCCGGCATATGAGCGAGAAAAGAA，横线处为限制酶NdeⅠ识别位点；

下游引物：TTGGCGGGATCCTTAACCCTCTATTT，横线处为限制酶BamHⅠ识别位点；

两种酶的PCR反应体系如下

表1：PCR反应体系

PCR反应条件：98℃，5min；98℃，10s，55℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，5min；4℃，保存。

2.重组表达菌的构建及酶蛋白的表达纯化

将嗜热精氨酸酶OCC08105的PCR产物用限制酶EcoRⅠ和NdeⅠ酶切，将嗜热天冬酰胺酶OCC10209的PCR产物用NdeⅠ和BamHⅠ酶切，载体pET-28a也分别用相应的限制酶酶切。酶切体系包括PCR产物或pET-28a质粒25μL，10×buffer 5μL，两种限制酶各1.5μL，蒸馏水15μL，混匀后于37℃酶切4h。再将双酶切的5μL PCR产物与3μL pET-28a质粒片段、1μL 10×T4DNA buffer和1μL T4 DNA Ligase混合，25℃连接2h。取连接混合物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到重组质粒，再筛选测序正确的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，培养OD₆₀₀值至0.6～1.0时加入0.5mM IPTG于20℃、120rpm振荡培养过夜，诱导酶蛋白的表达。最后，经细胞超声破碎获取表达蛋白，12,000rpm离心15min获取嗜热酶。通过Ni²⁺-NTA亲和层析对所得蛋白上清进行纯化，结果见图1，获得纯化的嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209蛋白。

实施例2：OCC08105和OCC10209的酶学性质表征

1.嗜热精氨酸酶活性的测定

嗜热精氨酸酶能够将L-精氨酸水解生成鸟氨酸和尿素，通过尿素比色法定量催化活力。将100μL、0.2M的L-精氨酸加入250μL、50mM磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，70℃预热反应体系后加入嗜热精氨酸酶150μL(终浓度为0.4mg/mL)，反应2min结束后立即置于冰水混合物中降至室温，加入1.5mL终止显色液(2.4M硫酸、200mM硼酸、6.4mM邻苯二甲醛、3.2mM盐酸萘乙二胺)，37℃恒温箱中显色20min，用紫外分光光度计测定OD₅₂₀。以每分钟消耗1μmol L-精氨酸的酶量作为1个酶活力单位。

2.嗜热天冬酰胺酶活性的测定

嗜热天冬酰胺酶能够将L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨，通过NH₃比色法定量酶活力。将100μL、80mM的L-天冬酰胺加入200μL、50mM的磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，60℃水浴预热后加入天冬酰胺酶20μL(终浓度为0.1mg/mL)，混匀反应5min，反应结束后立即加入100μL 1.5M终止反应液三氯乙酸。混匀后12,000rpm离心1min，向去除杂质的反应液中加入1.4mL超纯水以及200μL纳什试剂(7.0776g碘化汞钾与14.0275g氢氧化钾溶解于超纯水中，定容100mL，室温避光保存)。混匀后在室温静置10min显色，测定OD₄₅₀。以每分钟消耗1μmol L-天冬酰胺的酶量作为1个酶活力单位。

3.最适反应温度及热稳定性的测定

嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209的最适反应温度的测定在30～90℃进行。反应体系见本实施例的步骤1和步骤2。选择pH 7.0、50mM磷酸盐缓冲液。结果分别如图2A和图2E所示，横坐标为温度，纵坐标为相对活力，以最大活力为100％，嗜热精氨酸酶OCC08105在70℃时达到最大酶活力，嗜热天冬酰胺酶OCC10209的最大酶活力出现在60℃，说明本发明中的嗜热酶均能在高温下发挥催化活性，常温时相对活力低，具备非激活时低毒性的潜力。

嗜热精氨酸酶OCC08105的热稳定性测定分别在60℃、70℃和80℃水浴孵育，嗜热天冬酰胺酶OCC10209在50℃、60℃和70℃水浴孵育，于0、12、24、36、48、60、72h取样测定残余的酶活力。反应体系见本实施例的步骤1和步骤2，结果见图2B和图2F，横坐标为孵育时间，纵坐标为相对活力，以初始活力为100％。OCC08105在60～80℃孵育72h后，活力损失低于33％；OCC10209在50～60℃的半衰期超过72h。以上结果说明本发明的嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209具有很高的热稳定性，可以耐受NIR激光辐照GNR的光热转换，并在长时间的NIR驱动催化中保持高催化活性。

4.最适反应pH和pH稳定性的测定

在pH 3.0～12.0的范围内测定嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209的最适反应pH，反应体系见本实施例的步骤1和步骤2，不同的是将缓冲液替换为为50mM的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 3.0～8.0)和50mM的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 8.0～12.0)。结果见图2C和图2G，横坐标是pH值，纵坐标是相对酶活，以最高酶活力为100％。嗜热精氨酸酶OCC08105的最适pH为10.0，在pH 6.0～7.0时约为最大活力的88.0％；嗜热天冬酰胺酶OCC10209的最适pH为9.0时，在pH 6.0～7.0时的酶活力达到最大活力的87％以上。以上结果说明嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209具备在细胞pH微环境中展现高催化活力的应用潜力。

OCC08105和OCC10209的pH稳定性在pH 6.0～12.0的范围内测定，反应体系见本实施例的步骤1和步骤2，不同的是将缓冲液替换为50mM的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 6.0～8.0)和50mM的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 8.0～12.0)，25℃孵育1h和24h，测定残余的酶活力。结果见图2D和图2H，横坐标为pH值，纵坐标为相对酶活。结果表明嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬氨酸酶OCC10209在pH 6.0和7.0都有很高的稳定性。

实施例3：近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂的合成与表征1.GNR的合成与表征

根据晶种生长法合成金纳米棒(GNR)。晶种溶液的配制：将5mL CTAB溶液(0.2M)与5mL HAuCl₄溶液(0.5mM)混匀，再加入0℃的600μL硼氢化钠NaBH₄溶液(0.01M)至形成棕黄色溶液，继续搅拌2min后获得晶种溶液，于25℃水浴中静置待用。生长溶液的配制：向5mLCTAB(0.2M)中依次加入5mL HAuCl₄(1mM)和300μL硝酸银(4mM)，轻柔混匀后逐滴加入70μL抗坏血酸(0.0788M)，溶液由深黄色变为无色。GNR的合成：将12μL晶种溶液添加至10mL生长溶液中，置于28℃恒温环境静置20h生长。

利用HITACHI-H800透射电子显微镜(TEM)观察GNR的形态。结果如图3A所示，合成的GNR是长径比为3.5的棒状形态，平均长度44.0±2.2nm，宽约12.6±0.6nm。利用808nmNIR激光辐照GNR，记录GNR的优异光热转换能力。结果如图3B和C所示，10～100μg/mL的GNR在2W/cm² NIR激光照射下实现了与浓度正相关的光热转换效果；同时，25μg/mL GNR在0.5～3.0W/cm²NIR激光下展示出了由25℃至57℃的升温能力。由紫外-可见-近红外光谱仪记录UV-Vis光谱。结果如图4B中所示，合成的GNR具有两个典型的LSPR峰，纵向峰为721nm，横向峰为520nm，表明其具备在可见-近红外区域具有强大的LSPR吸收和散射的能力。

2.GHE的合成与表征

制备硫醇标记的透明质酸：将790.8mg EDC(4mmol)和460.4mg NHS(4mmol)依次添加到100mL HA溶液(3mM)中，持续2h搅拌。加入315.2mg半胱氨酸(终含量为2mmol)后继续搅拌24h。利用透析袋(分子截留量为8,000～14,000Da)透析4天，透析液为超纯水，使用SCIENTZ-12N冷冻干燥机获得冻干产物。

化学合成GHE：GNR经过超速离心以去除过量的表面活性剂CTAB，重新分散在超纯水中。向0.2mg/mL的GNR溶液中滴加0.2M碳酸钾溶液，将溶液pH调整至9.0。根据-SH与Au共价键合法，向GNR溶液中逐滴加入0.5mg/mL嗜热纯化酶和0.2mg/mL巯基标记的HA溶液，4℃搅拌10h以合成GHE纳米制剂，12000rpm离心10min以去除上清中未缀合的游离酶，获得完整的GHE纳米制剂。其中GH5为GNR-HA-嗜热精氨酸酶OCC08105，GH9为GNR-HA-嗜热天冬酰胺酶OCC10209。通过紫外可见吸收光谱和扫描电镜进行表征，结果如图4所示。合成的GH5粒径小于100nm，仍维持棒状形态。GE(GNR-Enzyme)和GHE在紫外可见光谱中均出现280nm的蛋白吸收峰，证实嗜热酶偶联成功。

3.NIR驱动GHE纳米制剂催化响应性检测

利用LSP808NL-2 W 808nm激光发射器照射检测NIR激活酶促效应。反应体系见实施例2的1和2，GHE与游离酶的酶添加量一致，近红外介导GHE/GE纳米制剂组仅添加NIR辐照作为辅助手段，水浴控温维持反应体系的温度稳定在25～70℃，酶活力测定方法同实施例2。结果如图5A和5B所示，37℃时，受NIR激活的嗜热精氨酸酶OCC08105纳米制剂(G5和GH5)的反应速率比游离酶嗜热精氨酸酶OCC08105分别提升了3.3和4.1倍，超过了游离酶在最适反应温度70℃时的最大活力；37℃时，受NIR激活的嗜热天冬酰胺酶OCC10209纳米制剂(G9和GH9)的反应速率也比游离酶的分别提升了2.0和1.9倍。说明NIR可以使嗜热精氨酸酶OCC08105和嗜热天冬酰胺酶OCC10209在生理温度很好地发挥水解活力。

4.储存稳定性和生物稳定性

将游离酶、GE和GHE于4℃储存28天，定期测试残余的酶活力，检测储存稳定性。酶活力测定体系同实施例2，结果如图5C和5D所示，以初始酶活性为100％。GE和GHE的稳定性都比游离酶好，28天后酶活力的损失小于20％，说明良好的稳定性具备生产应用价值。

生物稳定性是通过分别模拟细胞培养环境(含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基溶液)、模拟体液的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2)及含100mU/mL透明质酸酶的溶液环境，检测残余的酶活力。酶的活力测定同实施例2，结果如图5E和5F所示，GE和GHE都在模拟的细胞培养液中表现出了更高的稳定性，24h酶的活力仍维持在72％以上。以上结果说明，光驱动酶疗纳米制剂GE和GHE具备作为生物医药的应用潜力。

实施例4：光驱动酶促饥饿疗法的体外抗肿瘤效果

1.MTT法检测增殖抑制效果

以5,000个/孔的细胞密度将人乳腺癌细胞MCF-7接种于96孔板，将制备的0～200μg/mL药物制剂溶解于含有10％FBS的DMEM培养基中并处理细胞。待处理6h后，用PBS洗涤细胞一次，加入新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)。每孔用808nm激光器以2.0W/cm²的强度照射5min，并于37℃孵育24h。在培养基中加入20μL的5mg/mL MTT溶液，孵育4h。测量前小心去除悬浮液并每孔加入150μL DMSO。用TECAN Infinite F200 Pro酶标仪检测490nm处的吸光度。根据以下公式计算细胞增殖效率：

细胞存活率(％)＝(OD加药处理-OD空白孔)/(OD未处理-OD空白孔)×100％

游离嗜热酶对细胞模型MCF-7的细胞毒性如图6A和6B所示，横坐标分别为0～200μg/mL游离OCC08105和OCC10209的处理细胞浓度，纵坐标为细胞相对活力。结果显示以100μg/mL游离嗜热酶处理的肿瘤细胞仍维持高于70.0％的细胞活力。NIR激发下嗜热酶偶联纳米金复合物的细胞杀伤效果如图6C和D所示，横坐标分别为G5或G9纳米制剂处理细胞浓度，纵坐标为细胞相对活力。结果显示，NIR激光可显著激活25μg/mL G5和G9中偶联的嗜热酶，发挥显著的细胞增殖抑制能力。进一步，25μg/mL光驱动靶向酶疗GHE体系与25μg/mL游离嗜热酶，20μg/mL GNR，20μg/mL GH(GNR-HA)和25μg/mL GE的增殖抑制效果如图6E和6F所示，GHE纳米体系发挥了更强的肿瘤细胞杀伤的能力。

2.靶向入胞效果检测

利用蛋白质分子的赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC发生亲核反应，形成硫脲连接而共价结合的原理，构建FITC标记游离酶、GE和GHE的偶联物。构建FITC标记嗜热酶：将10mg嗜热纯化酶与1mg异硫氰酸荧光素FITC混合于10mL PBS缓冲液中，4℃避光下搅拌24h；将混合物在4℃透析(MWCO：7000Da)以去除未反应试剂，直至480nm的吸光度为0。利用FITC标记的嗜热酶构建纳米复合材料。将MCF-7细胞接种于12孔板中，用25μg/mL的酶疗纳米制剂处理细胞不同时间。当到达作用时间时，将含有纳米制剂的培养基吸弃，并用PBS洗涤细胞三次，在IX73P1F荧光显微镜下观察记录。随后，用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤细胞两次，通过CytoFLEX流式细胞仪记录FITC的荧光强度。结果如图7所示，经过HA修饰，GHE纳米体系比游离酶和GE更快速地进入细胞，解决了酶疗体系入胞能力较弱的而困境。

3.集落形成实验

以500细胞/孔的密度接种于12孔板中，待细胞贴壁后加入相应药物处理，在37℃含5% CO₂的培养环境中培养7天，期间每2天施加NIR照射以激活嗜热酶活性。吸弃培养液后用PBS冲洗细胞3次，用70%预冷乙醇在-20℃固定细胞1 h，去除上清液后用PBS清洗2次。用0.2%结晶紫染液染色15 min后，用PBS清洗残余染液。对细胞集落的形态进行拍照记录。随后，利用33%冰醋酸裂解细胞集落并离心去除杂质，记录OD₅₇₀。根据以下公式计算每组肿瘤细胞的集落形成能力：

集落形成率（%）=实验组OD₅₇₀/阴性对照OD₅₇₀×100%

本发明通过集落形成实验再一次验证光驱动酶疗纳米体系对细胞增殖的影响，结果如图8A和8C所示，相应定量结果如图8B和8D所示，嗜热酶受纳米金的光热作用而触发的催化活性转换明显抑制了细胞形成集落的能力，表明光热协同酶疗能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，且对比单独的光热治疗具备更强的抑制效果。

4.肿瘤细胞侵袭和迁移能力检测

肿瘤细胞侵袭实验：将经酶疗治疗处理过的1×10⁴MCF-7细胞重悬于200μL含有1％BSA的DMEM培养基中，注入Transwell小室上层。将650μL含有10％FBS的DMEM高糖培养基注入24孔板的Transwell小室下层。置于37℃含5％CO₂的培养环境中继续培养24h。取出Transwell小室，用无菌棉签小心擦去上层细胞，下层细胞用70％预冷乙醇浸润并于-20℃固定30min。同样，细胞用0.2％结晶紫溶液染色并拍摄记录，溶解于33％冰醋酸中以待定量。结果如图9所示，未经NIR处理的肿瘤细胞能够穿过Transwell聚碳酸酯膜层的小孔而转移至另一侧，具备强浸润能力；而当肿瘤细胞经NIR激活嗜热酶的处理后显示出明显的浸润抑制现象，这说明光驱动引发的氨基酸消耗能够有效抑制肿瘤细胞浸润的特性。

迁移能力检测：以20×10⁴细胞/mL的密度培养肿瘤细胞，当汇合率达到90％时，采用200μL移液枪头尖端制造细胞划痕。加入相应药物处理和2W/cm²NIR激活5min，记录12～48h伤口愈合宽度。结果如图10所示，GE和GHE经NIR激活后，48h划痕处无法得到有效的愈合，说明光驱动型氨基酸饥饿疗法能够有效抑制肿瘤细胞迁移。

实施例5：光驱动酶促饥饿治疗Balb/c荷瘤裸鼠

构建荷瘤Balb/C裸鼠模型：选择5～6周龄的雌性Balb/C裸鼠，收集并计数生长状态良好的MCF-7细胞，将肿瘤细胞重悬于无菌生理盐水中，以1×10⁶细胞(100μL)皮下注射至右后肢腋窝皮下。

体内光驱动靶向酶疗：当肿瘤体积达到80～100mm³时，将裸鼠随机分为6组，每组6只。裸鼠模型以5.0mg/kg的浓度尾静脉注射游离酶、GE和GHE，给药间隔为每3天一次，每次注射24h后，以2W/cm²的NIR激光连续照射肿瘤部位5min，期间持续记录裸鼠体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：V＝(a×b²)/2(V：肿瘤体积；a：肿瘤长直径；b：肿瘤短直径)。结果如图11A、11B和图13A、13B所示，本发明中基于嗜热精氨酸酶OCC08105设计的光驱动靶向酶疗纳米制剂G5、GH5和嗜热天冬酰胺酶OCC10209设计的光驱靶向酶疗纳米制剂G9、GH9引起了皮下移植瘤裸鼠模型的肿瘤的实质性消退，表明光驱动嗜热酶介导的氨基酸饥饿疗法协同光热疗法具备显著的体内抑瘤能力。图11C和13C显示小鼠体重没有减少，表明本发明所采用的复合物对于裸鼠没有明显的毒性，GE和GHE具备良好的生物安全性。

组织切片及H&E染色：抑瘤实验结束后，解剖裸鼠以获得包括心、肝、脾、肺、肾在内的主要脏器以及肿瘤组织。组织切片：用4％(w/v)多聚甲醛溶液4℃固定收集的器官组织48h，随后置于流水处冲洗固定液。将固定的组织依次置于低到高浓度的乙醇溶液(体积分数70～100％)中梯度脱水15min，将经脱过水的组织在二甲苯溶液中进行两次透明处理(各15min)，浸泡于融化的石蜡中。待石蜡凝固，取出包埋组织块，置于切片机的包埋架，将组织切成10μm的切片。H&E染色：将切片用二甲苯进行脱蜡处理3次(各10min)，而后由高到低浓度的无水乙醇溶液(体积分数100～70％)水化15min，用苏木精染液染色2min，蒸馏水冲洗5min，含1％盐酸的乙醇溶液分化10s后，硫酸锂溶液中返蓝2min。再利用伊红染液染色1min，由低至高浓度的乙醇溶液(体积分数70～100％)脱水处理15min，二甲苯透明两次(各5min)。趁二甲苯未干时，封片于中性树胶，置于通风橱中晾干。最后，使用Olympus IX73P1F荧光显微镜观察并拍摄切片。苏木精使细胞核内的染色质以及胞质内的核糖体附着紫蓝色，伊红使细胞质以及细胞外基质中成分附着红色。结果如图12A和14A所示，经过不同纳米制剂治疗的裸鼠的主要器官(心，肝，脾，肺，肾)的H&E染色病理学结果与阴性对照组基本保持一致，这表明光驱动靶向酶疗并未对裸鼠产生明显的毒副作用，证明了良好的生物安全性。

血清生化指标检测：抑瘤试验结束后，取裸鼠血清，并测血清中各项生化指标。结果如图12B和14B所示，代表裸鼠肝功能的ALT和AST指标、肾功能的尿素（Urea）及肌酐（Cre）、以及体内总蛋白（TP）水平，均位于裸鼠生化指标的正常水平范围内，说明本发明阐述的纳米制剂具备生物安全性，不能引发肝脏及肾脏的损伤。

Claims (10)

1.一种嗜热精氨酸酶OCC08105，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种嗜热天冬酰胺酶OCC10209，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其是由如下步骤所述方法制备得到：

(1)晶种生长法合成金纳米棒溶液：将5mL、0.5mM四水合氯金酸水溶液和5mL、0.2MCTAB水溶液混合均匀，25～30℃下加入到0～4℃的500～600μL、0.01M硼氢化钠水溶液反应1～2h得到金晶种浓度9～10μg/mL的棕黄色金晶种溶液；再将5mL、0.2M CTAB水溶液，5mL、1mM四水合氯金酸水溶液，200～350μL、4mM硝酸银水溶液和70μL、0.0788M抗坏血酸水溶液混合均匀，得到混合生长溶液；在27～30℃条件下，将12μL金晶种溶液添加到10mL混合生长溶液中生长20～30小时，制得金纳米棒浓度0.2～0.5mg/mL的金纳米棒溶液；

(2)巯基标记的透明质酸的合成：在100mL、3mM透明质酸水溶液中添加4mmol EDC和4mmol NHS，持续搅拌1.5～3.0h以活化透明质酸上的羧基；然后向其中加入2mmol半胱氨酸进行巯基标记，再使用透析管透析标记物3～5天后，冷冻干燥后得到巯基标记的透明质酸；

(3)GNR-HA-Enzyme的合成：将步骤(2)制得的巯基标记的透明质酸和纯化的酶嗜热精氨酸酶或嗜热天冬酰胺酶加入到步骤(1)的金纳米棒溶液中，低温剧烈搅拌9～12小时，得到Au-S键共价耦合的纳米颗粒，再通过高速离心的方式去除未结合的酶蛋白，去除上清后得到近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂。

4.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(1)的金纳米棒溶液中，金纳米棒的长径比为3.3～3.8：1，长度为42～46nm，宽度为12～14nm。

5.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(3)的金纳米棒溶液中，金纳米棒的浓度为0.1～0.2mg/mL，利用0.2M碳酸钾溶液将体系pH值调节至8.0～10.0。

6.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(3)的金纳米棒溶液中，巯基标记的透明质酸的浓度为0.1～0.2mg/mL。

7.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(3)的金纳米棒溶液中，嗜热精氨酸酶或嗜热天冬酰胺酶的浓度为0.4～0.5mg/mL。

8.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(3)中低温搅拌进行共价耦合的温度为4～8℃。

9.如权利要求3所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：步骤(3)中高速离心的转速为10000～14000rpm，离心时间为8～15min。

10.如权利要求3～9任何一项所述的一种近红外驱动嗜热酶催化型抗肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于：用于抗人乳腺癌MCF-7细胞。

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